CN110101868A - 一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用，属于生物医药领域，本发明的蛋白质高分子偶联物包括蛋白质类物质和顺次与其偶联的两个或两个以上环境刺激响应性高分子，该蛋白质高分子偶联物在温度、酶、pH、光、静电、磁场、化学物质等环境作用下发生环境刺激敏感响应性自组装，其自组装体结构能够显著提高了药物的稳定性，有效保持药物的活性，同时显著延长了药物的半衰期，改善了药代动力学参数，并且制备方法简单、条件参数易于控制，有很好的实用价值。本发明的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体在药物制备、药物控释领域有广阔的应用前景。

Description

一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备 方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药纳米材料研究领域，具体涉及环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用，更具体地，涉及环境刺激响应性自组装药物递释载体、蛋白质药物，以及分离的环境刺激响应性高分子在制备药物递释体系中的用途。
背景技术
蛋白质-高分子偶联物由于可以增大小分子蛋白质的水合半径，从而逃逸肾脏清除作用，已经成为有效延长蛋白药物循环半衰期最常用的方法。目前，解决这些问题的最常用方法是用聚乙二醇(PEG)修饰蛋白质药物，这种方法通常被称为PEG化(PEGylation)。用聚乙二醇(PEG)修饰IFN，能有效改善其药代动力学，改善药物分布，提高其疗效。另外，将治疗性蛋白融合到人血清白蛋白(HSA)和抗体的Fc片段等长效循环蛋白是另一种延长其循环半衰期的方法。通过融合人血清白蛋白能够有效提高干扰素循环半衰期并有效控制修饰位点。最近，无规卷曲的多肽被用于提高药物蛋白的体内半衰期，包括XTEN化,PAS化,和ELP化。然而，这些方法很难有效保持药物的稳定性和活性，而且未能进一步显著提高药代水平。
分子自组装是指在平衡条件下，通过物质本身间的相互作用包括共价键、配位键、离子-共价键、电荷转移、氢键、静电引力等自发结合形成的一类结构明确、稳定、具有某种特定功能或性能的分子聚集体或超分子结构。分子自组装是一种普遍存在于生命体系中的现象,是分子合成工程的重要手段之一，在分子器件、分子调控等方面具有潜在的应用价值，因而自组装体系的研究与应用受到了广泛的重视。
环境刺激响应性高分子材料是指对外界刺激如温度、pH值、光、电场、磁场、化学物质等能产生敏感响应性行为的一类高分子材料。目前,无论在学术界还是应用领域,环境响应性高分子材料的研究尤为活跃,已成为国内外众多学者关注的热点。这些刺激敏感型高分子材料在药物控制释放、生物材料培养、分离、蛋白酶的活性控制等方面具有潜在的应用价值。
因此，为了增强药物的稳定性和在目标组织中的活性，期望能够得到一种环境刺激响应性蛋白质-高分子偶联物自组装的纳米药物载体，其在体内运输过程中可以稳定存在，而当到达目标部位时可以保持药物的高活性，从而提高疾病的诊断或治疗效果。这种环境刺激响应性蛋白质-高分子偶联物自组装的药物递送途径可能提供了一种新型、简单、有效的途径用于提高循环半衰期短的药用蛋白的药代动力学表现，同时提高药物的稳定性和在目标组织中的活性，获得更好的疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用，该环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物可作为自组装载药体系，在温度、酶、pH、光、静电、磁场和/或化学物质作用下发生敏感响应性自组装，以期保持药物活性，提高药物稳定性，延长药物半衰期，改善药代动力学参数。
本发明首先提供一种环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体，所述载体由两个或两个以上环境刺激响应性蛋白、多肽和/或化学高分子聚合物顺次偶联得到。
本发明所述的环境刺激响应性包括能够对温度、酶、pH、光、静电、磁场和/或化学物质作用下发生环境刺激敏感响应；
所述环境刺激响应性蛋白包括温度响应性类弹性蛋白多肽ELP；所述环境刺激响应性化学高分子聚合物包括聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯(POEGMA)、聚2-羟丙基甲基丙烯酰胺(PHPMA)、聚乙烯醇接枝聚合物、聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)、聚甲基丙烯酸甲酯(POEGMA)、聚(N，N-乙基甲基丙烯酰胺)(PEMA)、聚乙烯甲醚(PVME)、聚(N-乙烯基己内酰胺)(PVCL)、聚(丙烯氧化物)(PPO)、具有生物相容性和生物可降解性天然大分子和含有氨基酸基团的温敏性聚合物的至少一种。
在本发明的实施例中，所述类弹性蛋白多肽ELP为重复氨基酸序列(XGVPG)n，其中，n为不小于18的整数，X是除脯氨酸以外的任何一种氨基酸。
优选地，该ELP药物递释载体由两个或两个以上嵌段组成，对于每个嵌段18≤n≤200；1：2≤n亲水段：n疏水段≤2：1，所述类弹性蛋白多肽ELP的响应温度为10-70℃；优选地，所述两个嵌段类弹性蛋白多肽的响应温度分别为10-25℃和35-70℃，并且嵌段偶联后发生环境响应自组装的温度为20-36℃；所述两个嵌段类弹性蛋白多肽分别为疏水性嵌段ELP和亲水性嵌段ELP。
更优选地，n为48-120的整数，X是异亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸等。
对于本发明的两个或两个以上嵌段ELP自组装体而言，通过对载体的重复氨基酸种类和序列大小进行限定，使不同嵌段ELP亲疏水性和相变温度不同，从而在达到低于体温20-36℃的一定临界胶束温度时可发生自组装形成胶束，疏水性多肽聚集成核，亲水性多肽分布在外周。不同嵌段ELP亲疏水性和相变温度主要由该嵌段的(XGVPG)n里的X决定。为使本发明的偶联物自组装成纳米胶束，本发明确定了1：2≤n亲水段：n疏水段≤2：1，特别是当亲水嵌段和疏水嵌段的n之比为1：1时结构最稳定，且n至少为18。ELP自组装体具有一个发生自组装的临界胶束温度，以及一个整体聚集成团的相变温度，临界胶束温度位于亲水嵌段和疏水嵌段ELP的各自的相变温度之间，整体聚集成团的相变温度一般为不同嵌段ELP相变温度中的最高值，主要由X决定。本发明选择了合适于不同嵌段的X和n，以保证本发明的偶联物可以在20-36℃内自组装成稳定的纳米胶束。
类弹性蛋白多肽(ELP)具有温敏性可逆相变的特性，其中，可逆相变是指类弹性蛋白在两相之间在一定温度时的相平衡压力下发生的相变化，也就是说，若环境温度低于它的相变温度,该多肽在水溶液中为高度可溶；相反,当环境温度高于该相变温度时，富含水的多肽链结构脱水，并开始聚集，形成一个富含ELP的聚集物，并且这个相变过程是可逆的。
发明人研究发现，ELP的相变温度可随氨基酸的疏水性和重复单元的数量而改变。疏水基团越多，重复单元数量越多，ELP的相变温度越低。而且ELP具有生物相容性，无毒无免疫原性。进而利用ELP蛋白的温敏可逆相变特性可以实现蛋白类药物的温度依赖性可控自组装，进而将循环半衰期延长与温度依赖性自组装结合起来，用于小分子蛋白和多肽类药物的给药。同时，发明人对载体的重复氨基酸种类和序列大小进行选择，使药物载体在体内保持稳定存在的胶束，保持了药物活性，显著降低了药物的释放速率，改善了药物的半衰期。
在本发明提供的上述环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体的基础上，本发明提供了一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体，所述蛋白质高分子偶联物由蛋白质类物质和顺次与其偶联的本发明所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体构成。
所述的蛋白质类物质选自医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体；所述的蛋白质类物质的分子量为1000-300000Da。该蛋白质类物质的分子量较小，容易被体内蛋白酶降解和肾排出，循环半衰期非常短，需要频繁给药以维持较高的血药浓度，尤其适于通过前述的环境刺激响应性蛋白质-高分子偶联物自组装药物载体，避免蛋白酶降解和肾排出，延长药物的半衰期。
优选地，所述蛋白质类物质为胰岛素，单克隆抗体，血液因子，集落刺激因子，生长激素，白介素，生长因子，治疗性疫苗，降钙素，肿瘤坏死因子和酶类。
更优选地，所述蛋白质类物质为天冬酰胺酶、谷氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶，表皮生长因子EGF、胰岛素样生长因子IGF、转化生长因子TGF、神经生长因子NGF、血小板衍生的生长因子PDGF，骨形态发生蛋白BMP，成纤维细胞生长因子、生长抑素、生长激素、生长激素、生长激素抑制素、甲状旁腺激素、集落刺激因子CSF、凝血因子、肿瘤坏死因素、干扰素、白细胞介素、胃肠肽、血管活性肠肽VIP、肠促胰酶肽CCK，胃泌素，促胰液素、促红细胞生成素、瘦素、荷尔蒙、抗利尿激素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺激素释放激素TRH、促甲状腺激素、促黄体生成激素、促黄体激素释放激素LHRH、组织型纤溶酶原激活剂、白细胞介素-1、白细胞介素-15、受体拮抗剂IL-1RA、胰高血糖素样肽-1及其类似物、瘦素、生长素、粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF、白细胞介素-2、腺苷脱氨酶、尿酸酶、天冬酰胺酶、人生长激素、天冬酰胺酶、巨噬细胞活化；绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、逆转录病毒载体、松弛肽、环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体、水蛭素中的至少一种。
作为本发明的优选实施方式，所述蛋白质类物质为干扰素、粒细胞集落刺激因子、瘦素、胰高血糖素样肽-1及其类似物和水蛭素中的至少一种。
优选地，所述蛋白质高分子偶联物自组装体的水合半径为10-100nm。
本发明可通过基因工程技术或化学合成方法将蛋白类物质与两个或两个以上环境刺激响应性高分子顺序性偶联，得到蛋白多嵌段环境刺激响应性高分子偶联物自组装体。调控其性质在达到一定响应条件时可发生自组装形成胶束。优选地，通过对ELP载体的重复氨基酸种类和序列大小进行限定，从而使不同嵌段ELP亲疏水性和相变温度不同，从而在达到低于体温20-36℃的一定临界胶束温度时可发生自组装形成胶束，疏水性多肽聚集成核，亲水性多肽分布在外周。本发明选择了合适于不同嵌段的X氨基酸和重复单元数n，并设计亲水嵌段和疏水嵌段的n之比为1：1，且n至少为18。以保证偶联物可以在20-36℃内自组装成稳定的纳米胶束。本发明发现，由于形成胶束增大了药物尺寸，而且紧密排列的胶束结构更难被体内的酶降解，保持了其在体内运输过程中的稳定性，同时大大延长了在血液循环中的存留时间，延长了循环半衰期，而纳米尺度的蛋白质-高分子偶联物已被证实可由高渗透性与滞留(EPR)效应被动靶向到达肿瘤细胞发挥作用。
根据本发明实施例，本发明是通过基因工程技术将两个或两个以上温度响应性ELP多肽与药用蛋白IFN的C末端融合表达，得到药用蛋白IFN-多嵌段温敏性ELP多肽偶联物。通过对载体的重复氨基酸种类和序列大小进行限定，从而使不同嵌段ELP亲疏水性和相变温度不同，从而在达到低于体温的一定临界胶束温度时可发生自组装形成胶束，疏水性多肽聚集成核，亲水性多肽分布在外周。
本发明提供了所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体、或所述的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体在制备药物中的应用。
所述药物为预防或治疗肿瘤、组织器官病变、免疫性疾病、代谢性疾病的药物。
所述组织器官病变包括但不限于肝炎。
所述免疫性疾病包括但不限于风湿。
所述代谢性疾病包括但不限于糖尿病。
作为优选，所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤、卵巢癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、肝脏肿瘤、肾脏肿瘤、神经胶质瘤等常见实体瘤。
本发明进一步提供了一种药物，含有上述的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体。
更进一步地，本发明提供了一种干扰素药物，包括由干扰素多肽和所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体组成的偶联物，所述干扰素多肽与所述环境刺激响应性自组装的蛋白药物递送载体可操作地相关联。
本文中的“操作地相关联”，即可以是这几个分子直接地关联，中间不含有其它分子，也可以是间接地关联，中间含有其它的分子。例如，药用蛋白IFN的C末端可以直接与温敏性ELP多肽的N末端相连，也可以二者之间含有其他的肽段。同时，“操作地相关联”表示分子之间存在电子相互作用。这类相互作用可以采取化学键的形式，其包括但不限于共价键、极性共价键、离子键、静电缔合、配位共价键、芳香键、氢键、偶极或范德华相互作用。本领域的普通技术人员理解，这些相互作用的相对强度可以变化很大。
本发明实施例中所述干扰素多肽为干扰素α。
具体地，所述偶联物的氨基酸序列包括如下任一氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO.7所示氨基酸序列；
(2)如SEQ ID NO.7所示的序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的多肽的氨基酸序列；
(3)与如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列。
上述序列如SEQ ID NO.7所示的由干扰素多肽和所述环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体组成的偶联物包括顺次连接的如下序列：IFNα多肽序列、linker、亲水性ELP嵌段、疏水性ELP嵌段，上述linker的序列为GSGG。本发明通过大量筛选和优化确定了IFNα与环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体连接的linker，保证了IFNα与两嵌段ELP药物递释载体的两个肽段不会发生功能区的折叠和遮挡，能够最大程度地保持IFNα和药物递释载体的活性和功能。
本发明提供纳米级别的IFNα-ELPdiblock偶联物自组装体；所述纳米级别的IFNα-ELPdiblock偶联物自组装体的分子直径≤200nm。此纳米尺度的蛋白质高分子偶联物具有通过高渗透性与滞留效应(EPR)介导的被动靶向肿瘤的优势，本发明利用肿瘤模型验证了所述蛋白质高分子偶联物自组装体在肿瘤治疗中的功能。结果表明，一次性静脉注射IFNα-ELPdiblock偶联物自组装体表现出显著增强的肿瘤聚集和渗透能力。
本发明提供的上述干扰素药物的终末半衰期为54.7h。上述干扰素药物的半衰期显著延长，药代动力学参数更优异，且具有良好的组织渗透性和活性，药物的疗效提高，药物的毒副作用小。
本发明所述的干扰素药物可采用不同的给药方式，当采用静脉注射给药时，所述干扰素药物中所述IFNα-ELPdiblock偶联物自组装体的浓度不低于1mg/kg体重剂量。
本发明还提供了编码所述的环境刺激响应性蛋白药物递释载体或所述的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物或上述干扰素药物的核酸。
本领域技术人员应该理解，当偶联物的氨基酸序列确定后，本领域技术人员可以根据密码子简并性和宿主细胞的密码子偏好性设计编码相同氨基酸序列的不同核酸序列，这些核酸序列均在本发明的保护范围内。
本发明还提供了含有上述核酸的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或细胞系。
本发明中，所述载体可以通过将所述核酸插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。所述载体可以是质粒或病毒。
质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。病毒很容易转染到受体细胞中。本领域技术人员可以根据需要进行选择。
对于用于构建重组细胞的重组载体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
所述工程菌或所述宿主细胞含有所述核酸或含有携带所述核酸的载体。
进一步地，本发明提供所述核酸或所述生物材料在制备蛋白质或多肽类药物中的应用。
所述药物预防或治疗肿瘤、组织器官病变、免疫性疾病、代谢性疾病的药物。
所述组织器官病变包括但不限于肝炎。所述免疫性疾病包括但不限于风湿。所述代谢性疾病包括但不限于糖尿病。作为优选，所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤、卵巢癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、肝脏肿瘤、肾脏肿瘤、神经胶质瘤等常见实体瘤。
本发明提供了一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体的制备方法，该方法包括：将蛋白药物与环境刺激响应性高分子通过基因工程学核酸序列顺序设计合成或通过化学方法偶联。其中，需要特别说明的是，优选情况下，由于所述响应性高分子可以为本实施例所述的温度响应性类弹性蛋白多肽，因此，关于本发明前述的响应性高分子的定义、范围以及解释均适用于本发明的环境刺激响应性蛋白质-高分子偶联物自组装体的制备方法中，本发明在此不再赘述。
本发明的发明点主要在于环境刺激响应性自组装材料以及由蛋白药物和响应性高分子偶联所获得的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法，本发明的技术方案中对偶联的操作方法并没有特别的限定。本领域的技术人员可以采用本领域常规使用的手段进行蛋白质和高分子的偶联，只要能够获得本发明所述的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体即可，例如根据本发明的一种优选的具体实施方式，在实施例中，当所应用的响应性高分子为温敏性多肽时，所述环境刺激响应性蛋白质-高分子偶联物自组装体的制备方法可以包括：应用基因工程将药用蛋白和两嵌段温敏性多肽融合表达，得到药用蛋白-两嵌段温敏性多肽偶联物。根据不同嵌段多肽亲疏水性和相变温度不同，可发生自组装形成疏水性多肽聚集成核，亲水性多肽分布在外周的胶束。
纳米尺度的蛋白质-高分子偶联物具有通过高渗透性与滞留效应介导的被动靶向肿瘤的优势，因此本发明实施例选择了肿瘤模型作为实施例，验证了该蛋白质-高分子偶联物在肿瘤治疗中的功效。结果表明温度响应性自组装的IFN-ELPdiblock偶联物表现出大大增强的半衰期、肿瘤聚集和治疗功效。这种环境刺激响应性蛋白质-高分子偶联物自组装的蛋白递送途径一方面由于形成胶束增大了药物尺寸，有效逃避了肾脏清除作用，在提高药代表现方面具有显著优势；另一方面由于其紧密排列的胶束结构更难被体内的酶降解，保持了其在体内运输过程中的稳定性，有效维持了蛋白药物在目标组织中的活性。极大提高治疗效果，同时降低毒副作用，适用于很多药用蛋白和多种疾病治疗，从而大大提高患者的生活质量。
基于本发明的上述技术方案，本发明取得了以下有益效果：
(1)本发明利用多嵌段的环境刺激响应性高分子作为蛋白药物递送载体，在一定环境刺激作用下(20-36℃)可发生环境刺激响应性自组装形成胶束。发明人对ELP的重复氨基酸序列、重复单元数量和序列大小进行选择，使药物递释载体的相变温度适当低于正常人体体温，既保证相变温度低于体温，实现体内聚集，并缓释蛋白类药物入血，显著降低了药物的释放速率，实现蛋白类药物的零级释放，有效延长了药物的循环半衰期，并显著提高了药物的生物利用度，改善了药代动力学参数。药物能够长效缓释，又具有良好的组织渗透性，生物利用率高。如果n过大，则融合蛋白分子量过大，即尺寸过大，会导致组织渗透性差而影响药效；而如果n过小，相变温度过高，则无法达到有效的体内聚集(如皮下聚集)，无法实现药物的长效缓释。
(2)本发明利用环境刺激响应性蛋白质-高分子偶联物自组装的蛋白递送途径由于形成胶束结构显著提高了药物的稳定性，有效保持药物的活性，同时显著延长了药物的半衰期，在实施例中，IFNα-ELPdiblock的终末半衰期(54.7h)是IFNα(0.44h)的124.3倍，是商品化长效IFN派罗欣(39.0h)的1.4倍。改善了药代动力学参数。
(3)本发明所需设备简单，成本低廉，工艺操作方便等。
附图说明
图1显示了本发明实施例1的IFNα-ELPdiblock质粒构建的方法流程示意图。
图2显示了本发明实施例2的通过ITC纯化获得IFNα-ELP和镍柱亲和层析纯化获得IFNα的结果。
图3显示了本发明实施例3的MALDI-TOF分析IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)和IFNα的分子量的结果。
图4显示了本发明实施例3的IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)和IFNα的二级结构。
图5显示了本发明实施例3的IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)的相转变温度结果。
图6显示了本发明实施例3的IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)相转变温度的浓度依赖性结果。
图7显示了本发明实施例3的IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)的水合半径随温度变化的结果。
图8显示了本发明实施例3的25μM的IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)和IFNα在37℃的水合半径结果。
图9显示了本发明实施例3的IFNα-ELPdiblock的冷冻电镜结果示意图。
图10显示了本发明实施例3的IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)临界胶束浓度(CMC)结果示意图。
图11显示了本发明实施例4的IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)，IFNα和PEGASYS的体外生物活性结果示意图。
图12显示了本发明实施例5的IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)和IFNα在蛋白酶K作用下的SDS-PAGE结果。
图13显示了本发明实施例5的IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)和IFNα在蛋白酶K作用下的水合半径结果。
图14显示了本发明实施例5的IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)和IFNα在蛋白酶K作用下的体外生物活性结果。
图15显示了本发明实施例5的IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)和IFNα在鼠血清孵育作用下的体外生物活性结果。
图16显示了本发明实施例6的静脉注射相同干扰素剂量的IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)，PEGASYS和IFNα后在裸鼠体内的血药浓度随时间的变化结果。
图17显示了本发明实施例7的IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)和IFNα在肿瘤及其他组织中的分布结果。
图18显示了本发明实施例8的小鼠静脉注射相同干扰素剂量的IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP(A)，PEGASYS和IFNα后抑制肿瘤生长情况的结果。
图19显示了本发明实施例8的小鼠静脉注射相同干扰素剂量的药物后肿瘤生长情况。
图20显示了本发明实施例8的小鼠静脉注射相同干扰素剂量的药物后的生存曲线结果。
图21显示了本发明实施例8的小鼠静脉注射相同干扰素剂量的药物后裸鼠体重随时间的变化结果。
图22显示了本发明实施例8的小鼠静脉注射相同干扰素剂量的药物后裸鼠肿瘤及其他组织的组织学变化情况的结果。
图23显示了本发明实施例8的小鼠静脉注射相同干扰素剂量的药物后肾、肝、心脏功能生理指标和血液指标变化情况的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明提供了一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物，可作为自组装载药体系。根据本发明的实施例，该自组装载药体系包括：前述的环境刺激响应性高分子作为药物递释载体，治疗剂(药用蛋白)与两个或两个以上环境刺激响应性两亲性高分子合成的聚合物胶束，所述治疗剂与所述药物载体操作地顺序相关联，所述治疗剂为蛋白质类物质。本发明实施例中，蛋白质类物质选自干扰素、粒细胞集落刺激因子、瘦素、胰高血糖素样肽-1及其类似物和水蛭素的至少一种。
本文所用术语“治疗”是指疾病或疾病状态的任何不期望的病征或症状的任何程度的减轻、预防或抑制。这些不期望的病征可以包括使个体的良好状态或外观的整体感觉恶化的那些病征。这个术语并非必须意味着疾病或疾病状态的完全治愈或消失。“治疗剂”是指在以治疗有效量向哺乳动物给药时，向该哺乳动物提供治疗益处的化合物。本文中，治疗剂可以指蛋白药物。本领域技术人员应当理解，术语“治疗剂”并不限于得到监管机构批准的蛋白药物。“治疗剂”可以与至少一种响应性高分子操作地相关联。
根据本发明实施例的蛋白药物，通过将蛋白质类治疗剂与前述的环境刺激响应性高分子药物载体相关联，显著延长了药物的半衰期，改善了药代动力学参数，同时有效提高蛋白药物的稳定性和活性，提高药物的疗效，降低药物的毒副作用。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1构建IFNα-ELPdiblock融合蛋白质粒并在大肠杆菌中表达
选择异亮氨酸I作为疏水性ELP嵌段的X氨基酸，ELP(I)序列的氨基酸重复单元为:(IGVPG)，共重复48次。
由生工生物技术(上海，中国)合成包含重复单元和BseRI/AcuI粘性末端的基因片段。
上游片段：5’GCATTGGTGTGCCGGGGATCGGTGTTCCGGGC3’(SEQ ID NO：1)
下游片段：5’TAGCCCGGAACACCGATCCCCGGCACACCAAT3’(SEQ ID NO：2)
通过BseRI/AcuI酶切位点插入到pET-24a(+)载体中，通过滚环法质粒构建获得24个如上重复单元的质粒。
选择丙氨酸A作为亲水性ELP嵌段和对照组ELP的X氨基酸，ELP(A)序列的氨基酸重复单元为:(AGVPG),共重复48次和96次。
由生工生物技术(上海，中国)合成包含重复单元和BseRI/AcuI粘性末端的基因片段，
上游片段：5’GCGCAGGTGTGCCGGGCGCGGGTGTTCCGGGCGCAGGTGTCCCGGGC3’(SEQ IDNO：3)
下游片段：5’CAGCCCGGGACACCTGCGCCCGGAACACCCGCGCCCGGCACACCTGC3’(SEQ IDNO：4)
通过BseRI/AcuI酶切位点插入到pET-24a(+)载体中，通过滚环法质粒构建获得16个和32个如上重复单元的质粒。
IFNα基因序列(NCBI GI 386795)由生工生物技术(上海，中国)合成并插入载体中。利用PCR技术，从载体中扩增IFNα编码序列，通过BseRI/AcuI酶切位点插入到pET-24a(+)载体中，通过质粒构建获得含有IFNα-ELP(A)48-ELP(I)48(IFNα-ELPdiblock)和IFNα-ELP(A)96(IFNα-ELP(A))基因的质粒，其中，IFNα基因序列如SEQ IDNO.5所示。
该IFNα基因序列引物如下：
上游引物：5’GAGATAGAGGAGTACATATGGGCTGTGATCTGCCTCAGACTCATT3’(SEQ ID NO：5)
下游引物：5’TTTCCGCTGAAGGCAGAGAGCCACCGCCACCGGATCCTTCTTTAGAACGCAGGCTCT3’(SEQ ID NO：6)
IFNα-ELPdiblock(SEQ ID NO.7)和IFNα-ELP(A)质粒构建方法如图1所示，构建得到质粒后在大肠杆菌(Rosetta-gami(DE3)pLysS，Novagen)中表达。在大规模的表达之前，先将转化得到的单克隆菌接种在50mL TB培养基中(含100μg/mL卡那霉素)，在37℃、180rpm条件下震荡培养过夜。第二天再转接入1L新鲜TB培养基当中(盛在2L的摇瓶中，卡那霉素浓度为100μg/mL)进行大规模培养并诱导表达。具体步骤如下：首先在37℃，200rpm条件下震荡培养5h，随后将培养温度设为18℃，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，终浓度为0.5mM，培养16h后收集菌体。
实施例2对实施例1培养获得的IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)偶联物进行纯化
1、本实施例中采用反相转变循环技术(Inverse transition cycling,ITC)纯化IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)。具体方法如下：
(1)将1L大肠杆菌培养液收集于离心瓶，以3000×g离心力离心收集菌体，去除上层培养液。
(2)用30mL冰冷PBS重悬菌体，再用超声仪在4℃条件下破碎细胞，然后将大肠杆菌破碎产物在4℃、14000×g离心力下离心15分钟。
(3)在步骤(2)收集的上清液中加入2mL聚乙烯亚胺(PEI，10％)，再次离心15分钟，目的为除去细胞裂解液中的核酸及其他带负电物质，得到的上清液进行ITC纯化：加入终浓度为3M的NaCl，37℃充分溶解后14000×g离心力下离心15分钟，去上清，沉淀溶解在提前预冷的10mM PBS中，完全溶解后离心，得到上清。此过程重复2-3次即可获得样品。
2、用Ni亲和层析的方法来纯化带有His标签的IFNα重组蛋白，具体步骤是：将上清用0.22μm滤膜过滤后，上样到镍亲和柱中，然后用AKTA Purifier 10系统进行纯化，之后用0～100％缓冲液B(10mM PBS,500mM咪唑,pH 7.4)进行梯度冲洗，收集各个洗脱峰，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。得到目标蛋白后，用HiPrep 26/10脱盐柱去除咪唑，并置将缓冲液置换成10mM PBS，pH 7.4，溶液中，保存在-80℃。
纯化样品用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试纯度，并用分光光度计法(NanoDrop 2000)测定了蛋白的浓度。SDS-PAGE分析样品由含有5％β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液配制，浓度为1mg/mL，95℃下加热5min后，10μL样品装载到预制的10％SDS-PAGE凝胶中，垂直电泳80～100V电压下运行90min(电泳液为：25mM Tris、250mMGlycine、0.1％SDS)。凝胶用考马斯蓝G-250染色处理后观察条带位置。图2显示了IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)和IFNα的表达与纯化。结果表明，通过大肠杆菌进行表达，纯化后获得纯度＞95％的蛋白，该蛋白即为IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)蛋白质-高分子偶联物。
实施例3测量IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)的物理化学表征参数
(1)用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定实施例2获得纯化产物的分子量，所用仪器为4800PlusMALDI-TOF/TOFTM分析仪(AB SCIEX)，结果如图3所示，表明IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)和IFNα的实验所测分子量与理论值接近。即获得了已纯化的分子量正确的蛋白样品，可用于后续实验。
(2)IFNα-ELPdiblock的二级结构用圆二色性谱分析测得：样品用水溶液稀释至0.15mg/mL，用Pistarπ-180(Applied Photophysics有限公司)在200-250nm波长范围内进行紫外扫描分析，结果如图4所示，图4显示了圆二色性色谱分析IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)和IFNα的二级结构，均在200-260nm波长范围内的圆二色谱都呈现出同样的208/222nm双峰曲线，为典型的α螺旋结构，且与IFNα曲线重叠良好，表明ELP融合并没有干扰IFNα的二级结构。
(3)IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)的相转变温度(Tt)通过浊度法进行测定：样品用PBS稀释至1mg/mL，用酶标仪(Molecular Devices)测定在0-72℃(以1℃/min递增)温度范围内OD350的紫外吸收，其中，对于IFNα-ELP(A)，Tt指样品浊度达到最大值一半时的温度，对于IFNα-ELPdiblock有两个相转变温度，Tt1指样品浊度开始超过基线时的温度，Tt2指上升阶段的样品浊度对温度求导数达到最大值时的温度，结果如图5所示，图5显示了IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)的相转变温度，IFNα-ELP(A)表现出急剧的相转变行为，而IFNα-ELPdiblock表现为两步相转变。表明IFNα-ELPdiblock在Tt1开始，相变温度较低的疏水性ELP(I)嵌段开始发生相转变聚集，开始自组装形成以ELP(I)为核心，外周为IFNα-ELP(A)的纳米胶束结构，达到Tt2温度后，亲水的ELP(A)嵌段也相转变聚集，此时IFNα-ELPdiblock整体聚集成团，因此，在Tt1到Tt2之间的温度范围IFNα-ELPdiblock以自组装成的纳米胶束结构稳定存在。而IFNα-ELP(A)作为对照组，只发生一次相转变，证明未发生自组装，仍以单分子状态存在。
(4)为了探索IFNα-ELPdiblock和IFNα-ELP(A)相转变温度的浓度依赖性，样品用PBS稀释至不同浓度，用酶标仪(Molecular Devices)测定在0-72℃(以1℃/min递增)温度范围内OD350的紫外吸收，结果如图6所示，和IFNα-ELP(A)的相变温度相似，IFNα-ELPdiblock的Tt1随浓度降低而升高，但一直远远低于37℃，保证了胶束在体内温度下的稳定性。然而Tt2受浓度影响不大，可能是由于胶束结构外层紧密排列的IFNα-ELP(A)使ELP(A)维持了较高浓度。
(5)在Malvern Zetasizer Nano-zs90上用动态光散射(DLS)和静态光散射(SLS)方法测定样品在不同温度下的水合半径(Rh)和回转半径(Rg)，并计算ρ比值：ρ＝Rg/Rh。样品稀释在PBS缓冲液中，测试前经0.22μm孔径滤膜过滤处理。
经DLS测试，如图7所示，单分子的IFNα-ELP(A)-ELP(I)在21℃水合半径由8.5±0.62nm变为25.5±2.0nm的IFNα-ELPdiblock纳米颗粒，并保持稳定大小，直至50℃以上发生进一步相变大量聚集。而IFNα-ELP(A)的水合半径在58℃由9.6±2.0nm转变为大分子聚集物。而肾脏滤过清除尺寸约为5nm半径，因此，在体内37℃温度下，与IFNα-ELP(A)(11.4nm)和IFNα(2.8nm)相比，25.5nm的IFNα-ELPdiblock纳米颗粒由于更难被肾清除，从而可以在血液循环中稳定滞留更长时间，表明蛋白质-高分子偶联物及其自组装体可以延长IFNα的循环半衰期，图8显示了DLS分析IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)和IFNα在37℃的水合半径。
经SLS测试，如表1可知，IFNα-ELPdiblock回转半径(Rg)为17.4nm，ρ比值为0.74，接近均质球形结构的理论值，证明了IFNα-ELPdiblock胶束为球形结构。而IFNα-ELP(A)和IFNα未测得回转半径值，表明其不满足球形结构。
(6)用冷冻电镜观测IFNα-ELPdiblock纳米颗粒的形貌，如图9所示，为直径约48nm的纳米球状结构，与DLS测试结果相符。
(7)IFNα-ELPdiblock的临界胶束浓度(CMC)检测，用尼罗红标记IFNα-ELPdiblock并梯度稀释到不同浓度，用分光光度计进行荧光光谱分析。图10显示IFNα-ELPdiblock临界胶束浓度为0.5μM。与IFNα-ELP(A)和IFNα相比，IFNα-ELPdiblock较低的CMC和增大的水合半径可延长纳米颗粒在血液循环中稳定存在的时间，逃避肾脏清除作用。
表1
实施例4实施例2制得的IFNα-ELPdiblock偶联物的体外生物活性检测
IFNα-ELPdiblock的抗细胞增殖活性采用MTT方法测定。MTT实验选用了人Burkitt’sB淋巴瘤细胞(Daudi B)，因为该细胞对IFN-α具有较高的敏感度。
Daudi B细胞在含有10％FBS、50U/mL盘尼西林和50μg/mL链霉素的RMPI-1640中培养一段时间后，在96孔板中接种一定浓度的细胞悬浮液(50μL/孔，104个细胞)，将IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、派罗欣(PEGASYS，上海罗氏制药有限公司)和IFNα样品系列稀释，各50μL加入96孔培养板中，设阴性对照(不含IFN-α)和空白对照(只含培养液)，37℃，5％CO2培养72～96h，加MTT溶解液(Promega)20μL/孔，3h后用酶标仪测定各孔490nm波长的吸收值，比较不同样品处理后细胞增殖的程度。
结果如图11和表2所示，结果显示了MTT测定IFNα-ELPdiblock的体外生物活性，其中，以IFNα为参照物，IFNα-ELPdiblock活性保持35％，与IFNα-ELP(A)近似，分别是PEGASYS的5.7和5.8倍。该结果表明，与IFNα-ELP(A)相比，本发明实施例2制得的自组装形成IFNα-ELPdiblock胶束结构后并没有严重降低IFNα的活性，而且活性保持率远远高于商品化的PEG化的IFN(PEGASYS)，为体内抗肿瘤活性测试提供了依据。
表2
样品 IC50(pg/mL) 相对活性(％)
IFNα 21.7 100
PEGASYS 350.6 6
IFNα-ELP(A) 60.4 36
IFNα-ELP<sub>diblock</sub> 61.6 35
实施例5实施例2制得的IFNα-ELPdiblock偶联物结构和功能的酶稳定性测试
(1)将1mg/mL的IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)和IFNα样品与蛋白酶K按摩尔比40：1混合，37℃孵育不同时间0,0.5,4,8h后用0.03M PMSF终止，酶切产物用SDS-PAGE、DLS和MTT进行检测，结果如图12所示，与IFNα-ELP(A)和IFNα相比，IFNα-ELPdiblock被酶降解需要更长的时间。相似的，图13结果表明，孵育4h后IFNα-ELPdiblock的水合半径为22.6nm，与0h基本一致，而IFNα-ELP(A)孵育4h后水合半径有多个峰值，表明已被降解为多个片段，结果表明IFNα-ELPdiblock在酶作用下结构最为稳定。
MTT结果如图14和表3所示，结果显示了IFNα-ELPdiblock在酶作用下蛋白活性降低速度最慢，4h IFNα-ELPdiblock活性是IFNα-ELP(A)的2.6倍，而IFNα已检测不到活性，表明IFNα-ELPdiblock在酶作用下功能更稳定。
(2)将1mg/mL的IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)和IFNα样品与鼠血清混合，37℃孵育不同时间0，1，2，3，5，7天，孵育产物用MTT进行检测。结果如图15和表4所示，结果显示了孵育7天后IFNα-ELPdiblock的体外生物活性是IFNα-ELP(A)的2.4倍。
IFNα-ELPdiblock偶联物结构和功能上的稳定性的提升可能是由于自组装后的胶束外层紧密排列的IFNα-ELP(A)使胶束更难以被蛋白酶降解。
表3
样品 0h IC50(pg/mL) 4h IC50(pg/mL)
IFNα 19.8 -
IFNα-ELP(A) 53.3 178.1
IFNα-ELP<sub>diblock</sub> 53.5 66.9
表4
样品 0d IC50(pg/mL) 7d IC50(pg/mL)
IFNα 20.2 -
IFNα-ELP(A) 55.8 170.3
IFNα-ELP<sub>diblock</sub> 54.6 71.5
实施例6实施例2制得的IFNα-ELPdiblock偶联物的药物代谢动力学测试
利用裸鼠模型，经尾静脉注射相同干扰素剂量的IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、PEGASYS和IFNα后，测定了血液中干扰素浓度随时间变化的情况，并利用DAS软件进行数据分析。
在药物处理期前，12只8周龄体重为20g左右的雌性裸鼠观察一段时间后，随机分成4组。以1mg/kg体重剂量尾静脉注射IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、PEGASYS和IFNα，然后在设定的时间点用异氟烷对裸鼠进行麻醉后经眼内眦静脉取血0.3-0.4mL，室温静置1h，在4℃、3000×g下离心收集上层血清，保存于-80℃低温冰箱。用人IFN-αELISA试剂盒(PBLinterferon source)根据说明书测定血清中的IFN-α含量。利用DAS 3.0药物代谢动力学分析软件计算出药物代谢动力学参数。
利用DAS软件中房室消除模型分析IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、PEGASYS和IFNα的药物代谢动力学参数，IFNα的终末半衰期(0.44±0.074h)延长到了IFNα-ELP(A)的9.6±0.44h和IFNα-ELPdiblock的54.7±2.6h,显著高于PEGASYS的39.0±2.5h。
IFNα-ELPdiblock的药时曲线面积为63.2±3.9mg/L·h，分别为PEGASYS(50.5±5.4mg/L·h)和IFNα-ELP(A)(12.1±1.5mg/L·h)的1.3和5.2倍，结果详见图16，结果表明，由于尺寸增大和肾脏清除减弱，IFNα-ELPdiblock自组装体胶束可显著提高IFN的药代动力学水平。
表5显示了静脉注射相同干扰素剂量的IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、PEGASYS和IFNα后的药物代谢动力学数据分析。
表5
参数 IFNα-ELP<sub>diblock</sub> IFNα-ELP(A) PEGASYS IFNα
分布半衰期(h) 1.1±0.44 0.38±0.078 0.78±0.068 0.065±0.01
终末半衰期(h) 54.7±2.6 9.6±0.44 39.0±2.5 0.44±0.074
药时曲线面积(mg/L·h) 63.2±3.9 12.1±1.5 50.5±5.4 1.3±0.008
平均驻留时间(h) 44.5±0.15 11.0±0.57 38.1±0.85 0.68±0.11
消除速率常数(1/h) 0.035±0.0072 0.31±0.15 0.078±0.059 1.4±0.29
外周到中心速率常数(1/h) 0.26±0.089 1.0±0.082 0.79±0.013 1.8±0.37
清除速率(L/h/kg) 0.074±0.03 0.32±0.18 0.12±0.06 0.51±0.26
实施例7实施例2得到的IFNα-ELPdiblock偶联物在组织中的分布情况
利用移植了卵巢癌细胞的裸鼠测定了以1.5mg/kg体重剂量尾静脉注射IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、PEGASYS和IFNα，给药2h，48h，120h后各主要组织器官中残留的干扰素的浓度。
将12只雌性无胸腺(Nude)裸鼠分成4组，IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、PEGASYS和IFNα组，人卵巢癌细胞(OVCAR-3)在含有10％FBS，50U/mL盘尼西林和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养一段时间后，用胰蛋白酶消化剥离，经PBS洗涤，重悬于不含上述添加物的DMEM培养基，0.2mL单细胞悬液(5×106个细胞)接种于裸鼠左后肢股骨处背部皮下，培养30天后形成100mm3大小的实体瘤肿块。IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、PEGASYS和IFNα以1.5mg/kg体重剂量尾静脉注射，给药2h，48h，120h后分别处死裸鼠，收集主要器官如心、肾、肝脏、脾脏、肺、胰腺、胃、肌肉、小肠及肿瘤。组织用提取缓冲液(PBS含1mM EDTA，0.5％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，1mM PMSF，按1:100比例稀释的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich))破碎后，离心取上清提取液。组织中的IFN的浓度用ELISA方法定量测定。
检测结果如图17所示，图17显示了IFNα-ELPdiblock在各组织中累积情况。在注射样品2h，48h，120h后，IFNα-ELPdiblock在各组织中能够有效累积,48h，120h后IFNα-ELPdiblock在各组织积累量显著高于PEGASYS。与之相反，IFNα-ELP(A)和IFNα在肿瘤中聚集量较少，并且给药后120d在所有主要组织器官中都几乎检测不到了，这是由于它们循环半衰期短。这些结果表明本发明的IFNα-ELPdiblock偶联物温度响应性自组装体大大提高了IFNα在小鼠体内的生物分布。从而提高干扰素在体内的生物利用度和抗肿瘤功效。
实施例8利用裸鼠模型测试实施例2得到的IFNα-ELPdiblock偶联物自组装体的体内抗肿瘤活性
本实施例采用OVCAR卵巢癌细胞在裸鼠皮下肿瘤模型来评价IFNα-ELPdiblock的体内生物活性。
将OVCAR细胞接种于裸鼠右后肢股骨处背部皮下，培养至形成实体瘤肿块(～30mm3)，从而建立裸鼠肿瘤模型。将40只裸鼠分成5组，IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、PEGASYS、IFNα和生理盐水组。以1.5mg/kg体重剂量尾静脉注射打入裸鼠体内，直至对照组小鼠全部死亡。每周观察裸鼠生存状态以及肿瘤生长情况，动态测量裸鼠体重和肿瘤体积随时间的变化。治疗结束后通过眼球取血，获得血液和血清送至清华大学校医院检验科测定乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮、红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白等基本生理指标水平。当小鼠肿瘤生长超过1000mm3或体重下降超过15％，小鼠即安乐处死。
图18，图19显示，对于OVCAR卵巢癌模型，IFNα-ELPdiblock的治疗效果大大优于PEGASYS，IFNα-ELP(A)和IFNα，图20显示，经等剂量尾静脉注射，IFNα-ELPdiblock组的40％的小鼠肿瘤被治愈，均未见复发。与之相比，PEGASYS,IFNα-ELP(A),IFNα组治愈率分别为10％，0％和0％。综上所述，这些体内抗肿瘤数据表明超分子IFNα-ELPdiblock偶联物温度响应性自组装体可以显著提高IFNα在小鼠体内的药效动力学表现。能够有效地治愈或抑制肿瘤的生长，具有非常好的体内抗肿瘤活性。图18显示了IFN-ELP抑制肿瘤生长情况，图19为小鼠肿瘤生长实物图，图20显示了注射药物后小鼠的生存曲线。
图21显示，所有组裸鼠都没有观察到明显的体重变化，表明IFNα-ELPdiblock没有明显的副作用。图22H&E染色表明IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、PEGASYS、IFNα对主要器官如心、肝、脾、肺、肾都没有引起明显的组织学改变。表明IFNα-ELPdiblock不会对体内器官造成明显毒性，为未来用于临床使用提供了基础。图23血液生化分析进一步证实了上述结果，与生理盐水组相比，IFNα-ELPdiblock、IFNα-ELP(A)、PEGASYS、IFNα都没有引起所有血常规标志物水平的显著变化。图21显示了注射药物后裸鼠体重随时间的变化情况。图22显示了注射药物后裸鼠各主要器官组织学改变。图23显示了小鼠注射药物后心脏(乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶)、肝(谷丙转氨酶、谷草转氨酶)、肾(肌酐、尿素氮)功能生理指标变化情况和血液指标(红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白)变化情况。
综上所述，本发明实施例创新性地提出了一种环境刺激响应性蛋白质-高分子偶联物自组装体IFNα-ELPdiblock，通过基因工程技术或化学合成方法将药用蛋白与两个或两个以上响应性高分子顺序性偶联，得到药用蛋白-多嵌段响应性高分子偶联物。调控其性质在达到一定响应条件时可发生自组装形成胶束。由于形成胶束增大了药物尺寸，而且紧密排列的胶束结构更难被体内的酶降解，保持了其在体内运输过程中的稳定性，同时大大延长了在血液循环中的存留时间，延长了循环半衰期，而纳米尺度的蛋白质-高分子偶联物已被证实可由高渗透性与滞留(EPR)效应被动靶向到达肿瘤细胞发挥作用。因此，环境刺激响应性蛋白质-高分子偶联物自组装体IFNα-ELPdiblock可大大提高循环半衰期短的药用蛋白的药代动力学性能并提高药用蛋白的稳定性和活性。表现出大大增强的肿瘤聚集，提高疗效而且显著提高了小鼠的生物安全性。这种环境刺激响应性的蛋白质-高分子偶联物智能药物递送体系适用于很多药用蛋白、酶和高分子，不仅可减少给药频率，还可极大提高蛋白药物稳定性、蛋白活性和治疗效果，同时降低毒副作用，从而大大提高患者的生活质量。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京大学医学部
<120> 一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用
<130> KHP191111334.4
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcattggtgt gccggggatc ggtgttccgg gc 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagcccggaa caccgatccc cggcacacca at 32
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgcaggtgt gccgggcgcg ggtgttccgg gcgcaggtgt cccgggc 47
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcccggga cacctgcgcc cggaacaccc gcgcccggca cacctgc 47
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagatagagg agtacatatg ggctgtgatc tgcctcagac tcatt 45
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttccgctga aggcagagag ccaccgccac cggatccttc tttagaacgc aggctct 57
<210> 7
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu
1 5 10 15
Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys
20 25 30
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Gly Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala
165 170 175
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly
180 185 190
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
195 200 205
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
210 215 220
Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
225 230 235 240
Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala
245 250 255
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly
260 265 270
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
275 280 285
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
290 295 300
Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
305 310 315 320
Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala
325 330 335
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly
340 345 350
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
355 360 365
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
370 375 380
Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
385 390 395 400
Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
405 410 415
Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
420 425 430
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
435 440 445
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
450 455 460
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
465 470 475 480
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
485 490 495
Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
500 505 510
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
515 520 525
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
530 535 540
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
545 550 555 560
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
565 570 575
Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
580 585 590
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
595 600 605
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
610 615 620
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
625 630 635 640
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Tyr
645 650

Claims (18)

1.一种环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体，其特征在于，所述载体由两个或两个以上环境刺激响应性蛋白、多肽和/或化学高分子聚合物顺次偶联并自组装得到。
2.根据权利要求1所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体，其特征在于，环境刺激响应性包括能够对温度、酶、pH、光、静电、磁场和/或化学物质作用下发生环境刺激敏感响应；
所述环境刺激响应性蛋白包括温度响应性类弹性蛋白多肽ELP；所述环境刺激响应性化学高分子聚合物包括聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯、聚2-羟丙基甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇接枝聚合物、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(N，N-乙基甲基丙烯酰胺)、聚乙烯甲醚、聚(N-乙烯基己内酰胺)、聚(丙烯氧化物)、具有生物相容性和生物可降解性天然大分子和含有氨基酸基团的温敏性聚合物的至少一种。
3.根据权利要求2所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体，其特征在于，所述环境刺激响应性蛋白为类弹性蛋白多肽ELP，其为重复氨基酸序列(XGVPG)n，其中，n为不小于18的整数，X是除脯氨酸以外的任何一种氨基酸。
4.根据权利要求3所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体，其特征在于，由两个或两个以上嵌段组成，对于每个嵌段18≤n≤200；所述类弹性蛋白多肽ELP的响应温度为10-70℃；
优选地，所述两嵌段类弹性蛋白多肽的响应温度分别为10-25℃和35-70℃，并且嵌段偶联后发生环境响应自组装的温度为20-36℃；优选地，n为48-120的整数，1：2≤(n亲水段：n疏水段)≤2：1，X是异亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸。
5.一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体，其特征在于，所述蛋白质高分子偶联物由蛋白质类物质和顺次与其偶联的权利要求1-4任一所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体构成。
6.根据权利要求5所述的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体，其特征在于，所述的蛋白质类物质选自医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体；所述的蛋白质类物质的分子量为1000-300000Da。
7.根据权利要求6所述的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体，其特征在于，所述蛋白质类物质为胰岛素，单克隆抗体，血液因子，集落刺激因子，生长激素，白介素，生长因子，治疗性疫苗，降钙素，肿瘤坏死因子和酶类。
8.根据权利要求5-7任一所述的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体，其特征在于，所述蛋白质类物质为天冬酰胺酶、谷氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶，表皮生长因子EGF、胰岛素样生长因子IGF、转化生长因子TGF、神经生长因子NGF、血小板衍生的生长因子PDGF，骨形态发生蛋白BMP，成纤维细胞生长因子、生长抑素、生长激素、生长激素、生长激素抑制素、甲状旁腺激素、集落刺激因子CSF、凝血因子、肿瘤坏死因素、干扰素、白细胞介素、胃肠肽、血管活性肠肽VIP、肠促胰酶肽CCK，胃泌素，促胰液素、促红细胞生成素、瘦素、荷尔蒙、抗利尿激素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺激素释放激素TRH、促甲状腺激素、促黄体生成激素、促黄体激素释放激素LHRH、组织型纤溶酶原激活剂、白细胞介素-1、白细胞介素-15、受体拮抗剂IL-1RA、胰高血糖素样肽-1及其类似物、瘦素、生长素、粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF、白细胞介素-2、腺苷脱氨酶、尿酸酶、天冬酰胺酶、人生长激素、天冬酰胺酶；巨噬细胞活化、绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、逆转录病毒载体、松弛肽、环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体、水蛭素中的至少一种。
9.权利要求1-4任一所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体、或权利要求5-8任一所述的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体在制备药物中的应用。
10.一种药物，含有权利要求5-8任一所述的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体。
11.一种干扰素药物，其特征在于，包括由干扰素多肽和权利要求1-4任一项所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体组成的偶联物，所述干扰素多肽与所述环境刺激响应性自组装的蛋白药物递送载体可操作地相关联。
12.根据权利要求11所述的干扰素药物，其特征在于，所述偶联物的氨基酸序列包括如下任一氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO.7所示氨基酸序列；
(2)如SEQ ID NO.7所示的序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的多肽的氨基酸序列；
(3)与如SEQID NO.7所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列。
13.编码权利要求1～4任一项所述的环境刺激响应性蛋白药物递释载体或权利要求5-8任一所述的环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物或权利要求11或12所述干扰素药物的核酸。
14.含有权利要求13所述核酸的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或细胞系。
15.权利要求13所述的核酸或权利要求14所述的生物材料在制备蛋白质或多肽类药物中的应用。
16.如权利要求9或15所述的应用，其特征在于，所述药物为预防或治疗肿瘤、组织器官病变、免疫性疾病、代谢性疾病的药物。
17.一种环境刺激响应性自组装的蛋白药物的制备方法，其特征在于，通过基因工程技术将权利要求1-4任一所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体与药用蛋白的C末端融合表达，得到环境刺激响应性自组装的蛋白药物。
18.权利要求11或12所述干扰素药物的制备方法，其特征在于，包括：将编码所述由干扰素多肽和权利要求1-4任一项所述的环境刺激响应性自组装的蛋白药物递释载体组成的偶联物的核酸导入宿主细胞，表达所述偶联物，经提取和纯化制备得到。
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