CN1957092A - P53野生型作为使用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗的生物标志 - Google Patents

Abstract

提供了用于确定增殖性疾病如癌症对治疗剂、尤其是与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂敏感性的生物标志，其中所述细胞毒剂尤其是破坏或影响DNA完整性的细胞毒剂。

Description

P53野生型作为使用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗的生物标志

本发明涉及用于确定增殖性疾病如癌症对治疗剂、尤其是与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂敏感性的生物标志。

大量的mTOR抑制剂具有有效的抗增殖特性，这使得它们可用于癌症的化疗，特别是实体瘤的化疗，尤其是晚期实体瘤的化疗。如WO 02/66019所公开，mTOR抑制剂也已经与某些细胞毒剂组合使用以进一步改善治疗效果或降低副作用。然而，仍然需要更多的基于mTOR抑制剂的组合疗法的目标用途，其中需要鉴定对该组合制剂治疗可能做出响应的患者。因此需要在例如临床检验中有用的生物标志，其能预测患者中的良性或恶性增殖性疾病如肿瘤对与细胞毒剂结合的mTOR抑制剂治疗的响应性。

已经惊奇地发现，野生型p53肿瘤抑制基因(另外也称作TP53基因)的存在是预测增殖性疾病对mTOR抑制剂和细胞毒剂组合治疗敏感性的有用生物标志。特别地，已经发现在人癌细胞系中野生型p53基因的存在与源自mTOR抑制剂与破坏或影响DNA完整性的细胞毒剂组合治疗的细胞杀伤/编程性细胞死亡/细胞凋亡增加十分相关。因此，当用于治疗保留野生型p53的癌细胞时，与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂更有可能表现出更显著的抗增殖/细胞杀伤作用。p53蛋白质(由TP53基因编码)是肿瘤抑制物，其在哺乳动物细胞的细胞周期停滞、衰老、分化和编程性细胞死亡/细胞凋亡的调节中发挥重要作用。特别地，p53通路在暴露于压力(例如DNA破坏、致癌压力、低氧、缺乏存活信号)的哺乳动物细胞中诱导细胞周期停滞和/或细胞凋亡。在所有的人类癌症中，有大约一半存在TP53突变，并且在许多癌细胞中诱导p53响应的能力较差(Vousden和Lu，NatureReviews，2002，2：594-604)。人p53的序列(mRNA[编码序列；1182个核苷酸]和蛋白质[393个氨基酸])可以从GenBank登录号NM 000546或者P04637获得。人TP53基因的完整序列可以从GenBank登录号U94788获得。

因此，本发明基于对倾向于异常增殖细胞中野生型p53(TP53)基因存在的确定。

本发明在一个方面提供了野生型p53(TP53)基因的存在(与p53[TP53]基因缺乏、缺少和缺失或突变的p53[TP53]基因的存在相对)作为用于确定增殖性疾病对与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗敏感性的生物标志的用途。

野生型p53(TP53)基因意味着不仅指内含子和外显子，还指与内含子和外显子相关或物理上接近的调节区、尤其是最5’端外显子的5’端的那些调节区。其包括例如天然基因的全长DNA序列以及任选地密码子的核苷酸取代(包括倒位)、插入和缺失，其前提条件是其表达野生型p53蛋白质或其功能等效物，例如保留其诱导细胞凋亡特性的功能性p53蛋白质。相反地，p53(TP53)基因的缺乏、缺少、缺失或突变是指导致p53(TP53)基因表达丧失或者突变基因表达的遗传和外遗传改变，例如扩增、甲基化、多态性、核苷酸突变、缺失、倒位、移位和杂合性丢失(LOH)，其中突变基因的表达造成例如不再保留诱导细胞凋亡特性的突变p53蛋白质的表达。

还在另一方面，本发明提供了确定受试者中增殖性疾病对与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗敏感性的方法，其包括确定来自受试者的样品中p53(TP53)状态(野生型对突变体或缺少/缺乏)。

在另一方面，本发明提供了选择患有增殖性疾病的受试者用于进行与细胞毒剂结合的mTOR抑制剂治疗的方法，其包括通过上述方法确定每一位受试者中增殖性疾病对组合治疗的敏感性，以及选择保留野生型p53(TP53)基因的受试者用于进行所述组合治疗。

如此处使用的术语“mTOR抑制剂”包括但不限于雷帕霉素(西罗莫司)或其衍生物。雷帕霉素是已知由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的大环内酯抗生素。适宜的雷帕霉素衍生物包括例如式A的化合物或者当R_2aa为-CH₂-CH₂-OH时的其前体药物，例如其可生理水解醚。

其中：

R_1aa为CH₃或C_3-6炔基，

R_2aa为H或-CH₂-CH₂-OH、3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基-丙酰基或四唑基，并且

X_aa为＝O、(H，H)或(H，OH)，

条件是当X_aa为＝O且R_1aa为CH₃时R_2aa不是H。

式A化合物公开于例如WO 94/09010、WO 95/16691、WO 96/41807、USP 5,362,718或WO 99/15530中，其在此引用作为参考。它们可通过如所公开制备或者通过与这些参考文献中所述类似的方法制备。

式A的代表性雷帕霉素衍生物为例如32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32(S或R)-二氢-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32(S或R)-二氢-40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯基]-雷帕霉素(也称为CCI779)或者40-表-(四唑基)-雷帕霉素(也称为ABT578)。优选的化合物为例如WO 94/09010中实施例8公开的40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素，或WO 96/41807中公开的32-脱氧雷帕霉素或16-戊-2-炔基氧-32(S)-二氢-雷帕霉素。雷帕霉素衍生物还包括如WO 98/02441和WO01/14387中公开的所谓的雷帕霉素类似物(rapalog)，例如AP23573、AP23464、AP23675或AP23841。其他雷帕霉素衍生物的例子为所公开的TAFA-93(雷帕霉素前体药物)、biolimus-7或biolimus-9。

在每一次引用专利申请或科学出版物的情况下，涉及化合物的主旨在此引入本申请作为参考。同样还包括其可药用盐、相应的外消旋物、非对映异构体、对映体、互变异构体，以及如果存在例如此处所公开的溶剂合物、水合物和多晶型物的情况下上面所公开化合物的相应晶体变型。用作本发明组合的有效成分的化合物可如引用文献所述分别制备和施用。

如此处使用的术语“细胞毒剂”为对细胞结构和功能有害的制剂，例如破坏或影响DNA完整性并可最终造成细胞死亡的制剂，例如抗肿瘤药物，比如微管活性剂，或者尤其是破坏DNA的药物，例如抗肿瘤抗代谢物、铂化合物、烷化剂、或者拓扑异构酶I或II抑制剂。术语“细胞毒剂”也包括造成DNA破坏的辐射处理，例如电离辐射，如放射性碘。这种辐射处理也可与细胞毒剂治疗组合使用。术语“细胞毒剂”也包括一种、两种或更多种可以“鸡尾酒”疗法施用的细胞毒剂。

如此处使用的术语“拓扑异构酶I抑制剂”包括但不限于拓扑替康、伊立替康、gimatecan、9-硝基喜树碱和大分子喜树碱缀合物PNU-166148(WO99/17804中的化合物A1)。可以施用例如以商标CAMPTOSAR^TM所销售的伊立替康。可以施用例如以商标HYCAMTIN^TM所销售的拓扑替康。

如此处使用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括但不限于安慈那环素，如阿霉素(包括脂质体制剂，例如CAELYX^TM)、柔红霉素、表阿霉素、去甲柔毛霉素和奈莫柔比星；蒽醌类的米托蒽醌和洛索蒽醌以及鬼臼毒素类的依托泊苷和替尼泊苷。可以施用例如以商标ETOPOPHOS^TM所销售的依托泊苷。可以施用例如以商标VM 26-BRISTOL^TM所销售的替尼泊苷。可以施用例如以商标ADRIBLASTIN^TM所销售的阿霉素。可以施用例如以商标FARMORUBICIN^TM所销售的表阿霉素。可以施用例如以商标ZAVEDOS^TM所销售的去甲柔毛霉素。可以施用例如以商标NOVANTRON^TM所销售的米托蒽醌。

术语“微管活性剂”涉及微管稳定剂和微管去稳定剂，这包括但不限于紫杉类，例如紫杉醇和多西他赛；长春花生物碱，例如长春花碱，特别是硫酸长春花碱、长春花新碱，特别是硫酸长春花新碱、和长春烯碱；discodermolide和埃博霉素及其衍生物，例如埃博霉素B或其衍生物。可以施用例如以商标TAXOL^TM所销售的紫杉醇。可以施用例如以商标TAXOTERE^TM所销售的多西他赛。可以施用例如以商标VINBLASTINR.P.^TM所销售的硫酸长春花碱。可以施用例如以商标FARMISTIN^TM所销售的硫酸长春花新碱。Discodermolide可如US 5,010,099所公开获得。

如此处使用的术语“烷化剂”包括但不限于环磷酰胺、异环磷酰胺、马法兰或亚硝基脲(BCNU或Gliadel^TM)。可以施用例如以商标CYCLOSTIN^TM所销售的环磷酰胺。可以施用例如以商标HOLOXAN^TM所销售的异环磷酰胺。

术语“抗肿瘤抗代谢物”包括但不限于5-氟尿嘧啶、喃氟啶、卡培他滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶核苷、吉西他滨、6-巯基嘌呤、羟脲、氨甲喋呤、依达曲沙和此类化合物的盐，并且还包括ZD1694(RALTITREXED^TM)、LY231514(ALIMTA^TM)、LY264618(LOMOTREXOL^TM)和OGT719。可以施用例如以商标XELODA^TM所销售的卡培他滨。可以施用例如以商标GEMZAR^TM所销售的吉西他滨。

如此处使用的术语“铂化合物”包括但不限于碳铂、顺铂和奥沙利铂。可以施用例如以商标CARBOPLAT^TM所销售的碳铂。可以施用例如以商标ELOXATIN^TM所销售的奥沙利铂。

增殖性疾病可为良性或者恶性增殖性疾病，例如良性前列腺增生，或者肿瘤疾病，优选地是恶性增殖性疾病，例如癌症如肿瘤和/或转移瘤(不管曾经位于何处)，例如脑和其他中枢神经系统肿瘤(例如脑膜、脑、脊髓、脑神经和中枢神经系统其他部位的肿瘤，例如成胶质细胞瘤或髓质母细胞瘤)；头部和/或颈部癌症；乳腺肿瘤；循环系统肿瘤(例如心脏、纵隔和胸膜，以及其他胸内器官、血管肿瘤和肿瘤相关的血管组织)；排泄系统肿瘤(例如肾、肾盂、输尿管、膀胱、其他和未指明的排尿器官)；胃肠道肿瘤(例如食管、胃、小肠、结肠、结肠直肠、直肠乙状结肠连接处、直肠、肛门和肛管)；涉及肝和肝内胆管、胆囊和肝道的其他和未指定部位、胰、其他和消化器官的肿瘤；头部和颈部；口腔(唇、舌、牙龈、口腔底、腭、以及口腔的其他部位、腮腺，以及唾液腺的其他部位、扁桃体、口咽、鼻咽、梨状窝、下咽部，以及唇、口腔和咽的其他部位)；生殖系统肿瘤(例如外阴、阴道、子宫颈、子宫体、子宫、卵巢，以及其他与雌性生殖器官相关的部位，胎盘、阴茎、前列腺、睾丸，以及其他与雄性生殖器官相关的部位)；呼吸道肿瘤(例如鼻腔和中耳、副鼻窦、喉、气管、支气管和肺，例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)；骨骼系统肿瘤(例如骨和四肢的关节软骨、骨关节软骨和其他部位)；皮肤肿瘤(例如恶性皮肤黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、间皮瘤、卡波西肉瘤)；和涉及其他组织的肿瘤，包括周围神经和自主神经系统、结缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼及附属器官、甲状腺、肾上腺和其他内分泌腺以及相关结构、淋巴结的继发恶性肿瘤和未指定恶性肿瘤、呼吸系统和消化系统继发恶性肿瘤以及其他部位的继发恶性肿瘤、血液和淋巴系统肿瘤(例如何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS相关的淋巴瘤、恶性免疫增殖性疾病、多发性骨髓瘤和恶性浆细胞瘤、淋巴细胞白血病、急性或慢性粒细胞白血病、急性或慢性淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、其他未指定细胞类型的白血病、未指定细胞类型的白血病，淋巴组织、造血组织和相关组织的其他和未指定的恶性肿瘤，例如弥漫型大细胞性淋巴瘤、T细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤)。骨髓癌症包括例如急性或慢性粒细胞白血病。

无论肿瘤和/或转移灶的部位如何，在上文和随后提到肿瘤、肿瘤疾病、癌或癌症的地方，也备选地或额外地意指最初器官或组织和/或任何其他部位的转移灶。

在淋巴癌或骨髓癌的情况下，术语细胞毒剂还可为例如白消安、阿糖胞苷、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨、羟脲、普鲁苄肼、博莱霉素或甲氨喋呤。在淋巴癌或骨髓癌的情况下，优选作为细胞毒剂的是拓扑异构酶II抑制剂，例如道诺红霉素或去甲柔毛霉素或者，尤其是靶向、降低或抑制PDGFR或c-AbI家族成员和其基因融合产物活性的化合物，例如伊马替尼、法尼基转移酶抑制剂、Ara-C、VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌、碳铂或midostaurine。

根据本发明的方法，可筛选患此类增殖性疾病的受试者以预测他们对mTOR抑制剂与细胞毒剂组合治疗的敏感性。此方法可在体外进行，例如在来自受试者的生物组织样品上进行。样品可为从哺乳动物体分离的任何生物材料，如组织、细胞系、血浆或血清、细胞或组织裂解物，优选地为肿瘤组织。

通过基于例如遗传和后遗传变化的DNA分析的任何技术方法，例如对扩增、甲基化、多态性、核苷酸突变(例如密码子175Arg、245Gly、248Arg、249Arg、273Arg、282Arg和其他的突变)、核苷酸缺失、倒位和/或移位和杂合性丢失(LOH)的DNA扫描，分析生物样品的p53(TP53)基因的状态。可通过基于如RNA表达或基于如蛋白质表达/修饰的任何技术分析生物样品的p53(TP53)状态，其中基于RNA表达的技术使用如RNA印迹或RT-PCR技术，基于蛋白质表达/修饰的技术使用如蛋白质印迹、免疫组化或ELISA技术，包括免疫测定法、免疫沉淀和电泳测定法。

例如，可在标准的免疫测定法形式中使用对p53蛋白质或p53翻译后修饰，如磷酸化(例如Ser46的磷酸化)、泛素化或乙酰化特异的抗体以测量p53蛋白质/磷酸化/泛素化/乙酰化水平。使用如单克隆抗体或多克隆抗体的ELISA(酶联免疫吸附测定法)类型测定法、免疫沉淀类型测定法、常规的蛋白质印迹测定法和免疫组化测定法也可用于测定作为生物标志的p53蛋白质/转录后修饰的水平。

对p53蛋白质/转录后修饰特异的多克隆和单克隆抗体可根据已知的免疫方法产生或商业购买(例如Santa Cruz Biotechnology Inc目录号sc6253)。

也可通过双向(2-D)凝胶电泳测量p53状态。2-D凝胶电泳为本领域已知并且一般包括沿第一向的等电聚焦(IEF)和随后沿第二向的SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。例如，使用抗体通过免疫印迹分析得到的电泳图。

本发明因此提供了选择患有增殖性疾病的患者以预测他们对用mTOR抑制剂和细胞毒剂组合治疗响应性的方法，其包括通过上述方法确定p53(TP53)状态。

在另一方面，本发明提供了治疗需要其的受试者中的增殖性疾病的方法，其包括通过上述方法确定来自受试者的样品中p53(TP53)基因的状态或p53表达和/或翻译后修饰的水平，以及用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗受试者。

在备选的实施方案中，本发明提供了在需要其的受试者中提高细胞毒剂活性或克服对细胞毒剂抗性的方法，其包括通过上述方法确定来自受试者的样品中p53(TP53)基因状态/表达，以及向该受试者并行或按顺序施用治疗有效量的mTOR抑制剂与所述细胞毒剂。

来自受试者特定组织如肿瘤组织样品中的p53(TP53)状态可与对照样品如来自未患此疾病的受试者的正常组织样品或者来自同一受试者的正常(即非肿瘤)组织样品比较。需要组合使用mTOR抑制剂和细胞毒剂的p53(TP53)野生型状态水平预示着mTOR抑制剂和细胞毒剂组合治疗具有有益治疗作用(即抗增殖作用和/或提高的细胞杀伤作用)。

此外，可使用此方法帮助选择细胞毒剂和/或mTOR抑制剂的适当剂量以便为每一个患者优化治疗。取决于患者中p53野生型状态，可使用较低剂量的组合中的有效成分，例如剂量需要不仅通常较小而且应用频率较低，或者可使用较低剂量以便在控制不需要的增殖的同时降低副作用的发生率。本文考虑的因素包括被治疗的特定疾病、被治疗的特定哺乳动物、各个患者的临床状况、活性化合物的递送部位、活性化合物的特定类型、施用方法、施用的时间安排、疾病的严重性和医务人员已知的其他因素。

如此处使用的术语“组合治疗”或“与……组合”或“与……结合”等等是指包括给单个患者施用所选则的mTOR抑制剂和细胞毒剂，并且旨在包括制剂不必通过相同施用途径或在同一时间施用的治疗方案。例如，可以单独实体同时地、并行地或顺序地向患者施用mTOR抑制剂和细胞毒剂，而没有特定时间限制，其中此类施用提供了两种化合物在体内的治疗有效水平。

可通过上面提到的考虑因素控制待施用组合的每一活性成分的治疗有效量，并且为预防、改善或治疗疾病的最小量。此量优选地低于对宿主有毒性或使宿主明显更易感的量。

如WO 02/66019中公开，适当的mTOR抑制剂剂量为例如大约0.1-30mg级别的日剂量率，例如作为单剂量或分次剂量或间歇(例如一周一次)口服大约0.05-20mg活性成分。可通过任何常规途径施用雷帕霉素或其衍生物，例如式A的化合物，尤其是以如片剂、胶囊剂、口服溶液形式经肠施用，如口服，或者以含如大约0.1％-大约99.9％、优选大约1％-大约60％有效成分的注射溶液或混悬液形式经肠胃外施用。

可以大约1-5mg/m²/天的剂量范围向人施用拓扑替康。可以大约50-350mg/m²/天的剂量范围向人施用伊立替康。

可以大约50-300mg/m²/天的剂量范围向人施用紫杉醇。可以大约25-100mg/m²/天的剂量范围向人施用多西他赛。

可以大约50-1500mg/m²/天的剂量范围向人施用环磷酰胺。可以大约0.5-10mg/m²/天的剂量范围向人施用马法兰。

可以大约50-1000mg/m²/天、如500mg/m²/天的剂量范围向人施用5-氟尿嘧啶。可以大约10-1000mg/m²/天的剂量范围向人施用卡培他滨。可以大约1000mg/m²/周的剂量范围向人施用盐酸吉西他滨。

可以大约每四周大约200-400mg/m²的剂量范围向人施用碳铂。可以大约每三周大约25-75mg/m²的剂量范围向人施用顺铂。可以大约每两周大约50-85mg/m²的剂量范围向人施用奥沙利铂。

可以大约2.5-850mg/天、更优选5-600mg/天和最优选20-300mg/天的剂量范围向人施用伊马替尼。

在根据本发明的方法中使用的优选组合为例如雷帕霉素、40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯基]-雷帕霉素或40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素与细胞毒剂如吉西他滨或顺铂的组合。如上文所公开，在根据本发明的方法中使用的备选组合为起增效作用数量的mTOR抑制剂与细胞毒剂如吉西他滨或顺铂的组合。

优选地，TP53为人基因。

本发明的方法优选地在呈现p53(TP53)野生型状态的的肿瘤细胞上进行。

在另一个实施方案中，惊奇地发现，在p53(TP53)野生型细胞中用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗所引起的增加的细胞杀伤/编程性细胞死亡/细胞凋亡与细胞毒性诱导的p21^Waf1/Cip1(也称作CDKN1A、WAF1、CIP1、SDI1、CAP20、MDA-6、p21)蛋白质(此后称为p21)表达上调的强烈弱化有关。

p21为细胞周期蛋白激酶“抑制剂”cip/kip家族的成员，其在允许细胞周期通行以及阻止细胞凋亡中发挥作用。在本发明的背景中，p21作为对胁迫信号例如DNA损伤的响应、对活化p53的响应而使细胞生长停滞的功能很确定。的确，可以假设增加的p21蛋白质表达允许此类受胁迫细胞存活，例如允许细胞完成DNA修复过程。由此，作为对细胞毒素处理做出响应而削弱p21表达的增加可促进细胞杀伤/编程性细胞死亡/细胞凋亡(Weiss，Cancer Cell，2003，4：425-429)。人p21的序列(mRNA[编码序列：495个核苷酸]和蛋白质产物[164个氨基酸])可以从GenBank登录号NM000389、NM 078467或AAH01935获得。人p21基因的完整序列可以从GenBank登录号NM 078467获得。

此外，一些癌症患者具有增加的总的或胞质肿瘤p21表达，其与预后较差和对化学治疗响应性较差关联(Weiss，见上)。评价癌症患者中基础p21表达也可用于选择进行特定化学疗法治疗、例如基于与一种或多种细胞毒剂和任选放疗组合的mTOR治疗的患者。

因此，本发明还提供：

i.p21用作确定受试者的增殖性疾病对与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗敏感性或响应性的生物标志的用途；

ii.选择患有增殖性疾病的受试者用于使用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗的方法，其包括通过上述方法确定每一个受试者中增殖性疾病对使用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗的敏感性，以及选择对组合治疗表现出基础p21表达增加的那些受试者；

iii.确定受试者中的增殖性疾病对使用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗敏感性或响应性的方法，其包括在单独用细胞毒剂治疗和细胞毒剂与mTOR抑制剂组合治疗之前和/或之后确定来自受试者的样品中p21表达水平；

iv.在用细胞毒剂治疗的受试者中提高该细胞性剂活性或克服对细胞毒剂抗性的方法，其包括：

-通过上述方法确定来自受试者的样品中p21表达水平，

-如果在施用细胞毒剂之后p21表达上调，则向该受试者施用治疗有效量的与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂，

-用mTOR抑制剂和细胞毒剂组合治疗之后再次确定来自受试者的新样品中p21表达的水平，和

-如果p21表达下调，则再用mTOR抑制剂与所述细胞毒剂并行或按顺序治疗受试者。

如上面已经提到，如上面针对p53所公开确定p21蛋白质水平；然而，应当理解，使用p21特异性抗体而不是p53特异性抗体，例如商业购买的单克隆或多克隆抗体(例如Oncogene Research products，Clone EA10，目录号OP64)。

受试者特定组织如肿瘤组织样品中的水平可与对照样品如未患此疾病的受试者正常组织样品或同一受试者的正常(即非肿瘤)组织样品比较。p21表达诱导的缺乏或削弱(当用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂的治疗与单独用细胞毒剂治疗所诱导的p21表达相比)预示着与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂具有有益治疗作用(即抗增殖/细胞杀伤作用)。评价细胞毒剂对p21表达的诱导和/或mTOR抑制剂对p21表达的反作用也可用于调整细胞毒剂的剂量，如降低细胞毒剂量。

本实施例举例说明本发明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

在96孔板中以每孔2×10³个细胞/100μl的密度接种p53(TP53)野生型人腺癌A549(CCL-185)肿瘤细胞(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD.，USA)并在37℃和5％CO₂条件下孵育24小时。用与20nM 40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素或媒介物对照DMSO组合的亚最佳浓度的吉西他滨(例如5-17.5nM)再孵育细胞72小时。在细胞中加入YO-PRO染料(YO-PRO^R-1碘化物[491/509]，目录号Y3603，Molecular Probes)并用Cytofluor II荧光板读取仪测定细胞死亡或细胞毒性，并在细胞裂解之后测定相对细胞增殖。在该测定法中，mTOR抑制剂，如40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素显著(在统计学上)增强了亚最佳浓度吉西他滨细胞的杀伤作用(p＜0.05；ANOVA，Tukey检验)。当使用人肺腺癌A549以外的p53（PT53)野生型细胞系如人MCF7乳腺癌细胞(HTB-22；美国典型培养物保藏中心)时获得与上面公开类似的结果。

然而，用p53(TP53)突变/缺乏的肿瘤细胞系，如PC3M人前列腺癌细胞(以0.8×10³个细胞/100μl的密度接种)或MDA-MB231人乳腺癌细胞(以2×10³个细胞/100μl的密度接种；HTB-26；美国典型培养物保藏中心)重复该过程。在p53(TP53)突变/缺乏的细胞系中没有见到细胞死亡的显著增强或一致增强。

以每个10cm平板0.1×10⁶个细胞/10ml的密度接种A549细胞并在37℃和5％CO₂条件下孵育24小时。周与20nM 40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素或媒介物对照DMSO组合的亚最佳浓度的吉西他滨(例如5-12.5nM)再孵育细胞72小时。通过8％SDS-PAGE电泳分离相当于50μg总蛋白的细胞提取物并周抗聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的兔多克隆抗体(CellSignalling Technology目录号9542)进行免疫印迹分析。在该测定法中，mTOR抑制剂如40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素的存在(与相同浓度的单独的吉西他滨或mTOR抑制剂相比)导致在亚最佳吉西他滨浓度时的PARP切割(细胞凋亡的标志)增加。这验证了上面的结果，即在p53(TP53)野生型A549细胞中mTOR抑制剂的存在导致在亚最佳吉西他滨浓度时的细胞死亡水平更高。

实施例2

在96孔板中以每孔5×10³个细胞/100μl的密度接种p53(TP53)野生型人肺腺癌A549细胞并在37℃和5％CO₂条件下孵育24小时。用与20nM40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素或与媒介物对照DMSO组合的亚最佳浓度的顺铂(例如3-10μg/ml)再孵育细胞24小时。如上开展YO-PRO^测定法以测定细胞死亡或细胞毒性并在细胞裂解后测定相对细胞增殖。在该测定法中，mTOR抑制剂，如40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素显著(在统计学上)增强了亚最佳浓度顺铂的细胞杀伤作用(p＜0.05；ANOVA，Tukey检验)。随后用双因素ANOVA分析表明RAD001和顺铂的相互作用很显著(p＜0.001)。当使用人肺腺癌A549以外的p53(PT53)野生型细胞系如人MCF7乳腺癌细胞时获得与如上公开类似的结果。在用人MCF7乳腺癌细胞的的情况中，与化合物的孵育时间为30小时。

然而用p53(TP53)突变/缺乏的肿瘤细胞系，如PC3M(以3×10³个细胞/100μl的密度接种)或DU145(以5×10³个细胞/100μl的密度接种；HTB-81；美国典型培养物保藏中心)重复该过程。在这种情况中与化合物的孵育时间为22小时(对于DU145)或者30小时(对于PC3M)。在p53(TP53)突变/缺乏的肿瘤细胞系中没有见到细胞死亡的显著增强或一致增强。

以每个10cm平板0.1×10⁶个细胞/10ml的密度接种A549细胞并在37℃和5％CO₂条件下孵育24小时。用与20nM 40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素或媒介物对照DMSO组合的亚最佳浓度的顺铂(例如0.5-4μg/ml)再孵育细胞24小时。通过8％SDS-PAGE电泳分离相当于50μg总蛋白的细胞提取物并用抗聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和p53的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析。在该测定法中，mTOR抑制剂如40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素的存在(与相同浓度的单独的顺铂或mTOR抑制剂相比)导致在亚最佳顺铂浓度时的PARP切割(细胞凋亡的标志)增加。这验证了上面的结果，即在p53(TP53)野生型A549细胞中mTOR抑制剂的存在导致在亚最佳顺铂浓度时的细胞死亡水平更高。

p53(TP53)状态预测了如受试者中肿瘤对mTOR抑制剂和细胞毒剂组合的敏感性。如所公开，可使用从肿瘤组织获得的DNA、RNA或蛋白质评价p53状态以预测对mTOR抑制剂和细胞毒剂组合的可能的响应性。

实施例3

分别以每个6cm平板0.3×10⁶和0.4×10⁶个细胞/4ml的密度接种p53(TP53)野生型A549和MCF7细胞，并在37℃和5％CO₂的条件下孵育24小时。用与20nM 40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素或媒介物对照DMSO组合的亚最佳浓度的顺铂(例如0.5-4μg/ml)再分别孵育细胞24小时和30小时。在15％SDS-PAGE电泳分离相当于30μg总蛋白的细胞提取物并用抗p21的小鼠多克隆抗体(Oncogene Research Products，Clone EA10，目录号OP64)进行免疫印迹分析。单独的顺铂在两个细胞系中都以浓度依赖的方式诱导了p21蛋白质表达增加。mTOR抑制剂如40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素的存在显著削弱了顺铂诱导的p21蛋白质表达上调。与之相反，p53调节的促细胞凋亡蛋白质-Bax蛋白质的表达未受单独制剂或组合制剂的影响。在该测定法中，mTOR抑制剂的存在抑制了细胞毒性诱导的p21蛋白质的表达。这可以解释使用顺铂和mTOR抑制剂组合所导致的细胞杀伤/细胞凋亡响应性的增强。

实施例4

以每个6cm平板0.1×10⁶个细胞/5ml的密度接种p53(TP53)野生型A549细胞并在37℃和5％CO₂的条件下孵育24小时。细胞不经转染或使用Oligofectamine(Invitrogen，目录号12252-011)用100nM的靶向人p53(登录号：NM000546；靶序列：5’-GCA TCT TAT CCG AGT GGAA-3’)的siRNA或靶向LacZ(登录号：M55068；靶序列：5’-GCG GCT GCCGGA ATT TAC CTT-3’)对照siRNA转染。孵育30小时之后，用浓度逐渐增加的顺铂(例如0.5-6μg/ml)再孵育细胞24小时。用15％(p21)和10％(p53和PARP)SDS-PAGE电泳分离相当于30μg(p21)和50μg(p53和PARP)总蛋白的细胞提取物，并分别使用抗p21和p53/PARP的鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体进行免疫印迹分析。对未转染细胞或LacZ siRNA对照转染细胞用顺铂处理则以浓度依赖方式诱导p53和p21蛋白质的表达，在较高顺铂浓度下(2-6g/ml)PARP切割(细胞凋亡的标志)明显。在p53siRNA转染细胞中，出现了顺铂诱导的p53蛋白质表达的显著削弱，其与p21表达、PARP切割和细胞活力丧失的强烈弱化有关。使用靶向人p53的其他两个siRNA(靶序列：5’-GGA AGA CTC CAG TGG TAAT-3’和5’-GAT ATT GAA CAA TGG TTC A-3’)也观察到了对p53表达、p21表达和PARP切割的相同作用。这些数据直接验证了用顺铂和mTOR抑制剂组合所导致的提高的细胞杀伤/细胞凋亡响应性是通过p53依赖的机制引起的。

实施例5

以每个6cm平板0.1×10⁶个细胞/5ml的密度接种p53(TP53)野生型A549细胞并在37℃和5％CO₂的条件下孵育24小时。细胞不经转染或使用Oligofectamine(Invitrogen，目录号12252-011)用100nM靶向p21(登录号：NM000389；靶序列：5’-GTG GAC AGC GAG CAG CTG A-3’)的siRNA或靶向LacZ(如上文)的对照siRNA转染。孵育30小时之后，用亚最佳浓度的顺铂(例如1-2μg/ml)再孵育细胞24小时。分别用15％和10％的SDS-PAGE电泳分离相当于30μg(p21)和50μg(PARP)总蛋白的细胞提取物，并分别用抗p21和PARP的鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体进行免疫印迹分析。对未转染细胞或LacZ siRNA对照转染细胞用顺铂处理则以浓度依赖的方式诱导p21蛋白质的表达，PARP切割(细胞凋亡的标志)不明显。在p21siRNA转染细胞中，出现顺铂诱导的p21蛋白质表达的显著弱化，其与PARP切割的强烈诱导有关。这些数据直接验证了细胞毒性诱导的p21蛋白表达的弱化造成了用顺铂和mTOR抑制剂组合处理时细胞杀伤/细胞凋亡响应的提高。

                                 序列表

<110>诺瓦提斯公司(Novartis AG)

<120>P53野生型作为使用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗的生物标志

<130>4-33584A

<140>

<141>

<150>US 60/546,856

<151>2004-02-23

<160>5

<170>PatentIn版本3.2

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物序列

<400>1

gcatcttatc cgagtggaa                                                   19

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物序列

<400>2

gcggctgccg gaatttacct t                                                21

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物序列

<400>3

ggaagactcc agtggtaat                                                   19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物序列

<400>4

gatattgaac aatggttca                                                   19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物序列

<400>5

gtggacagcg agcagctga                                                   19

Claims (14)

1.确定具有增殖性疾病的受试者中p53(TP53)状态用作生物标志的用途，其用于确定该受试者对用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗的敏感性。

2.根据权利要求1所述的用途，其包括p53(TP53)基因分析和p53表达水平/翻译后修饰的用途。

3.确定受试者中的增殖性疾病对mTOR抑制剂和细胞毒剂组合治疗敏感性的方法，其包括确定来自受试者的样品中p53(TP53)基因的状态和/或p53的表达水平/翻译后修饰。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中增殖性疾病包括癌症。

5.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其包括确定p53(TP53)的遗传状态和/或p53的表达水平。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中样品来自受试者的肿瘤。

7.选择患有增殖性疾病的受试者用于进行mTOR抑制剂和细胞毒剂组合治疗的方法，其包括通过权利要求3-6中任一项所述的方法确定每一受试者中增殖性疾病对组合治疗的敏感性，以及选择显示为野生型p53(TP53)状态的那些受试者用于组合治疗。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中mTOR抑制剂包括雷帕霉素或雷帕霉素衍生物。

9.根据权利要求8所述的方法或用途，其中雷帕霉素衍生物包括40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素、40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯基]-雷帕霉素或40-表-(四唑基)-雷帕霉素。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中细胞毒剂选自抗肿瘤抗代谢物、铂化合物、烷化剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、微管活性剂和辐射。

11.p21用作确定受试者中增殖性疾病对与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗敏感性或响应性的生物标志的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其包括确定p21表达水平。

13.确定受试者中增殖性疾病对与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗敏感性或响应性的方法，其包括在用细胞毒剂单独治疗之后和细胞毒剂与mTOR抑制剂组合治疗之后确定来自受试者样品中的p21表达水平。

14.在用细胞毒剂治疗的受试者中提高该细胞毒剂活性或克服对该细胞毒剂抗性的方法，其包括：

-确定来自受试者样品中的p21表达水平，

-如果施用细胞毒剂之后p21表达上调，则向该受试者施用治疗有效量的与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂，

-用mTOR抑制剂和细胞毒剂组合治疗之后再次确定来自受试者的新样品中的p21表达水平，和

-如果p21表达下调，则再并行或按顺序用mTOR抑制剂与该细胞毒剂治疗受试者。