CN109517824A

CN109517824A - 一种识别靶标蛋白cd71的方法及核酸适体的应用

Info

Publication number: CN109517824A
Application number: CN201811452037.2A
Authority: CN
Inventors: 谭蔚泓; 叶茂; 张慧; 金程; 彭波
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2019-03-26
Anticipated expiration: 2038-11-30
Also published as: CN109517824B

Abstract

本发明涉及一种识别靶标蛋白CD71的方法及核酸适体的应用，具体是在制备靶标蛋白CD71制剂以及肿瘤靶向载药制剂上的应用。本发明提供了一种新的可识别细胞表面标志性蛋白的方法，由于识别的标志性蛋白CD71在多种肿瘤细胞表面高表达，因此，该核酸适体的特异性识别CD71可以用于多种肿瘤细胞的研究。由于CD71蛋白可以被细胞内化，因此，可以将靶向CD71的核酸适体作为靶向配体，与抗肿瘤药物偶联构建靶向递送系统，来实现肿瘤的靶向性治疗。

Description

一种识别靶标蛋白CD71的方法及核酸适体的应用

技术领域

本发明涉及一种靶标蛋白CD71的识别方法，以及一种核酸适体在制备识别靶标蛋白CD71制剂以及肿瘤靶向载药制剂上的应用。

背景技术

核酸适体(aptamer)是一种通过SELEX(指数富集的配体系统进化)技术从随机单链寡聚核苷酸库中筛选出来的能高亲和性结合靶分子的单链DNA或RNA。适体因其结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点，同时，相比传统抗体，适体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性。因此，适体在基础研究、临床诊断、药物研制等方面展现了广阔的应用前景。

多数肿瘤的发生与细胞膜蛋白的改变密切相关，异常的膜蛋白可作为肿瘤诊断、治疗及预后评估的理想标记分子。然而，现在临床上广泛应用的肿瘤标志分子多为分泌蛋白，细胞表面标记分子的发现由于缺少有效技术支持仍处于初级阶段。转铁蛋白受体CD71是机体介导铁代谢的重要蛋白质分子，在铁的运输、转化和利用中起着关键作用。CD71是一种介导细胞内铁摄取和调节细胞生长相关的Ⅱ型跨膜糖蛋白。它由两个同源二聚体(180kDa)的亚基通过两条二硫键交联而成组成，每个单体(含760个氨基酸，分子量为90～95kDa)包含一个大的胞外C端区域(671个氨基酸)，一个单跨膜区域(包含28个氨基酸)及一个短的N端区域(包含61个氨基酸)。在正常细胞中，CD71的表达水平较低，由于快速生长的肿瘤细胞对铁的需求量增加，肿瘤细胞(如肝癌、黑色素瘤、胰腺癌、肺腺癌、慢性淋巴细胞性白血病和非何杰金瘤)中CD71的表达显著增加。因此，CD71是一个理想的靶标，被认为是一种有效的肿瘤标志物。我们通过一系列实验证明核酸适体TY8识别细胞的机制是通过结合细胞表面的CD71蛋白，这为肿瘤的诊断和治疗研究提供了新的方法和手段。

靶向配体在抗肿瘤药物靶向传递方面有很大的应用潜能。其对靶分子结合的选择性可赋予抗癌药物靶向特异性，同时增加药物在病变组织内的富集。目前研究比较多的配体包括抗体、多肽、小分子等。抗体通常对靶点具有高亲和力，但免疫原性高。多肽分子量小且易于合成,但多肽在体循环中易于酶解，不适合在体内应用。小分子化合物，如叶酸(folic acid,FA)，分子量小，稳定性好，但对肿瘤靶向性不高，因为肾近端小管和脑血管脉络丛同样有高表达的叶酸受体。和这些配体相比，核酸适体可体外合成且易于修饰，因其带负电荷，在体循环中很少参加非特异性相互作用。同时，它们能高亲和力高特异性地结合靶分子，分子量小，使其具有很高的组织穿透性。由于CD71蛋白在很多肿瘤细胞表面都高表达而且可以连续被细胞内化，因此，我们将特异性结合CD71的核酸适体TY8作为靶向配体，与化疗药物偶联构建靶向递送系统，来实现肿瘤的靶向性治疗。

发明内容

本发明的目的是旨在克服现有的技术不足，提供一种识别靶标蛋白CD71的方法，以及在该方法中使用的核酸适体构建识别靶标蛋白CD71制剂和靶向载药制剂的应用。

一种识别靶标蛋白CD71的方法：是利用如下序列的核酸适体进行识别：

5’-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3’,SEQNO.1。

所述的方法，还可以通过对核酸适体增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体。

所述的方法，还可以将所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同结合CD71蛋白能力的核酸适体衍生物。

上述方法可以用于肿瘤细胞和正常细胞之间的差异化研究。

上述核酸适体构建识别靶标蛋白CD71制剂的应用。

上述核酸适体构建靶向载药制剂的应用。进一步的是用于构建肿瘤靶向载药制剂的应用。

所述的靶向载药制剂采用连接子将核酸适体和抗癌药物连接组成。

所述的抗癌药包括：微管蛋白抑制类小分子药物。

所述的微管蛋白抑制类小分子药物是：印度洋无壳软体动物截尾海兔Dolabellaauricularia分离得到Dolastatin 10的合成衍生物单甲基奥瑞他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)。

所述的连接子是瓜氨酸和结氨酸(Val-Cit)的二肽连接子。

本发明为了鉴定核酸适体的靶标，方法为：

①通过胰蛋白酶实验证明TY8结合细胞的膜蛋白；

②利用低渗缓冲液提取细胞膜蛋白；

③将生物素标记的TY8或文库与膜蛋白孵育，再与琼脂糖珠孵育，离心得到与TY8、文库结合的蛋白；

④利用SDS-PAGE胶分离蛋白，分析TY8与文库的差异蛋白；

⑤切出差异蛋白，酶解，上质谱分析蛋白样品；

⑥再利用Knock down等技术验证质谱结果。

本发明为了达到能够特异性运输抗癌药物的目的，提供的方法为：

①合成TY8-SH：利用Polygen DNA合成仪合成带有巯基修饰的TY8-SH,在高效液相色谱上进行纯化。

②合成TY8-MMAE:将MC-Val-Cit-PABC-MMAE(购于南京联宁公司)与TY8-SH常温反应过夜，并在高效液相色谱上进行纯化，最终制得TY8-MMAE。

本发明的有益效果：

(1)核酸适体可体外合成且易于修饰，合成方便，成本低，具有高的穿透性，对靶物质可高亲和力并特异性地结合，显著优于其它识别标记物，如抗体等。

(2)提供了一种新的可识别细胞表面标志性蛋白CD71的核酸适体，可以用于肿瘤细胞和正常细胞之间的差异化研究。而且由于识别的标志性蛋白CD71在多种肿瘤细胞表面高表达，该核酸适体可以用于多种肿瘤细胞的识别诊断。

(3)由于CD71蛋白在很多肿瘤表面都高表达且可以连续被细胞内化，所以可以将特异性结合CD71的核酸适体作为靶向配体，与抗肿瘤药物偶联构建靶向递送系统，用于肿瘤的靶向性治疗。

附图说明

图1 A.胰蛋白酶实验鉴定核酸适体TY8靶标类型；B.基于核酸适体TY8结合的膜蛋白的跑胶结果，其中泳道1为TY8，2为文库，3为空白珠子。

图2为FTIC标记的TY8与PE标记的CD71抗体共定位结果。Merge代表合并图，DIC代表明场图。

图3为用敲低CD71蛋白的siRNA处理PL45细胞，适体TY8与其结合情况。

图4为CD71纯蛋白与TY8结合亲和力分析。

图5为TY8通过结合CD71特异性识别葡萄膜黑色素瘤细胞OCM-1，而不识别脉络膜永生化细胞UC的试验结果。

图6为TY8内化进入OCM-1细胞，并进入溶酶体示意图。

A为文库、TY8分别与OCM-1孵育结果图，B为TY8与溶酶体探针共定位图。

图7 A.核酸适体TY8与MMAE缀合示意图；B.TY8与MMAE合成时HPLC纯化图；C.TY8-MMAE质谱图。

图8为TY8-MMAE对OCM-1细胞特异性的杀伤效果。

图9为TY8-MMAE特异性识别OCM-1的小鼠移植瘤模型；

图10为TY8-MMAE对OCM-1的小鼠移植瘤模型的治疗效果；

图11为TY8-MMAE对几种类型癌细胞的增殖影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得到的。

细胞来源：

以下实施例中用到的胰腺导管癌细胞株PL45，人结肠癌细胞HCT116，肝癌细胞HepG2均来自上海细胞库；葡萄膜黑色素瘤细胞株OCM-1来自温州医科大学；脉络膜永生化细胞UC来自复旦大学。

Washing buffer：PBS溶液中含以下物质:5mM MgCl₂,4.5g/L葡萄糖；

Binding buffer：PBS溶液中含以下物质：5mM MgCl₂,4.5g/L葡萄糖,0.1mg/mLyeast tRNA,1mg/mL BSA and 20％FBS。

低渗缓冲液：取25.2mL的Washing buffer于50mL离心管中，分别向其中加入3mL10×cocktail，1.5mL 1M的Tris-HCl，300μL 100×的PMSF，震荡混匀后4℃保存。

膜蛋白裂解液：取5mL的低渗缓冲液于15mL的离心管中，向管中加入50μL的Triton-X-100，4℃保存。

购买的试剂：

ELISA试剂盒购于BD公司，该试剂盒包括：coating buffer(涂层缓冲液)，assaydiluent(封闭液)，SAv-HRP(链霉亲和素包被的HRP试剂)，substrate solution(底物溶液)，stop solution(终止溶液)等。

DPBS、BSA、EDTA、胰蛋白酶、蛋白酶K、RNAiMAX转染试剂、无血清DMEM培养基等购于赛默飞公司。

cocktail，PMSF，Triton-X-100购于sigma公司。

HRP-conjugated goat anti-mouse购于Jackson Immuno Research。

ECL化学发光液、TEAA、CCK-8、loading buffer、丙烯酰胶、Tris-HCl、SDS、APS、TEMED、溴酚蓝、考马斯亮蓝染色液等购于碧云天公司。

链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠购于GE公司。

实施例1：核酸适体TY8的靶标类型鉴定

实验步骤如下：

(1)ssDNA的准备：新合成的ssDNA为粉末状，加入灭菌水配成10μM体系，放入-20℃保存。取50μM核酸适体TY8和文库(library)，95℃变性5min，后在冰上复性10min，离心4℃5000rpm，3min，加入Binding buffer使DNA浓度为250nM，置于冰上待用。

ssDNA序列(TY8)：

ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC；

(2)细胞的准备：培养四个皿的PL45细胞，至对数生长期，弃掉培养基，用2mL DPBS洗两次，向其中两个皿分别加入200μl 0.25％胰蛋白酶和200μl 0.1mg/ml蛋白酶K室温消化10min，另外两个皿分别加入0.2％的EDTA同等条件消化，随后加入500μl完全培养基终止消化，离心800rpm 4min，吸弃上清。用Washing buffer洗两遍，细胞计数板计数，使每组细胞数目为3×10⁵个。

(3)ssDNA与细胞的孵育：将上述随机文库链取200μl到EDTA消化的细胞中，将TY8分别取200μl到另外三种方式消化的细胞中，重悬细胞轻轻吹打混匀，4℃摇床避光孵育1h，孵育完后，加入Washing buffer离心洗涤两次，加入500μl Washing buffer，将准备好的待测样品过膜，使其分散成单个细胞，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。结果如图1A所示，TY8可以靶向识别经EDTA处理的PL45细胞，而不能识别蛋白酶K和胰蛋白酶处理的PL45细胞，说明TY8结合的靶标类型为蛋白。

实施例2：核酸适体靶标质谱鉴定

1)提取细胞膜蛋白

(1)将PL45细胞接种在10cm培养皿中，培养24h，约为10个大皿；

(2)吸弃旧培养基，DPBS清洗两次；

(3)细胞中加入EDTA室温消化，后将EDTA吸弃，用DPBS将细胞吹打下来,收集在15mL离心管中；

(4)用Washing buffer离心洗涤，弃上清；

(5)向15mL离心管中加入相应量低渗缓冲液(300μL/皿)，震荡混匀后在4℃摇床30min。后离心,4000rpm,10min,弃上清。再用低渗缓冲液洗涤3次；

(6)向离心管中加相应量膜蛋白裂解液(200μL/皿),震荡混匀后在4℃,裂解30min,后离心保留上清,4000rpm,4℃,10min。保留的上清液即蛋白质样品,放在-80℃保存。

2)PAGE胶蛋白样品的制备

(1)链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠的封闭：取三个1.5mL EP管,均加入100ul的琼脂糖凝胶珠，离心2500rpm 3min，分别标记为空白样、文库样、TY8样。向每个EP管中加入1mL的5％的BSA,震荡混匀，在4℃摇床封闭1h；

(2)膜蛋白的封闭:向收集的蛋白样品中加入3mL的DNA封闭液,震荡匀后在4℃,孵育1h,封闭完之后,取出适量留作全蛋白样品组；

(3)琼脂糖凝胶珠和膜蛋白封闭完之后,用Washing buffer洗涤5次,2500rpm，4℃,3min,置于冰上待用；

(4)琼脂糖凝胶珠、文库、核酸适体与膜蛋白孵育:将封闭之后的膜蛋白均匀分成3组并各自加入3个已封闭好的琼脂糖凝胶珠的EP管中,并按相应标记分别加入文库和TY8。震荡混匀放入4℃摇床孵育1h；

(5)孵育完之后,Washing buffer洗涤离心5次,2500rpm,4℃,3min,离心之后弃上清；

(6)蛋白质变性：加入与琼脂糖凝胶珠等体积的2×loading buffer，100℃变性10min,置于冰上10min,-80℃保存。

3)SDS-PAGE

(1)PAGE胶的制备:8％分离胶和5％浓缩胶10％SDS-PAGE蛋白分离胶(5mL):在小烧杯中,按顺序加入2mL ddH₂O,1.6mL30％丙烯酰胶,1.25mL 1.5M Tris-HCl(pH8.8),0.05mL10％SDS,0.05mL10％APS，0.002mLTEMED,充分混匀加入胶板中。室温放置，待胶凝固后加入5％SDS-PAGE蛋白浓缩胶。按顺序吸取3.4mLddH2O,0.85mL 30％丙烯酰胺，0.625mL1.0M Tris-HCl(pH6.8),0.05mL10％SDS,0.05mL10％APS,0.005mLTEMED。

(2)电泳:将配置好的SDS-PAGE胶正确装入电泳槽中,入1×电泳液(一块胶用量750mL),将已经准备好的样品按marker、空白珠子样、文库组珠子样、核酸适体珠子样顺序将样品加入孔内60V电压进行电泳,待溴酚蓝条带迁移至下层分离胶之后,升高电压至120V继续电泳,直至溴酚蓝条带迁移至胶底品,完成电泳。

(3)蛋白固定：取出SDS-PAGE胶,去除浓缩胶,将分离胶放入固定液中2h,后用超纯水漂洗3次,每次15min。

(4)将PAGE胶转移到考马斯亮蓝染色液中过夜，用超纯水洗涤考马斯亮蓝染液染好的胶洗涤4次,每次15min。至胶上蛋白条带清晰可见。

(5)扫描仪扫描SDS-PAGE胶，结果如图1B所示。

4)为了鉴定SDS-PAGE胶中显示出的差异蛋白，将其酶切提取，进行质谱鉴定。结果如表1所示，在差异条带中共检测到的蛋白质中CD71得分最高排在第一位为2088.63，远远高于排在第二位的蛋白角蛋白Keratin(常见的来源于头发和皮肤的蛋白，其出现可能是由于操作处理过程不当造成)，且条带覆盖率达到了70.13％。考虑到CD71为一种跨膜蛋白，我们推测CD71蛋白很可能是TY8结合的靶标。

表1：TY8结合蛋白的质谱分析结果

实施例3：TY8与CD71蛋白的共定位

激光共聚焦荧光显微镜可以直观的显示细胞表面的荧光信号，本实验利用激光共聚焦荧光显微镜做了核酸适体与CD71蛋白的共定位实验，进一步证明TY8的靶标就是CD71蛋白。

具体实验步骤如下：

(1)细胞的准备：PL45细胞提前24小时接光学培养皿，使得使用时细胞的融合度达到90％-95％，Washing buffer洗三次，用1％的BSA封闭30min，封闭完之后吸弃。

(2)TY8和抗体的准备：

共三组样品：

第一组：向装有200μL的Binding buffer的1.5mL的EP管中,加入50pmol5′端标记有FITC荧光团的TY8；

第二组：向装有200μL的Binding buffer的1.5mL的EP管中,加入50pmol5′端标记有FITC荧光团的TY8，加9μL的PE标记的CD71的抗体；

第三组：向装有200μL的Binding buffer的1.5mL的EP管中,加入9μL的PE标记的CD71的抗体。

(3)细胞与TY8和抗体的孵育：将准备好的TY8和抗体的复合物加到细胞中，做好相应的标记，4℃，避光孵育1h。

(4)拍照：1h之后用Washing buffer洗涤三次，加1mLWashing buffer,用激光共聚焦荧光显微镜去拍照即可，拍照倍数为60倍。结果如图2所示，FITC标记的TY8与PE标记的CD71抗体荧光图合并之后，可以看出荧光信号是重叠的。

实施例4：干扰实验

通过siRNA干扰CD71蛋白，蛋白表达量减少的同时TY8与其结合程度也大大减少，说明CD71是其靶标蛋白。

表2

具体实验步骤如下：

(1)提前24小时接两个六孔板(两个孔用作2条siRNA序列，一个孔用作一条NC序列，一个孔用作Blank)，使得第二天转染时PL45细胞密度在80％左右；

(2)提前给六孔板换液，每个孔2mL的新鲜培养基，做好标记：Blank，NC，siRNA 1，siRNA 2；

(3)siRNA浓度为15nM,加1.65μL的siRNA序列于200μL无血清DMEM培养基中再加6μL RNAiMAX转染试剂静置15min，静置之后加入相应孔中；

(4)转染24h后，一个六孔板收集细胞做流式，另一个六孔板提取蛋白做Westernblot；

流式细胞术检测步骤：

①ssDNA TY8的准备：准备四个平行样，每组样品取45μL的Binding buffer于1.5mLEP管中，加入50pmol的TY8/文库(lib)，95℃变性10min，变性完之后立即置于冰上冷却10min，冷却完之后离心，5500rpm，4℃，3min，向每个EP管中加入150μL的Bindingbuffer，使其终浓度为250nM，置于冰上待用。

②细胞的准备：丢弃六孔板中的培养基，用DPBS洗涤3次，每次1mL，加1mL的)。2％EDTA室温消化4min，吹打下来转移到新的1.5mL的EP管中，并做好标记，用Washing buffer洗涤两次，每次1mL，用细胞计数仪计数，每个样3×10⁵细胞，1000rpm，4℃，3min离心，去除上清，待用。

③ssDNA TY8与细胞的孵育：

将已经准备好的ssDNA TY8加到相应标记的EP管中，震荡混匀后在4℃，水平摇床上80rpm，孵育1h，孵育完之后，1000rpm，4℃，3min，再用Washing buffer洗涤三次，1000rpm，4℃，3min每次。洗涤完之后，用400μLBinding buffer重悬，流式细胞术检测细胞的荧光强度即可，FITC电压为300V。

结果如图3所示，siRNA 1，siRNA 2干扰之后的PL45细胞均不再与核酸适体TY8结合，而NC序列干扰之后的人胰腺导管腺癌细胞PL45仍与核酸适配体TY8结合，就说明核酸适配体TY8与人胰腺导管腺癌PL45细胞的结合与CD71有关。

实施案5：ELISA实验检测TY8与纯蛋白CD71的亲和力

(1)取ELISA板，共八孔。在新的1.5mL EP管中加入coating buffer，后加入CD71纯蛋白，终浓度为0.3μM。后均匀加入到ELISA孔中，4℃摇床孵育过夜。

(2)次日吸出coating buffer,用Washing buffer清洗三次。

(3)每孔加入250μL assay diluent(封闭液)，室温摇床孵育1h。

(4)吸弃溶液，用Washing buffer洗涤三次。

(5)根据实验用量，提前将核酸适体TY8，95℃变性5min，冰上复性10min。用Binding buffer配制不同浓度的biotin-TY8,使每孔浓度分别为0，0.025，0.05，0.1，0.15，0.25，0.5，0.75μM，配制不同浓度的核酸适体时采用逐步稀释法配制，4℃摇床孵育1h。

(6)吸弃溶液，Washing buffer洗四次。

(7)每孔加入100μL链霉亲和素包被的HRP试剂(SAv-HRP),室温孵育1h。

(8)吸弃溶液，Washing buffer洗涤五次。

(9)每孔加入100μLsubstrate solution,室温摇床避光孵育30min。

(10)每孔加入50μL stop solution。

(11)酶标仪检测，检测过程中注意避光操作。

(12)根据所测吸收值，利用Graphpad软件制作Kd曲线。

如图4所示，利用酶标仪检测后计算得出TY8结合CD71纯蛋白的解离常数Kd＝50.48nM。Kd值在nM级别，这一结果证明了TY8对CD71蛋白具有很强的亲和力。

实施例6：TY8可以通过CD71识别葡萄膜黑色素瘤细胞

流式细胞仪检测TY8与OCM-1和UC细胞的结合。

步骤如下：OCM-1细胞和UC细胞培养至对数生长期，用PBS洗涤3次，再用EDTA室温消化离壁，吹打下来转移到EP管中，用Washing buffer洗涤两次，用细胞计数仪计数，每个样3×10⁵细胞，离心，去除上清，待用。将FITC-TY8(上海生工)和FITC-Library(上海生工)(对照文库)用Binding buffer稀释成250nM；FITC-TY8和FITC-Library与细胞于4℃3D摇床孵育40min后，用Washingbuffer洗两次；用PBS将细胞重悬至400μL，经流式细胞仪(BD,美国)检测并分析结果。

利用CD71的siRNA干扰OCM-1细胞中CD71表达后与TY8的结合情况。

将5×10⁵个细胞铺于6孔板中，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)分别在细胞中转染(质粒：脂质体＝1：2.5)不同的序列，转染4-6小时后更换为有血清的培养基，实验分成4组：1)转染CD71-siRNA1实验组(吉玛公司，正向序列5-ACUUGCUGUAGAUGAAGAA-3)，2)转染CD71-siRNA2实验组(吉玛公司，正向序列5-CUUCCAGACUAACAACAGA-3)，3)转染对照序列的阴性对照组，4)未转染siRNA的空白对照组。转染72h后，收取细胞，用流式细胞仪检测不同组别细胞与FITC-TY8的结合，同时采用Western blot检测CD71被干扰情况。具体步骤如下：收取细胞加入RIPA蛋白强裂解液(P0013B，碧云天)提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度(Pierce)，10％SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到尼龙膜(Bio-Rad)，5％脱脂奶粉封闭，CD71抗体(BD Biosciences，)过夜孵育，TBST洗三次，加入HRP-conjugated goat anti-mouse与膜孵育，经洗涤后，与ECL化学发光液(Pierce)反应后进行显影成像。以GAPDH作为Western blot的内对照。结果如图5所示，TY-8可识别葡萄膜黑色素瘤细胞OCM-1而不识别脉络膜永生化细胞，通过siRNA干扰0CM-1中CD71表达后，TY8与OCM-1结合受影响。

实施例7：TY8可内化进入OCM-1,并进入溶酶体

(1)将OCM-1细胞接种于光学培养皿中，共3皿。培养24h,待细胞密度为80％左右。

(2)弃掉培养基，用DPBS清洗细胞两次，一皿细胞加入终浓度250nM的FITC-TY8，一皿细胞加入终浓度250nM的FITC-LIB(文库)，一皿加入250nM的FITC-TY8和溶酶体红色荧光探针(Lyso-Tracker Red),均37℃孵育1h。

(3)Washing buffer清洗两次，再加入1mLDPBS共聚焦观察。

如图6所示，TY8可内化进入OCM-1且与溶酶体红色荧光探针存在共定位。

实施例8：构建肿瘤靶向载药体系TY-MMAE

将TY8-SH加入10mM的MC-Val-Cit-PABC-MMAE溶液中，常温孵育过夜，再加入50μL3.0M NaCl和1000μL冰乙醇并置于-20℃冰箱中冷却30min。在4℃下对沉淀的DNA产物14000rpm离心5min，移除上清，加入TEAA震荡，过液相分离纯化，真空干燥真空干燥后重新溶解于超纯水中，并做脱盐处理，在通过紫外吸收定量后存储在-20℃备用。如图7A为TY8-MMAE的结构示意图；B为HPLC分离图；C为质谱图。

实施例9：TY8-MMAE对OCM-1和UC选择性杀伤

将对数生长期的OCM-1和UC细胞调节细胞浓度至5×10⁴个/mL在96孔板中铺板，100μL/孔。配制不同浓度的TY-MMAE与细胞共孵育48,72h；每孔加入10μL的CCK-8试剂，37℃孵育2h后，酶标仪(450nm波长)检测OD值，每个实验独立重复三次后计算细胞相对存活率。如图8所示，TY8-MMAE对OCM-1具有选择性杀伤作用。

实施例10：TY8-MMAE靶向OCM-1小鼠移植瘤

采用5周裸鼠，皮下注射1×10⁷个OCM-1细胞，待肿瘤长到(800-900mm³)，在麻醉状态下经尾静脉注射Cy5标记的conseq-MMAE和TY8-MMAE(5nmol/只)，分别在3.5h和5.5h时解剖小鼠，取出肿瘤和主要器官(心、肝、脾、肺、肾)，然后使用小动物成像仪IVIS LμMina II拍摄成像。如图9所示，TY8-MMAE较对照组conseq-MMAE(conseq是随机序列，与TY8对照)更具有靶向肿瘤的能力。

实施例11：TY8-MMAE在OCM-1细胞小鼠移植瘤模型中的起抑制作用

以OCM-1细胞皮下移植瘤小鼠模型为研究对象，尾静脉注射D-PBS(溶剂，空白对照),conseq,TY8,conseq-MMAE,TY8-MMAE，四天一次，连续4周，每四天称量小鼠体重，用游标卡尺测量肿瘤体积并记录实验数据，根据公式计算肿瘤体积(V＝L×W²/2)，并拍照记录。如图10所示，相较于其他组，TY8-MMAE抑制肿瘤增殖效果更明显。

实施例12：TY8-MMAE对几种类型癌细胞的增殖影响

将对数生长期的各组癌细胞调节细胞浓度至1×10⁵个/mL在96孔板中铺板，100μL/孔。配制20nmol/L的TY8-MMAE与细胞共孵育48h，每孔加入10μL的CCK-8试剂，37℃孵育1h后，酶标仪(450nm波长)检测OD值，每个实验独立重复三次后计算细胞相对存活率。结果见图11，可见，基于TY8对这几种癌细胞表面的CD71蛋白的特异性识别，导致TY8-MMAE的靶向治疗作用明显，在结肠癌，肝癌上也有很好的效果。

序列表

<110> 湖南大学

<120> 一种识别靶标蛋白CD71的方法及核酸适体的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

actcataggg ttaggggctg ctggccagat actcagatgg tagggttact atgagc 56

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

cacgcucggu caaaagguuu u 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

aaccuuuuga ccgagcgugu u 21

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

acuugcugua gaugaagaa 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

uucuucaucu acagcaagu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

cuuccagacu aacaacaga 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

ucuguuguua gucuggaag 19

Claims

1.一种识别靶标蛋白CD71的方法，其特征在于，是利用如下序列的核酸适体进行识别：

5’-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过对核酸适体增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同结合CD71蛋白能力的核酸适体衍生物。

4.核酸适体构建识别靶标蛋白CD71制剂的应用，其特征在于，所述的核酸适体序列如下：

5’-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3’。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过对核酸适体增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同结合CD71蛋白能力的核酸适体衍生物。

7.核酸适体构建靶向载药制剂的应用，其特征在于，所述的核酸适体序列如下：

5’-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3’。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过对核酸适体增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同结合CD71蛋白能力的核酸适体衍生物。

10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述的靶向载药制剂采用连接子将核酸适体和抗癌药物连接组成。