CN1565621A - 抑制细胞生长的多肽的获得及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由25个氨基酸组成的多肽和相应的cDNA的编码序列和制备方法，以及该多肽及其衍生物和相应的cDNA在肿瘤及其它增殖性疾病治疗中的具体用途。其特征是确定了p55PIK蛋白(磷脂酰肌醇－3－激酶的调节亚基)中氨基端25个氨基酸的多肽具有结合视网膜母神经瘤蛋白(Rb)的关键作用，在细胞内能阻断Rb的磷酸化，达到抑制细胞分裂的生物效应。应用这一多肽及衍生物或采用转染相应的cDNA，在细胞内表达这一多肽，能达到有效抑制细胞生长及肿瘤生长的作用，在肿瘤及有关细胞分裂疾病的临床治疗、肿瘤药物及诊断试剂的制备中具有独特的使用价值。同时本发明公开的阻断Rb的磷酸化过程的新方法，也提供了一个设计新的治疗肿瘤药物的途径。
Description
一、技术领域：
本发明涉及一种由25个氨基酸(甲硫氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸)构成的多肽在肿瘤及其它增殖性疾病的治疗中的应用，属于医学生物工程领域。
二、背景技术：
肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病，目前其死亡率在国内已成为仅次于心脑血管疾病的第二位致死病因。临床中主要应用化疗、放疗及手术治疗，这些方法形成了比较成熟的治疗体系，取得了较好的效果。然而，由于这些方法选择性低，难以避免毒副作用强、正常细胞和肿瘤之间治疗窗口小的缺点，要进一步提高疗效乃至达到治愈目的发展潜力有限，因此亟待研发新的有效治疗方法。
近来肿瘤细胞生物学的快速发展，为满足这一社会需求提供了现实的可能性，其中，随着细胞的信号转导途径(Signaling transduction pathways)的阐明，发现了越来越多的可用作治疗肿瘤的药靶。有一些已经成功地应用于临床，取得了非常好的效果。比如在许多乳腺癌细胞中ErbB2(一种能促进蛋白磷酸化的上皮生长因子受体)过度表达，并且其蛋白激酶活性也增强，应用一种特异性针对这一蛋白单克隆抗体能有效的抑制ErbB2蛋白激酶活性，阻断这一蛋白介导的信号转导。这一抗体目前已获FDA批准进入临床使用。
细胞生长的信号是由细胞内外促进生长的因子经过一系列蛋白参与传递到细胞核，引起细胞周期的许多调节蛋白结构和功能变化而导致细胞分裂。在这些调节细胞生长周期的蛋白中，视神经母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma Protein，Rb)担当着一个极其重要的角色，Rb是一个具有强烈抑制细胞生长的核蛋白，其抑制细胞分裂的能力是由其磷酸化的程度决定的。当细胞内外刺激生长的信号传到细胞核时，一些能磷酸化修饰Rb的蛋白激酶(比如CDK4或6)受到激活，使Rb中的十几个丝氨酸和苏氨酸磷酸化，这一结果导致Rb抑制细胞周期的功能丧失，细胞因此进入分裂周期。因此，阻断Rb的磷酸化是一个很有前途的开发治疗肿瘤新药的途径。至今为止，多个参与Rb磷酸化的酶和蛋白质已被发现，但由于Rb磷酸化途径是一个很复杂的有多个蛋白参与的过程，其机制还不清楚，目前没有有效的方法或化合物能直接阻断Rb的磷酸化，达到抑制细胞生长作用。
三、发明内容：
在研究中，我们发现了Rb和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的一个亚基的相互作用。PI3K由调节亚基和催化亚基组成，催化亚基催化某些脂类及蛋白质上的丝氨酸和苏氨酸磷酸化的活性是PI3K蛋白的核心效应组成部分，然而，催化亚基的活性受调节亚基的调控，调控通过以下两个机制实现：①催化亚基的活性本身受调节亚基影响；②调节亚基通过和其他蛋白的相互作用把催化亚基定位于目标蛋白。我们研究发现，Rb和PI3K的相互作用是由PI3K中的55千道尔顿的调节亚基(p55PIK)中氨基端1-25号氨基酸(序列为：甲硫氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸；见《氨基酸和核苷酸序列表》)参与的，该多肽片段被称为Rb结合功能区(Rb bindingdomain)，它把PI3K和Rb相互连接在一起，PI3K的蛋白激酶活性导致了Rb的磷酸化，从而引起了细胞分裂。根据这一模型，我们设想，如果我们仅仅只是在细胞中表达p55PIK中Rb结合功能区，这一多肽能有效地结合于Rb，竞争性抑制细胞内PI3K和Rb的结合，由于这个多肽不具有任何磷酸化蛋白激酶活性，所以多肽结合Rb将抑制Rb的磷酸化过程，保持Rb抑制细胞生长的功能，从而达到阻止肿瘤细胞分裂过程的目的。
证明这一模型的关键之处在于合成这一多肽并把这一多肽导入分裂细胞中，再观察这一多肽对细胞分裂的影响。为达到这一目的，我们采用分子生物学的手段，制造一个DNA构建体，这一构建体编码由这一Rb结合功能区和绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，再把这种构建体转入培养细胞中，因为检测GFP的技术已相当成熟，我们把产生GFP信号的细胞(含有转入的DNA构建体)单独分离出来，分析其细胞分裂状况。其结果和仅仅只表达GFP的细胞(转染相应的对照DNA构建体)进行比较，以证实单独表达p55PIK中的Rb结合功能区多肽是否能抑制细胞生长。
实验结果表明，在几种不同的具有生长分裂能力的培养细胞系中表达这一25氨基酸的多肽，这些细胞的DNA合成及其他几个证明细胞生长的观察指标都显著降低，证明了这一多肽具有抑制细胞生长的能力。
与现有抑制细胞生长的方法相比，采用本发明达到了以下效果(说明见附图1)：
①细胞中单独表达p55PIK的Rb结合功能区能结合于Rb，抑制了Rb的磷酸化过程，从而有效提高Rb的抑制细胞周期的能力，为治疗细胞生长异常疾病新药的设计和筛选，提供了一种新的方法和途径。
②这一多肽的序列存在于细胞的蛋白中，毒副作用低，抗原性弱，实验结果也发现这一多肽对细胞凋亡没有明显的影响，所以这一多肽，对正常细胞没有明显的杀伤作用。
③这一多肽及相应cDNA在细胞内，能有效地抑制细胞增殖。
④这一多肽分子量小能化学合成，便于大规模直接应用于临床，同时也可用其他的方法(比如用质粒及病毒载体)把这一多肽投入到细胞内，以达到治疗肿瘤的目的。
四、附图说明
附图1：N25(p55PIK Rb结合功能区)阻断细胞分裂。在细胞中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通过p55PIK和Rb相互作用，这一相互作用激活了促进Rb磷酸化的一系列蛋白激酶，导致Rb的磷酸化。Rb的磷酸化使Rb抑制细胞生长的功能丧失，细胞进入生长周期。Rb结合功能区N25多肽具有结合Rb的能力，但这一结合并不能激活引起Rb的磷酸化的蛋白激酶，从而保持了Rb的低磷酸化和其抑制细胞生长的能力，阻断了细胞的分裂。
附图2：在培养的细胞中检测GFP，N25-GFP和N25-GFP蛋白的表达。用pEGFP-C1(表达GFP蛋白)，pEGFP-N25(表达N25-GFP融合蛋白)和pEGFP-C25(表达GFP-N25融合蛋白)质粒各10微克转染培养的COS7细胞。48小时后，把细胞裂解。裂解液中蛋白用12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到尼龙膜。该膜用于Western印迹法检测GFP，N25-GFP和N25-GFP蛋白的表达(GFP抗体来自CLONTECH)。图中箭头表明N25-GFP和GFP-N25的位置。
附图3：N25多肽抑制了Rb的磷酸化。3T3细胞(购自ATCC)培养于10厘米培养皿中。用pEGFP-C1(表达GFP蛋白)，pEGFP-N25(表达N25-GFP融合蛋白)和pEGFP-C25(表达GFP-N25融合蛋白)质粒各10微克转染细胞。两天后，表达GFP的细胞用流式细胞仪分离，细胞裂解后，来自不同细胞的等量蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到膜上，膜用识别磷酸化Rb的抗体检测细胞Rb磷酸化水平。图中ppRb代表磷酸化Rb。
五、具体实施方式
例1：在pEGFP质粒中引入编码p55PIK氨基端的25个氨基酸残基的多肽cDNA(这一多肽以下简称为N25)。
pEGFP-N1和pEGFP-C1质粒载体购于美国Clontech公司(目录号为：6085-1，6084-1)，质粒包含编码绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA，用EcoRI-BamHI(购于美国Promega公司，目录号为：R6011，R6021)酶切质粒，酶切后的质粒在琼脂糖胶中分离、纯化，用于以后的连接反应。从胶中回收DNA片段的试剂盒来自德国Qiagen公司(产品目录号为：28704)。
编码小鼠p55PIK全长蛋白的cDNA来源于小鼠睾丸组织cDNA文库(美国Stratagene公司，目录号为：937308)，克隆到pcDNA3(购于Invitrogen公司，目录号为：V79020)，用于扩增N25 cDNA的PCR引物序列为：
引物1：5′TTTTGAATTCTATGGACCGCGATGACGCAGA
引物2：5′TTTTGGATCCATTTCAATATAAAATATCAGT
PCR条件：94℃ 2分钟；94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 2分钟共25个循环；72℃延伸5分钟。
PCR试剂盒来自美国Promega公司(目录号为：M1861)，PCR产物经过纯化后(纯化用的试剂盒来自德国Qiagen公司，产品目录号为：28704)，用EcoRI-BamHI酶切；再用琼脂糖胶纯化，然后和酶切纯化后的载体pEGFP-N1或pEGFP-C1进行连接反应(连接试剂盒来自美国Promega公司，目录号为：M1801)。转化细菌后(感受态细菌来自美国Promega公司，目录号为：L2001)，克隆用常规菌落PCR进行筛选。选出阳性克隆，其cDNA序列的正确性通过核酸序列测定得到证实后，大规模纯化制备质粒(大规模纯化试剂盒来自美国Promega公司，目录号为：A7270)，用于以后的实验。这两种质粒在真核细胞分别表达一个N25和GFP的融合蛋白。pEGFP-N1中，表达的N25连接在GFP的N未端，该融合蛋白称为N25-GFP；在pEGFP-C1表达的融合蛋白中N25是连接于GFP的C-未端，该蛋白称为GFP-N25。
例2：DNA构建体表达融合蛋白的检测
采用常规的DNA转染实验检测融合蛋白的表达。我们用COS7细胞(购于美国ATCC，目录号为：CRL-1651)检测融合蛋白的表达。
转染试剂盒购于美国Invitrogen(目录号为11668)，转染实验也按照生产厂家提供的使用说明完成。COS7细胞培养在10％小牛血清DMEM营养液中。转染48小时后，COS7细胞用生理盐水(PBS)洗两次，加入细胞裂解液裂解细胞，用超声波破坏DNA后，加入适量的2-巯基乙醇和溴酚蓝，于沸水中处理5分钟，置于冰上保存，随后上样于12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的蛋白转移到尼龙膜上，此膜用抗GFP抗体(购于美国Invitrogen，目录号为R970)检测融合蛋白的产生，结果证实了GFP-N25和N25-GFP在细胞中的表达(见附图1)。
例3：N25多肽的表达抑制细胞生长及细胞周期的实验。
用NIH/3T3(小鼠成纤维上皮细胞，购自美国ATCC，目录号为：CRL-1658)和MCF-7(人乳腺癌细胞系，购自美国ATCC，目录号为：HTB-22)检测N25氨基酸多肽对细胞生长的影响。
细胞在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，37℃、5％CO2/95％空气培养条件下培养于10厘米细胞培养皿。
用于实验质粒：pEGFP-N25(表达N25-GFP融合蛋白)；pEGFP-C25(表达GFP-N25融合蛋白)；pEGFP-N1或pEGFP-C1作为对照质粒。
用于转染的质粒和脂质体转染试剂(购自购于美国Invitrogen，目录号为：11668)混合后，室温放置15分钟，加入培养于无血清DMEM营养液的细胞中(细胞密度约为50％)在37℃中培养5小时，再加10％胎牛血清，继续培养48小时。在荧光显微镜中，表达融合绿色荧光蛋白或单独荧光蛋白的细胞很容易和不表达这些蛋白的细胞区分开来。另外，采用流式细胞仪，这些荧光蛋白阳性细胞也很容易分离纯化出来。几种检测细胞生长的标志指标被用来研究证实N25多肽对细胞生长的影响，在这些实验中，仅仅只表达荧光蛋白的细胞作为对照组用。
首先，我们用上述质粒转染3T3和MCF7细胞，两天后，采用流式细胞仪把转染了DNA的GFP阳性细胞挑选出来，分析这些细胞的细胞周期分布。
实验结果表明：表达N25对细胞凋亡没有明显影响，而N25能抑制细胞周期进入S期，诱导细胞进入G0/G1期，其作用见下表。
表1：N25抑制细胞周期，诱导细胞进入G0/G1期作用
| 3T3细胞 | MCF7细胞 | |||||
| G0/G1 | S | G2/M | G0/G1 | S | G2/M | |
| GFP对照 | 30.4％ | 27.9％ | 41.7％ | 72.2％ | 22.6％ | 5.2％ |
| N25-GFP | 42.1％ | 22.1％ | 35.7％ | 87.6％ | 11.1％ | 1.3％ |
| GFP-N25 | 48.9％ | 19.5％ | 31.6％ | 93.1％ | 6.0％ | 0.9％ |
DNA合成是细胞增殖的标志。下一个实验中，我们检测N25的细胞DNA合成的影响。3T3和MCF7细胞在转染pEGFP-N1及表达N25-GFP和GFP-N25质粒两天后，在细胞培养液加入能渗入到新合成的DNA链中的BrdU标记细胞15小时，再用免疫荧光技术检测转染了质粒的GFP阳性细胞，再确定这些细胞DNA中BrdU渗入的阳性率(这代表了细胞DNA合成率)。结果表明，N25也强烈抑制了细胞DNA的合成。(见表2)
表2：N25抑制细胞DNA合成
| 3T3细胞 | MCF7细胞 | |||
| BrdU阳性细胞 | 抑制率 | BrdU阳性细胞 | 抑制率 | |
| GFP对照 | 53.8％ | 0％ | 31.2％ | 0％ |
| N25-GFP | 2.5％ | 95.4％ | 2.2％ | 89.5％ |
| GFP-N25 | 1.4％ | 97.4％ | 1.5％ | 95.2％ |
例4：N25表达抑制Rb的磷酸化
Rb的磷酸化和Rb抑制细胞生长的功能密切相关。我们采用Western印迹法检测了转染不同的质粒的细胞中Rb的磷酸化水平，用上述质粒转染MCF7细胞两天后，采用流式细胞仪把GFP阳性细胞分离纯化出来，用裂解液裂解细胞，上样，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，再把蛋白转移到膜上，膜用针对Rb磷酸化的抗体(购自美国Santa Cruz公司目录号为：IF8)进行检测，结果(见附图2)表明，Rb在表达GFP的细胞中主要以磷酸化状态存在，而在表达N25的细胞中，Rb处于低磷酸化状态。表明了这些细胞中，Rb具有抑制细胞生长的作用。
氨基酸和核苷酸序列表
<110>夏献民
<120>抑制细胞生长的多肽的获得及用途
<160>2
<210>1
<211>25
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<400>1
Met Asp Arg Asp Asp A1a Asp Trp Arg Glu Val Met Met Pro Tyr
1 5 10 15
Ser Thr Glu Leu Ile Phe Tyr Ile Glu Met
20 25
<210>2
<211>75
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(75)
<400>2
ATG GAC CGC GAT GAC GCA GAC TGG AGG GAG 30
Met Asp Arg Asp Asp Ala Asp Trp Arg Glu
1 5 10
GTG ATG ATG CCC TAT TCG ACA GAA CTG ATA 60
Val Met Met Pro Tyr Ser Thr Glu Leu Ile
15 20
TTT TAT ATT GAA ATG 75
Phe Tyr Ile Glu Met
25
Claims (4)
1.应用p55PIK蛋白氨基酸残基1-25的多肽及含有这一多肽序列的衍生物，治疗人类肿瘤，及其他和细胞生长异常有关的疾病。多肽序列为：甲硫氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸，见《氨基酸和核苷酸序列表》。技术特征为这段多肽及其衍生物具有结合Rb并抑制Rb磷酸化的能力。
2.权利要求1所述多肽相应的核苷酸编码序列。
3.权利要求1所述多肽相应的核苷酸编码序列在制备基因治疗载体中的用途。
4.权利要求1所述多肽及其相应的核苷酸编码序列用于制备肿瘤治疗药物中的应用。
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2003
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