CN108779149A - 用于非小细胞肺癌和其他癌症免疫治疗的肽和肽组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(能够例如作为刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞并转入患者的疫苗组合物的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关T细胞(CTL)肽表位。与主要组织兼容性复合体(MHC)分子结合的肽或与此同类的肽也可以是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。

Description

用于非小细胞肺癌和其他癌症免疫治疗的肽和肽组合物
技术领域
本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞并转入患者的疫苗复合物的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关T细胞(CTL)肽表位。与主要组织兼容性复合体(MHC)分子结合的肽或与此同类的肽也可以是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。
本发明还涉及上述肽在生成结合于肿瘤相关抗原(TAA)以靶向癌细胞的特异性T细胞受体(TCR)、生成表达该T细胞受体的T细胞，以及在使用该T细胞受体治疗癌症的方法中的用途。源自人肿瘤细胞的HLA-I类分子的新型肽序列及其变体可以用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中或作为开发药物/免疫活性化合物和细胞的靶标。优选的是具有氨基酸序列KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)的肽。
背景技术
非小细胞肺癌(NSCLC)根据显微镜下观察到的癌细胞大小命名，须与小细胞肺癌(SCLC)区分。NSCLC约占所有肺癌的85％至90％(AmericanCancerSociety，2015)。
两种肺癌(SCLC和NSCLC)在男性和女性中均是第二常见的癌症。肺癌是癌症死亡的主要原因，约占25％。因此，每年死于肺癌的人数多于结肠癌、乳腺癌和前列腺癌加起来的人数。此外，两种肺癌占所有新癌症病例约13％(超过180万)。肺癌主要发生于老年人中。诊断时的平均年龄约为70岁。所有病例中，低于2％的在45岁以下确诊。
NSCLC有四种主要类型，即，腺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌和大细胞癌。腺癌和鳞状细胞癌是基于细胞形态的最常见类型NSCLC(Traviset al.，LungCancerPrinciplesandPractice，Lippincott-Raven，NewYork，361-395，1996)。腺癌的特征在于处于肺中更边缘的位置，通常有K-ras致癌基因突变(Gazdaret al.，AnticancerRes.，14，261-267，1994)。鳞状细胞癌通常处于更中心的位置，通常携带p53基因突变(Niklinskaet al.，FoliaHistochem.Cytobiol.，39，147-148，2001)。
已报告许多与肺癌发生和进展有关的基因改变，但确切的分子机制仍不清楚(Sozzi，G.Eur.J.Cancer37：63-73(2001))。大多数NSCLC的特征在于存在ras突变，从而使患者对已知激酶抑制剂的治疗相对不敏感。因此，目前肺癌治疗通常仅限于细胞毒性药物、手术和放射治疗。在过去十年中，已经出现新开发的细胞毒药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨和长春瑞滨，为晚期NSCLC患者提供多种治疗选择；但是，与基于顺铂的疗法相比，各种新的治疗方案只能提供较小的生存益处(Schiller，J.H.et al.，N.Engl.J.Med.346：92-98(2002)；Kelly，K.et al.，J.Clin.Oncol.19：3210-3218(2001))。因此，临床医生迫切期待新的治疗策略，如分子靶向药物的开发。
癌症免疫治疗代表了癌症细胞特异性靶向作用的一个选项，同时最大限度地减少副作用。癌症免疫疗法利用存在的肿瘤相关抗原。
肿瘤相关抗原(TAA)的目前分类主要包括以下几组：
a)癌-睾丸抗原：T细胞能够识别的最先确认的TAA属于这一类抗原，其成员在组织学相异的人肿瘤、正常组织、睾丸的精母细胞/精原细胞中都由表达，偶尔在胎盘中有表达，因此，它最初被称为癌-睾丸(CT)抗原。由于睾丸细胞不表达HLAI类和II类分子，所以，在正常组织中，这些抗原不能被T细胞识别，因此在免疫学上可考虑为具有肿瘤特异性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成员和NY-ESO-1；
b)分化抗原：肿瘤和正常组织(肿瘤源自该组织)都含有TAA。大多数已知的分化抗原发现于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。许多此类黑色素细胞谱系相关蛋白参与黑色素的生物合成，因此这些蛋白不具有肿瘤特异性，但是仍然被广泛用于癌症的免疫治疗。例子包括，但不仅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-1或前列腺癌的PSA；
c)过度表达的TAA：在组织学相异的肿瘤中以及许多正常组织中都检测到了基因编码被广泛表达的TAA，一般表达水平较低。有可能许多由正常组织加工和潜在提呈的表位低于T细胞能够识别的阈值水平，而它们在肿瘤细胞中的过度表达能够通过打破先前确立的耐受性而引发抗癌反应。这类TAA的典型例子为Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1；
d)肿瘤特异性抗原：这些独特的TAA产生于正常基因(如β-catenin、CDK4等)的突变。这些分子变化中有一些与致瘤性转化和/或进展相关。肿瘤特异性抗原一般可在不对正常组织带来自体免疫反应风险的情况下诱导很强的免疫反应。另一方面，这些TAA在多数情况下只与其上确认了有TAA的确切肿瘤相关，并且通常在许多个体肿瘤之间并不都共享TAA。在含有肿瘤特定(相关)同种型蛋白的情况下，如果肽源自肿瘤(相关)外显子也可能出现肽肿瘤特异性(或相关性)；
e)由异常翻译后修饰产生的TAA：此类TAA可能由肿瘤中既不具有特异性也不过度表达的蛋白产生，但其仍然具有肿瘤相关性(该相关性由主要对肿瘤具有活性的翻译后加工所致)。比如此类TAA由于糖基化模式的改变而产生，导致肿瘤产生针对MUC1的新型表位或在降解过程中发生类似蛋白质剪切的情况，这可能具有也可能不具有肿瘤特异性的TAA产生；
f)肿瘤病毒蛋白：这些TTA是病毒蛋白，可在致癌过程中发挥关键作用，并且由于它们是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能够激发T细胞反应。这类蛋白的例子有在宫颈癌患者中表达的人乳头状瘤16型病毒蛋白、E6和E7。
基于T细胞的免疫治疗靶向作用于主要组织兼容性复合体(MHC)分子提呈的来源于肿瘤相关蛋白或肿瘤特异性蛋白的肽表位。肿瘤特异性T淋巴细胞所识别的抗原，及其表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达通常上调。
MHC分子有两类：MHCI类和MHCII类。MHCI类分子由一条α重链和β-2-微球蛋白，MHCII类分子由一条α和一条β链组成。三维结构可形成一个结合槽，用于与肽进行非共价相互作用。大部分有核细胞上都可发现MHC-I类分子。它们提呈主要为内源性的蛋白、缺陷核糖体产物(DRIP)和较大肽裂解生成的肽。然而，源自核内或外源的肽也经常在MHC-I类分子上发现。这种I-类分子非经典提呈方式在文献中被称为交叉提呈(BrossartandBevan，1997；Rocket al.，1990)。MHCII类分子主要存在于专职性抗原呈递细胞(APCs上)，主要呈递由APC在胞吞过程中摄入并随后进行加工的外源性或跨膜蛋白多肽。
肽和MHCI类的复合体由负载相应T细胞受体(TCR)的CD8阳性T细胞进行识别，而肽和MHCII类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。因此，TCR、肽和MHC按照1∶1∶1的化学计量呈现，这一点已是本领域共识。
CD4阳性辅助T细胞在诱导和维持CD8阳性细胞毒性T细胞的有效反应中发挥重要作用。肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性T细胞表位的识别对开发能引发抗肿瘤免疫反应的药物产品可能非常重要(Gnjaticet al.，2003)。在肿瘤部位，T辅助细胞维持着对细胞毒性T细胞(CTL)友好的细胞因子环境(Mortaraet al.，2006)并吸引效应细胞，如CTL、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和粒细胞(Hwanget al.，2007)。
在没有炎症的情况下，MHCII类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专职性的抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。在癌症患者的肿瘤细胞中发现有MHCII类分子的表达(Dengjelet al.，2006)。本发明的拉长(较长)肽可作为MHC-II类活性表位。
MHC-II类表位激活的辅助T细胞在编排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发TH1细胞反应的辅助T细胞表位支援CD8阳性杀伤T细胞的效应子功能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关肽/MHC复合体)。这样，肿瘤相关T辅助细胞肽表位单独使用或与其他肿瘤相关肽结合使用可作为刺激抗肿瘤免疫反应的疫苗化合物的活性药物成分。
哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有CD8阳性T淋巴细胞，CD4阳性T细胞也能通过分泌干扰素-γ(IFNγ)抑制血管生成而足以抑制肿瘤的表现(BeattyandPaterson，2001；Mumberget al.，1999)。没有CD4T细胞作为直接抗肿瘤效应因子的证据(Braumulleret al.，2013；Tranet al.，2014)。
由于HLAII类分子的组成性表达通常仅限于免疫细胞，因此，直接从原发肿瘤中分离II类肽之前被认为是不可能的事。然而，Dengjel等人成功地在肿瘤中直接识别了多个MHCII类表位(WO2007/028574，EP1760088B1)。
因为依赖CD8的和依赖CD4的两种类型的应答对抗肿瘤效应是共同和协同作用的，肿瘤相关抗原被CD8阳性T辅助细胞(配体：MHCI类分子+肽表位)或是被CD4阳性T辅助细胞(配体：MHCII类分子+肽表位)识别和表征对于开发肿瘤疫苗是很重要的。
对于MHCI类肽来说，要触发(引发)细胞免疫，也必须结合到一个MHC分子上才可以。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-I类-结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相互作用的结合槽处的序列上通常包含两个保守的氨基酸残基(“锚”)。这样，每个MHC的等位基因都有“结合基序”，从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性结合。
在MHC-I类依赖性免疫反应中，肽不仅要与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们之后还必须能被T细胞负载的特异性T细胞受体(TCR)识别。
对于被T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而不由正常健康组织表达，或正常健康组织表达数量相对较少。在一个优选的实施方案中，与正常健康组织相比，所述肽应在肿瘤细胞中过度提呈。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原往往是源自直接参与因细胞周期控制或凋亡抑制中的其功能而发生的正常细胞向肿瘤细胞转化的蛋白。另外，这些直接导致转化事件的蛋白的下游靶标可能会被上调，因此可能与肿瘤间接相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标(Singh-Jasujaet al.，2004)。至关重要的是，表位存在于抗原氨基酸序列中，以确保这种来自肿瘤相关抗原的肽(“免疫原性肽”)可导致体外或体内T细胞反应。
因此，TAA是基于T细胞疗法(包括但不限于肿瘤疫苗)研发的起点。识别和表征TAA的方法通常基于对患者或健康受试者T细胞的使用情况，或基于肿瘤与正常组织肽之间差别转录特性或差别表达模式的产生。然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过度表达或选择性表达的基因的识别并不能够提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要递呈而且对这个特定表位的免疫耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因此，在本发明的一非常优选的实施例中，只选择那些针对可发现功能性和/或增殖性T细胞情况的过量提呈或选择性提呈肽，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以特异性抗原刺激后能够克隆地扩展并能够执行效应子功能(“效应T细胞”)的T细胞。
在通过根据本发明的特定TCR(例如可溶性TCR)和抗体或其他结合分子(支架)靶向作用于肽-MHC的情况下，潜在肽的免疫原性是次要的。在这些情况下，提呈是决定因素。
尽管在关于TAA的基础和临床研究方面取得了重大进展(Rosenbeget al.，NatureMed.4：321-7(1998)；Mukherji et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8078-82(1995)；Huet al.，CancerRes.56：2479-83(1996))，但是，只有有限数量的候选TAA可用于治疗癌症。TAA在癌细胞中大量表达，同时表达限于癌细胞将是免疫治疗靶标有希望的候选物。此外，诱导有效和特异性抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定预期可促进肽接种策略在各种类型癌症中的临床使用(BoonandcanderBruggen，J.Exp.Med.183：725-9(1996)；vanderBruggenet al.，Science 254：1643-7(1991)；Brichard et al.，J.Exp.Med.178：489-95(1993)；Kawakami et al.，J.Exp.Med.180：347-52(1994)；Shichijo et al.，J.Exp.Med.187：277-88(1998)；Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：1914-8(1997)；Harris，J.Natl.CancerInst.88：1442-5(1996)；Butterfield et al.，CancerRes.59：3134-42(1999)；Vissers et al.，CancerRes.59：5554-9(1999)；vanderBurg et al.，JImmunol 156：3308-14(1996)；Tanaka et al.，CancerRes.57：4465-8(1997)；Fujie et al.，Int.J.Cancer 80：169-72(1999)；Kikuchi et al.，Int.J.Cancer81：459-66(1999)；Oiso et al.，Int.J.Cancer 81：387-94(1999))。
此外，尽管在癌症治疗分子靶向药物的开发方面已取得了进展，但是有反应的肿瘤类型范围以及治疗有效性仍然非常有限。因此，迫切需要开发靶向作用于恶性细胞特异性高的分子的新型抗癌药物，并且可能导致最小副反应或无副反应。通常也有必要确定代表癌症生物标志物的因子，尤其是NSCLC，从而更好地诊断癌症、评估预后和预测治疗成功性。
发明内容
在本发明的第一方面，本发明涉及一种肽或其药用盐，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24的氨基酸序列，或该序列的与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24具有治安至少65％、优选至少77％、更优选至少85％同源(优选至少75％或至少85％相同)的变体序列，其中变体与MHC结合和/或诱导T细胞与所述肽发生交叉反应，其中所述肽不是构成所述肽基础的全长多肽。
本发明进一步涉及本发明的肽或其药用盐，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24的序列、或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24具有至少65％、优选至少75％、更优选至少85％同源(优选为至少75％或至少85％相同)的变体，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸，其中变体与MHC结合和/或诱导T细胞与所述肽发生交叉反应。
下表显示了根据本发明的肽及其各自的SEQ ID NO。
表1：本发明中的肽
另一方面，本说明书涉及包含以下通式I的氨基酸序列的MAG-003肽，例如分离的肽，或其药学上可接受的盐：
X1X2LEHVVRX3(SEQ ID NO：5)
式I
其中X1选自氨基酸K和Y，X2选自氨基酸V、L和A，X3选自V、L、A和I，其中所述肽结合HLAI类或II类分子和/或诱导T细胞与所述肽发生交叉反应。一方面，所述肽不是构成所述肽基础的全长多肽。
本发明还概括性地涉及本发明中的肽在治疗增殖性疾病中的用途，增殖性疾病为例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、默克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌和胆管癌和食管癌。
特别优选的是本发明的肽(单独或组合)，其选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24。更优选的是本发明的肽(单独或组合)选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24(见表1)以及其在非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、默克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌和胆管癌和食管癌，优选为成胶质细胞瘤、胃癌、肺癌、肝细胞癌、结直肠癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的免疫治疗中的用途。
本发明还涉及本发明的肽，其具有与人主要组织兼容性复合体(MHC)I类分子或以延长形式例如长度变体形式存在的MHC-II类分子结合的能力。
本发明进一步涉及本发明中的肽，其中所述肽(每种肽)由或基本由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽被修饰和/或包含非肽键。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽为融合蛋白的一部分，特别是与HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸融合，或与抗体(例如，树突状细胞特定抗体)融合，或融合到抗体的序列中。
本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明的肽。本发明还涉及本发明的核酸，其为DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合。
本发明进一步涉及一种能够表达和/或表达本发明核酸的表达载体。
本发明进一步涉及本发明的肽、本发明的核酸或本发明的表达载体在药物中的用途，特别是用于治疗癌症。
本发明进一步涉及本发明中肽或本发明中所述肽复合体(含有MHC)的特异性抗体以及制造这些抗体的方法。
本发明还涉及包含本发明上述核酸或表达载体的宿主细胞。
本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其为抗原提呈细胞，优选为树突细胞。
本发明进一步涉及制备本发明肽的一种方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞，以及从所述宿主细胞或其培养基中分离肽。
本发明进一步涉及本发明中的方法，其中通过使足量的抗原与抗原提呈细胞接触，抗原被载在表达于合适抗原提呈细胞或人工抗原呈递细胞表面的I或II类MHC分子上。
本发明进一步涉及本发明的方法，其中抗原提呈细胞包含能表达和/或表达含SEQID NO.1至SEQ ID NO：24、优选为含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24或其变体氨基酸序列的肽的表达载体。
本发明进一步涉及以本发明方法制造的激活的T细胞，其中所述T细胞有选择性地识别一种细胞，该细胞表达含本发明氨基酸序列的多肽。
本发明进一步涉及一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常地表达含本发明任意氨基酸序列的多肽，该方法包括对患者施用本发明方法制造的有效量T细胞。
本发明进一步涉及任何所述肽、本发明的核酸、本发明的表达载体、本发明的细胞、本发明的激活的T淋巴细胞、T细胞受体或抗体或其他肽-和/或肽-MHC结合分子作为药物或在药物制备中的用途。所述药物优选为具有抗癌活性。
优选情况为，所述药物为基于可溶性TCR或抗体的细胞治疗药物、疫苗或蛋白质。
本发明还一般涉及本发明的用途，其中所述癌细胞为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、默克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌，优选为小细胞肺癌细胞。
本发明进一步涉及一种基于本发明肽的生物标志物，在此称为“靶标“，其可用于诊断癌症，优选为非小细胞癌。所述标志物可以是肽本身的过度提呈，或相应基因的过度表达。标志物也可以用于预测治疗成功的可能性，优选为免疫疗法，最优选为靶向由该生物标志物识别的相同靶的免疫疗法。例如，抗体或可溶性TCR可用于对肿瘤切片进行染色以检测是否存在与MHC复合的相关肽。任选地，抗体具有进一步的效应子功能，如免疫刺激域或毒素。
本说明书进一步涉及这些新靶标在识别可识别至少一种所述靶标的TCR，优选为识别激活T细胞的TCR中的用途。
本发明还涉及这些新靶点在癌症治疗中的用途。
本发明进一步涉及本发明的肽在制备TCR、单独的TCR亚基(单独或组合)及其亚结构域，特别是可溶性TCR(sTCR)和克隆TCR，中的用途，所述TCR加工为自体或异体T细胞，以及涉及这些TCR的制备方法，以及载有所述TCR或与所述TCR交叉反应的其他细胞。
本发明进一步涉及TCR蛋白、单独的TCR亚基(单独或组合)及其亚结构域，特别是结合至KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)-HLA-A*02复合体的可溶性TCR(sTCR)和克隆TCR，其包含TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
本发明还涉及包含编码本发明TCR的核苷酸序列的分离核酸。本发明还涉及本发明制备的包含编码TCRα链、β链或两者的核酸的重组表达载体。
本发明进一步涉及包含重组表达载体的分离的宿主细胞，该重组表达载体表达核酸，核酸编码本发明的TCRα链、β链或两者。
本发明进一步涉及包含本发明重组表达载体的分离宿主细胞，优选细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。
本发明进一步涉及包含本发明重组表达载体的分离PBL，其中所述PBL为CD8+T细胞或CD4+T细胞。
本发明进一步涉及包含本发明中至少一种宿主细胞的细胞群。
本说明书进一步涉及本发明的TCR蛋白在治疗增殖性疾病，如：非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、默克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌中的用途。
具体实施方式
是否能刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的存在增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可以性。目前，针对癌症免疫治疗，正在探索各种利用免疫系统的体液和细胞进行免疫的机制。
细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的T-细胞表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，TCD8+能识别通常8至10个源自蛋白或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRIP)的氨基酸残基的主要组织兼容性复合体(MHC)所载的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。
术语”T细胞反应”指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和激活。对于MHCI类限制性细胞毒性T细胞，效应子功能可以为溶解肽脉冲的、肽前体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞、分泌细胞因子，优选为肽诱导的干扰素-γ，TNF-α或IL-2，分泌效应分子，优选为肽诱导的颗粒酶或穿孔素，或脱颗粒。
本文所用“肽”这一术语，是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但至短可为8个氨基酸长度，至长可为10、11或12个氨基酸或更长，如果为MHC-II类肽时(本发明肽的延长变体)，至长可为13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长度或更长。
因此，“肽”这一术语应包括一系列氨基酸残基的盐，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。优选的情况是，盐为肽的药用盐，例如：氯化物或乙酸(三氟乙酸)盐。必须注意的是，本发明肽的盐与其体内状态的肽基本上不同，因为该不是体内的盐。
术语“肽”应也包括“寡肽”。本文使用的术语“寡肽”是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。寡肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于15个氨基酸。
“多肽”这一术语是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。多肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，“多肽”这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。
一种肽、寡肽、蛋白质或编码该分子的核苷酸如果能诱导免疫反应，则具有”免疫原性”(因此是本发明中的一种“免疫原”)。在本发明的情况下，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞反应的能力。因此，”免疫原”是一种能够诱导免疫反应的分子，并且在本发明的情况下，是一种能诱导T细胞反应的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽，肽与MHC的复合体、和/或用于提高特异性抗体或TCR抗性的蛋白。
I类T细胞“表位”要求的是一种结合至MHCI类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHCI类α链、β-2-微球蛋白和肽)，其可以通过T细胞负载匹配T细胞受体与具有适当亲和力的MHC/肽复合物结合来识别。结合至MHCI类分子的肽的典型长度为8-14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。
在人类中，有三种编码MHCI类分子的不同基因位点(人MHC分子也是指定的人白细胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-B*07是可从这些基因位点表达的不同MHCI类等位基因的实例。
表2：HLA-A*02和HLA-A*24和最常见HLA-DR血清类型的表达频率F。频率是从Mori等人(Moriet al，1997)改编的美国人的单体型频率中推导出来的，使用的是HardyWeinberg公式F＝1-(1-Gf)2。由于连锁不平衡，一个A*02或1*24的组合与某些HLA-DR等位基因的组合可能比预期的单一频率相比更丰富或更少。详情请参阅Chanock等人的成果(Chanocket al，2004)。
MAGEA4基因是MAGEA基因家族的一员。该家族的成员将具有50至80％序列同一性的蛋白质进行相互编码。MAGEA基因的启动子和第一个外显子显示出相当大的变异性，表明该基因家族的存在能够在不同的转录控制下表达相同的功能。MAGEA基因聚簇于染色体位置Xq28。他们牵涉某些遗传性疾病，如先天性角化不全。对于该基因已经发现了至少四种编码相同蛋白质的变体。[由RefSeq提供，2008年7月]
MAGEA4位置被描述为在细胞质内(Kimet al.，2015)。但是，在细胞核中也检测到了MAGEA4染色，在分化良好与分化较差的癌症中细胞核和细胞质之间具有差异性分布(Sarcevicet al.，2003)。
MAGEA4用作一种雄性生殖细胞标志物。它在细胞中不表达，但在精原细胞和成熟生殖细胞中表达(Mitchellet al.，2014)。
MAGEA4是一种癌胚蛋白或癌症睾丸抗原。无明确的证据表明MAGEA4存在直接促肿瘤效应。一项研究表明，MAGEA4过度表达可通过抑制细胞周期停滞和细胞凋亡促进自发转化的正常口腔角质形成细胞的生长(Bhanet al.，2012)。但是，其他报道表明MAGEA4在体外具有肿瘤抑制效应，因为过表达增加细胞凋亡和caspase-3活性，而MAGEA4沉寂导致caspase-3活性降低(Peikertet al.，2006)。其他人报告，MAGEA4的C端片段在体外具有促凋亡活性(Sakuraiet al.，2004)，并且其通过与癌蛋白gankyrin相互作用抑制锚定非依赖性生长(Nagaoet al.，2003)。
零散的证据表明与肿瘤转移有关：MAGEA4表达与食管鳞状细胞癌淋巴结转移(Forghanifardet al.，2011)、膀胱癌进展为肌肉浸润性癌(Bergeronet al.，2009)和外阴癌淋巴结转移(Bellatiet al.，2007)有关。
无明确的证据表明MAGEA4与癌症干细胞样细胞相关。但是，在来自不同癌细胞系(包括肺、结肠和乳腺)的侧群细胞(Yamadaet al.，2013)以及霍奇金淋巴瘤肿瘤样本(Shaferet al.，2010)中检测到MAGEA4表达。此外，MAGEA4在未分化人胚胎干细胞及其衍生物、畸胎瘤细胞中有描述(Lifantsevaet al.，2011)。
MAGEA4在癌症中过度表达-在许多不同癌症类型中描述有MAGEA4表达。有关具体癌症实体的详细信息，请参阅下面的小节。这里列出的只是一些关于癌症类型的更多信息，不包括下面的特定章节。
在原发性黑色素瘤中，MAGEA4的表达已通过免疫组织化学在10-30％的肿瘤中检测到，在高达44％的远端转移中检测到(Barrowet al.，2006；Luftlet al.，2004)。头颈部原发性粘膜黑色素瘤显示MAGEA4染色阳性率高达60％(Prasadet al.，2004)。
在膀胱癌中，MAGEA4在38％的非肌层浸润性肿瘤、48％的肌肉浸润性肿瘤、65％的原位癌和73％的淋巴结转移瘤中观察到(Bergeronet al.，2009)。另一项研究描述了MAGEA4在膀胱癌中的表达、频率稍低，与腺癌(4/15，27％)、肉瘤样癌(4/14，29％)、小细胞癌(5/20，25％)或移行细胞癌(281/1，522，19％)相比，在鳞状细胞癌中表达频率最高(25/55，46％)(Kocheret al.，2002)。在泌尿道上皮癌中，免疫组化检测到MAGEA4表达于64％的病例中，RT-PCR检测表达于58％的病例中(Sharmaet al.，2006)。通过RT-PCR检测，40-60％的头颈部鳞状细胞癌样本中有MAGEA4(Cuffelet al.，2011；Sogaet al.，2013)。在57％的口腔鳞状细胞癌样本中检测到MAGEA4表达(Montoroet al.，2012；Rieset al.，2005)。在分析的70例良性和恶性甲状腺肿瘤样本中，任何一个样本免疫组化方法均未检测到MAGEA4表达(Meloet al.，2011)。MAGEA4表达仅发现于典型精原细胞瘤，但未发现于非精原细胞性睾丸生殖细胞肿瘤(Aubryet al.，2001；Bodeet al.，2014)。在14％(5/35)的胃肠道间质肿瘤中检测到MAGEA4表达(Perezet al.，2008)。
在儿童髓母细胞瘤中，MAGEA4mRNA在28％(7/25)的样本中检测到，但仅在4％(1/25)样本中观察到免疫反应性(Oba-Shinjoet al.，2008)。另一项研究发现MAGEA4mRNA在18％(2/11)的髓母细胞瘤中较弱(Jacobset al.，2008)。
一项研究发现MAGEA4在60％的成人T细胞白血病/淋巴瘤样本中表达(Nishikawaet al.，2012)。另一份报告描述了在5％(2/38)非霍奇金淋巴瘤样本和20-30％霍奇金病样本中低得多的表达频率。在霍奇金淋巴瘤中，里德-斯腾伯格细胞是被最强染色的细胞，而周围细胞则不是(Chambostet al.，2000)。在39个多发性骨髓瘤样本中未检测到MAGEA4表达(Andradeet al.，2008)。
在33％的宫颈鳞状细胞癌(20/60)中检测到MAGEA4免疫反应性(Sarcevicet al.，2003)。
通过免疫组织化学发现MAGEA4表达存在于12％的子宫内膜样腺癌、63％的子宫乳头状浆液性癌和91％的子宫癌肉瘤中。在肿瘤人群中，癌肉瘤中MAGEA4表达程度最高(Resnicket al.，2002)。
通过免疫组织化学检测的MAGEA4染色不均一，仅有一部分阳性肿瘤在超过50％的肿瘤细胞中表达MAGEA4(Resnicket al.，2002；Sarcevicet al.，2003)。
与大量报告MAGEA4在不同癌症类型中表达的研究相比，MAGEA4与结局和预后相关性的证据更为有限。但是，一些报告发现MAGEA4表达与临床参数有关。在头颈部鳞状细胞癌中，MAGEA4表达与总体生存率差有关，并且是不良结局的独立预后指标(Cuffelet al.，2011)。在膀胱癌中，MAGEA4表达与肌肉浸润性癌的复发和进展相关(Bergeronet al.，2009)，而强MAGEA4染色与生存率下降有关(Kocheret al.，2002)。在胃肠道间质瘤中，MAGEA4与其他癌症睾丸抗原的表达与复发相关(Perezet al.，2008)，在外阴癌中，MAGEA4在复发肿瘤中更常检测到(Bellatiet al.，2007)。
MAGEA4表达与晚期肿瘤分期相关的证据由一些涵盖不同癌症类型的报告提供：在恶性黑色素瘤中，MAGEA4表达随着疾病的进展而增加，由原发性肿瘤的9％增加至远处转移的44％(Barrowet al.，2006)。同样，在外阴癌中，MAGEA4表达在伴有淋巴结转移的肿瘤中更为常见(Bellatiet al.，2007)。此外，MAGEA4表达与子宫内膜癌(Chitaleet al.，2005)、宫颈鳞状细胞癌(Sarcevicet al.，2003)和膀胱癌(Bergeronet al.，2009；Kocheret al.，2002)的高级别肿瘤或较晚期别相关。
MAGEA4似乎由肿瘤细胞表达，无证据表明在基质、血管、免疫或其他肿瘤相关细胞中表达。此外，在培养过的肿瘤细胞系，如：胃癌细胞系(Liet al.，1997)、食管癌细胞系(Tanakaet al.，1997)、胰腺癌细胞系(Kubuschoket al.，2004)和头颈部鳞状细胞癌细胞系(Hartmannet al.，2015)中也检测到MAGEA4表达。
表3：作为一般癌症靶标的MAGEA4
抗原特征 评估
根据文献报告，在[相关癌症]中过度表达
根据文献报告，在其他癌症中过度表达 +
T细胞对所述源蛋白衍生靶标的反应 +
癌胚蛋白表达模式 +
癌干细胞表达 (-)
在细胞周期进程和肿瘤细胞增殖中的作用 (-)
参与肿瘤浸润、迁移和转移
与癌症相关信号通路连接1
抗凋亡作用 (-)
促血管生成作用/新生血管形成
与癌症预后不良有关的过度表达 +
与晚期癌症阶段相关的过度表达 +
一般癌症靶点
亚细胞定位2 CY
文献中源蛋白的表征(-，+，++，+++) +
细胞类型关联性3 TU
1TGF＝转化生长因子；PI3K＝磷脂酰肌醇3激酶；p53＝细胞肿瘤抗原p53；EGFR＝上皮生长因子受体；FGF2＝成纤维细胞生长因子2；Wnt＝Wnt/β-连环蛋白通路(胚胎发生)；Ras＝大鼠肉瘤原癌基因；NF-kB＝核因子κB(真核转录因子)2Cy＝细胞质；3TU＝肿瘤细胞
MAGEA4作为治疗靶点-免疫治疗靶点(疫苗、佐剂、CAR)
20例晚期食管癌、胃癌或肺癌患者皮下注射接受含有300μg蛋白质的MAGEA4疫苗，每2周一次，共6次。在完成一个接种周期的15名患者中，4名患者显示出MAGEA4特异性体液反应，并且这些患者显示出比无抗体反应的患者更长的总生存期。CD4和CD8T细胞反应分别在3例和6例患者中观察到，并且诱导MAGEA4特异性产生IFNγ的CD8T细胞而不是CD4T细胞的患者比没有诱导的患者生存时间更长(Saitoet al.，2014)。
有一例肺转移结肠癌患者病例报告，用融合肽MAGE-A4-H/K-HELP(由通过甘氨酸接头融合到MAGE-A4(143-154)杀伤表位的MAGE-A4(278-299)辅助表位组成)以及OK432和Montanide治疗。治疗诱导MAGEA4特异性Th1和CTL免疫反应和MAGEA4特异性IgG。最终诊断时肿瘤生长和癌胚抗原肿瘤标志物下降(Takahashiet al.，2012)。
一项I期临床试验研究了食管癌患者中TCR工程化自体CTL的过继转移对与HLA-A*24：02结合的MAGEA4(143-151)的反应。给予患者TCR转导淋巴细胞一次，无需预处理，随后在2和4周后用MAGEA4肽进行皮下免疫。未观察到目标肿瘤消退，可能是由于缺乏淋巴细胞凋亡方案和给予了IL2(Kageyamaet al.，2015)。在小鼠中的临床前研究已证明，转移的T细胞抑制了在小鼠中接种的MAGEA4表达肿瘤细胞系的生长，额外的肽疫苗接种增强了这种抗肿瘤活性(Shirakuraet al.，2012)。
提出了以过继CTL转移靶向作用于MAGEA4作为EBV阴性霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的治疗方案。靶向作用于EBV衍生肽的输注CTL被描述为可在EBV(+)淋巴瘤患者中诱导完全缓解。因此，靶向作用于淋巴瘤(包括MAGEA4)表达的其他抗原正在进行探索，作为一种可能的治疗方案(Cruzet al.，2011；Gerdemannet al.，2011)。
几项研究已证明，在与重叠肽库进行脉冲的自体抗原呈递细胞孵育后，健康供体和癌症患者可产生MAGEA4特异性CD4(+)T细胞(Cesson et al.，2011；Gerdemann et al.，2011；Ohkuri et al.，2009)。
MAG-003，即KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)是MAGEA4(氨基酸286-294)的一种HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。(Jiaet al.2010；Wuet al.2011)中的内容通过引用整体并入本文。一方面，MAG-003在体外从HLA-A*0201阳性PBMC和在HLA-A*0201/Kb转基因小鼠中引发特异性CTL。另一方面，诱导的CTL以HLA-A*0201限制性方式裂解靶细胞，证明MAG-003是HLA-A*0201限制性CTL表位并充当治疗性抗肿瘤疫苗接种的靶标(Jiaetal.2010)，该文中的内容通过引用整体并入本文。
此外，SYFPEITHI常规(Rammenseeet al.，1997；Rammenseeet al.，1999)预测MAG-003与A*02：01结合，绝对评分为25，相对评分为0.69。本发明人确认100％的鉴定来自与A*02样本结合的MAG-003。
表4：正常组织和癌症中MAG-003的提呈。
A＊02 样本 平均强度 j得分
正常 0/245 --- ---
癌症 14/397 1.1e+07 0.000
HCC 1/16 2.9e+06 0.000
MEL 0/3 0.0e+00
OC 2/20 4e+07 0.000
pNSCLC 11/91 1.0e+07 0.000
与正常细胞相比在肿瘤细胞上TAA过度提呈或特定提呈足够其在免疫治疗中有效使用，一些肽为肿瘤特异性的，尽管存在其源蛋白也存在于正常组织中。但是，mRNA表达谱增加了免疫治疗目标肽选择中其他级别的安全性。特别是对于具有高安全性风险的治疗选择，诸如亲和力成熟的TCR，理想的目标肽将来源于对该肿瘤独一无二且不出现于正常组织中的蛋白。
手术切除组织标本按如上所述在获得每名患者的书面知情同意后提供。手术后立即速冻肿瘤组织标本，之后在液态氮中用杵臼匀浆。使用TRI试剂(Ambion公司，Darmstadt，德国)之后用RNeasy(QIAGEN公司，Hilden，德国)清理从这些样本中制备总RNA；这两种方法都根据制造商的方案进行。
通过新一代测序技术(RNAseq)由CeGaT(Tübingen，Germany)对肿瘤和正常组织的RNA样本进行基因表达分析。简言之，根据供应商的方案(IlluminaInc.，SanDiego，CA，USA)，其中包括RNA碎片化、cDNA转化和测序适配器的加入，利用IlluminaHiSeqv4试剂盒准备测序文库。从多个样本获得的文库根据制造商的说明等摩尔混合并在IlluminaHiSeq2500序列发生器上测序，产生50bp的单端读数。处理的读数使用STAR软件映射至人类基因组(GRCh38)。根据ENSEMBL序列数据库的说明(Ensemb177)，表达数据在转录水平设置为RPKM(每百万映射读数每千碱基读数，由Cufflinks软件生成)并在外显子水平上设置(总读数，由Bedtools软件生成)。外显子读数被归为外显子长度和校准尺寸，以获得RPKM值。
表5-7显示了各种癌症中MAG-003表达的RNASeq数据(表达得分)
表5：RNASeq分数1
表6：RNASeq分数3
表7：肿瘤表达
与大量报告MAGEA4在不同癌症类型中表达的研究相比，MAGEA4与结局和预后相关性的证据更为有限。但是，一些报告发现MAGEA4表达与临床参数有关。在头颈部鳞状细胞癌中，MAGEA4表达与总体生存率差有关，并且是不良结局的独立预后指标(Cuffelet al.，2011)。在晚期NSCLC癌症(Yoshidaet al.，2006；Shigematsuet al.，2010)和卵巢癌(Yakirevichet al.，2003)中MAGE-A4表达与患者生存率之间呈负相关。在膀胱癌中，MAGEA4表达与肌肉浸润性癌的复发和进展相关(Bergeronet al.，2009)，而强MAGEA4染色与生存率下降有关(Kocheret al.，2002)。在胃肠道间质瘤中，MAGEA4与其他癌症睾丸抗原的表达与复发相关(Perezet al.，2008)，在外阴癌中，MAGEA4在复发肿瘤中更常检测到(Bellatiet al.，2007)。
在高级浆液性卵巢癌的癌症基因组图谱(TCGA)研究中，低于中值MAGEA8表达与PFS增加11.4个月相关，这是最强的可验证效应。MAGEA8高表达与高CD3肿瘤患者中较差的PFS有关，可能表明MAGEA8有免疫抑制作用，如通过激活免疫抑制性Tregs实现(Enget al.，2015)。
高风险组和低风险组结肠癌患者通过八种生物标志物(ZBTB32、OR51B4、CCL8、TMEFF2、SALL3、GPSM1、MAGEA8和SALL1)为个体治疗提供参考(Zhanget al.，2015)。在人类鳞状细胞癌细胞系实验中，MAGE-A5和MAGE-A8报告为使用帕尼单抗进行的抗EGFR治疗的负向预测因子(Hartmannet al.，2014)。
MAGEA4表达与晚期肿瘤分期相关的证据由一些涵盖不同癌症类型的报告提供：在恶性黑色素瘤中，MAGEA4表达随着疾病的进展而增加，由原发性肿瘤的9％增加至远处转移的44％(Barrowet al.，2006)。同样，在外阴癌中，MAGEA4表达在伴有淋巴结转移的肿瘤中更为常见(Bellatiet al.，2007)。此外，MAGEA4表达与子宫内膜癌(Chitaleet al.，2005)、宫颈鳞状细胞癌(Sarcevicet al.，2003)和膀胱癌(Bergeronet al.，2009；Kocheret al.，2002)的高级别肿瘤或较晚期别相关。
在一项优选的实施方案中，术语”核苷酸序列”是指脱氧核苷酸的杂聚物。
编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序列。一般来说，编码肽、多肽以及本发明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。
如本文所用的术语“肽的核苷酸编码”是指对肽进行编码的核苷酸序列，其包括与将通过例如树突细胞或有助于产生TCR的另一细胞系统表达该序列的生物系统相容的人工(人造)启动密码子和终止密码子。
本文提到的核酸序列既包括单链核酸也包括双链核酸。因此，除非本文另有所指，否则，例如对于DNA，具体的序列是该序列的单链DNA、该序列与其互补序列的双螺旋(双链DNA)以及该序列的互补序列。
“编码区”这一术语是指在基因的天然基因组环境中天然或正常编码该基因的表达产物的那部分基因，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。
编码区可来自非突变(“正常”)基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。
“表达产物”这一术语是指多肽或蛋白，它是基因和遗传码退化并因而编码同样的氨基酸所造成的任何核酸序列编码同等物的翻译产物。
“片段”这一术语，当指的是一种编码序列时，表示包含非完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。
术语“DNA片段”这一术语是指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA结构的组分形式存在，它们从至少分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即不含污染性内源性材料，并且获得的数量和浓度能够用标准生化方法进行鉴定、处理和回收该片段及其组分核苷酸，比如，通过使用克隆载体。。此类片段以开放阅读框框(未被内部未翻译序列打断)或内含子(通常存在于真核基因中)的形式存在。未翻译DNA序列可以存在于开放阅读框架的下游，在那里其不会干预编码区的操纵或表达。
“引物”这一术语表示一种短核酸序列，其可与一个DNA链配对，并在DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链之处提供一个游离的3′-OH末端。
“启动子”这一术语表示参与结合RNA聚合酶从而激活转录的DNA区域。
术语“分离”表示一种物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，同样的核苷酸和多肽，在天然环境中被从一些或所有的共存物质中分离出来，就是分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可以是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。
本发明中披露的多核苷酸和重组或免疫原性多肽也可以以“纯化”的形式存在。术语“纯化”并非要求绝对的纯度；它只是一个相对的定义，可以包括高度纯化或部分纯化的制剂，相关领域技术人员能理解这些术语。例如，从cDNA文库中克隆出的基因按惯例可同通过电泳纯化。明确考虑到将起始材料或天然物质纯化至少一个数量级，优选为两或三个数量级，更优选为四或五个数量级。此外，明确涵盖所述多肽的纯度优选为99.999％，或至少为99.99％或99.9％；甚而适宜为以重量计99％或更高。
根据本发明公开的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和/或多肽的表达载体可以以“浓缩的形式”存在。本文使用的术语“浓缩”是指材料的浓度至少例如是其自然浓度的大约2、5、10、100或1000倍，优选按重量计为0.01％，优选为至少0.1％。也明确考虑到，按重量计约为0.5％、1％、5％、10％和20％的浓缩制剂。序列、构型、载体、克隆物以及包含本发明的其他材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。“活性片段”这一术语是指产生免疫反应的片段(即具有免疫原性活性)，通常是一种肽、多肽或核酸序列的片段，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起或在载体中给予一种动物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人；这种免疫反应采用的形式是在接受动物(如：人)体内刺激T细胞反应。或者，“活性片段”也可用于诱导体外T细胞反应。
本文使用的“部分”(portion)、“节段”(segment)、“片段”(fragment)这几个术语，当与多肽相关地使用时是指残基的连续序列，比如氨基酸残基，其序列形成一个较大序列的子集。例如，如果一个多肽以任一种肽链内切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)进行处理，则该处理获得的寡肽会代表起始多肽的部分、节段或片段。当与多核苷酸相关地使用时，这些术语是指用任何核酸内切酶处理所述多核苷酸产生的产物。
根据本发明，术语“等同度百分比”或“等同百分比”，如果指的是序列，则表示在待对比序列(“被对比序列”)与所述序列或权利要求的序列(“参考序列”)对准之后将被对比序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算等同度百分比：
等同度百分比＝100[1-(C/R)]
其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的差异数量，其中
(i)参考序列中每个碱基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准碱基或氨基酸；
(ii)参考序列中每个空隙，以及
(iii)参考序列中每个对准碱基或氨基酸与被比对比序列中对准碱基或氨基酸不同，即构成一个差异以及
(iv)必须在对准序列的第1位置开始对准；
并且R是参考序列中碱基或氨基酸的数量，在与对比序列的比对中，在参考序列中产生的间隙也被计算为碱基或氨基酸。
如果“被对比序列”和“参考序列”之间存在的一个对准按上述计算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比，则被对比序列与参考序列具有指定的最低等同度百分比，虽然可以存在按本文上述计算的等同度百分比低于指定等同度百分比的对准。
因此，如上所述，本发明提出了一种肽，其包括选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24的序列、或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24具有88％同源性的其变体、或诱导与该肽发生T细胞交叉反应的变体。本发明所述的肽具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或所述肽延长版本的II类分子结合的能力。
在本发明中，“同源性”一词是指两个氨基酸序列之间的同一度(参见上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的”同源”是通过将理想条件下调整的两个序列与待比较序列进行比对后确定的。此类序列同源性可通过使用ClustalW等算法创建一个排列而进行计算。也可用使用一般序列分析软件，更具体地说，是VectorNTI、GENETYX或由公共数据库提供的其他工具。
本领域技术人员能评估特定肽变体诱导的T细胞是否可与该肽本身发生交叉反应(Appayet al.，2006；Colombettiet al.，2006；Fonget al.，2001；Zarembaet al.，1997)。
发明人用给定氨基酸序列的“变体”表示，一两个氨基酸残基的改变(例如，被另一个天然氨基酸残基的侧链或其他侧链取代)，这样，这种肽仍然能够以含有给定氨基酸序列(由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24组成)的肽大致同样的方式与HLA分子结合。例如，一种肽可以被修饰以便至少维持(如没有提高)其能与HLA-A*02或-DR等合适MHC分子的结合槽相互作用和结合，以及至少维持(如没有提高)其与激活T细胞的TCR结合的能力。类似地，TCR蛋白可被修饰以便至少维持(如果不提升的话)其能与HLA-A或-DR等合适MHC分子/KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)复合体相互作用和结合，以及至少维持(如果不提升的话)激活T细胞的能力。
随后，这些T细胞可与表达多肽的细胞和杀伤细胞发生交叉反应(其中包含本发明中定义的同源肽的天然氨基酸序列)。正如科学文献和数据库(Rammenseeet al.，1999；Godkinet al.，1997)中所述，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成一种与HLA结合槽的结合模序相称的核心序列，其定义由构成结合槽的多肽链的极性、电物理、疏水性和空间特性确定。因此，本领域技术人员能够通过保持已知的锚残基来修饰SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24提出的氨基酸序列，并且能确定这些变体是否保持与MHCI或II类分子结合的能力。本发明的变体保持结合MHCI类或II类分子/KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)复合体的能力。表达本发明变体的T细胞可以在随后杀死表达含有同源肽的天然氨基酸序列的多肽的细胞，例如KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)。
如果无另有说明，那么本文公开的原始(未修饰)肽可以通过在肽链内的不同(可以为选择性)位点上取代一个或多个残基而被修饰。优选情况是，这些取代位于氨基酸链的末端。此取代可以是保守性的，例如，其中一个氨基酸被具有类似结构和特点的另一个氨基酸所取代，比如其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或类似的大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，这些氨基酸往往表现出与原氨基酸的大小、电荷、极性和疏水性之间的相似性相关，这是确定“保守取代”的基础。
在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换：基团1-小脂肪族、非极性或略具极性的残基(Ala，Ser，Thr，Pro，Gly)；基团2-极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；基团3-极性、带正电荷的残基(His，Arg，Lys)；基团4-大型脂肪族非极性残基(Met，Leu，Ile，Val，Cys)以及基团5-大型芳香族残基(Phe，Tyr，Trp)。
较不保守的取代可以涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可以涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种“激进”取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用是不完全可预测的，激进的取代可以会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。
当然，这种取代可以涉及普通L-氨基酸之外的其他结构。因此，D-氨基酸可以被本发明的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，非标准氨基酸(即，除了常见的天然蛋白原氨基酸)也可以用于取代之目的，以生产根据本发明的免疫原和免疫原性多肽。
如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的迭加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过4个。
与未修饰的多肽相比，本发明所指氨基酸序列组成多肽中的一两个非锚定氨基酸(见＝锚定继续相关内容见下文)被交换，不会导致其与人类主要组织兼容性复合体(MHC)II或II类分子的结合能力改变或受到不利影响。在另一实施方案中，与未修饰的多肽相比，本发明所指氨基酸序列组成多肽中一两个氨基酸与其对应的保守氨基酸(见下文)发生交换，不会导致其与人类主要组织兼容性复合体(MHC)II或II类分子的结合能力改变或受到不利影响。
与T细胞受体的相互作用没有实质性贡献的氨基酸残基可以通过替换其他氨基酸来改变，这些氨基酸的掺入不会对T细胞反应产生实质性的影响，也不会消除与MHC相关的结合。因此，除了特定限制性条件外，本发明的肽(在此术语中，发明者包括寡肽或多肽)可以为任何包括给定氨基酸序列或部分或其变体的肽。
表9：本发明肽的变体
较长(延长)的肽也可能适合。MHCI类表位也是可行的，尽管通常而言，实际上的表位是在加工过程中几乎不影响暴露实际表位所需的蛋白裂解的残基。本发明的肽可被延长多达四个氨基酸，即1、2、3或4个氨基酸可以以任意组合加到任一端，使长度在8-11个氨基酸之间，通过包含实际表位的较长肽或蛋白经肽加工而产生。优选两侧的残基在4∶0至0∶4之间。本发明延长的组合请见表10。
表10：本说明书肽的拉长组合
C-端 N-端
4 0
3 0或1
2 0或1或2
1 0或1或2或3
0 0或1或2或3或4
N-端 C-端
4 0
3 0或1
2 0或1或2
1 0或1或2或3
0 0或1或2或3或4
拉伸/延长的氨基酸可以是所述蛋白或任何其他氨基酸的原序列肽。延长可用于增强所述肽的稳定性或溶解性。
因此，本发明所述的表位可以与天然肿瘤相关表位或肿瘤特异性表位相同，也可以包括来自参考肽的不超过四个残基的不同肽，只要它们有基本相同的抗原活性即可。
在一项替代实施方案中，肽的一边或双边被延长4个以上的氨基酸，优选最多30个氨基酸的总长度。这可形成MHC-II类结合肽。结合至MHCII类肽可通过本领域中已知的方法进行测试。
因此，本发明提出了MHCI类表位的肽和变体，其中所述肽或抗体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸长度(即10、11、12、13、14个氨基酸，如果为延长II类结合肽时，长度也可为15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸)。
当然，本发明的肽或变体能与人主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合。肽或变体与MHC复合物的结合可用本领域内的已知方法进行测试。
优选情况是，当本发明的肽特异性T细胞相比于取代肽受到检测时，如果取代肽在相对于背景肽溶解度增加达到最大值的一半，则该肽浓度不超过约1mM，优选为不超过约1μM，更优选为不超过约1nM，再优选为不超过约100pM，最优选为不超过约10pM。也优选为，取代肽被一个以上的T细胞识别，最少为2个，更优选为3个。
肿瘤特异性TCR亲和力增强及其开发依赖于存在最佳TCR亲和力的窗口。这样窗口的存在是根据观察结果：HLA-A2限制性病原体特异性TCR与HLA-A2限制性肿瘤相关自身抗原特异性TCR相比，KD值通常大约低10倍(Aleksic et al.2012；Kunert et al.2013)。现已知，尽管肿瘤抗原可能具有免疫原性，但是因为肿瘤来自个体自身的细胞，因此仅突变蛋白质或翻译加工改变的蛋白将将被免疫系统视为外来物质。上调或过度表达(所谓的自体抗原)的抗原不一定诱导针对肿瘤的功能免疫应答：表达对这些抗原具有高度反应性的TCR的T细胞会在一种称为中枢耐受的程序中在胸腺内被不利选择(Xing et al.2012；Ruella etal.2014；Sharpe et al.2015)，也就是说只有对自身抗原具有低亲和力TCR的细胞才仍然存在。因此，本说明书的TCR或变体对MAG-003的亲和力可通过本领域熟知的方法来增强，如下文所述。
“药物组合物”是指适合在医疗机构用于人体的组合物。优选地，药物组合物为无菌状态，并根据GMP指南生产。
药物组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽(也参见上文)。此处使用的“药用盐”是指所公开的肽的一种衍生物，其中该肽由制药剂的酸盐或碱盐进行改性。例如，用与适合的酸反应的游离碱(通常其中的中性药物有一个中性-NH2基团)制备酸式盐。适合制备酸盐的酸包括有机酸，如：乙酸、丙酸、羟基酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水杨酸等等、以及无机酸，如：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一种肽上提呈的酸性基团的碱盐制剂使用药用碱基进行制备，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等等。
药物组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽或TCR蛋白(也参见上文)。此处使用的“药用盐”系指所公开的肽的一种衍生物，其中该肽由制酸或药剂的碱盐进行改性。例如，用与适合的酸反应的游离碱(通常其中的中性药物有一个中性-NH2基团)制备酸式盐。适合制备酸盐的酸包括有机酸，如：乙酸、丙酸、羟基酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水杨酸等等、以及无机酸，如：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一种肽上提呈的酸性基团的碱盐制剂使用药用碱基进行制备，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等等。
本发明的另一实施方案涉及一种非天然肽，其中所述肽由或基本由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成，并经合成产生(即，合成)为一种药用盐。合成产生肽的方法是本领域公知的。本发明肽的盐与其体内状态的肽基本上不同，因为这些体内产生的肽不是盐。该肽的非天然盐形式介导肽的溶解度，特别是包含所述肽的药物组合物的情况下，例如，本文所公开的肽疫苗。为了向需治疗的受试者有效地提供肽，需要肽具有充分、至少基本的溶解度。优选地，盐为肽的药用盐。本发明的这些盐包括碱和碱土盐类，诸如Hofmeister系列的盐，包含阴离子PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、Cl-、Br-、NO3 -、ClO4 -、I-、SCN-和阳离子NH4 +、Rb+、K+、Na+、Cs+、Li+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+和Ba2+。特别地，盐选自(NH4)3PO4、(NH4)2HPO4、(NH4)H2PO4、(NH4)2SO4、NH4CH3COO、NH4Cl、NH4Br、NH4NO3、NH4CIO4、NH4I、NH4SCN、Rb3PO4、Rb2HPO4、RbH2PO4、Rb2SO4、Rb4CH3COO、Rb4Cl、Rb4Br、Rb4NO3、Rb4CIO4、Rb4I、Rb4SCN、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、K2SO4、KCH3COO、KCl、KBr、KNO3、KClO4、KI、KSCN、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、Na2SO4、NaCH3COO、NaCl、NaBr、NaNO3、NaCIO4、NaI、NaSCN、ZnCI2Cs3PC4、Cs2HPO4、CsH2PO4、Cs2SO4、CsCH3COO、CsCl、CsBr、CsNO3、CsCIO4、CsI、CsSCN、Li3PO4、Li2HPO4、LiH2PO4、Li2SO4、LiCH3COO、LiCl、LiBr、LiNO3、LiClO4、LiI、LiSCN、Cu2SO4、Mg3(PO4)2、Mg2HPO4、Mg(H2PO4)2、Mg2SO4、Mg(CH3COO)2、MgCl2、MgBr2、Mg(NO3)2、Mg(ClO4)2、MgI2、Mg(SCN)2、MnCl2、Ca3(PO4)，、Ca2HPO4、Ca(H2PO4)2、CaSO4、Ca(CH3COO)2、CaCl2、CaBr2、Ca(NO3)2、Ca(ClO4)2、CaI2、Ca(SCN)2、Ba3(PO4)2、Ba2HPO4、Ba(H2PO4)2、BaSO4、Ba(CH3COO)2、BaCl2、BaBr2、Ba(NO3)2、Ba(ClO4)2、BaI2和Ba(SCN)2。特别优选为NH乙酸、MgCl2、KH2PO4、Na2SO4、KCl、NaCl和CaCl2，例如：氯化物或乙酸盐(三氟乙酸)盐。
在特别优选的实施方案中，药物组合物包括乙酸(醋酸盐)，三氟乙酸盐或盐酸(氯化物
另一方面，本发明提出了一种编码本发明中肽或肽变体、TCR蛋白和TCR变体的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可以为，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合物，它们可为单链和/或双链、或多聚核苷酸的原生或稳定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，并且只要它编码肽，就可以包含也可以不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。另一个方面，本发明提出了一种可根据本发明表达多肽的表达载体。
对于连接多核苷酸，已经开发出多种方法，尤其是针对DNA，可通过向载体补充粘性末端等方法进行连接。例如，可向DNA片段加入互补的同聚物，之后DNA片段被插入到载体DNA。然后，通过在互补的同聚物之间形成氢键将载体和DNA片段连接，从而形成重组DNA分子。
含有一个或多个酶切位点的合成接头为DNA片段与载体连接提供了另一种方法。含各种限制性核酸内切酶的合成接头可通过多种渠道购得，其中包括从国际生物技术公司(InternationalBiotechnologiesInc，NewHaven，康涅狄格州，美国)购得。
编码本发明多肽的DNA理想修饰方法是使用Saiki等人(Saikiet al.，1988)所采用的聚合酶链反应方法。此方法可用于将DNA引入合适的载体(例如，通过设计合适的酶切位点)，也可用于本领域已知的其他有用方法修饰DNA。如果使用病毒载体，痘病毒载体或腺病毒载体为优选。
之后，DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)在合适的宿主中表达，从而产生本发明发肽和变体肽。因此，可根据已知技术使用编码本发明肽或变体的DNA，用本文所述方法适当修饰后，构建表达载体，然后表达载体用于转化合适宿主细胞，从而表达和产生本发明中的多肽。此类技术包括那些公开于，例如，美国专利4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810,648。
编码含本发明化合物多肽的DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可以被加入到其他多种DNA序列，从而引入到合适的宿主中。同伴DNA将取决于宿主的性质、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持为游离体还是要相互结合。
一般来说，DNA可以适当的方向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体(如质粒)中。如有必要，该DNA可以与所需宿主所识别的相应转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体通过标准方法被引入宿主。一般来说，并不是所有的宿主都会被载体转化。因此，有必要选择转化过的宿主细胞。选择方法包括用任何必要的控制元素向表达载体插入一个DNA序列，该序列对转化细胞中的可选择性属性(如抗生素耐药性)进行编码。
另外，有这种选择属性的基因可在另外一个载体上，该载体用来协同转化所需的宿主细胞。
然后，本发明中的重组DNA所转化的宿主细胞在本文中所述本领域技术人员熟悉的合适条件下培养足够长的时间，从而表达之后可回收的肽。
有许多已知的表达系统，包括细菌(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、酵母(如酵母菌)、丝状真菌(如曲霉菌)、植物细胞、动物细胞及昆虫细胞。该系统可优选为哺乳动物细胞，如来自ATCC细胞生物学库(CellBiologyCollection)中的CHO细胞。
典型的哺乳动物细胞组成型表达载体质粒包括CMV或含一个合适的多聚A尾巴的SV40启动子以及抗性标志物(如新霉素)。一个实例为从Pharmacia公司(Piscataway，新泽西州，美国)获得的pSVL。一种可诱导型哺乳动物表达载体的例子是pMSG，也可以从Pharmacia公司获得。有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，一般可从StratageneCloningSystems公司(LaJolla，加州92037，美国)获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIp)，并插入了酵母可选择性标记物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416质粒为酵母着丝粒质粒(Ycp)。基于CMV启动子的载体(如，来自于Sigma-Aldrich公司)可提供瞬时或稳定的表达、胞浆表达或分泌，以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同组合物中的N-端或C-端标记。这些融合蛋白可用于检测、纯化及分析重组蛋白。双标融合为检测提供了灵活性。
强劲的人巨细胞病毒(CMV)启动子调控区使得COS细胞中的组成蛋白表达水平高达1mg/L。对于较弱的细胞株，蛋白水平一般低于0.1mg/L。SV40复制原点的出现将导致DNA在SV40复制容纳性COS细胞中高水平复制。例如，CMV载体可包含细菌细胞中的pMB1(pBR322的衍生物)复制原点、细菌中进行氨苄青霉素抗性选育的钙-内酰胺酶基因、hGHpolyA和fl的原点。含前胰岛素原引导(PPT)序列的载体可使用抗FLAG抗体、树脂和板引导FLAG融合蛋白分泌到进行纯化的培养基中。其他与各种宿主细胞一起应用的载体和表达系统是本领域熟知众所周知的。
在另一个实施方案中，对本发明的两个或更多的肽或肽变体进行编码，因此，以一个连续顺序(类似于“一串珠子”的构建体)表达。在达到目标，所述肽或肽变体可以通过连接符氨基酸的延伸处(例如LLLLLL)连接或融合一起，也可以他们之间没有任何附加的肽而被连接。这些构建体也可用于癌症治疗，可诱导涉及MHCI和MHCII类分子的免疫应答。
本发明还涉及一种宿主细胞，其以本发明构建的多核苷酸载体转化而来。宿主细胞可为原核细胞，也可为真核细胞。在有些情况下，细菌细胞为优选原核宿主细胞，典型为大肠杆菌株，例如，大肠杆菌菌株DH5(从Bethesda Research Laboratories公司(Bethesda，马里兰州，美国)获得)和RR1(从美国菌种保藏中心(ATCC，Rockville，马里兰州，美国)，ATCC编号31343获得)。首选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选为脊椎动物细胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纤维细胞和结肠癌细胞株中的细胞。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可从Stratagene Cloning Systems公司(LaJolla，加州92037，美国)获得。首选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为ATCC中的CCL61细胞、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3为ATCC中的CRL1658细胞、猴肾源性COS-1细胞为ATCC中的CRL1650细胞以及人胚胎肾细胞的293号细胞。优选昆虫细胞为Sf9细胞，可用杆状病毒表达载体转染。有关针对表达选择合适宿主细胞的概要，可从教科书(Paulina Balbás and Argelia Lorence 《Methodsin Molecular Biology RecombinantGene Expression，Reviews and Protocols》Part One，Second Edition，ISBN978-1-58829-262-9)和技术人员知道的其他文献中查到。
含本发明DNA结构的适当宿主细胞的转化可使用大家熟知的方法完成，通常取决于使用载体的类型。关于原核宿主细胞的转化，请参见，例如，Cohen等人的文献(Cohen etal.，1972)和(Green and Sambrook，2012)。酵母细胞的转化在Sherman等人的文章(Sherman et al.，1986)中进行了描述。Beggs(Beggs，1978)中所述的方法也很有用。对于脊椎动物细胞，转染试剂对于转化这类细胞很有用，例如，磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体试剂，可从Stratagene Cloning Systems公司或Life Technologies公司(Gaithersburg，马里兰州20877，美国)获得。电穿孔也可用于转化和/或转染细胞，是本领域用于转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞大家熟知的方法。
被成功转化的细胞(即含本发明DNA结构的细胞)可用大家熟知的方法(如PCR)进行识别。另外，上清液中存在的蛋白可使用抗体进行检测。
应了解，本发明中的某些宿主细胞用于制备本发明中的肽，例如细菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞。但是，其他宿主细胞可以对某些治疗方法有用。例如，抗原提呈细胞(如树突状细胞)可用于表达本发明中的肽，使他们可以加加载相应的MHC分子中。因此，本发明提出了含本发明中核酸或表达载体的一种宿主细胞。
在一个优选实施方案中，宿主细胞为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈细胞。2010年4月29日，美国食品和药物管理局(FDA)批准载有含前列腺酸性磷酸酶(PAP)的重组融合蛋白可用于治疗无症状或症状轻微的转移性HRPC(Rini et al.，2006；Smallet al.，2006)。
另一方面，本发明提出了一种制备一种肽及其变体的方法，该方法包括培养宿主细胞和从宿主细胞或其培养基中分离肽。
在另一个实施方案中，本发明中的肽、核酸或表达载体用于药物中。例如，肽或其变体可制备为静脉(i.v.)注射剂、皮下(s.c.)注射剂、皮内(i.d.)注射剂、腹膜内(i.p.)注射剂、肌肉(i.m.)注射剂。肽注射的优选方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的优选方法为i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，给予50μg至1.5mg，优选为125μg至500μg的肽或DNA，这取决于具体的肽或DNA。在以前的试验中使用上述剂量范围是成功的(Walter et al.，2012)。
用于主动免疫接种的多聚核苷酸可为基本纯化形式，也可包被于载体或输送系统。核酸可以为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可以为其组合物。这种核酸的设计和引入方法为本领域所熟知。例如，文献中有其概述(Teufel et al.，2005)。多核苷酸疫苗很容易制备，但这些载体诱导免疫反应的作用模式尚未完全了解。合适的载体和输送系统包括病毒DNA和/或RNA，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含一种以上病毒元素的混合病毒的系统。非病毒输送系统包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，是DNA输送所属领域内熟知的系统。也可使用物理输送系统，如通过”基因枪”。肽或核酸编码的肽可以是一种融合蛋白，例如，含刺激T细胞进行上述CDR的表位。
本发明的药剂也可以包括一种或多种佐剂。佐剂是那些非特异性地增强或加强免疫反应的物质(例如，通过CD8-阳性T细胞和辅助T(TH)细胞介导的对一种抗原的免疫应答，因此被视为对本发明的药剂有用。适合的佐剂包括(但不仅限于)1018ISS、铝盐、AS15、BCG、CP-870，893、CPG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的TLR5配体、FLT3配体、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特resiquimod、ImuFactIMP321、白细胞介素IL-2、IL-13、IL-21、干扰素α或β，或其聚乙二醇衍生物、ISPatch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、LipoVac、MALP2、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS1312、Montanide ISA206、Montanide ISA50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳状液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、载体系统、基于聚丙交酯复合乙交酯[PLG]和右旋糖苷微粒、重组人乳铁传递蛋白SRL172、病毒颗粒和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGFtrap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支杆菌提取物和细菌细胞壁合成模拟物的Aquila公司的QS21刺激子，以及其他专有佐剂，如：Ribi′sDetox、Quil或Superfos。优选佐剂如：弗氏佐剂或GM-CSF。前人对一些树突状细胞特异性免疫佐剂(如MF59)及其制备方法进行了描述(Allison andKrummel，1995)。也可以使用细胞因子。一些细胞因子直接影响树突状细胞向淋巴组织迁移(如，TNF-)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原提呈细胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国5849589号专利，特别以其完整引用形式并入本文)，并充当免疫佐剂(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich et al.，1996)。
据报告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐剂在疫苗中的作用。如果没有理论的约束，CpG寡核苷酸可通过Toll样受体(TLR)(主要为TLR9)激活先天(非适应性)免疫系统从而起作用。CpG引发的TLR9活化作用提高了对各种抗原的抗原特异性体液和细胞反应，这些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被杀死的病毒、树突状细胞疫苗、自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖结合物。更重要的是，它会增强树突状细胞的成熟和分化，导致TH1细胞的活化增强以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成加强，甚至CD4T细胞的缺失。甚至有疫苗佐剂的存在也能维持TLR9活化作用诱发的TH1偏移，这些佐剂如：正常促进TH2偏移的明矾或弗氏不完全佐剂(IFA)。CpG寡核苷酸与以下其他佐剂或配方一起制备或联合给药时，表现出更强的佐剂活性，如微粒、纳米粒子、脂肪乳或类似制剂，当抗原相对较弱时，这些对诱发强反应尤为必要。他们还能加速免疫反应，使抗原剂量减少约两个数量级，在有些实验中，对不含CpG的全剂量疫苗也能产生类似的抗体反应(Krieg，2006)。美国6406705B1号专利对CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原结合使用促使抗原特异性免疫反应进行了描述。一种CpGTLR9拮抗剂为Mologen公司(德国柏林)的dSLIM(双干环免疫调节剂)，这是本发明药物组合物的优选成分。也可使用其他如TLR结合分子，如：RNA结合TLR7、TLR8和/或TLR9。
其他有用的佐剂例子包括(但不限于)化学修饰性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA模拟物，如，Poly(I：C)及其衍生物(如：AmpliGen、Hiltonol、多聚-(ICLC)、多聚(IC-R)、多聚(I：C12U))、非CpG细菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，如：环磷酰胺、舒尼替单抗、西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGFTrap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系统的其他抗体靶向性主要结构(如：抗-CD40、抗-TGFβ、抗-TNFα受体)和SC58175，这些药物都可以有治疗作用和/或充当佐剂。技术人员无需过度实验就很容易确定本发明中有用的佐剂和添加剂的数量和浓度。
首选佐剂是抗-CD40、咪喹莫特、瑞喹莫德、GM-CSF、环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗、干扰素α、CpG寡核苷酸及衍生物、多聚(I：C)及衍生物、RNA、西地那非和PLG或病毒颗粒的微粒制剂。
本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特、resiquimod和干扰素-α。
本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特和resimiquimod。在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂为环磷酰胺、咪喹莫特或resiquimod。更优选的佐剂是Montanide IMS1312、Montanide ISA206、Montanide ISA50V、Montanide ISA-51、聚-ICLC和抗CD40mAB或其组合物。
此组合药物为非肠道注射使用，如皮下、皮内、肌肉注射，也可口服。为此，肽和其他选择性分子在药用载体中分解或悬浮，优选为水载体。此外，组合物可包含辅料，如：缓冲剂、结合剂、冲击剂、稀释剂、香料、润滑剂等。这些肽也可与免疫刺激物质合用，如：细胞因子。可用于此类组合物的更多辅料可在从A.Kibbe所著的Hand book of PharmaceuticalExcipiems(Kibbe，2000)等书中获知。此组合药物可用于阻止、预防和/或治疗腺瘤或癌性疾病。例如，EP2112253中有示例制剂。
重要的是要认识到，通过本发明的疫苗引发的免疫应答在不同的细胞阶段和开发的不同阶段攻击癌症。而且不同的癌症相关信号通路被攻击。这相对于其他疫苗的优势，这些疫苗只针对一个或几个靶标，这可以会导致肿瘤很容易适应于攻击(肿瘤逃逸)。此外，并非所有的个体肿瘤都表达相同模式的抗原。因此，几个肿瘤相关肽的组合确保了每个肿瘤都承担至少一些靶标。该组合物以这样的方式设计，预期每个肿瘤可表达几种抗原并覆盖肿瘤生长和维持所需要的几种独立的途径。因此，疫苗可易于”现成的”用于较大患者群体。这意味着，预选择接受疫苗治疗的患者可限制为HLA分型，无需抗原表达的任何额外的生物标志物评估，但仍然确保多个靶标同时被诱导的免疫应答攻击，这对于疗效很重要(Banchereau et al.，2001；Walter et al.，2012)。
本文所用的“支架”一词是指与决定因子(如抗原)特异性结合的分子。在一项实施方案中，支架是能够引导其所连接的实体(例如，(第二)抗原结合部分)至目标靶点，例如，至特定类型的肿瘤细胞或承载抗原决定簇的肿瘤基质(如根据目前申请中肽和MHC的复合体)。在另一项实施例中，支架能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复合体抗原)激活信号通路。支架包括但不限于抗体及其片段，抗体的抗原结合区，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区，结合的蛋白包括至少一个锚蛋白重复序列基元和单域抗原结合(SDAB)分子、适体、(可溶)TCR和(经修饰的)细胞，例如同种异体或自体T细胞。为了评估某个分子是否是结合至靶点的支架，可进行结合测定。
“特异性”结合是指，与其他天然肽-MHC复合体相比，该支架与感兴趣的肽-MHC复合体更好地结合，结合程度为，带有活性分子的支架能够杀死带有特定靶点的细胞，不能杀死不带有特定靶点但呈递其他肽-MHC复合体的细胞。如果交叉反应性肽-MHC的肽并不是天然的，即，并非来自人HLA-多肽组，则结合至其他肽-MHC复合体是无关紧要的。评估靶细胞杀伤的测试在本领域中是公知的。它们应该含有未改变的肽-MHC提呈的靶细胞(原发细胞或细胞系)或载有肽的细胞进行，以便达到天然肽-MHC的水平。
各支架可包括一个标记，其通过确定是否存在标记所提供的信号可检测到结合支架。例如，该支架可用荧光染料或任何其他适用的细胞标记分子进行标记。此类标记分子是本领域中公知的。例如，通过荧光染料进行的荧光标记可通过荧光或激光扫描显微术或流式细胞术提供结合适体的可视化。
各支架可与第二个活性分子(例如IL-21、抗CD3、抗CD28)共轭。
关于多肽支架的进一步信息，可参阅，例如，在WO2014/071978A1背景技术部分，并作为参考文献引用。
本发明还涉及适体。适体(例如，参见WO2014/191359及其中引用的文献)是短的单链核酸分子，其可以折叠为特定的三维结构并识别特定的靶标结构。它们似乎是开发靶向治疗的合适替代方法。适体已显示可选择性与具有高亲和力和特异性的复合体靶标相结合。
识别细胞表面分子的适体在过去十年内已经确定，并为开发诊断和治疗方法提供了手段。由于适体已显示几乎无毒性和免疫原性，因此，它们是生物医学应用中有前景的候选物质。事实上适体，例如前列腺特异性膜抗原识别适体，已被成功地用于靶向治疗并在体内模型的异种移植物中显示出功能。此外，认识到特定肿瘤细胞系的适体也已确定。
可选择DNA适体来揭示各种癌细胞的广谱标识属性，特别是那些来自于实体瘤的细胞，而非致瘤和主要健康细胞不被识别。如果所识别的适体不仅识别特定的肿瘤亚型，而且与一系列肿瘤相互作用，这使适体适用于作为所谓的广谱诊断和治疗手段。
此外，用流式细胞仪对细胞结合行为的研究显示，适体在纳摩尔级别显示出很好的亲和力。
适体用于诊断和治疗目的。此外，也可以显示，一些适体被肿瘤细胞吸取，因而可作为抗癌剂靶向递送的分子赋形剂，将例如siRNA等抗癌制剂送入肿瘤细胞。
适体可以针对复杂目标如细胞、和组织、以及本发明肽与MHC分子的复合物进行选择，使用cell-SELEX(通过指数富集的配体系统进化)技术。
本发明中的肽可用于生成和开发出针对MHC/肽复合物的特定抗体。这些抗体可用于治疗，将毒素或放射性物质靶向病变组织。这些抗体的另一用途是为了成像之目的(如PET)将放射性核素靶向病变组织。这可有助于检测小转移灶或确定病变组织的大小和准确位置。
因此，本发明的另一方面是提出产生特异性结合至与HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性复合体(MHC)的一种重组抗体的方法，该方法包括：用可溶形式的与HLA限制性抗原(优选为本发明的一种肽)络合的(MHC)I或II类分子对包含表达所述主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类的基因工程改造的非人哺乳动物进行免疫；将mRNA分子与产生自所述非人哺乳动物细胞的抗体分离；构建一个噬菌体展示库，显示由所述mRNA分子编码的蛋白分子；以及将至少一个噬菌体与所述噬菌体显示库分离，所述的至少一个噬菌体显示所述抗体特异性地结合至与HLA限制性抗原络合的所述人主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类。
因此，本发明的另一方面提出一种抗体，其特异性结合至与一种HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性复合体(MHC)，其中该抗体优选为多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体和/或嵌合抗体。
产生这种抗体和单链I类主要组织兼容性复合物的相应方法，以及产生这些抗体的其他工具在WO03/068201、WO2004/084798、WO01/72768、WO03/070752以及出版物(Cohenet al.，2003a；Cohen et al.，2003b；Denkberg et al.，2003)中进行了披露，为了本发明之目的，所有参考文献通过引用被完整地并入本文。
优选地，该抗体与复合体的结合亲和力低于20纳摩尔，优选为低于10纳摩尔，这在本发明情况下也被视为具有“特异性”。
本说明书涉及与MAG-003特异性结合的TCR蛋白或其变体或功能片段。
本发明进一步涉及本发明的TCR蛋白，其中该TCR蛋白(在化学上)被修饰和/或包含非肽键。
本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明的所述TCR蛋白，前提是该TCR蛋白并非完整(完全)的人蛋白。
本发明进一步涉及一种本发明的核酸，为DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合。
本发明进一步涉及一种能表达本发明核酸的表达载体。
本发明进一步涉及本发明的TCR蛋白、本发明的核酸或本发明的表达载体的药用用途，特别是用于治疗非小细胞肺癌。
本发明进一步涉及含本发明核酸或本发明表达载体的宿主细胞。
本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其为T细胞，优选为CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞。
本说明书还涉及一种制备本发明TCR蛋白的方法，所述方法包括：用A2/MAG-003单体孵育来自HLA-A*02阴性健康供体的PBMC，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育PBMC，并通过荧光激活细胞分选(FACS)-Calibur分析来分离高亲和力T细胞。
本说明书还涉及一种制备本发明TCR蛋白的方法，所述方法包括：用A2/p286-1Y2L单体孵育来自HLA-A*02阴性健康供体的PBMC，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育PBMC，并通过荧光激活细胞分选(FACS)-Calibur分析分离高亲和力T细胞。
本说明书还涉及一种制备本发明TCR蛋白的方法，所述方法包括：用A2/p286-1Y2L9L单体孵育来自HLA-A*02阴性健康供体的PBMC，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育PBMC，并通过荧光激活细胞分选(FACS)-Calibur分析分离高亲和力T细胞。
本说明书还涉及一种制备本发明TCR蛋白的方法，所述方法包括：获得含完整人体TCRαβ基因位点(1.1和0.7Mb)的转基因小鼠(其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏)，用MAG-003对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光激活细胞分选(FACS)-Calibur分析分离高亲和力T细胞。
本说明书还涉及一种制备本发明TCR蛋白的方法，所述方法包括：获得含完整人体TCRαβ基因位点(1.1和0.7Mb)的转基因小鼠(其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏)，用p286-1Y2L对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光激活细胞分选(FACS)-Calibur分析分离高亲和力T细胞。
本说明书还涉及一种制备本说明书TCR蛋白的方法，所述方法包括：获得含完整人体TCRαβ基因位点(1.1和0.7Mb)的转基因小鼠(其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏)，用p286-1Y2L9L对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光激活细胞分选(FACS)-Calibur分析分离高亲和力T细胞。
本发明还涉及一种在靶细胞异常表达MAG-003的患者中杀灭靶细胞的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本发明T细胞。
本发明进一步涉及本发明的任意TCR蛋白、本发明的核酸、本发明的表达载体、本发明的细胞、本发明的激活细胞毒性T淋巴细胞作为药物或在制造药物中的用途。本发明进一步涉及本发明的用途，其中药剂可有效抗癌。
本发明进一步涉及本发明的用途，其中所述癌细胞为非小细胞肺癌或其他实体或血液肿瘤细胞，如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、默克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊和胆管癌和食管癌。
本发明进一步涉及一种基于本发明肽的特定标志物蛋白和生物标志物，在此称为“靶标”，其可用于诊断和/或判断非小细胞肺癌的预后。本发明还涉及这些新靶点在癌症治疗中的用途。
本文中术语“抗体”为广义上的定义，既包括多克隆也包括单克隆抗体。除了完整或”全部”的免疫球蛋白分子，“抗体”这一术语还包括这些免疫球蛋白分子和人源化免疫球蛋白分子的片段(如，CDR、Fv、Fab和Fc片段)或聚合物，只要它们表现出本发明的任何期望属性(例如，非小细胞肺癌标志物(多)肽的特异性结合、将毒素传递给癌症标志物基因表达水平增加时的非小细胞肺癌细胞和/或抑制非小细胞肺癌标志物多肽的活性)。
只要有可能，本发明的抗体可从商业来源购买。本发明的抗体也可以使用已知的方法制得。技术人员会了解全长非小细胞肺癌标志物多肽或其片段可用于产生本发明的抗体。用于产生本发明抗体的多肽可部分或全部地由天然源经纯化而得，也可利用重组DNA技术生产。
本领域的技术人员会认识到，两种或两种以上不同集合的单克隆抗体或多克隆抗体能最大限度地增加获得一种含预期用途所需的特异性和亲和力(例如，ELISA法、免疫组织化学、体内成像、免疫毒素疗法)的抗体的可以性。根据抗体的用途，用已知的方法对其期望活性进行测试(例如，ELISA法、免疫组织化学、免疫治疗等；要获取产生和测试抗体的进一步指导，请参阅，例如，Greenfield，2014(Greenfield，2014))。例如，该抗体可用ELISA法或免疫印迹法、免疫组织化学染色福尔马林固定的癌组织或冰冻的组织切片进行检测。在初次体外表征后，用于治疗或体内诊断用途的抗体根据已知的临床测试方法进行检测。
此处使用的术语“单克隆抗体”是指从大量同质抗体中获得的一种抗体，即，除了可能存在少量的自然发生的突变外，由相同的抗体组成的抗体群。此处所述的单克隆抗体具体包括”嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与从特定物种中获得的抗体或属于特定抗体类型和分类型抗体的相应序列相同(同质)，同时，剩余链与从其他物种中获得的抗体或属于特定抗体类型和子类型抗体的相应序列以及这些抗体的片段相同(同质)，只要他们表现出预期的拮抗活性(美国4816567号专利，其在此以其整体并入)。
本发明的单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制得。在杂交瘤方法中，老鼠或其他适当的宿主动物通常会被接种一种免疫剂，以诱导产生或能够产生与免疫剂特异性结合抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可在体外进行免疫接种。
单克隆抗体也可由DNA重组方法制得，如：美国4816567号专利所述。编码本发明单克隆抗体的DNA可很容易地使用传统程序进行分离和测序(例如：通过使用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
体外方法也适用于制备单价抗体。抗体消化以产生抗体的片段，尤其是Fab片段，可以通过使用本领域已知的常规技术完成。例如，可以通过使用木瓜蛋白酶完成消化。木瓜蛋白酶消化的实施例在WO94/29348和美国4342566号专利中有描述。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两种相同的抗原结合性片段，称为Fab片段(每个片段都有一个抗原结合点)和残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段和一个pfc′片段。
抗体片段，不论其是否附着于其他序列，均可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、删除、替换、或其他选择性修饰，但前提是，片段的活性与非修饰的抗体或抗体片段相比没有显著的改变或损失。这些修饰可提供一些额外的属性，如：删除/添加可与二硫键结合的氨基酸，以增加其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，抗体片段必须拥有生物活性的特性，如：结合活性、调节结合结构域的结合力等。抗体的功能性或活性区域可通过蛋白特定区域的基因突变、随后表达和测试所表达的多肽进行确定。这些方法为本行业技术人员所熟知，包括突变编码抗体片段的核酸的特定位点基因。
本发明的抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(如：鼠)抗体的人源化形式为嵌合抗体免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如：Fv、Fab、Fab′或抗体的其他抗原结合序列)，其中包含从非人免疫球蛋白中获得的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有与其特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔子)CDR的残基取代。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架(FR)残基被相应的非人残基取代。人源化抗体也可能包括在受体抗体和导入的CDR或框架序列中都没有发现的残基。一般来说，人源化抗体将包括几乎所有的至少一个、通常为二个可变域，其中，全部或几乎全部的CDR区域均对应于非人免疫球蛋白的区域并且全部或几乎全部的FR区域均为人免疫球蛋白相同序列的区域。理想情况是，人源化抗体还将包括至少免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。
人源化非人抗体的方法为本行业所熟知。一般来说，人源化抗体具有一个或多个从非人源头引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基往往被称为“输入”残基，通常从“输入”可变域中获得。人源化基本上可以通过将啮齿动物CDR或CDR序列取代为相应的人抗体序列而完成。因此，这种“人源化”抗体为嵌合抗体(美国4816567号专利)，其中大大少于完整的人可变域被来自于非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常为人抗体，其中有些CDR残基以及可以的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。
可使用免疫后在内源性免疫球蛋白产生缺失时能产生完整人抗体的转基因动物(如：小鼠)。例如，它被描述为，嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区域基因的纯合性缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。在此种系变种小鼠中人种系免疫球蛋白基因数组的转移在抗原攻击后将导致人抗体的生成。人抗体也可在噬菌体展示库中产生。
本发明的抗体优选为通过药用载体的形式给予受试者。通常，在制剂中使用适量的药用盐，以使制剂等渗。药用载体的例子包括生理盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH值优选为约5至8，更优选为约7至7.5。此外，载体还包括缓释制剂，如：含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，其中基质为有形物品形式，如：薄膜、脂质体或微粒。本行业的技术人员熟知，某些载体可以为更优选，取决于例如，抗体的给药途径和浓度。
该抗体可通过注射(如：静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内)或通过输注等其他方法给予受试者、患者或细胞，确保其以有效的形式传输到血液中。这些抗体也可以通过瘤内或瘤周途径给予，从而发挥局部和全身的治疗作用。局部或静脉注射为优选。
抗体给药的有效剂量和时间表可根据经验确定，并且作出此类决定属本行业的技术范围内。本行业的技术人员会明白，必须给予的抗体剂量根据以下因素会有所不同，例如：接受抗体的受试者、给药途径、使用的抗体以及其他正在使用的药物的特定类型。单独使用的抗体的通常日剂量可以为约1μg/kg至最多100mg/kg体重或更多，这取决于上述因素。给予的抗体，优选用于治疗非小细胞肺癌后，治疗抗体的疗效可通过技术人员熟知的不同方法评估。例如：接受治疗的受试者癌症的大小、数量和/或分布可使用标准肿瘤成像技术进行监测。因治疗而给予的抗体与不给予抗体时的病程相比，可阻止肿瘤生长、导致肿瘤缩小、和/或阻止新肿瘤的发展，这样的抗体是一种有效治疗癌症的抗体。
本发明的另一方面提出了制备识别特异性肽-MHC复合物的可溶性T细胞受体(sTCR)的一种方法。这种可溶性T细胞受体可从特异性T细胞克隆中产生，并且它们的亲和力可以通过互补决定区靶向诱变而增加。为了T细胞受体选择之目的，可以使用噬菌体展示(美国2010/0113300，(Liddy et al.，2012))。为了在噬菌体展示期间以及实际使用为药物时稳定T细胞受体之目的，可通过非天然二硫键、其他共价键(单链T细胞受体)或通过二聚化结构域连接α和β链(Boulter et al.，2003；Card et al.，2004；Willcox et al.，1999)。T细胞受体可以连接到毒素、药物、细胞因子(参见US2013/0115191)、域招募效应细胞，如抗CD3域等，以便对靶细胞执行特定的功能。此外，它可以表达于用于过继转移的T细胞。参见例如WO2004/033685A1、WO2004/074322A1和WO2013/057586A1，其内容通过引用整体并入。
此外，可用本发明的肽和/或TCR或抗体或其他结合分子在活检样本的基础上验证病理师对癌症的诊断。
该抗体或TCR也可用于体内诊断实验。一般来说，抗体用放射性核素标记(如：111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)，从而可用免疫成像法定位肿瘤。在一实施方案中，其中的抗体或片段与两个或两个以上选自包括上述蛋白的组的蛋白质靶目标细胞外域结合，并且亲和力值(Kd)低于1x10μM。
诊断用抗体可用适合各种影像学方法检测的探针进行标记。探针检测方法包括但不限于，荧光、光、共聚焦和电镜方法；磁共振成像和光谱学技术；透视、计算机断层扫描和正电子发射断层扫描。合适的探针包括但不限于，荧光素、罗丹明、曙红及其它荧光团、放射性同位素、黄金、钆和其他稀土、顺磁铁、氟-18和其他正电子发射放射性核素。此外，探针可以是双功能或多功能的，并且可被不止一种以上方式检测。这些抗体可用所述的探针直接或间接进行标记。抗体探针的连接，包括探针的共价连接、将探针融合入抗体、以及螯合化合物的共价连接从而结合探针、以及其他本行业熟知的方法。对于免疫组织化学方法，疾病组织样本可以是新鲜或冷冻或可以包埋于石蜡中以及用福尔马林等防腐剂固定。固定或包埋的切片包括与标记一抗和二抗接触的样本，其中该抗体用于检测原位蛋白的表达。
通过以下实施例对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。为了本发明之目的，所有参考文献均以完整引用的形式并入本文。
附图说明
图1显示了MAGEA4中MAG-003外显子表达(肿瘤对比健康组织，RNASeq数据)。将健康组织上MAGEA4中MAGE-003外显子表达与各种实体肿瘤(红色条)上的MAGE-003外显子表达进行比较。健康组织亚型分为高(深绿色条)、中等(浅绿色条)和低风险(灰色条)组织。每个条代表一个样本。仅在胎盘和睾丸中发现正常组织上有高表达(低风险)。(RPKM＝每百万映射读数每千碱基读数)
图2显示了MAGEA8上MAG-003外显子表达(肿瘤对比健康组织，RNASeq数据)。将健康组织上的MAGEA8外显子表达与各种实体肿瘤(红色条)上的MAGEA8外显子表达进行比较。健康组织亚型分为高(深绿色条)、中等(浅绿色条)和低风险(灰色条)组织。每个条代表一个样本。仅在胎盘中发现正常组织上有高表达(低风险)。(RPKM＝每百万映射读数每千碱基读数)。
图3-5显示了与载有MAG-003肽(SEQ ID NO：1)或SEQ ID NO：1第1-9位上的各种MAG-003丙氨酸取代变体的靶细胞共孵育后，用MAG-003特异性TCR的α和β链RNA电穿孔的CD8+T细胞的IFNγ释放，如本文所公开。
图6显示了实施例7的MAGEA4表达。在所提供的癌症标本中MAGEA4mRNA可检测。表达水平范围为头颈癌和非小细胞肺癌样本(HNSCC062T1、HNSCC064T1和NSCLC004T1)中表达尚可，在非小细胞肺癌和卵巢癌样本(NSCLC006T1和OC036T1)中表达相当低。
实施例
当与来自自体情况(即患者)的T细胞相比时，异体反应性环境可用于规避自身耐受性并产生具有更高亲合力的T细胞。此类环境的实例包括体外产生异体HLA反应性肽特异性T细胞(Sadovnikova et al.1998；Savage et al.2004；Wilde et al.2012)和用人-MHC或人TCR的转基因小鼠进行免疫(Stanislawski et al.2001；Li et al.2010)。
实施例1
体外产生异体HLA反应性肽特异性T细胞(Sadovnikovaet al.2004)
获得知情同意后，使用来自HLA-A*02阴性健康供体的PBMC。从MBLI中获得含有MAG-003的重组生物素化HLA-A2I类单体和A2荧光四聚体。将PBMC使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释的抗CD20SA室温下孵育1小时，洗涤，并使用生物素化的A2/MAG-003单体室温下温育30分钟，洗涤并在具有10％人AB血清的RPMI中用24孔板以3×106个细胞/孔进行铺板。第1天以10ng/mL加入白细胞介素7(IL-7；R&DSystems，Minneapolis，MN)，第4天以10U/mL加入IL-2(Chiron，Harefield，UnitedKingdom)。在5周的期间，每周用新鲜的PBMC对细胞进行再刺激，用1∶1的比例与应答细胞混合，并在24孔板中以3×106/孔进行铺板。
为了获得高亲合力T细胞，将大约106个含有HLA-A2/MAG-003四聚体-藻红蛋白(PE)(获得自MBLI)的PBMC37℃下孵育30分钟，随后用抗CD8-异硫氰酸荧光素(FITC)/别藻蓝蛋白(APC)在4℃下孵育20分钟，然后进行荧光激活细胞分选(FACS)-Calibur分析。用FACS-Vantage(BectonDickinson，Cowley，Oxford，UnitedKingdom)进行分选。分选的四聚体阳性细胞在24孔板中扩增，方法为每孔2x105个分选细胞、2x106个经照射的A2阴性PBMC作为进料、2x104CD3/CD28珠/mL(Dynal，OsloNorway)和IL-2(1000U/mL)。然后使用如此获得的高亲合力T细胞鉴定和分离TCR进行氨基酸/DNA序列测定，并使用本领域熟知的方法将其克隆到表达载体中。
实施例2
用人-MHC或人TCR的转基因小鼠进行免疫
MAG-003用于用完全的人TCRαβ基因座(1.1和0.7Mb)对转基因小鼠进行免疫，其T细胞表达补偿小鼠TCR缺陷的多种人TCR谱。(Li et al.2010)。为了获得高亲合力T细胞，从转基因小鼠获得的PBMC与四聚体-藻红蛋白(PE)一起孵育，然后按上所述进行细胞分选。然后使用如此获得的高亲合力T细胞鉴定和分离TCR进行氨基酸/DNA序列测定，并使用本领域熟知的方法将其克隆到表达载体中。
一方面，MAG-003及其变体，即p286-1Y2L(具有2个氨基酸取代，SEQ ID NO：2)和p286-1Y2L9L(具有3个氨基酸取代，SEQ ID NO：3)，表现出强有力的结合亲和力和HLA-A*0201分子稳定性。特别地，p286-1Y2L9L显示可诱导特异性CTL，其一方面裂解来自健康供体PBMC和HLA-A2.1/Kb转基因小鼠的靶向癌细胞。参见，例如，(Wu et al.2011)，该文中的内容通过引用整体并入本文。
为了获得针对MHCI或II/p286-1Y2L或p286-1Y2L9L复合体的高亲合力TCR，这些肽可用于实施例1和2中描述的方法。然后使用如此获得的高亲合力T细胞鉴定和分离TCR进行氨基酸/DNA序列测定，并使用本领域熟知的方法将其克隆到表达载体中。
高亲合力TCR变体也可以通过酵母、噬菌体或T细胞展示技术从CDR突变体库中选择(Holler et al.2003；Li et al.2005；Chervin et al.2008)。因此，候选TCR变体为设计TCRCDR突变提供了指导，以获得高亲和力TCR变体(Robbins et al.2008；Zoete etal.2007)。
实施例3：TCR的克隆
克隆TCR的方法是本领域已知的，例如，如美国专利8,519,100中所述，其全部内容通过引用并入本文用于所述方法。编码限制性位点NdeI(用于在细菌中有效启动表达的被引入的甲硫氨酸)的α链可变区序列特异性寡核苷酸A1，和编码限制性位点SalI的α链恒定区序列特异性寡核苷酸A2被用于扩增α链可变区。在β链的情况下，编码限制性位点，如NdeI(用于在细菌中有效启动表达的被引入的甲硫氨酸)的β链可变区序列特异性寡核苷酸B1和编码限制性位点，如AgeI的β链恒定区序列特异性寡核苷酸B2被用于扩增β链可变区。
通过(Molecular Cloninga Laboratory Manual Thirdeditionby SambrookandRussell)中描述的标准方法将α和β可变区克隆到含有Cα或Cβ的基于pGMT7的表达质粒中。使用Applied Biosystems 3730x1 DNA分析仪对质粒进行测序。
将用NdeI和SalI切割的编码TCRα链的DNA序列连接到用NdeI和XhoI切割的pGMT7+Ca载体中。将用NdeI和AgeI切割的编码TCRβ链的DNA序列连接到用NdeI和AgeI切割的单独pGMT7+Cβ载体中。将结合的质粒转化为感受态大肠杆菌菌株XL1-blue细胞中，并在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂板上铺板。在37℃孵育过夜后，挑取单个菌落，并在含有100μg/ml氨苄青霉素的10mlLB中摇荡培养过夜。使用Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化克隆的质粒，并使用自动DNA测序仪(Lark Technologies)对插入片段进行测序。
实施例4：自体T细胞工程技术
T细胞可进行工程化处理以表达高亲合力TCR(所谓的TCR疗法)或蛋白融合衍生的嵌合抗原受体(CAR)，增强了对MHCI/MAG-003复合体或MHCII/MAG-003复合体的抗原特异性。一方面，该方法克服了与中枢和外周耐受性相关的一些限制，并且生成在靶向作用于肿瘤更有效的T细胞，而不需要患者进行新的T细胞活化。
为了获得表达本说明书TCR的T细胞，编码肿瘤特异性TCR-α和/或TCR-β链的核酸(按实施例1-3中所述进行鉴定和分离)被克隆入表达载体，诸如γ逆转录病毒或慢病毒。重组病毒产生，然后测试功能，如抗原特异性和功能性亲合力。然后，最终产品的等分试样被用于转导靶T细胞群体(一般纯化自患者的PBMC)，在输入患者前展开。
引入外周T细胞的TCR链可能与内源性TCR链竞争，与TCR表面表达所需的CD3复合体结合。由于高水平的TCR表面表达对通过表达肿瘤靶抗原的细胞触发赋予适当的灵敏度是必要的(Cooper et al.，2000；Labrecque et al.，2001)，因此增强TCR-α和TCR-β基因表达水平的策略是TCR基因治疗中的重要考虑因素。
为了增加本说明书的TCR表达，本说明书可使用强启动子，例如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)、巨细胞病毒(CMV)、鼠干细胞病毒(MSCV)U3、磷酸甘油酸激酶(PGK)、β-肌动蛋白、泛素蛋白和猿猴病毒40(SV40)/CD43复合启动子(Cooper et al.，2004；Jones etal.，2009)、拉长因子(EF)-1a(Tsuji et al.，2005)和脾脏病灶形成病毒(SFFV)启动子(Joseph et al.，2008)。
除了强启动子外，许多TCR表达盒含有附加的元素，可提高转基因表达，包括中枢多聚嘌呤区(CPPT)，其促进了慢病毒构建体的核易位(Follenzi et al.，2000)，和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元素(WPRE)，其通过提高RNA稳定性增加转基因表达水平(Zuffereyet al.，1999)。
实现高水平的TCR表面表达需要引入TCR的TCR-α和TCR-β链高水平转录。为了实现它，本说明书的TCR-α和TCR-β链可在单一的载体中被克隆入双顺反子构建体，其已被证明能够克服这一障碍。使用TCR-α和TCR-β链在之间的病毒核糖体间进入位点(IRES)导致两链的协同表达，因为TCR-α和TCR-β链均由在翻译过程中分成两个蛋白质的单一转录物产生，从而确保了产生TCR-α和TCR-β链的相等摩尔比。(Schmitt et al.2009)。
已证明有利于增加TCR转基因表达的另一种修饰是密码子优化。遗传密码冗余让一些氨基酸被一个以上的密码子编码，但某些密码子没有其他密码子“理想”，因为匹配tRNA以及其他因子的相对可用性(Gustafsson et al.，2004)。修改TCR-α和TCR-β基因序列使得每个氨基酸被用于哺乳动物基因表达的最佳密码子编码，以及消除mRNA不稳定性基序或隐蔽剪接位点，已显示可显著提高TCR-α和TCR-β基因表达(Scholten et al.，2006)。
此外，引入的和内源性TCR链之间的错配可能会导致获得特异性，这些特异性对自身免疫构成显著风险。例如，混合TCR二聚体的形成可能会减少可用以形成正确配对TCR复合体的CD3分子数目，因此，可以显著降低表达所引入TCR的细胞的功能性亲合力(Kuballet al.，2007)。
为了减少错配，本说明书引入的TCR链的C-末端结构域可以进行修改以促进链间亲和力，而降低引入链与内源TCR配对的能力。这些策略可能包括用鼠配对物取代人类TCR-α和TCR-βC端结构域(鼠化C端结构域)；通过引入第二半胱氨酸残基到引入TCR的TCR-α和TCR-β链产生C末端结构域的第二间二硫键(半胱氨酸修饰)；交换TCR-α和TCR-β链C端结构域的相互作用残基(“孔中小块”)；直接熔合TCR-α和TCR-β链可变结构域至CD3ζ(CD3ζ融合)。(Schmitt et al.2009)。
本说明书提出了可用于治疗癌症/肿瘤(优选为过度提呈或只提呈MAG-003的非小细胞肺癌)的TCR蛋白。
实施例5：同种异体T细胞工程技术
γδT细胞是涉及抗病原体第一道防线的非常规T淋巴细胞效应子，可以通过激活受体等、TCR-γ和TCR-δ链以MHC无关的方式与肿瘤细胞相互作用并根除肿瘤细胞。这些γδT细胞显示出预活化的表型，其在激活后可快速产生细胞因子(IFN-γ、TNF-α)和发生强细胞毒性反应。这些T细胞对许多癌症具有抗肿瘤活性，并表明γδT细胞介导的免疫治疗是可行的并且可诱导客观的肿瘤反应。(Braza et al.20l3)。
使用固定化抗原、激动单克隆抗体(mAb)，肿瘤衍生的人造抗原呈递细胞(aAPC)或活化mAb和aAPC的组合的最新进展已成功地用寡克隆或多克隆TCR扩增γδT细胞谱。例如，固定化的主要组织相容性复合体I类链相关A是表达TCRδ1同种型的γδT细胞的刺激物，且板结合活化抗体已经离体扩增了Vδ1和Vδ2细胞。在aAPC上共培养后，产生了临床上足够量的TCRδ1、TCRδ2和TCRδ1negTCRδ2neg，并且这些亚组在体外和体内显示出记忆表型和对肿瘤反应性的差异。(Deniger et al.2014)。
另外，通过引入TCR-α和TCR-β链可以证明γδT细胞适于遗传修饰。(Hiasa etal.2009)。本说明书的另一方面涉及表达与MAG-003结合的TCR-α和TCR-β的γδT细胞的产生。为此，γδT细胞通过Deniger et al.2014所述的方法扩增，接着将表达与MAG-003结合(如实施例3所述)的TCR的重组病毒转导入扩增的γδT细胞。然后将病毒转导的γδT细胞输注入患者。
实施例6：免疫原性和功能性T细胞数据
使用模拟药品的制造程序的方案测试MAG-003的免疫原性。观察健康供体MAG-003特异性T细胞的引发。生成的T细胞能够杀死载有肽的靶细胞，证明其功能性。数据表明1)MAG-003为免疫原性靶标，2)产生针对MAG-003的T细胞具有功能性。
所产生的其他数据提供了证据表明，MAG-003是与HLA-A*02：01结合非常良好的肽。
实施例7：组织中的MAGEA4mRNA表达
使用原位杂交(ISH)技术直接在福尔马林固定的或冷冻的组织切片中检测mRNA表达。由于其高灵敏度和空间分辨率，它是一种合适的方法来确定细胞类型特异性靶标表达和癌组织切片内靶标表达的分布或频率。
使用Advanced Cell Diagnostics(ACD)开发的BaseScopeTM技术进行ISH检测MAGEA4mRNA。BaseScopeTM技术基于四对Z形寡核苷酸探针与靶序列的杂交。信号扩增通过分支DNA扩增实现，该扩增基于寡核苷酸的多个杂交步骤，最终构建分支DNA(bDNA)树。最后，大量的标记探针与bDNA树的分支杂交，并可检测增强的信号。显色BaseScopeTM检测试剂盒(RED)包括与酶(碱性磷酸酶)连接的标记探针。信号检测取决于显色底物FastRed的酶转化，它会额外放大原始信号。BaseScopeTM是一种非常灵敏的技术，这是因为信号放大过程高效，与高灵敏度配对且Z探针对与靶标mRNA强大结合，即使被部分交联或降解。根据ACD的说明，单个探针对与每个单个mRNA分子结合足以产生可检测的ISH信号。
每个ISH实验细分为两个方法学过程：1)用于靶标修复的组织预处理，以及2)靶标杂交、信号放大和检测。最佳的预处理条件对于在FFPE组织切片中成功进行靶标检测至关重要。固定过程诱导细胞和组织中蛋白质、DNA和RNA的交联，从而掩盖杂交位点。因此，为了确保靶标mRNA的可取性和探针组的适当结合，这些交联必须在靶杂交之前除去。组织预处理包括三个不连续的步骤：1)通过过氧化氢处理阻断内源碱性磷酸酶，2)通过在靶标修复试剂中煮沸进行靶标修复，以及3)通过蛋白酶消化进行靶标修复。由于不同FFPE块之间的固定和交联程度可能不同，因此必须通过实验确定每个FFPE块的最佳靶标修复条件。因此，将组织切片展开至不同的煮沸和蛋白酶消化时间，随后与阳性和阴性对照探针组杂交。通过显微镜评估阳性对照中的特异性信号强度、阴性对照中的非特异性背景和组织形态学来确定最佳条件。根据制造商的方案进行组织预处理。预处理试剂包含在BaseScopeTM试剂盒中。在完成不同的预处理步骤之后，通过特异性探针组与相关mRNA杂交以及随后的分支DNA信号扩增和显色或荧光信号检测来评估靶标表达。根据制造商的方案进行所有的测定。
表10：表达分析
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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<212> PRT
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<220>
<221> 其他特性
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是Lys或Tyr
<220>
<221> 其他特性
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是Val、Leu或Ala
<220>
<221> 其他特性
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可以是Val、Leu、Ala或Ile
<400> 25
Xaa Xaa Leu Glu His Val Val Arg Xaa
1 5

Claims (41)

1.一种肽及其药用盐，所述肽包括选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24、以及与SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.24具有至少88％同源性的变体序列中的氨基酸序列，其中变体肽与主要组织兼容性复合体(MHC)结合和/或诱导T细胞与该变体肽发生交叉反应，其中所述肽不是全长多肽。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽有能力与MHC-I或-II类分子结合，其中所述肽与MHC结合时能够被CD4和/或CD8T细胞识别。
3.根据权利要求1或2所述的肽或其变体，其中氨基酸序列包括SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.24中任一序列的连续氨基酸延伸区段。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽或其变体，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸、更优选为8至16个氨基酸、最优选为该肽由或基本由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽或其变体，其中所述肽被修饰，和/或包含非肽键。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽或其变体，其中所述肽为融合蛋白的一部分，尤其包含HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸。
7.一种核酸，其编码权利要求1至6中任一项所述的肽或其变体，其任选地连接到异源启动子序列。
8.一种表达载体，其能够表达或表达权利要求7所述的核酸。
9.一种重组宿主细胞，其包括权利要求1至6所述的肽、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体，其中所述宿主细胞优选为抗原提呈细胞，例如树突状细胞。
10.一种制备权利要求1至6中任一项所述的肽或其变体的方法，该方法包括培养权利要求9所述的宿主细胞，该宿主细胞提呈权利要求1至6所述的肽、或表达权利要求7所述的核酸、或载有权利要求8所述的表达载体，以及从该宿主细胞或其培养基中分离出肽或其变体。
11.一种体外制备激活的T淋巴细胞的方法，该方法包括将T细胞与载有抗原的人I或II类MHC分子体外接触一段时间，该时间足以以抗原特异性的方式激活T细胞，人I或II类MHC分子在合适的抗原提呈细胞表面或人工模拟的抗原提呈细胞结构表面上表达，其中所述抗原为权利要求1至4任一项中所述的肽。
12.一种激活的T淋巴细胞，由权利要求11所述的方法制成，其有选择性地识别一种细胞，该细胞提呈含权利要求1至4任一项中给定氨基酸序列的多肽。
13.一种杀灭患者中靶细胞的方法，其中该靶细胞提呈含有权利要求1至4中任一项给出的氨基酸序列的多肽，所述方法包括向患者施用有效量的权利要求12所述的激活的T细胞。
14.一种抗体，特别是可溶性或膜结合性抗体，其特异性地识别权利要求1至5中所述的肽或其变体，优选为与MHC分子结合时的权利要求1至5中任一项所述的肽或变体。
15.权利要求1至6任一项中所述的肽、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的宿主细胞或权利要求12所述的激活的T淋巴细胞或权利要求14所述的抗体在药物中的用途。
16.权利要求1至6任一项中所述的肽、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的宿主细胞、权利要求12所述的激活的T淋巴细胞或权利要求14所述的抗体在癌症诊断和/或癌症治疗、或制备抗癌药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的权利要求1至6任一项中所述的肽、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的宿主细胞、权利要求12所述的激活的T淋巴细胞或权利要求14所述的抗体的用途，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、默克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌和胆管癌和食管癌以及其他肿瘤，这些肿瘤过表达能够衍生得到SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24的肽的蛋白。
18.一种试剂盒，包括：
(a)容器，包含药物组合物，该药物组合物含有权利要求1至6中任一项所述的肽或变体、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的细胞、权利要求12所述的激活的T淋巴细胞、或权利要求14所述的抗体，以溶液或冻干的形式；
(b)任选地，第二个容器，其含有冻干剂型的稀释液或重构液；
(c)任选地，至少一种以上选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24的肽，以及
(d)任选地，(i)使用溶液或(ii)重构和/或使用冻干剂型的说明书。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，进一步包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针，或(v)注射器。
20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述肽选自SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.24。
21.一种T细胞受体(TCR)，优选为与HLA配体反应的可溶性或膜结合的TCR或其功能片段，其中所述配体与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24的氨基酸序列具有至少85％同源性，或其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24中的任一组成。
22.根据权利要求21所述的T细胞受体，其中所述T细胞受体以可溶性分子提供并任选地具有其他效应子功能，如抗体片段、免疫刺激结构域或毒素。
23.根据权利要求21或22所述的T细胞受体，其中所述TCR是包含α和β链恒定结构域序列的α/β异源二聚体TCR，其中所述恒定结构域序列通过在例如任一TRAC的外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间以天然二硫键连接。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的T细胞受体，其中所述TCR与可检测标记、治疗药剂、PK修饰基团或其任何组合相关联。
25.根据权利要求24所述的T细胞受体，其中所述治疗药剂是与所述TCR的α或β链的C或N末端共价连接的CD3抗体。
26.一种核酸、或能够表达该核酸的表达载体，其中所述核酸编码权利要求21至25中任一项所述的T细胞受体，并任选地连接到异源启动子序列。
27.一种宿主细胞，其包括权利要求26所述的核酸、或编码权利要求14所述的抗体的核酸、或权利要求26所述的表达载体，其中所述宿主细胞优选为T细胞或NK细胞。
28.一种制备权利要求21至24中任一项所述的T细胞受体的方法，所述方法包括培养权利要求27所述的宿主细胞，以及从宿主细胞和/或其培养基中分离出所述T细胞受体。
29.一种用于产生用于个体患者的个性化抗癌疫苗或化合物和/或细胞疗法，所述方法包括：
a)识别个体患者的肿瘤样本所提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；
b)将a)中识别的肽与已经针对免疫原性和/或在肿瘤中相对正常组织过提呈进行预先筛选的肽库进行比较；
c)选择库中的与在该患者中识别的TUMAP匹配的至少一种肽；以及
d)基于步骤c)生产和/或制备个性化疫苗或化合物或细胞疗法。
30.根据权利要求29中所述的方法，其中所述TUMAP通过以下方法识别：
a1)将肿瘤样本的表达数据与肿瘤样本组织类型相应的正常组织样本的表达数据进行比较，以识别在肿瘤样本中过表达或异常表达的蛋白；和
a2)将表达数据与肿瘤样本中与MHCI类和/或II类分子结合的MHC配体的序列相关联，以识别源自于肿瘤过表达或异常表达的蛋白的MHC配体。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中MHC配体的序列的识别是通过洗脱由肿瘤样本分离的MHC分子的结合肽，并对所洗脱的配体进行测序。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中与肿瘤样本组织类型相应的正常组织样本获得自同一患者。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中包含在库中的肽基于以下步骤进行识别：
aa.通过高度平行的方法，例如微阵列或基于测序的表达谱，进行全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析，其包括识别相较于正常组织在恶性组织中过表达的基因；
ab.选择步骤aa检测到的有选择地表达或过表达的基因所编码的肽，以及
ac.通过选定的肽确定体内T细胞反应的诱导，包括使用来自健康供体或所述患者的人类T细胞而进行的体外免疫原性测定；或
ba.用质谱法识别来自所述肿瘤样本的HLA配体；
bb.通过高度平行的方法，例如微阵列或基于测序的表达谱，进行全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析，其包括识别相较于正常组织在恶性组织中过表达的基因；
bc.比较所识别的HLA配体与该基因表达数据；
bd.选择步骤bc检测到的有选择地表达或过表达的基因所编码的肽；
be.重新检测肿瘤组织上且在健康组织上缺乏或不经常检测到的由步骤bd选定的TUMAP，并确定在mRNA水平上过表达的相关性；以及
bf.通过选定的肽确定体内T细胞反应的诱导，包括使用来自健康供体或所述患者的人类T细胞的体外免疫原性测定。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中包含在库中的肽的免疫原性通过包括体外免疫原性检测、针对个别HLA结合性的患者免疫监测、MHC多聚体染色、ELISPOT分析和/或细胞内细胞因子染色的方法而确定。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述库包括选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24的多个肽。
36.根据权利要求29至35中任一项所述的方法，其还包括，识别该肿瘤样本与该个体患者的相应正常组织相比而独特具有的至少一种突变，以及选择与该突变相关的肽，使其包含于疫苗中或用于产生细胞疗法。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述至少一种突变通过全基因组测序而识别。
38.一种药物组合物，其包括选自以下的至少一种活性成分：
a)选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24的肽；
b)与a)中的肽和/或肽-MHC复合体反应的T细胞受体；
c)包含a)中的肽、以及HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸1至80的融合蛋白；
d)编码a)至c)中任一项的核酸，或包含该核酸的表达载体；
e)包含d)的表达载体的宿主细胞；
f)通过以下方法获得的激活的T淋巴细胞，该方法包括将T细胞与a)的肽进行体外连接一段时间，该时间足以以抗原特异性方式激活所述T细胞，该肽在合适的抗原提呈细胞表面表达，以及将这些激活的T细胞转入自体或其他患者；
g)与a)中的肽和/或肽-MHC复合体、和/或提呈a)中的肽的细胞反应，且可能通过与例如免疫激活域或毒素融合而修饰的抗体或可溶性T细胞受体；
h)识别选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24的肽和/或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24的肽与MHC分子的复合体的适体；
i)a)至h)中任一项的共轭或标记肽或支架，以及药学上可接受的载体，以及任选地，药学上可接受的赋形剂和/或稳定剂。
39.一种适体，其特异性地识别权利要求1至5中任一项所述的肽或其变体，优选为权利要求1至5中任一项所述的与MHC分子结合的肽或其变体。
40.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求38所述的药物组合物，其中癌症为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、默克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌、或其组合。
41.根据权利要求41所述的方法，其中癌症为非小细胞肺癌。
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