CN101463090A - 纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纤连蛋白与钙粘附蛋白－11的融合蛋白、制备方法及应用，目的是提供一种可以促进骨和软骨种子细胞与支架材料的粘附的融合蛋白，属于组织工程领域。所述融合蛋白采用将含有PHSRN和RGD基序的FNIII_7－10片段与钙粘附蛋白－11胞外结构域EC_1－2制备融合蛋白，进行生物支架材料的表面修饰，充分考虑种子细胞的粘附的“同嗜性”和“异嗜性”，并兼顾种子细胞的粘附和成骨或成软骨分化，建立骨和软骨组织工程生物材料的表面仿生微环境。本发明适用于组织工程骨和软骨产品的构建及附载细胞的整形材料制作。

Description

纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白制备与应用，目的促进骨和软骨种子细胞与支架材料复合的粘附，属于组织工程领域。

背景技术

种子细胞在材料表面上的粘附过程，可分为四个连续发生并相互重叠的变化时相，即细胞附着、细胞伸展、肌动蛋白细胞骨架的组织以及粘附斑的形成。细胞粘附涉及多种生物分子，包括细胞外基质蛋白、细胞膜蛋白以及细胞骨架蛋白的相互联系和相互作用。细胞和材料的粘附是一个包括多因素的复杂过程，受多种因素的影响。细胞、材料及其二者所处的环境，都不同程度地影响细胞与材料的粘附。从材料方面来说，材料表面的理化特性、几何形状及表面能以及材料的降解活性，都对细胞粘附起关键性作用。如何有目的的进行组织工程材料的表面修饰以利于种子细胞粘附、增殖及分化是组织工程骨和软骨构建中要解决的关键问题。

细胞表面的粘附受体，主要包括：参与同种细胞间粘着结合的表面受体钙粘蛋白，主要以同嗜性方式与细胞—细胞识别相关；整合素以异嗜性方式和细胞—细胞及细胞—细胞外基质结合有关，由α和β亚基以非共价方式组织成活性二聚体；此外还有选择素和免疫球蛋白类。在骨细胞和培养的成骨细胞可表达整合素亚单位α₂以及纤维连接蛋白受体α₃β₁、α₄β₁、α₅β₁和α_Vβ₃。软骨细胞表面可表达α₅β₁，α₁β₁、α₂β₁、α₁₀β₁，α₆β₁，α_Vβ₃等整合素受体，与纤连蛋白(Fibronectin，FN)，II型、VI型胶原，层粘连蛋白的以及玻基结合素和骨桥蛋白相结合。整合素在介导锚定过程的同时，还介导跨膜信号的传递，在粘附斑形成后，一系列的酶会被激活，包括粘附斑激酶、胞外信号调节酶、有丝分裂原激活蛋白激酶途径的某些因子等，启动了胞内外信号的传递，触发了细胞的增殖、迁移、分化、分泌等功能活动，使种子细胞能获得良好的生物学特性。而作为α₅β₁配体的FN属于多糖蛋白，具有粘附细胞的能力，对骨和软骨形成有着重要作用。FN作为ECM中重要的一种整合素配体，参与细胞与细胞、细胞与基质之间的粘连，维持细胞正常形态，促进细胞分化。FN可与胶原结合调节细胞粘附，同时促进成骨细胞系细胞增殖分化并使成熟成骨细胞存活时间延长。FN还可以与羟基灰石结合调节钙代谢及细胞粘附，对矿化过程起调节作用。FN在成骨细胞分化时及以后持续表达。有实验证实，FN对磷酸钙陶瓷的表面修饰能明显提高大鼠成骨细胞的贴附率，有利于成骨细胞的生长及成骨表型。因而在材料表面接上FN的特异性功能片段，将有助于通过RGD-α₅β₁相互作用，促进细胞的粘附。

FN与α₅β₁的结合需要其9号III型重复序列(FNIII)的PHSRN基序和9号III型重复序列的RGD基序参与，这两个基序每一部分对应的连接力较低，但联合作用生物学效应显著，可以提供稳定的粘附。除了增强细胞-支架的粘附，种子细胞在材料表面的密度决定着下步分化及成熟的能力，因此需要把把FN片段与已知三维结构并且具有明确粘附功能和成骨/软骨效应的分子上，而钙粘附蛋白-11(Cadherin-11，缩写Cad-11)为一种较佳的选择。Cad-11属II型钙粘附蛋白，是一种钙离子依赖性介导细胞-细胞间粘附的单链跨膜糖蛋白，与胚胎肢节形成、骨组织的形成等关系密切，因其最早在成骨细胞系中克隆而来，所以又称之为成骨细胞型钙粘附蛋白(OB-cadherin)。目前已有学者进行了Cad-11连接和粘附特性的精确亚结构域结构的研究。人Cadherin-11是一种由796个氨基酸残基组成的蛋白质(Okazaki M.，J.Biol.Chem.1994，269：12092-8.)，其分子量约为88.0KD。Cadherin-11在细胞中是以一种含22个氨基酸残基的信号肽和31个前肽的原肽形式合成的，信号肽和前肽在转运和分泌过程中被切除。在成骨细胞持续表达Cadherin-11，在胚胎期，Cadherin-11限制性的在间质细胞表达。Cadherin-11最早从原肠胚期仅在中胚层表达，至体节分化后仅在生骨节表达，影响着成骨细胞分化过程中的细胞排列、聚集及分离，显示Cadherin-11在骨骼形成的凝聚中发挥重要功能。2005年Matsusaki等在生长面的软骨细胞中发现了Cadherin-11的表达；2007年Agarwal等在小鼠的滑膜囊内发现了Cadherin-11的表达，表明了Cadherin-11在软骨形成中也起着重要作用。X线衍射晶体分析法确定了Cad-11胞外结构域中EC₁区编码蛋白决定粘附的相互作用，即II型的识别特异性主要是在EC1区，EC1也是钙粘附蛋白单体的重要界面，介导了细胞粘附。

基于以上考虑，本发明将含有PHSRN和RGD基序的FNIII_7-10片段与Cadherin-11的胞外结构域EC_1-2的融合蛋白进行生物支架材料的表面修饰，充分考虑粘附的“同嗜性”和“异嗜性”，并兼顾种子细胞的粘附和成骨，建立组织工程生物材料的表面仿生微环境，为组织工程骨和软骨的构建提供有力的支持。

发明内容

本发明为解决现有技术的不足提供一种促进骨和软骨种子细胞与支架材料复合的粘附分子的设计和应用方法，它可在组织工程化骨、软骨的构建中使用，为生物支架材料的表面仿生微环境的建立提供了一种有效技术方法。

本发明的技术解决方案如下：

本方法以含有PHSRN和RGD基序的纤连蛋白的FNIII_7-10片段与钙粘附蛋白-11的胞外结构域EC_1-2的融合蛋白Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10，进行生物支架材料的表面仿生微环境建立，促进种子细胞与组织工程生物支架材料的粘附，步骤如下：

(1)融合蛋白的构建：将含有PHSRN和RGD基序的FNIII_7-10片段与成骨细胞特异性钙粘蛋白胞外结构域EC_1-2制备融合蛋白Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10，采用的是EC_1-2-(GlySer)n-FNIII_7-10，(GlySer)n是中间所加的一段柔性肽，n为1—3的整数。经生物信息学分析，该融合蛋白中保留了FNIII_7-10片段与成骨细胞特异性钙粘蛋白表位特征，钙离子结合区保持稳定，各自的空间结构不受影响。融合蛋白具有SEQID NO：1的氨基酸序列和SEQID NO：2的核苷酸序列。

(2)融合蛋白的表达、纯化及活性分析：Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10表达重组体pet22b-fn-cad转化入改良大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)，通过氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素和四环素4种抗生素筛选。经过IPTG诱导表达3h，取样行SDS-PAGE电泳分析，分析重组蛋白表达率和融合蛋白表达形式后，用Ni+珠一步法亲和层析纯化。

(3)融合蛋白在生物支架材料的表面仿生微环境建立：将具有生物活性的融合蛋白Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10进行支架材料表面的附载，常用方式为涂层。本发明中所述涂层可以采用浸涂和喷涂两种方式进行，对于多孔性骨和软骨材料可以采用浸涂方式，以免造成喷涂的浪费，而对平面材料表面可以采用喷涂，防止因为浸涂而引起的挂膜。

(4)种子细胞在生物支架材料表面的粘附：将种子细胞种植在前述融合蛋白修饰的支架材料上，进行静态或者动态培养，促进细胞在生物支架材料表面的粘附。

本发明的有益效果

本发明针对目前的组织工程骨和软骨研究中种子细胞与生物支架材料的粘附问题，进行一种促进种子细胞与材料粘附的融合蛋白的制备，建立生物支架材料表面的仿生微环境。通过制备含有PHSRN和RGD基序的纤连蛋白的FNIII_7-10片段与钙粘附蛋白-11的胞外结构域EC_1-2的融合蛋白Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10，经过融合蛋白的构建、表达、纯化及活性分析后，进行生物支架材料的表面仿生微环境建立，将骨髓骨髓间充质干细胞作为种子细胞进行与经过改建的生物材料表面复合，增强了种子细胞与材料的粘附率，在特定分化环境下，增强了种子细胞的成骨和成软骨定向分化能力。本发明所提供的融合蛋白对生物支架材料进行必要的涂层和表面修饰，提高了表面生物活性，解决了生物支架材料亲水性差，细胞吸附力弱，不利于细胞在材料上的粘附，进而影响细胞的增殖和分化难题。本发明适用于组织工程骨和软骨产品的构建及附载细胞的整形材料制作，具有广阔的临床应用前景。

附图说明

图1示出了单独的Cad-11EC_1-2的蛋白结构模式图；

图2示出了单独的FNIII_7-10片段的蛋白结构模式图；

图3示出了Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10融合蛋白结构模式图：1为EC₁；2为EC₂；3为(GlySer)₃柔性肽；4为FN₇；5为FN₈；6为FN₉7为FN₁₀；8为PHSRN基序；9为RGD基序；

图4示出了Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10融合蛋白载体构建模式图；

图5示出了Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10融合蛋白SDS-PAGE电泳结果图：

1道为marker；2-4道分别为PET22b、PET22b/Cad-EC_1-2、PET22b/FN_7-10、PET22b/Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10未加IPTG诱导；6-9道分别为PET22b、PET22b/Cad-EC_1-2、PET22b/FN_7-10、PET22b/Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10加IPTG(终浓度0.4mM)诱导4h后。

图6示出了Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10融合蛋白抗HIS免疫印迹：1为PET22b/Cad-EC_1-2上清；2为PET22b/Cad-EC_1-2沉淀；3为PET22b/FN_7-10上清；4为PET22b/FN_7-10沉淀；5为PET22b/Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10上清；6为PET22b/Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10沉淀.

图7示出了Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10融合蛋白对骨髓间充质干细胞粘附的影响.

具体实施方式

以下结合实施例详细说明本发明的构建过程：

实施例1、FNIII_7-10片段和Cad—11的EC_1-2片段的克隆：

1.人FNIII_7-10片段的克隆

用总RNA提取试剂盒，从人成纤维细胞HFL-I(上海细胞所)中提取总RNA，按照RT-PCR试剂盒的方法，进行反转录反应。以获得的反转录产物为模版进行PCR获得FNII1_7-10cDNA，所用引物P1和P2用寡核苷酸合成仪合成。

P1(5’-3’)：acgcgtcgacccattgtctccacca(25bp，下划线的碱基序列为SalI酶切位点)P2(5’-3’)：aaggaaaaaagcggccgctaatgttcggtaattaatgga(39bp，下划线的碱基序列为NotI酶切位点)

PCR的方法为：

①50μl反应体系包括：10×PCR反应缓冲液5μl，dNTP5μl，P1引物、P2引物各2μl，模板cDNA1μl，pfu酶1.0μl，无DNA酶水34.5μl。

②扩增条件为：94度5分钟—94度1分钟，59度1分钟，72度1.5分钟，35循环—72度10分钟。

通过凝胶电泳显示一大小为1.4kb的条带，利用PCR产物回收试剂盒回收，克隆至pGEM-T载体的多克隆位点后，转化JM109感受态细菌，蓝白斑筛选到阳性克隆后，常规方法抽提质粒，进行测序，证实获得了与天然FNIII_7-10片段cDNA序列一致的克隆。

2.人Cadherin-11的胞外结构域信号肽和EC_1-2区的克隆

从正常骨折病人骨组织中分离正常人成骨细胞，经纯化和培养后，用总RNA提取试剂盒从成骨细胞中提取总RNA，按照RT-PCR试剂盒的方法，进行反转录反应。以获得的反转录产物为模版进行PCR获得Cadherin-11胞外结构域信号肽和EC_1-2区片段的cDNA，所用引物P3和P4用寡核苷酸合成仪合成。

P3(5’-3’)：acgcgtcgacatgaaggagaactactgt(28bp，下划线的碱基序列为SalI酶切位点)

P4(5’-3’)：aaggaaaaaagcggccgcctttggtgggttgtc(33bp，下划线的碱基序列为NotI酶切位点)

PCR的方法为：

①50μl反应体系包括：10×PCR反应缓冲液5μl，dNTP 5μl，P3引物、P4引物各2μl，模板cDNA 1μl，pfu酶1.0μl，无DNA酶水34.5μl。

②扩增条件为：94度5分钟—94度1分钟，61度1分钟，72度1分钟，35循环—72度10分钟。

通过凝胶电泳显示一大小为0.8kb的条带，利用PCR产物回收试剂盒回收。克隆至pGEM-T载体的多克隆位点后，转化JM109感受态细菌，蓝白斑筛选到阳性克隆后，常规方法抽提质粒，进行测序，证实获得了与天然Cadherin-11的胞外结构域信号肽和EC_1-2区片段cDNA序列一致的克隆。

实施例2、本发明融合蛋白的表达

为了将FNIII_7-10片段和Cad—11的EC_1-2片段以融合蛋白形式从大肠杆菌分泌表达，如附图4所示，选择利用分泌型载体pET-22b(+)作为载体(Novagen Corp.USA)。在该载体的多克隆位点区域中，含有SalI酶切位点(179)和NotI酶切位点(166)，便于融合蛋白的克隆。为了使表达的两个片段的空间构象尽量与天然产物相近，以保持其最大的生物学活性，在引物中设计引入亲水性和低电荷效应的氨基酸序列作为接头(GlySer)n，因为甘氨酸结构简单，对融合蛋白的立体构象影响较小。利用重叠PCR方法，进行带有编码含(GlySer)n柔性接头肽的Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10融合蛋白克隆，n可以是1-10的整数。当n＝3时，可合成如下寡聚核苷酸引物，所用引物P5、P6、P7和P8用寡核苷酸合成仪合成。

P5(5’-3’)：acgcgtcgacatgaaggagaactactgt(28bp)(黑色下划线部分显示的是上游引物中引入SalI酶切位点，黑体斜字显示是起始密码子)

P6(5’-3’)：tggtggagacaatggagaaccagaaccagaaccctttggtgggttgtc(48bp)(黑色下划线部分显示的是柔性接头肽段(GlySer)3序列)

P7(5’-3’)：gacaacccaccaaagggttctggttctggttctccattgtctccacca(48bp)(黑色下划线部分显示的是柔性接头肽段(GlySer)3序列)

P8(5’-3’)：aaggaaaaaagcggccgctaatgttcggtaattaatgga(39bp)(黑色下划线部分显示的是下游引物中引入NotI酶切位点，黑体斜字显示是终止密码子)

重叠延伸PCR：

混合此4个长片段寡核苷酸后，将实施例1构建的FNIII7-10PCR产物和Cad-11PCR产物为模板，进行第一次PCR，把第一次PCR产物作为模板，使用两末端引物继续进行第二次PCR.扩增条件为：第一次PCR：①94度5分钟；②94度1分钟，68度1分钟，72度2分钟，10循环；第二次PCR：①94度5分钟；②94度1分钟，55度1分钟，72度2分钟，25循环；③72度10分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的结果。

PCR扩增后，在cDNA的5’—端(Cad-11片段)引入一个SalI，同时在3’端(FNIII7-10片段)引入NotI位点。二者之间为柔性接头肽段(GlySer)3序列。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(2.24kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。用SalI和NotI酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，与用SalI和NotI酶切酶切后的pET-22b(+)载体连接(实验中的pfu酶、内切酶、连接酶、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司)，形成pET-22b(+)/Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10。DNA测序结果表明序列正确。将质粒pET-22b(+)/Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10转化感受态菌株Rosetta-gami(DE3)(德国Merck公司)，获得pET-22b(+)/Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10/Rosetta-gami(DE3)表达菌种。融合蛋白Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10的核苷酸序列如SEQID NO：2所示，其具有SEQID NO：1的氨基酸序列。SEQID NO：1中，129-131氨基酸(Gln-Ala-Val)是Cad-11-EC_1-2片段特异性结合区，决定着粘附特性；508-512氨基酸(PHSRN基序)和625-627氨基酸(RGD基序)是FNIII_7-10的重要的特异性结合区。

实施例3、本发明融合蛋白的诱导表达和纯化

将鉴定正确的阳性克隆菌株pET-22b(+)/Cad-11-EC1-2/FNIII7—10/Rosetta-gami(DE3)，接种到含有35μg/mL氯霉素、四环素12.5μg/mL和卡那霉素100μg/mL的5mL LB培养基中，在37℃以180r/min培养过夜，次日以1∶1000转接，振荡培养至A600值达0.6时加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，30度℃，400rpm/min诱导表达3h。取适量菌液在4℃条件下，5000r/min条件下离心5min，菌体沉淀用1mL细菌裂解液(50mmol/LTris2HCl，pH＝7.2，50mmol/L NaCl)重悬。重悬液用超声法破碎细胞，裂解菌体再在13000r/min条件下离心5min。分别取菌体裂解上清液(可溶蛋白部分)和沉淀重悬液(不可溶蛋白部分)各10μL，SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。用灰度扫描分析，表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的43.7％。

包涵体的纯化如下：(1)超声破碎获得包涵体：用裂解缓冲液(50mmol/L Tris HCl，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl)重悬收集的细菌沉淀，溶菌酶冰上作用2h，冰浴超声裂菌15min。将超声破碎后的菌体悬液以5000r/min离心5min。重复上述步骤3、4次，至离心后的上清液清亮不粘稠为止。收集上清液，同时准备不同浓度的尿素洗涤沉淀。(2)洗涤包涵体。将沉淀用4mol/L尿素洗涤，4℃，12000r/min离心20min，沉淀用8mol/L尿素溶液重悬，4℃下静置溶解。用Ni2+-NTA柱亲和层析纯化所溶解的沉淀，分别使用浓度为25和300mmol/L的咪唑进行洗脱。将纯化后的蛋白进行梯度复性，最后以pH7.0的水透析，冻干后以10ml生理盐水复溶，用SDS-PAGE分析。经SDS-PAGE电泳分析，融合蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在，细菌的裂解上清中(可溶性表达部分)仅存在微量目的蛋白。灰度扫描分析蛋白纯度95％。

融合蛋白的Western blot分析：蛋白纯化产物经SDS-PAGE电泳分离后，将融合蛋白转移至NC膜上，5g/L脱脂奶粉室温封闭1h，加入抗His单抗，4℃孵育过夜。PBST洗膜4次，每次10min，再加入HRP标记的羊抗小鼠IgG，37℃温育1h，PBST和PBS先后洗膜4次后，ECL化学发光显色。如图6所示在分子量75000Da处有一条带，与融合蛋白预期分子量相符，目的蛋白与抗His标签抗体有良好的反应性。

实施例4、本发明融合蛋白的活性鉴定

将纯化的融合蛋白稀释成不同的浓度，以0，100，200，400，800μg/ml的浓度，分别铺衬在96孔培养板中，4度过夜，1％BSA封闭2h，并以单纯的FNIII_7-10、单纯的Cad-11-EC_1-2蛋白及未处理作对照。按常规方法，分别进行骨髓间充质干细胞的培养，用含10％FBS的培养液将细胞数1.0×10⁴个/孔接种在前述的96孔培养板。置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3h。用PBS缓冲液进行轻冲培养板，然后于高倍镜下计数培养板中的细胞数量。也可通过MTT法，对支架种植细胞进行检测：调整细胞密度至5.0×10⁴个/cm²，滴加至涂层后培养板，分别在37℃、5％CO₂培养箱孵育4h后作MTT检测。结果发现与对照相比，如图7所示，融合蛋白铺衬可以明显提高前述细胞的粘附，其中100-200μg/ml作用最佳(P<0.01))。当种子细胞为成骨细胞或者软骨细胞时，也获得相类似的结果。这表明大肠杆菌表达的融合蛋白具有一定的活性。

实施例5、融合蛋白在生物支架材料的表面仿生微环境建立

将具有生物活性的纯化的融合蛋白Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10进行支架材料表面的附载，常用方式为涂层。本发明中所述涂层可以采用浸涂和喷涂两种方式进行，对于多孔性骨和软骨材料可以采用浸涂方式，以免造成喷涂的浪费，而对平面材料表面可以采用喷涂，防止因为浸涂而引起的挂膜。如在多孔双相钙磷陶瓷(BCP)材料采用浸涂方式：先将支架材料与10mg/ml的交联剂硫磺基-6(3′-2-吡啶二硫-丙酰胺)-己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)溶液室温反应36h，再与200μg/ml的融合蛋白溶液反应36h，三蒸水漂洗5次，4℃保存。SEM观察BCP表面形态，融合蛋白Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10进行支架材料表面的附载，与单纯的FNIII_7-10、单纯的Cad-11-EC_1-2蛋白附载的材料及未处理的材料相比，支架材料的表面形态均无明显不同，表明本发明的融合蛋白在支架材料的改性，不会改变材料的物理形态。这对于经过设计和制备的具有确定的分化诱导性的支架材料而言，是十分重要的。不会对生物支架材料的孔隙率、孔隙大小、泡孔均匀性及泡孔间连续性产生影响。同时由于在支架表面植入特殊位点与细胞起特异性反应，对不同类型细胞起选择粘附的作用。其中，FNIII_7-10的PHSRN和RGD基序可以提供对骨髓间充质干细胞、成骨细胞或者软骨细胞的特异性粘附；Cadherin-11的EC_1-2既可以提供细胞-细胞、细胞-材料间的粘附，也可提供使种子细胞分别向成骨或者成软骨定向分化的分子机制。用本发明所提供的融合蛋白进行涂层的材料，能使细胞有效地粘附和进行生命活动。通过在材料表面引入能促进细胞粘附、生长和诱导分化作用的蛋白质，在材料表面构建仿生微环境。

实施例6、种子细胞在生物支架材料表面的粘附

以BCP为例，将种子细胞种植在实施例5中提及的融合蛋白修饰的支架材料上，进行静态或者动态培养，促进细胞在生物支架材料表面的粘附。将分别经融合蛋白、单纯的FNIII_7-10、单纯的Cad-11-EC_1-2蛋白及未处理的BCP材料作对照。在直径0.5cm、厚度0.3cm的圆柱形BCP材料中，调整种子细胞密度至5.0×10⁵个/cm²，每个样品滴加细胞悬液0.1ml，在37℃+5％CO2培养箱孵育24h，加培养基0.5ml轻轻冲洗材料，使未粘附细胞落在培养板底部。取出材料，0.25％胰酶充分消化所粘附细胞，细胞计数板计数。结果发现在经过融合蛋白涂层的材料表面粘附的细胞量显著性高于其它对照(P<0.01)。

种植7d后，通过DNA含量分析样品中细胞量：通过反复冻融法使细胞裂解，以去离子水冲洗使细胞脱离材料，离心收集细胞成分，加入1ml TRIZOL试剂充分研磨，收集液体至1.5ml EP管，室温静置5分钟，4℃ 12000×g离心10分钟移除不溶性物质；加入氯仿0.2ml，摇晃混匀，室温静置3分钟，4℃ 12000×g离心15分钟；上层水相物作总RNA提取，余下中间相和有机相加无水乙醇0.3ml充分混匀，室温静置3分钟，4℃ 2000×g离心5分钟；弃上清，沉淀用0.1mol/L柠檬酸钠溶液反复洗涤，4℃ 2000×g离心5分钟；弃上清，加入75％乙醇1.5ml，4℃ 2000×g离心5分钟，风干后加入8mmol/L氢氧化钠溶液(pH＝8.0)500μl溶解，4℃ 12000×g离心10分钟，取上清液，紫外分光光度计测定260nm吸光度，计算DNA含量。结果显示，在经过融合蛋白涂层的材料表面粘附的细胞量显著性高于其它对照(P<0.01)。显微镜下观察细胞生长情况，表征支架材料的细胞相容性。可发现：细胞能进入支架材料的孔隙中生长，且分泌出大量的细胞外基质，说明经本发明提供的融合蛋白涂层的材料生物相容性较好，能为细胞提供一个模拟生物体内的生长环境以供其贴附、生长、增殖和分化。

取融合蛋白修饰的BCP材料，以及前述的单纯的FNIII_7-10、单纯的Cad-11-EC_1-2蛋白及未处理的BCP材料作对照，置12孔培养板中。取第三代骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为5.0×10⁵个/cm²，接种在材料上，用含成骨补充成分(含10^-8M地塞米松、10^-3Mβ-甘油磷酸、50mg/L抗坏血酸)的培养基培养。分别在培养后第7d、第14d、第21d各取出3个各组材料，PBS冲洗3次，胰酶消化细胞，收集在Ep管中，加入1ml裂解液(含25mM Tris、015％Triton X2100)，反复吹打，并置37℃过夜，镜下观察已无完整细胞，按ALP试剂盒(南京建成公司)说明操作，520nm处测吸光度，计算各管中ALP活性。结果显示在经过本发明所提供融合蛋白涂层的材料表面粘附的细胞，其ALP显著性高于其它对照(P<0.01)。这提示种子细胞在本发明所提供融合蛋白涂层的材料表面，具有明确的成骨分化效应。

取融合蛋白修饰的BCP材料，以及前述的几种材料作为对照，置12孔培养板中。取第三代骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为5.0×10⁵个/cm²，接种在材料上，添加无血清软骨诱导液进行单层细胞诱导培养(含10ng/ml TGF-β1，0.1μM地塞米松，50μg/ml抗坏血酸，1×ITS+1)。分别在培养后第7d、第14d、第21d各取出3个各组材料，PBS冲洗3次，胰酶消化细胞，收集在Ep管中，提取细胞总RNA。采用一步法RT-PCR法检测可聚蛋白多糖(aggrecan)mRNA表达，引物由北京赛百盛公司合成，序列为引物1：5’-cgc ttg cca ggg ggagtt gta ttc-3’；引物2：5’-ggaggc cag ggt agc att ttg agc-3’；405bp)，GAPDH为内参。反应条件为：50℃，30min；15℃，15min；94℃，1min；退火(aggrecan为55℃)，45s；72℃，1mim30循环；72℃，10min。产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，图象分析软件进行条带灰度分析。结果显示在经过本发明所提供融合蛋白涂层的材料表面粘附的细胞，其aggrecan表达量显著性高于其它对照(P<0.01)。这说明种子细胞在本发明所提供融合蛋白涂层的材料表面，呈现明确的成软骨分化效应。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白、制备方法及应用

<160>2

<210>1

<211>641

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>1954

<212>DNAT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Claims (9)

1、一种纤连蛋白与钙粘附蛋白-11融合蛋白，所述融合蛋白采用含有PHSRN和RGD基序的FNIII_7-10片段与钙粘附蛋白-11制备融合蛋白，进行生物支架材料的表面修饰，建立骨和软骨组织工程生物材料的表面仿生微环境；所述融合蛋白命名为Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10，其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列和SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10采用将含有PHSRN和RGD基序的FNIII_7-10片段与成骨细胞特异性钙粘蛋白胞外结构域EC_1-2制备融合蛋白，采用的是EC_1-2-(GlySer)n-FNIII_7-10，(GlySer)n是中间所加的一段柔性肽，n为1—10的整数；SEQ ID NO：1中，129-131氨基酸(Gln-Ala-Val)是Cad-11-EC_1-2片段特异性结合区；508-512氨基酸(PHSRN基序)和625-627氨基酸(RGD基序)是FNIII_{7 -10}的特异性结合区。

3、根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述n为3。

4、权利要求1或2所述纤连蛋白与钙粘附蛋白-11融合蛋白的制备方法，步骤如下：

(1)融合蛋白的构建：以含有PHSRN和RGD基序的FNIII_7-10片段与成骨细胞特异性钙粘蛋白胞外结构域EC_1-2制备融合蛋白Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10，采用的是EC_1-2-(GlySer)n-FNIII_7-10，(GlySer)n是中间所加的一段柔性肽，n为1—10的整数，融合蛋白具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列和SEQ ID NO：2的核苷酸序列；

(2)融合蛋白的表达、纯化及活性分析：将Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10表达重组体pet22b-fn-cad转化入改良大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)，通过氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素和四环素4种抗生素筛选，经过IPTG诱导表达3h，取样行SDS-PAGE电泳分析，分析重组蛋白表达率和融合蛋白表达形式后，用Ni+珠一步法亲和层析纯化。

5、权利要求1或2所述融合蛋白的应用，其特征在于，将所述融合蛋白Cad-11-EC_1-2/FNIII_7-10进行生物支架材料的表面仿生微环境建立，方法是以涂层的方式进行支架材料表面的附载；将种子细胞种植在前述融合蛋白修饰的生物支架材料上，进行静态或者动态培养，促进细胞在生物支架材料表面的粘附。

6、根据权利要求5所述融合蛋白的应用，其特征在于，所述的生物支架材料为人工合成可降解聚合物聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚酯尿烷、聚酸酐亚胺共聚物、聚羟丁酯及其共聚物或聚羟基丁酸已酯，或为天然高分子聚合物胶原、纤维蛋白、壳聚糖、藻酸盐或天然珊瑚，或为由上述多种材料构成的复合材料。

7、根据权利要求5所述融合蛋白的应用，其特征在于，所述种子细胞，对于组织工程骨是骨髓间充质干细胞或成骨细胞；对于组织工程软骨是骨髓间充质干细胞或软骨细胞。

8、根据权利要求5所述融合蛋白的应用，其特征在于，所述涂层采用浸涂或喷涂两种方式进行，对于多孔性骨和软骨材料采用浸涂方式，对平面材料表面可以采用喷涂。

9、根据权利要求5所述融合蛋白的应用，其特征在于：生物支架材料的表面修饰，是指粘附蛋白在材料表面的种植或交联。

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