CN109562200A - 固体表面的蜘蛛丝涂层 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于用能够形成聚合固体结构的重组蜘蛛丝蛋白涂覆固体表面的方法。方法包括以下步骤：‑将固体表面暴露于重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液，并且从而在重组蜘蛛丝蛋白和固体表面之间不形成共价键的情况下形成吸附在固体表面上的重组蜘蛛丝蛋白的表面层；和‑另外将固体表面的表面层暴露于重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液，并且从而在表面层上形成重组蜘蛛丝蛋白的组装的丝结构层；其中该方法不包括蜘蛛丝蛋白的干燥进入(dring‑in)。

Description

固体表面的蜘蛛丝涂层
发明的技术领域
本发明涉及表面化学领域，并且更具体地涉及表面涂层，例如表面涂覆的医学装置和科学工具。本发明提供了一种用于用重组蜘蛛丝蛋白涂覆固体表面的方法、以及一种用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面。
发明背景
植入物广泛用于骨科应用，诸如固定骨折、脊柱重建、和软组织锚固。硬植入物诸如牙齿和髋关节植入物与植入失败(failure)的风险相关。这可以是感染或导致植入物的封装和排斥的免疫系统异物应答所导致的。例如，仅仅在美国在大约5％的病例且每年总计约100,000病例中发生骨科骨折和重建装置的感染。
植入物感染不仅是宿主因素和手术技术的结果。植入装置的解剖部位和特征(包括尺寸、形状、材料、形貌和预期用途)都是重要的变量。已经提出几种用抗生素或其他生物分子直接涂覆植入物以便增强骨整合并且减轻与异物应答或感染相关的不良事件的方法，参见例如SB Goodman等人，Biomaterials 34(13):3184-3183(2013)。用可增强植入物对身体的接受度并且降低感染风险的材料预涂覆植入物是非常感兴趣的。
然而，考虑到大多数植入物表面是疏水性的和电中性的，通过简单吸收生物分子(诸如短肽)来涂覆植入物通常是低效的，这导致用于将电荷引入植入物表面的复杂且耗时的方法的演变并且在植入物表面上产生许多层涂层。例如，已经开发逐层(LBL)涂覆方法，所述逐层(LBL)涂覆方法涉及将植入物重复浸入具有相反电荷的聚电解质溶液中，然后沉积生长因子，诸如BMP-2。LBL涂覆方法也已经被用于顺序沉积羟基磷灰石和BMP-2。羟基磷灰石形成基层，而BMP-2被呈现在最外层中。然而，大多数目前的LBL方法需要使用几百层来避免生物分子的突发释放；因此，LBL方法是劳动密集型的、成本高的，并且可导致批次间(batch-to-batch)的可变性。其次，LBL涂覆方法通常使用酸性溶液执行以用于有效负载，该酸性溶液对生物分子不是友好的。
G.Vidal等人，Acta Biomaterialia,9(1),4935-4943(2013)报道了经由钛结合肽(TiBP)将来自家蚕(Bombyx mori)的丝心蛋白化学接枝到钛表面。在蛋白与表面相互作用的初始吸附阶段后，蛋白吸附停滞，并且基本上不再粘附丝心蛋白。因此，所得产物由经由TiBP接枝到钛表面上的丝心蛋白表面单层组成。值得注意的是，一部分吸附的蛋白在缓冲液流动期间被洗掉，这意味着化学接枝的蚕涂层不稳定。
具有1-2μm的厚度的重组蜘蛛丝蛋白的膜先前已经通过空气干燥实现，参见例如WO 2012/055854 A1。这种空气干燥方法是耗时的，并且所得膜仅松散地附接到在下面的表面，这意指所得膜可容易地从表面脱落，例如在涂层预调整(pre-conditioning)或灭菌所需的洗涤条件期间。空气干燥方法的其他缺点是所得表面相当不均匀，导致某些应用的再现性较低，并且刚性，即由于含水量低而具有低粘度。此外，对膜的空气干燥仅限于更简单的开放和平坦表面。
P.H.Zeplin等人，Adv.Funct.Mater.24:2658-2666(2014)公开了通过浸涂在硅树脂表面上形成蜘蛛丝蛋白的微米膜。将硅树脂物品浸入丝溶液中并且空气干燥几次，并且然后进行固定步骤。这种相对复杂的方案产生相当厚的膜，通常在1μm和6μm之间，这些膜抑制细胞增殖和分化。该膜被建议用作生物障屏。
US 2011/0230911公开了通过将蛋白溶解在苛刻的有机溶剂(HFIP)中，将HFIP溶液空气干燥到表面上，然后是固定步骤，在聚苯乙烯和玻璃表面上形成蜘蛛丝蛋白的厚膜(0.5-1.5μm)。
尽管在本领域取得进展，但是对用于涂覆植入物表面和其他固体表面的简单且有效的方法仍然存在需求。对用于植入物和其他固体表面的、可通过简单且有效的方法施加并且为涂覆的表面提供有吸引力的特性的新涂层也存在需求。
发明概述
本发明的目的是提供一种用于用生物分子涂覆植入物表面和其他固体表面的简单且有效的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于用生物分子涂覆植入物表面和其他固体表面的方法，所述方法可在具有生理pH的水性溶剂中执行。
本发明的一个目的是提供一种用于在植入物表面和涂层之间没有共价键的情况下用生物分子稳定涂覆植入物表面和其他固体表面的方法。
本发明的另外的目的是提供一种在植入物表面和涂层之间没有共价键的情况下用生物分子稳定涂覆的固体表面。
本发明的目的是提供一种用生物分子稳定涂覆的固体表面，所述固体表面具有足够稳定性以允许涂层的预调整和灭菌。
本发明的目的是提供一种用薄的纳米尺寸膜稳定涂覆的固体表面。
本发明的另外的目的是提供一种用含有生物分子的纳米尺寸膜稳定涂覆的固体表面。
本发明的另外的目的是用生物分子涂覆所有类型的表面形状。
对于这些目的和从以下公开内容中将明显的其他目的，本发明根据第一方面提供了一种根据所附权利要求并且如本文所呈现的用于涂覆固体表面的方法。
本发明根据第二方面另外提供了一种根据所附权利要求并且如本文所呈现的涂覆的固体表面。
附图简述
图1示出了重组蜘蛛丝蛋白和比较蛋白(蛋白酶3C)的吸附行为。
图2示出了不同浓度的重组蜘蛛丝蛋白的吸附的QCM-D测量。
图3示出了根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白涂层的粘弹性特性的评价。
图4示出了根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白涂层的纳米纤维的形貌图像。
图5示出了根据本发明的蜘蛛丝蛋白涂层的化学洗涤稳定性。
图6示出了官能化蜘蛛丝蛋白涂层在钛和不锈钢上的组装。
图7说明了在官能化蜘蛛丝蛋白涂层上的细胞存活力。
图8示出了官能化蜘蛛丝蛋白在金和SiO2表面上的吸附行为，并且显示出保留的官能度。
图9示出了官能化蜘蛛丝蛋白在金表面上的吸附行为。
图10示出了蛛丝蛋白C-末端结构域的序列比对。
图11示出了在官能化蜘蛛丝蛋白涂层上生长的原代细胞的生长曲线和显微照片。
图12示出了(A)重组蜘蛛丝蛋白对金表面的吸附行为，以及(B)所得表面形貌。
所附序列列表
发明详述
本发明基于这样的洞察，即根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白非常适用作固体表面的涂层，因为它们在类似生理的条件下自发地与固体表面形成稳定涂层，即，在加工的任何步骤期间没有变性。如本文所示，很大的优点是，从一开始就是功能性的重组蜘蛛丝蛋白可在类似生理的条件下变成功能性表面涂层。值得注意的是，在不需要任何共价附接的情况下，根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白在表面上自发地自组装成原纤维结构。非常令人惊讶的是，在根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白的表面和初始层之间没有活跃地形成共价键的情况下，可实现稳定涂层。这允许简单且有效的涂覆方法在形成涂层时同时也维持根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白的生物学特性。方法是湿涂覆方法。这意指方法在水性溶液存在下发生，并且不涉及将溶液干燥进入(drying-in)到表面上以形成膜的任何步骤。所得涂层比通过干燥进入方法产生的膜明显更薄。出于成本原因，较薄的涂层有利于降低原材料的消耗。出于安全原因，如果将外来化合物引入体内，那么较薄的涂层也有利于降低外来化合物的负载。较薄的涂层也有利于提供与在下面的表面更好的直接接触。这降低了涂层将从表面剥离的风险，并且从而有助于涂层的稳定性。涂层的稳定性允许涂层的预调整和灭菌，这对于体内应用是至关重要的。
重组蜘蛛丝出于几种原因(尤其是其强度、弹性和低免疫原性)是生物材料应用的感兴趣材料。根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白可与其他生物活性肽诸如细胞结合基序或抗微生物肽一起重组产生。然后，可溶性融合蛋白可组装成稳定且柔性的宏观材料，该宏观材料保留了与丝基因融合的肽基序的功能。此外，根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白可与功能性蛋白或肽结构域诸如亲和结构域和酶一起重组产生。融合蛋白保留了蜘蛛丝部分组装成宏观丝结构的能力，以及表现出来自添加的功能性结构域的活性的能力。
为了解决与硬植入物的表面特性相关的复杂问题，根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白的薄丝涂层用作以修饰植入物表面特性的合适形式。此类丝涂层的特性可通过以与功能性肽基序或结构域融合的重组表达被容易地改变。根据本发明的与不同基序融合的重组蜘蛛丝蛋白可被容易地混合以允许形成多功能性丝涂层。
本文显示出根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白在没有共价附接的情况下在表面上形成稳定丝涂层，这意指在涂覆方法期间不需要另外的化学品或苛刻的条件。
首先，已经表征了根据本发明的非官能化重组蜘蛛丝蛋白的表面吸附和组装行为。通过几种技术对蛋白组装成丝涂层进行实时研究。耗散型石英晶体微天平(QCM-D)以高灵敏度(ng/cm3)实时监测传感器表面上的分子相互作用。这通过将传感器以其共振频率振荡并且通过测量其响应频率来完成。同时，可监测振荡的耗散，这提供了关于材料的粘弹性特性的信息。被截留在涂层中的水影响传感器的振荡频率和耗散，并且从而有助于信号输出。表面等离子体共振(SPR)和椭圆偏振术(ellipsometry)是光学技术，它们分别使用由于接近于表面的蛋白的相互作用引起的反射角的改变和光偏振改变。在这两种技术中的任一种中，水对响应都没有贡献。通过在设计用于组合两种技术的模块中同时进行QCM-D和椭圆偏振术监测，表面上的吸附的量可根据每种技术确定并且用于计算涂层中的含水量。为了更多地了解丝涂层的纳米结构，将该丝涂层用原子力显微术(AFM)进行分析，该原子力显微术(AFM)允许在纳米尺度上进行高分辨率的形貌成像。通过在水性溶液中测量，在表征期间维持天然结构。
其次，通过从与多种生物活性蛋白和肽(诸如增强丝涂层上细胞贴附和增殖的纤连蛋白肽基序，以及抗微生物肽爪蟾抗菌肽(Magainin)I)融合的重组蜘蛛丝蛋白提供根据本发明的功能性涂层，将期望的生物活性引入植入物表面。在生物材料应用中，将功能性基序包含在涂层中的潜力是至关重要的，以便优化植入物在体内的接受度并且解决感染问题，这也是对成功植入的挑战。此外，使用与具有折叠依赖性功能的蛋白结构域，诸如亲和结构域(例如结合IgG的Z结构域)、酶(例如木聚糖酶)或生长因子(例如成纤维细胞生长因子FGF)融合的丝蛋白引入更先进的生物活性。
根据第一方面，本发明提供了一种用于用能够形成聚合固体结构的重组蜘蛛丝蛋白涂覆固体表面的方法，所述方法包括以下步骤：
-将固体表面暴露于重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液，并且从而在重组蜘蛛丝蛋白和固体表面之间不形成共价键的情况下形成吸附在固体表面上的重组蜘蛛丝蛋白的表面层；和
-另外将固体表面的表面层暴露于重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液，并且从而在表面层上形成重组蜘蛛丝蛋白的组装的丝结构层。
在根据本发明的方法中；涂覆方法在水性溶液中发生。这意味着方法不涉及将重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液干燥进入到表面上的任何步骤。因此，方法不包括蜘蛛丝蛋白的干燥进入。
在形成组装的丝结构层的第二步骤中，只要存在可用的蛋白，组装就继续进行，这是与根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白的自组装性质相关的独特行为。
本发明的用于在水性溶液中用重组蜘蛛丝蛋白涂覆固体表面的方法有利地提供了双层结构，所述双层结构具有第一表面层和第二结构层，所述第一表面层由重组蜘蛛丝蛋白和固体表面之间的非共价键形成，其中重组蜘蛛丝蛋白在表面层上自发地组装成丝结构层。
方法是湿涂覆方法。这意指涂覆方法在水性溶液存在下发生，并且不涉及将溶液干燥进入到表面上以形成膜的任何步骤。
与提供蜘蛛丝蛋白膜的常规干燥进入方法相比，本发明的用于在水性溶液中用重组蜘蛛丝蛋白涂覆固体表面的方法提供几个优点：
·快速产生涂层
·可控制涂层的厚度
·更少的批次间变化和改进的再现性
·可以涂覆任何形状的三维物体。
与蜘蛛丝蛋白的常规干燥进入涂层相比，由本发明的用于在水性溶液中涂覆的方法提供的重组蜘蛛丝蛋白的涂层具有几个优点：
·更均匀的涂层表面
·更薄的涂层(与1-2μm的空气干燥的膜相比，通常厚度小于50nm)，这降低所需的蛋白量，并且给予更好的直接接触
·具有高含水量的粘性的另一层，这使得涂层更类似于活组织。
对比研究用来自家蚕(B.mori)的丝涂覆钛表面的潜力的G.Vidal等人，ActaBiomaterialia,9(1)，4935-4943(2013)，他们研究的该丝类型未显示出根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白的组装阶段。相反，在Vidal等人中的蛋白吸附在蛋白与表面相互作用建立的初始阶段后停滞。值得注意的是，一部分吸附的蛋白在缓冲液流动期间被洗掉。家蚕(B.mori)丝在钛上的吸附行为类似于本工作中用作参考蛋白的非组装蛋白酶3C。Vidal等人使用钛结合肽与家蚕丝蛋白的化学偶联来改进丝对钛传感器的吸附，并且避免冲洗时蛋白的损失。感兴趣的是，根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白显示出以促进连续丝组装的方式良好吸附钛的固有倾向。根据本发明的蜘蛛丝蛋白在初始表面层上形成组装的丝结构层和形成稳定的组装的丝结构层方面令人惊讶地有效。涂层的厚度可通过吸附时间来调节，并且它对于用多种缓冲液冲洗是稳定的，不需要任何化学修饰或特定肽基序。
固体表面优选地是生物材料的表面，并且更优选地是植入物或医学装置的表面，诸如植入物的表面。
固体表面优选地是为疏水性的材料。根据本发明的优选的疏水性固体表面与水具有大于30°的接触角θ，如通过悬滴法测量的。根据本发明的其他优选的固体表面具有pKa<7的疏水性固体表面暴露的羟基基团(如果有的话)。根据本发明的一组优选的疏水性固体表面表现出与水大于30°的接触角θ和pKa<7的疏水性固体表面暴露的羟基基团(如果有的话)两者。特别令人惊讶的是，根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白自发地自组装到疏水性表面和具有低程度去质子化羟基基团的表面上，而不需要用于将电荷引入植入物表面和在植入物表面上产生许多层涂层的复杂和耗时的方法。根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白的这些特性使得该方法非常有效且不复杂。
一组优选的固体表面包括选自由金属、金属合金、聚合物、矿物、玻璃和玻璃样材料、氨基硅烷、和疏水性烃组成的组(诸如选自由钛、不锈钢、聚苯乙烯、羟基磷灰石、二氧化硅、APTES官能化二氧化硅、金、和烷基硫醇官能化金(诸如具有>30°的接触角的烷基硫醇官能化金)组成的组)的材料。优选的固体表面是聚苯乙烯。
根据本发明的方法可还包括在将固体表面或表面层暴露于重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液的步骤之间或之后的一个或更多个洗涤步骤，其中每个洗涤步骤涉及去除邻近涂覆的表面的可溶性重组蜘蛛丝蛋白。优选的洗涤步骤包括用醇诸如乙醇、酸诸如HCl和/或碱诸如NaOH洗涤。涂层有利地对实际上相关浓度的醇、酸和碱是抗性的。这使得在不损失生物功能性或没有图层从表面分离的情况下洗涤和灭菌涂覆的表面是可能的。
如上所述，涂覆方法是湿涂覆方法。这意指涂覆在重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液存在下发生，并且不涉及将该溶液干燥进入到表面上以形成膜的任何步骤。然而，在去除重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液后，并且优选地在如上所述的一个或更多个洗涤步骤后，干燥具有固定的蜘蛛丝蛋白的所得涂层是可能的。
根据本发明的一组优选的重组蜘蛛丝蛋白还包含有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白部分或非蛛丝蛋白多肽部分，其是生物活性蛋白部分或生物活性肽部分。有利的是，即使当蛛丝蛋白部分形成组装的丝结构层时，生物活性蛋白/肽部分也是功能暴露的。生物活性蛋白/肽部分的非限制性实施例包括细胞结合基序、抗微生物肽、亲和结构域、酶、生长因子和重组抗体片段。
非蛛丝蛋白部分是包含提供生物活性，例如亲和力和/或酶促活性的至少3个氨基酸残基的蛋白或多肽片段。特别地，3-10个氨基酸残基范围内的短的非蛛丝蛋白部分可构成细胞结合基序，例如RGD。非蛛丝蛋白部分优选地包含多于10个氨基酸残基，诸如多于30个氨基酸残基，诸如多于50个氨基酸残基。非蛛丝蛋白部分优选地包含少于1000个氨基酸残基，诸如少于400个氨基酸残基，更优选地少于300个氨基酸残基。
衍生自蜘蛛丝蛋白的部分可被诱导在结构上重排，并且因此形成聚合固体结构，而非蛛丝蛋白部分在结构上不重排，但维持其期望的结构和生物活性。因此，根据本发明的蛋白可同时具有期望的生物活性和在生理条件下用于蛋白结构的内部固体支持活性两者。尽管当蛛丝蛋白部分在结构上重排以形成聚合固体结构时，非蛛丝蛋白部分与蛛丝蛋白部分共价附接，但非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分的生物活性被维持。
术语“非蛛丝蛋白(non-spidroin)”意味着不衍生自蜘蛛丝蛋白的蛋白，即与蜘蛛丝蛋白具有低程度(或没有)同一性和/或相似性。非蛛丝蛋白部分优选地与本文公开的任何蛛丝蛋白氨基酸序列，并且特别是SEQ ID NO：2-8和71中的任一个具有小于30％同一性，诸如小于20％同一性，优选地小于10％同一性。
根据本发明的一组优选的重组蜘蛛丝蛋白包含以下或由以下组成：蛋白部分REP和任选地CT，以及任选地有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分，其中
REP是70至300个氨基酸残基的重复片段，选自由L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、和L(GA)nGL组成的组，其中
n是2至10的整数；
每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨基酸残基中的0至3个不是Ala，并且剩余的氨基酸残基是Ala；
每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40％的氨基酸残基是Gly；并且
每个单独的L区段是0至30个氨基酸残基的接头氨基酸序列；并且
CT是70至120个氨基酸残基的片段，与SEQ ID NO 3或SEQ ID NO：69具有至少70％同一性。
根据本发明的融合蛋白在蛛丝蛋白片段REP和CT中具有内部固体支持活性，并且任选地有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分中具有另外的生物活性。当融合蛋白在结构上重排以形成聚合固体结构时，融合蛋白的生物活性被维持。这些蛋白结构、或蛋白聚合物也提供有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分的高且可预测的密度。
在大多数已经工程化为含有有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分的蛋白中，该部分已经作为线性延伸被添加到N-末端或C-末端，因此由于来自蛋白的其余部分的链的最小限制，该部分具有高的暴露可能性和柔性。将有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分置于重组蜘蛛丝蛋白内，诸如在REP和CT部分之间也是可能的。
术语“融合蛋白”在本文意味着通过由重组核酸，即通过组合正常情况下不会一起出现的两个或更多个核酸序列而人工产生的DNA或RNA表达而制备的蛋白(基因工程)。根据本发明的融合蛋白是重组蛋白，并且因此它们与天然存在的蛋白不同。特别地，因为野生型蛛丝蛋白不是由如上所述的重组核酸表达的，所以他们不是根据本发明的融合蛋白。组合的核酸序列编码具有特定功能特性的不同蛋白、部分蛋白或多肽。所得融合蛋白、或重组融合蛋白是具有源自原始蛋白、部分蛋白或多肽中的每一种的功能特性的单个蛋白。此外，根据本发明的融合蛋白和对应的基因是嵌合的，即该蛋白/基因部分衍生自至少两种不同的物种。
融合蛋白通常由170至2000个氨基酸残基，诸如170至1000个氨基酸残基，诸如170至600个氨基酸残基，优选地170至500个氨基酸残基，诸如170至400个氨基酸残基组成。小尺寸是有利的，因为含有蜘蛛丝蛋白片段的较长蛋白可形成无定形聚集体，这需要使用苛刻的溶剂来溶解和聚合。
融合蛋白可含有一个或更多个接头肽或L区段。一个或更多个接头肽(linkerpeptide(s))可排列在融合蛋白的任何部分之间，例如在REP和CT部分之间、在融合蛋白的任一末端处或在蛛丝蛋白片段和细胞结合基序之间。一个或更多个接头(linker peptide(s))可在融合蛋白的功能性单元之间提供间隔区，而且还可构成用于鉴定和纯化该融合蛋白的工具(handle)，例如His和/或Trx标签。如果融合蛋白含有用于鉴定和纯化融合蛋白的两个或更多个接头肽，那么优选它们被间隔区序列隔开，例如His6-间隔区-His6-。接头还可构成信号肽，诸如信号识别颗粒，其将融合蛋白指导到膜和/或导致融合蛋白从宿主细胞分泌到周围介质中。融合蛋白还可在其氨基酸序列中包括裂解位点，这允许裂解和去除一个或更多个接头(linker(s))和/或其他相关部分。各种裂解位点是本领域技术人员已知的，例如化学剂的裂解位点，诸如Met残基后的CNBr的裂解位点和Asn-Gly残基之间的羟胺的裂解位点；蛋白酶(诸如凝血酶或蛋白酶3C)的裂解位点；以及自剪接序列，诸如内含肽自剪接序列。
蛛丝蛋白片段和有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分直接或间接相互连接。直接连接意味着部分之间的直接共价结合，而没有插入序列，诸如接头。间接连接也意味着部分通过共价键连接，但是存在间隔序列，诸如接头和/或一个或更多个另外的部分，例如1-2个部分。
因此，有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分可在融合蛋白的内部或任一末端处排列，即C-末端排列或N-末端排列。优选细胞结合基序排列在融合蛋白的N-末端处。如果融合蛋白含有用于鉴定和纯化融合蛋白的一个或更多个连接肽，例如His或Trx标签，优选将其排列在融合蛋白的N-末端处。
优选的融合蛋白具有N-末端排列的有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分的形式，通过0-30个氨基酸残基，诸如0-10个氨基酸残基的连接肽与REP部分偶联。任选地，融合蛋白具有N-末端或C-末端连接肽，所述N-末端或C-末端连接肽可含有纯化标签(诸如His标签)、和裂解位点。
不希望受任何具体理论的束缚，预期非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分有功能的展示在所得涂层的表面上，参见实施例6-13。
蛋白部分REP是具有在富含丙氨酸的链段(stretches)和富含甘氨酸的链段之间交替的重复特征的片段。REP片段通常含有多于70个，诸如多于140个，并且少于300个，优选地少于240个，诸如少于200个氨基酸残基，并且本身可分成几个L(接头)区段、A(富含丙氨酸)区段和G(富含甘氨酸)区段，如将在下面更详细解释的。通常，所述接头区段位于REP片段末端，而剩余的区段又富含丙氨酸和富含甘氨酸，所述接头区段为任选的。因此，REP片段通常可具有以下结构中的任一个，其中n是整数：
L(AG)nL，诸如LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5L；
L(AG)nAL，诸如LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5A6L；
L(GA)nL，诸如LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5L；或
L(GA)nGL，诸如LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5G6L。
因此，富含丙氨酸或富含甘氨酸的区段是否与N-末端或C-末端接头区段相邻不是至关重要的。优选n是2至10，优选地2至8，还优选地4至8，更优选的4至6，即n＝4、n＝5或n＝6的整数。
在一些实施方案中，REP片段的丙氨酸含量高于20％，优选地高于25％，更优选地高于30％，并且低于50％，优选地低于40％，更优选地低于35％。预期较高的丙氨酸含量提供更硬和/或更强和/或不太可延伸的纤维。
在某些实施方案中，REP片段不含脯氨酸残基，即REP片段中不存在Pro残基。
现在转向构成REP片段的区段，强调每个区段是单独的，即特定REP片段的任何两个A区段、任何两个G区段或任何两个L区段可以是相同的或可以是不同的。因此，每种类型的区段在特定REP片段内是相同的不是蛛丝蛋白的一般特征。而且，以下公开内容为技术人员提供了如何设计单独的区段并且将它们聚集成REP片段的指南，该REP片段是细胞支架材料中有用的功能性蜘蛛丝蛋白的一部分。
每个单独的A区段是具有8至18个氨基酸残基的氨基酸序列。优选每个单独的A区段含有13至15个氨基酸残基。大多数或多于两个A区段含有13至15个氨基酸残基，并且少数诸如一个或两个A区段含有8至18个氨基酸残基，诸如8-12或16-18个氨基酸残基也是可能的。这些氨基酸残基中的绝大多数是丙氨酸残基。更具体地说，这些氨基酸残基中的0至3个不是丙氨酸残基，并且剩余的氨基酸残基是丙氨酸残基。因此，每个单独的A区段中的所有氨基酸残基毫无例外地或除了一、二或三个氨基酸残基可以是任何氨基酸以外，都是丙氨酸残基。优选取代丙氨酸的氨基酸是天然氨基酸，优选地单独选自丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的组，更优选地是丝氨酸。当然，A区段中的一个或更多个是全丙氨酸区段，而剩余的A区段含有1-3个非丙氨酸残基，诸如丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或甘氨酸是可能的。
在实施方案中，每个A区段含有13-15个氨基酸残基，包括10-15个丙氨酸残基和0-3个如上所述的非丙氨酸残基。在更优选的实施方案中，每个A区段含有13-15个氨基酸残基，包括12-15个丙氨酸残基和0-1个如上所述的非丙氨酸残基。
优选每个单独的A区段与选自SEQ ID NO：5的氨基酸残基7-19、43-56、71-83、107-120、135-147、171-183、198-211、235-248、266-279、294-306、330-342、357-370、394-406、421-434、458-470、489-502、517-529、553-566、581-594、618-630、648-661、676-688、712-725、740-752、776-789、804-816、840-853、868-880、904-917、932-945、969-981、999-1013、1028-1042和1060-1073的组的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地95％，最优选地100％的同一性。该组中的每个序列对应于天然存在的Euprosthenops australisMaSp1蛋白的序列的一个区段，该序列由克隆对应的cDNA推断得来，参见WO 2007/078239。可选地，每个单独的A区段与选自SEQ ID NO：2的氨基酸残基25-36、55-69、84-98、116-129和149-158的组的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地95％，最优选地100％的同一性。该组中的每个序列对应于表达的非天然蜘蛛丝蛋白的一个区段，这些非天然蜘蛛丝蛋白具有在适当的条件下形成丝纤维的能力。因此，在蛛丝蛋白的某些实施方案中，每个单独的A区段与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。不希望受任何具体理论的束缚，设想根据本发明的A区段形成螺旋结构或β折叠。
此外，从实验数据中已经得出结论，每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列。优选每个单独的G区段由14至23个氨基酸残基组成。每个G区段的至少40％的氨基酸残基是甘氨酸残基。通常，每个单独的G区段的甘氨酸含量在40％-60％的范围内。
优选每个单独的G区段与选自SEQ ID NO：5的氨基酸残基20-42、57-70、84-106、121-134、148-170、184-197、212-234、249-265、280-293、307-329、343-356、371-393、407-420、435-457、471-488、503-516、530-552、567-580、595-617、631-647、662-675、689-711、726-739、753-775、790-803、817-839、854-867、881-903、918-931、946-968、982-998、1014-1027、1043-1059和1074-1092的组的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地95％，最优选地100％的同一性。该组中的每个序列对应于天然存在的Euprosthenopsaustralis MaSp1蛋白的序列的一个区段，该序列由克隆对应的cDNA推断得来，参见WO2007/078239。可选地，每个单独的G区段与选自SEQ ID NO：2的氨基酸残基1-24、37-54、70-83、99-125和130-148的组的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地95％，最优选地100％的同一性。该组中的每个序列对应于表达的非天然蜘蛛丝蛋白的一个区段，这些非天然蜘蛛丝蛋白具有在适当的条件下形成丝纤维的能力。因此，在细胞支架材料中蛛丝蛋白的某些实施方案中，每个单独的G区段与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，每个G区段的前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。
存在G区段的三种亚型。该分类基于对Euprosthenops australis MaSp1蛋白序列的仔细分析(参见WO 2007/078239)，并且已经在构建新型非天然蜘蛛丝蛋白中使用和验证了该信息。
G区段的第一种亚型由一字母氨基酸共有序列GQG(G/S)QGG(Q/Y)GG(L/Q)GQGGYGQGAGSS(SEQ ID NO:6)表示。该第一种且通常最长的G区段亚型通常含有23个氨基酸残基，但可含有少至17个氨基酸残基，并且缺少带电荷的残基或含有一个带电荷的残基。因此，优选该第一种G区段亚型含有17-23个氨基酸残基，但是预期其可含有少至12个或多达30个氨基酸残基。不希望受任何具体理论的束缚，设想该亚型形成卷曲结构或31-螺旋结构。该第一种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO：5的氨基酸残基20-42、84-106、148-170、212-234、307-329、371-393、435-457、530-552、595-617、689-711、753-775、817-839、881-903、946-968、1043-1059和1074-1092。在某些实施方案中，根据本发明的该第一种亚型的每个G区段的前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。
G区段的第二种亚型由一字母氨基酸共有序列GQGGQGQG(G/R)YGQG(A/S)G(S/G)S(SEQ ID NO:7)表示。该第二种通常中间尺寸的G区段亚型通常含有17个氨基酸残基，并且缺少带电荷的残基或含有一个带电荷的残基。优选该第二种G区段亚型含有14-20个氨基酸残基，但是预期其可含有少至12个或多至30个氨基酸残基。不希望受任何具体理论的束缚，设想该亚型形成卷曲结构。该第二种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO:5的氨基酸残基249-265、471-488、631-647和982-998。
G区段的第三种亚型由一字母氨基酸共有序列G(R/Q)GQG(G/R)YGQG(A/S/V)GGN(SEQ ID NO:8)表示。该第三种G区段亚型通常含有14个氨基酸残基，并且通常是G区段亚型中最短的。优选该第三种G区段亚型含有12-17个氨基酸残基，但是预期其可含有多至23个氨基酸残基。不希望受任何具体理论的束缚，设想该亚型形成转角结构。该第三种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO:5的氨基酸残基57-70、121-134、184-197、280-293、343-356、407-420、503-516、567-580、662-675、726-739、790-803、854-867、918-931、1014-1027。
因此，在丝涂层中蛛丝蛋白的优选的实施方案中，每个单独的G区段与选自SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少80％，优选地90％，更优选地95％的同一性。
在REP片段的A和G区段的交替序列的实施方案中，每隔一个G区段具有第一种亚型，而剩余的G区段具有第三种亚型，例如...A1G短A2G长A3G短A4G长A5G短...。在REP片段的另一个实施方案中，一个第二种亚型的G区段经由插入中断G区段规则性，例如...A1G短A2G长A3G中A4G短A5G长...。
每个单独的L区段表示任选的接头氨基酸序列，所述任选的接头氨基酸序列可含有0至30个氨基酸残基，诸如0至20个氨基酸残基。虽然该区段是任选的，并且对蜘蛛丝蛋白的功能不是至关重要的，但其存在仍然允许完全功能性的蜘蛛丝蛋白及其聚合物形成纤维、膜、泡沫和其他结构。在来自Euprosthenops australis的MaSp1蛋白的推断的氨基酸序列的重复部分(SEQ ID NO:5)中也存在接头氨基酸序列。特别地，接头区段的氨基酸序列可类似于所述A或G区段中的任一个，但通常不足以满足如本文所定义的标准。
如WO 2007/078239所示，排列在REP片段的C-末端部分处的接头区段可由富含丙氨酸的一字母氨基酸共有序列ASASAAASAASTVANSVS(SEQ ID NO:31)和ASAASAAA(SEQ IDNO:32)表示。事实上，第二序列可被认为是根据本文定义的A区段，而第一序列与根据该定义的A区段具有高度相似性。接头区段的另一个实例具有富含甘氨酸的一字母氨基酸序列GSAMGQGS(SEQ ID NO:33)，并且与根据本文定义的G区段具有高度相似性。接头区段的另一个实例是SASAG(SEQ ID NO:34)。
代表性L区段是SEQ ID NO:5的氨基酸残基1-6和1093-1110；和SEQ ID NO:2的氨基酸残基159-165，但是本领域技术人员将容易认识到存在用于这些区段的许多合适的替代氨基酸序列。在REP片段的一个实施方案中，L区段中的一个含有0个氨基酸，即一个L区段是空的。在REP片段的另一个实施方案中，两个L区段都含有0个氨基酸，即两个L区段是空的。因此，根据本发明的REP片段的这些实施方案可示意性地表示如下：(AG)nL、(AG)nAL、(GA)nL、(GA)nGL；L(AG)n、L(AG)nA、L(GA)n、L(GA)nG；和(AG)n、(AG)nA、(GA)n、(GA)nG。这些REP片段中的任一种都适用于与如下文定义的任何CT片段一起使用。
细胞支架材料中蛛丝蛋白的任选的但优选的CT片段与蜘蛛丝蛋白的C-末端氨基酸序列具有高度相似性。如WO 2007/078239所示，该氨基酸序列在多种物种和蜘蛛丝蛋白(包括MaSp1、MaSp2和MiSp(小壶状蛛丝蛋白(minor ampullate spidroin)))中非常保守。以SEQ ID NO:4提供了MaSp1和MaSp2的C-末端区域的共有序列。在图10中，比对了表1中呈现的MaSp蛋白(SEQ ID NO:38-68)，如果合适的话以GenBank登录条目表示。
表1-拖丝蛋白CT片段
在细胞支架材料中的蜘蛛丝蛋白中存在哪些特定CT片段不是至关重要的。因此，CT片段可选自图10和表1所示的氨基酸序列或具有高度相似性的序列中的任何一种，诸如来自大腹园蛛的MiSp CT片段SEQ ID NO:69(Genbank条目AFV 31615)。多种C-末端序列可用于蜘蛛丝蛋白中。
CT片段的序列与基于图10的氨基酸序列的共有氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少50％的同一性，优选地至少60％，更优选地至少65％的同一性，或甚至至少70％的同一性。
代表性CT片段是Euprosthenops australis序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的氨基酸残基166-263。另一个代表性CT片段是MiSp序列SEQ ID NO:69。因此，在一个实施方案中，CT片段与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2的氨基酸残基166-263、图10和表1的任何单独的氨基酸序列、或SEQ ID NO:69具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少85％，优选地至少90％，诸如至少95％的同一性。例如，CT片段可与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2的氨基酸残基166-263、图10和表1的任何单独的氨基酸序列、或SEQ ID NO:69相同。
CT片段通常由70至120个氨基酸残基组成。优选CT片段含有至少70个或多于80个，优选地多于90个氨基酸残基。还优选CT片段含有至多120个或少于110个氨基酸残基。典型的CT片段含有约100个氨基酸残基。
如本文使用的，术语“％同一性”计算如下。使用CLUSTAL W算法(Thompson等人,Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994))将查询序列与靶序列进行比对。在对应于所比对序列中的最短序列的窗口上进行对比。对比每个位置处的氨基酸残基，并且将查询序列中具有在靶序列中相同的对应物的位置的百分比报告为％同一性。
如本文使用的，按对“％同一性”所描述的计算术语“％相似性”，但以下除外：疏水性残基Ala、Val、Phe、Pro、Leu、Ile、Trp、Met和Cys相似；碱性残基Lys、Arg和His相似；酸性残基Glu和Asp相似；并且亲水性的不带电荷的残基Gln、Asn、Ser、Thr和Tyr相似。在该上下文中剩余的天然氨基酸Gly不与任何其他氨基酸相似。
在整个本说明书中，根据本发明的替代实施方案实现了对应相似性百分比，而不是指定的同一性百分比。其他替代实施方案实现了指定的同一性百分比以及选自对于每个序列的优选的同一性百分比的组中的另一个较高的相似性百分比。例如，某序列可与另一个序列70％相似；或者其可与另一个序列70％相同；或者其可与另一个序列70％相同并且90％相似。
在根据本发明的优选的融合蛋白中，REP-CT片段与SEQ ID NO:2具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少85％，优选地至少90％，诸如至少95％的同一性。
在根据本发明的一种优选的融合蛋白中，蛋白与SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和70中的任何一种具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少85％，优选地至少90％，诸如至少95％的同一性。在特别优选的实施方案中，根据本发明的融合蛋白是SEQID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和70中的任何一种。
有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分可为在该上下文中期望暴露的任何部分，并且特别是能够提供根据本发明的蜘蛛丝蛋白的期望的结合官能度的细胞结合基序或另一种肽/蛋白。
可用于本发明的特异性细胞结合肽包括RGD、IKVAV(SEQ ID NO：35)、YIGSR(SEQID NO:36)，并且特别是RGD。特别优选的细胞结合肽是FNcc基序，即侧翼为第一Cys作为第三上游残基并且第二Cys残基作为第四下游残基的RGD基序(CXXRGDXXXC；SEQ ID NO:37)，参见SEQ ID NO:11。
其他有用的特异性蛋白是亲和结构域，包括葡萄球菌蛋白A及其变体，诸如Z结构域；链球菌蛋白G及其变体、白蛋白及其变体、生物素及其变体；和链霉抗生物素蛋白及其变体。
另一组有用的特异性蛋白包括抗微生物肽及其变体，诸如爪蟾抗菌肽I。
另一组有用的特异性蛋白是酶及其变体，包括木聚糖酶和Dispersin B。
另一组有用的特异性蛋白是生长因子及其变体，包括FGF、FGF2、IGF1、EGF1、NGF1、VEGF及其变体。
另一组有用的特异性蛋白是重组抗体片段及其融合物，包括单链可变片段(scFv)、Fab片段及其变体。
在该上下文中，如果在至少15个氨基酸残基，优选地至少20、25或30个氨基酸残基的窗口上，蛋白与靶分子具有特异性结合亲和力，并且与原始分子或其部分中之一具有至少70％，诸如80％、85％、90％或95％的同一性，那么该蛋白被认为是“变体”。
根据相关方面，本发明提供了根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白的用途，其中所述重组蜘蛛丝蛋白是包含有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分的融合蛋白。上文公开了优选的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分。
根据第二方面，本发明提供了一种用能够形成聚合固体结构的重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，其中重组蜘蛛丝蛋白涂层包括：
-在重组蜘蛛丝蛋白和固体表面之间不形成共价键的情况下吸附在固体表面上的重组蜘蛛丝蛋白的表面层；和
-在表面层上的重组蜘蛛丝蛋白的组装的丝结构层。
与蜘蛛丝蛋白的常规干燥进入涂层相比，由本发明的用于在水性溶液中涂覆的方法提供的重组蜘蛛丝蛋白的涂层具有几个优点：
·更均匀的涂层表面
·更薄的涂层(与1-2μm的空气干燥的膜相比，通常厚度小于50nm)，这减少所需的蛋白量，并且给予更好的直接接触
·具有高含水量的粘性其他层，这使得涂层更类似于活组织。
本发明的用于在水性溶液中用重组蜘蛛丝蛋白涂覆固体表面的方法有利地提供了双层结构，所述双层结构具有第一表面层和第二结构层，所述第一表面层由重组蜘蛛丝蛋白和固体表面之间的非共价键形成，其中重组蜘蛛丝蛋白在表面层上自发地组装成丝结构层。根据本发明的蜘蛛丝蛋白在初始表面层上形成组装的丝结构层和形成稳定的组装的丝结构层方面令人惊讶地有效。
所得双层结构的感兴趣特性是组装的丝结构层比表面层更粘稠。初始表面层含有较少的水，并且因此更刚性，而组装的丝结构层含有更多的水，并且更粘稠。这使得例如植入物的涂覆结构更类似于周围组织，并且降低炎性反应的风险等。两层的粘度可通过使用耗散型石英晶体微天平(QCM-D)监测比较它们的耗散与频率比率来确定。组装的丝结构层具有比初始表面层更高的耗散与频率比率，优选地至少高2倍，并且通常高5-10倍。
组装的丝结构层优选地呈纳米纤维的物理形式，优选地具有小于20nm，诸如10-20nm的直径；和/或其中重组蜘蛛丝蛋白涂层具有小于50nm，诸如10-40nm的总厚度。
本文公开了可构成固体表面的优选的材料。本文还公开了优选的重组蜘蛛丝蛋白。
在优选的实施方案中，用根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面可通过根据本发明的方法制备，或者甚至被通过根据本发明的方法制备。
固体表面优选地是生物材料、植入物或医学装置的表面，更优选地是植入物的表面。涂覆的表面也可用作用于细胞培养(优选地体外)的基质。根据本发明的涂覆的表面还可用作用于细胞固定、细胞培养、细胞分化、组织工程和引导细胞再生的支架。它还可用于制备和分析分离程序，诸如层析、细胞捕获、选择和培养、有源过滤器和诊断。
在一个实施方案中，用根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面还包含贴附到重组蜘蛛丝蛋白涂层上生长的真核细胞。优选的细胞类型包括成纤维细胞和内皮细胞，优选地人类细胞，并且优选地人类原代细胞。
通过QCM-D、椭圆偏振术、和SPR实时研究根据本发明的重组蜘蛛丝蛋白的表面吸附，显示出这些蛋白只要表面被暴露于蛋白溶液就自发地组装成丝涂层。涂层对于用高达0.5M HCl、0.5M NaOH、和70％乙醇以及PBS洗涤是稳定的，这意指涂层可被灭菌，并且具有用于体内应用的潜力。蛋白与表面相互作用在表面上形成刚性的初始蛋白层，而随后的蛋白与蛋白的组装在涂层中掺入大量的水，产生粘性相。对蛋白涂层的表面形貌的研究显示出，蛋白组装成纳米纤维并且形成异质层，这可以与体内结缔组织的原纤维结构相比较。用纤连蛋白基序和抗微生物肽官能化的丝蛋白可在聚苯乙烯、钛、和不锈钢上形成涂层。该涂覆方法对于使用类似生理的条件官能化植入物材料以便改进它们在体内的功能非常有用。在两种类型的官能化丝上的涂层上培养成纤维细胞显示出良好的细胞存活力。从在具有纤连蛋白基序的丝涂层上培养内皮细胞获得类似的结果。该涂覆方法对于允许固体表面的多用途官能化也非常有用。例如，具有几乎任何期望亲和力的IgG分子的Fc部分可被固定到具有与Z部分融合的蜘蛛丝的涂层上。
以下将通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
实验部分
材料
在大肠杆菌(E.coli)BL21中重组产生蛋白，并且使用层析纯化。如果未说明其他条件，在20mM Tris pH 8.0缓冲液使用蛋白。在吸附测量期间，将蛋白溶液保持在冰上。具有1-十一烷硫醇(Sigma Aldrich)的烷基硫醇溶液以在99.5％乙醇(溶剂)中的2mM溶液来制备。通过将培养皿碎片溶解在甲苯中制备2％聚苯乙烯溶液。
耗散型石英晶体微天平监测
耗散型石英晶体微天平(QCM-D)监测利用AT切割石英晶体的压电特性，通过施加脉冲电压来监测其振荡频率和振荡耗散的改变。在质量吸附到晶体传感器上后，频率降低，并且耗散增加。通过比较耗散改变与频率改变，可评价吸附的层的粘弹性特性。
用钛和SS2343型不锈钢(Biolin Scientific)涂覆的QCM-D传感器根据制造商建议进行清洁，并且无需另外修改即可使用。金涂覆的QCM-D传感器通过三步程序清洁，从浸入98％甲酸中10分钟开始，然后在Milli-Q水中彻底冲洗，在Harrick等离子PDC-3XG等离子清洁器中以最大功率进行5min等离子处理，并且随后在80℃在Milli-Q水、32％氨、和30％过氧化氢的6:1:1混合物中孵育8min。在Milli-Q水中彻底冲洗后，将表面在氮气中干燥，并且在烷基硫醇溶液中孵育过夜。通过在99.5％乙醇中超声波处理5min重复5次去除过量的烷基硫醇。通过在DataPhysics OCA40仪器上测量每个传感器上2μl Milli-Q水滴的接触角来验证官能化，显示出疏水性表面的接触角为102°±2°。聚苯乙烯传感器通过在已经根据制造商建议清洁的金传感器上旋涂在甲苯中的2％聚苯乙烯来制备。
QCM-D测量在E4仪器(Q-Sense)中进行。流速被设置为20μl/min，并且温度被固定在20.0℃。将系统用20mM Tris平衡，直到基线稳定。在相同的设置下研究蛋白涂层的稳定性。在疏水性表面上120分钟的蛋白吸附并且用20mM Tris冲洗60分钟后，将传感器展现给磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及0.1M和0.5M氢氧化钠、0.1M和0.5M盐酸、或20％和70％乙醇。使每种溶液在传感器上流动持续30分钟，然后直接是30分钟的20mM Tris冲洗，以重新获得Tris基线，用于评价对应于表面上蛋白量的改变的净频率改变。
椭圆偏振术
椭圆偏振术监测被反射到表面上的光的偏振的改变。当蛋白吸附到表面上时，光偏振被改变。通过监测该改变，可计算折射率和吸附质量的改变。将烷基硫醇官能化金传感器安装在Q-Sense椭圆偏振模块中，以允许同时进行使用用于QCM-D监测的E1仪器(Q-senseAB)数据收集和使用椭圆偏振仪(Physics Instruments)记录在吸附期间蛋白涂层介电特性的改变。
对于椭圆偏振术，使用入射角为65°的532nm激光。关于E4仪器中的测量使用相同的设置，不同之处是流速被设置为25μl/min。使用QTools软件(Biolin Scientific)由频率和耗散移动计算质量吸附。利用该技术，被掺入到涂层中的水对信号有贡献，使得利用这些计算获得的质量为湿质量。使用椭圆偏振软件(Plamen Petrov)和3层模型由椭圆偏振数据计算干质量。表面等离子体共振
在表面等离子体共振(SPR)中，记录了在晶体芯片上的薄金层中发生等离子体共振时的入射角。当分子与芯片表面相互作用时，该角度被改变，这与折射率的改变相关，并且从而它间接与接近于芯片表面的质量改变相关。
将ProteOnTMGLM传感器芯片从其支持物上卸下，并且如以上关于QCM-D金传感器所述进行清洁。使用ProteOnTMXPR36蛋白相互作用阵列系统(Bio-Rad)，其中芯片和支架两者的温度被设置为25.0℃，并且流速被设置为25μl/min。使用最大注射体积，导致960s的给定流速的蛋白注射。执行三次蛋白注射。在每次注射后，在自动注射器再填充时间期间，使20mM Tris缓冲液在芯片上流动。
原子力显微术
在QCM-D分析后，使用原子力显微术对具有吸附蛋白的传感器成像，其中表面形貌通过测量非常接近于正扫描样品上选择区域的表面的针尖的偏转改变来确定。在BrukerDimension FastScan仪器中，使用PeakForce轻敲模式在20mM Tris缓冲液中对蛋白涂层成像。使用ScanAsyst流体+针尖。
丝涂层上的细胞培养和细胞接种
将来自人类来源的小血管的原代内皮细胞(人类真皮微血管内皮细胞HDMEC，Promocell)在含有5％FBS的内皮细胞生长介质MV2(Promocell)中培养。将人类原代真皮成纤维细胞(HDFn，ECACC,UK)在补充有5％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM F12ham中培养。将细胞以5000个/cm2接种到96孔板(Sarstedt Tc悬浮细胞)中的丝涂层上。
存活/死亡染色
在第2天和第8天，将细胞在PBS中洗涤，并且用在介质中的分别针对存活细胞和死亡细胞的钙黄绿素-AM和EthD-1(存活/死亡存活力试剂盒，Molecular probes)染色30分钟。在倒置荧光显微镜(Nikon Tsi-u)中以10×放大倍数拍摄显微照片。
Alamar蓝存活力测定
用在培养基中1:10稀释的Alamar蓝分析第0天、第3天、第8天和第11天的细胞存活力持续2h。以激发/发射540/595在ClarioStar酶标仪中测量上清液的荧光强度。将不具有细胞的介质用作空白，将其从值中减去。将孔以一式三份运行。
实施例1-丝涂层形成的实时监测揭示连续吸附
使重组蜘蛛丝蛋白RepCT(SEQ ID NO:2)在金表面上流动，分别使用QCM-D传感器和SPR传感器进行分析。图1示出了在烷基硫醇修饰的金传感器上的蛋白吸附。显示出了由QCM-D(A)和SPR(B)研究的0.1g L-1RepCT的吸附，以及由QCM-D(C)和SPR(D)研究的0.1g L-1蛋白酶3C的吸附。I、III和V指示在表面上蛋白流动的开始，而在时间点II和IV，用缓冲液冲洗表面。
当RepCT在QCM-D传感器流动时，它以两个不同的阶段吸附到表面上(图1A)。在最初几分钟期间，蛋白-表面相互作用导致-23Hz(n＝6，σ＝4)的快速频移和表面层的形成。奇怪的是，当表面被蛋白的初始表面层覆盖时，吸附未停滞。相反，批次(bulk)蛋白与表面吸附的蛋白相互作用，以通过蛋白-蛋白相互作用形成更厚的涂层。只要批次中存在蛋白，该方法继续。我们将此解释为丝组装，即在初始表面层上形成组装的丝结构层。当蛋白溶液被更换为缓冲溶液以冲洗表面时，传感器的频率和耗散保持不变，这意指涂层的吸附质量和粘弹性特性被维持。因此，在缓冲液流动期间蛋白未被洗掉，指示蛋白-蛋白相互作用是稳定的。
使用非丝蛋白蛋白酶3C进行相同的实验，该蛋白酶3C类似于RepCT的尺寸(分别为24kDa和23kDa)和主要二级结构基序(PDB序列中55％的β-折叠类似于本文中的蛋白酶3C，并且RepCT中30％-60％的β-折叠呈丝形式，如从易于形成β-折叠的区域的百分比预测的那样)。在蛋白酶3C吸附的最初几分钟后，通过蛋白与表面相互作用驱动，不再发生吸附，因为这些蛋白不能自组装(图1C)。
在用RepCT和蛋白酶3C的SPR分析中观察到相同的吸附模式。在本文中，注射器体积将每次注射的吸附时间限制为15分钟。为了研究更长时间段后的吸附，执行三次蛋白注射(图1B和D中的阶段I、III和V)，其中在其(图1B和D中的阶段II和IV)之间用缓冲液冲洗。如用QCM-D观察到，蛋白酶3C的吸附达到饱和，而只要蛋白在批次溶液中可用，RepCT的吸附就继续。这些实验清楚地显示出在丝吸附到表面上时发生丝组装，因为连续吸附行为不同于非组装蛋白的饱和吸附。
实施例2-组装方法的浓度依赖性
通过使递增浓度的蛋白在金表面上流动使用QCM-D研究重组蜘蛛丝蛋白RepCT(SEQ ID NO:2)的组装方法的浓度依赖性。
图2(左图)示出了疏水性烷基硫醇化金传感器上RepCT吸附的QCM-D测量。在每个箭头处，缓冲液在表面上流动持续30min。在每个编号标记处增加蛋白浓度：I)0.05mg/ml、II)0.1mg/ml、III)0.3mg/ml、和IV)0.5mg/ml。右边的图像是相同浓度的丝纤维的光学显微镜照片。标尺是1.0mm。
在吸附期间，将RepCT的浓度从0.05mg/ml增加到0.1mg/ml、0.3mg/ml，并且最后增加到0.5mg/ml，导致在组装阶段中对于每次浓度增加更快的吸附，而不使表面饱和(图2)。这再次证明观察到的吸附模式是由于RepCT蛋白的自组装性质。从对应浓度的蛋白溶液中看到纤维形成的相同浓度依赖性(图2)。
实施例3-自组装的丝涂层富含水
吸附层的粘弹性特性可由使用耗散(D)与频率(f)比率的QCM-D测量获得。刚性层的形成给出低D值，并且因此给出低ΔD/Δf，而粘性层的形成产生高ΔD/Δf。对于重组蜘蛛丝蛋白RepCT(SEQ ID NO:2)，初始吸附阶段产生0.014的ΔD/Δf(n＝6，σ＝0.017)，并且在组装阶段期间，ΔD/Δf为0.118(n＝6，σ＝0.017)。因此，初始表面层是刚性的，并且连续丝组装产生更粘稠的层，即组装的丝结构层。
通过将耗散相对于频移绘图将丝涂层的这种粘弹性特性在图3中可视化。在图3A中，将在吸附到QCM-D传感器期间耗散的改变相对于RepCT(黑色，长曲线)和蛋白酶3C(以一式三份示出，较短的灰色曲线)的对应频率改变进行绘图，这两种蛋白都以20mM Tris缓冲液来使用。在图3B中，通过计算来自QCM-D测量的湿质量(实线)和来自同时椭圆偏振测量的干质量(虚线)，来确定RepCT涂层的含水量(点线)。
在接近零的频率，即在涂层形成开始时，耗散改变比频率改变慢得多。在某一点上，曲线的斜率采用更高的值(这测量的其余部分保持)，导致高的耗散和频率值。该行为应该与蛋白酶3C吸附的耗散频率图进行比较(图3A，三条较低的曲线对应于一式三份的蛋白酶3C吸附测量)。这些蛋白不能像RepCT能够的那样自组装成连续涂层。因此，这些曲线永远达不到低于-30Hz的频率。在实验的主要部分期间，斜率持续低，这意味着形成刚性蛋白层。在达到最小频率后，由于缓冲液冲洗，斜率被反转。这被解释为去除一些松散结合的蛋白，同时稍微降低粘弹性。
通过比较如从由同一表面上同时测量获得的QCM-D和椭圆偏振术数据计算的吸附质量，可分别提取有水和没有水的质量，并且可确定蛋白涂层中的含水量(图3B)。蛋白酶3C层的含水量为40％(n＝3，σ＝10)，而RepCT涂层具有高达77％(n＝3，σ＝11)的含水量，符合其相当高的D/f值。
实施例4-丝组装成原纤维结构
用显微术可视化重组蜘蛛丝蛋白RepCT(SEQ ID NO:2)的涂层结构。将烷基硫醇化的金传感器在QCM-D测量期间吸附后用原子力显微术成像。
图4示出了在烷基硫醇官能化金QCM-D传感器上2分钟吸附(A)和120分钟吸附(B)后的RepCT蛋白的形貌图像，其在Tris缓冲液中通过AFM获得。感兴趣的是，我们发现蛋白不以同质层而以纳米纤维吸附(图4)。纳米纤维的宽度为10-20nm，并且以范围为从70-400nm的各种长度堆叠成串，看起来像一排排珍珠。
实施例5-涂层对化学洗涤是稳定的
通过使0.1M PBS、和0.5M HCl、0.1M和0.5M NaOH以及20％和70％乙醇在涂层上流动，在QCM-D测量期间评价重组蜘蛛丝蛋白RepCT(SEQ ID NO:2)的涂层的涂层稳定性。在这些洗涤中的每一次之间，使Tris缓冲液在表面上流动，以区分缓冲液批次效应(bufferbulk effects)与涂层的实际改变。在改变回Tris缓冲液后，任何向更高频率的净移动都将指示蛋白已被洗掉。
图5示出了疏水性表面上RepCT组装的QCM-D分析，随后然后用如图表中说明的溶液冲洗。箭头显示出冲洗溶液何时更换为Tris缓冲液。如图5中明显的，在任何洗涤步骤后都未发生质量损失，这意指丝涂层对所有测试溶液都是稳定的。
实施例6-植入物表面的简单且无化学的官能化
评价分别与抗微生物肽爪蟾抗菌肽I(MAG-RepCT；SEQ ID NO:9)和纤连蛋白基序(FNcc-RepCT；SEQ ID NO:11)融合的重组蜘蛛丝蛋白用于官能化临床相关植入物材料的可能性。通过QCM-D实时研究每种丝类型在聚苯乙烯、钛和不锈钢涂覆传感器上流动时的吸附。这两种丝类型都可在没有任何预调整的情况下良好地吸附到所有表面上。
图6示出了具有FNcc-RepCT(A)和MAG-RepCT(B)的丝组装到钛(实线)和不锈钢(虚线)上的QCM-D研究。MAG-丝和FNcc-丝两者的组装能力被保留，导致在功能性丝的表面上形成与非功能性丝同样良好的涂层。
这开辟了临床相关植入物材料的简单、非共价官能化，其中可改进体内植入物性能的肽基序可在不需要任何化学附接的情况下被固定在植入物表面上。
进一步使用QCM-D技术研究用各种类型的(MAG-RepCT、FNcc-RepCT和Z-RepCT)Z-RepCT(SEQ ID NO:13)涂覆构成不同化学和物理特性的其他表面的可能性，该Z-RepCT(SEQID NO:13)是与Z结构域，即来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的IgG结合结构域B的工程化类似物融合的重组蜘蛛丝蛋白。结果概要在表2中呈现。
表2.用于通过自组装的丝涂层的基材
实施例7-功能性涂层增强细胞与植入物表面的相互作用
为了评价根据本发明的重组蜘蛛丝涂层的细胞相容性，允许真皮来源的人类成纤维细胞和内皮细胞在涂层上生长11天，在此期间，通过Alamar蓝监测生长(图7A和B)。在2和8天后，将细胞染色，以研究存活细胞和死亡细胞的存在，而且还将细胞形态和细胞在基质上的扩散可视化(绿色染色)(图7C和D)。
图7说明了聚苯乙烯上FNcc-RepCT(SEQ ID NO:9)和MAG-RepCT(SEQ ID NO:11)的丝涂层上的细胞存活力。显示出HDF(A)和HDMEC(B)的细胞计数。每种丝类型上HDF(C)和HDMEC(D)在第2天(d2)和第8天(d8)的存活/死亡图像在右侧显示。
结果指示两种细胞类型都在丝涂层上存活和增殖。在MAG丝上，成纤维细胞显示出非常类似于RepCT丝(SEQ ID NO:2)的生长曲线，即根据本发明的重组蜘蛛丝对成纤维细胞没有添加任何特定功能，而内皮细胞在MAG-RepCT丝上显示出与RepCT丝相比稍微增加的生长。
存活/死亡染色显示出高水平的存活细胞，并且两种涂层仅偶尔出现死亡细胞。成纤维细胞出现正常形态，并且在FN丝和MAG丝两者上扩散。内皮细胞在第2天扩散稍差，但在培养时间期间有所改进，并且细胞在第8天显示出正常形态，但不像FN丝上那么高的汇合。结果表明丝涂层能够增强与细胞的相互作用，并且支持细胞在涂覆的表面上的生长和存活。
实施例8-亲和丝融合物的涂层形成
使具有亲和结构域的三种不同的丝融合物；Z-RepCT、C2-RepCT和ABD-RepCT单独在金表面上流动,使用QCM-D传感器进行分析。Z-RepCT(SEQ ID NO:13；图8A)是与Z结构域，即来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的IgG结合结构域B的工程化类似物融合的重组蜘蛛丝蛋白。C2-RepCT(SEQ ID NO:15；图8B)是与衍生自葡萄球菌蛋白G的Fc结合结构域B1的C2融合的重组蜘蛛丝蛋白。ABD-RepCT(SEQ ID NO:17；图8C)是与衍生自葡萄球菌蛋白G的白蛋白结合结构域融合的重组蜘蛛丝蛋白。
图8A-C示出了0.1mg/ml丝融合蛋白在20mM Tris中的典型吸附行为。在时间点I，将表面暴露于蛋白溶液，并且在时间点II，将表面用缓冲液冲洗。在最初的几分钟期间，蛋白-表面相互作用由于表面层的形成而导致快速频移。此后，批次蛋白与表面吸附的蛋白相互作用，以通过蛋白-蛋白相互作用形成更厚的涂层，这通过持续的斜率频移观察到的。只要批次中存在蛋白，该方法就继续，但是然后在用缓冲液冲洗表面时，频率稳定。
为了确认Z-RepCT涂层(SEQ ID NO:13；图8D)维持的亲和力，将SiO2表面首先用Z-RepCT溶液(I)涂覆，用Tris(II)洗涤，并且然后暴露于IgG(III)，显示出暴露的Z部分的结合官能度。在Tris缓冲液(IV)存在的情况下结合的IgG被保留。最后用HCl(V)去除结合的IgG使功能性涂层再生。
实施例9-生长因子丝融合物的涂层形成
使具有生长因子的两种不同的丝融合物；RepCT-FGF(SEQ ID NO:19)和IGF1-RepCT(SEQ ID NO:21)单独在金表面上流动，使用QCM-D传感器进行分析。图9示出了0.1mg/ml RepCT-FGF在20mM Tris中的典型吸附行为。在时间点I，将表面暴露于RepCT-FGF蛋白溶液，并且在时间点II，将表面用Tris缓冲液冲洗。
在最初的几分钟期间，蛋白-表面相互作用由于表面层的形成而导致快速频移。此后，批次蛋白与表面吸附的蛋白相互作用，以通过蛋白-蛋白相互作用形成更厚的涂层，这通过持续的斜率频移观察到的。只要批次中存在蛋白，该方法就继续，但是然后在用缓冲液冲洗表面时，频率稳定。
为了确认涂层内的功能性生长因子，在具有或不具有补充的可溶性生长因子的明确的细胞培养介质中在聚苯乙烯孔上形成的丝涂层上培养内皮细胞。使用Quick粘附测定分析细胞在涂层上贴附和散开的能力。在一周的培养中，使用重复的Alamar蓝存活力测定来分析增殖行为。这些测定确认了涂层内的生长因子是功能性的。
实施例10-抗微生物丝融合物的涂层形成
使具有抗微生物序列的两种不同的丝融合物；DspB-RepCT(SEQ ID NO:23；包含水解生物膜中糖苷的酶Dispersin B)和WGR-RepCT(SEQ ID NO:25；包含工程化抗微生物肽)在金表面上流动，并且使用QCM-D传感器进行分析，以便验证蛋白吸附和蛋白-蛋白相互作用。
为了研究抗微生物作用，将两种类型细菌(金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))孵育到涂覆的表面上，并且此后进行存活/死亡染色，并且用共聚焦显微术进行分析，以确定存活细菌的比率。
实施例11-抗体片段丝融合物的涂层形成
使与来自scFv文库的重组抗体片段融合的丝在金表面上流动，并且使用QCM-D传感器进行分析，以便验证蛋白吸附和蛋白-蛋白相互作用。
为了验证它们结合其靶抗原的能力，将荧光标记的抗原添加到涂覆的表面，然后是彻底洗涤以及用荧光显微术分析和图像分析。
实施例12-酶丝融合物的涂层形成
使与酶木聚糖酶融合的丝(Xyl-RepCT；SEQ ID NO:27)在金表面上流动，并且使用QCM-D传感器进行分析，这验证蛋白吸附和蛋白-蛋白相互作用。
涂层中的酶促活性使用比色测定木聚糖的裂解来验证。简而言之，添加40mM PNX(对硝基苯基-木吡喃糖苷)底物，然后孵育，例如50℃持续10min至过夜。然后，将100μl终止溶液(0.5M Na2CO3)添加到每个膜中，随后是在410nm处的吸光度测量，以鉴定来自酶促反应的产物。
实施例13-链霉抗生物素蛋白丝融合物的涂层形成
使与单体链霉抗生物素蛋白融合的丝(M4-RepCT；SEQ ID NO:29)在金表面上流动，并且使用QCM-D传感器进行分析，以便验证蛋白吸附和蛋白-蛋白相互作用。
为了验证生物素化分子的结合，将涂层与含有Atto-565-生物素的溶液一起孵育。彻底洗涤后，使用倒置Nikon Eclipse Ti仪器(在563nm处激发，在592nm处发射)对涂层进行荧光显微镜分析，以研究结合的标记的生物素的存在。
表3.用于通过自组装的丝涂层的融合蛋白
实施例14-与细胞结合基序融合的丝的涂层形成
通过将无菌过滤的FNcc-RepCT(MiSP)-丝蛋白(SEQ ID NO:70)(0.3g L-1)在96孔未处理的板(Sarstedt)中孵育0.5小时来制备用于细胞培养物的涂层。去除液体，并且将孔用Tris缓冲液(20mM)洗涤两次，然后设置成在无菌条件下干燥过夜。
将来自人类来源的毛细血管的原代内皮细胞(HUVEC，Promocell)在含有胎牛血清(FBS，5％)的内皮细胞生长介质MV2(Promocell)中培养。使用在第6代的细胞，并且以5000个/孔接种到96孔板中的丝涂层上，其中未涂覆的孔作为对照。将细胞在37℃在受控水平的CO2(5％)和湿度(95％)培养。
用在培养基中1:10稀释的细胞存活力试剂(Invitrogen)分析第1天、第4天和第7天的细胞存活力持续2h。以激发＝540nm和发射＝595nm在CLARIOstar酶标仪(BMG LABTECH股份有限公司)中测量上清液的荧光强度。将不具有细胞的介质中的Alamar蓝用作空白，并且从值中将其减去。将孔以一式三份运行。图11示出了生长曲线的图，其中清楚的是FNcc-RepCT(MiSP)-丝蛋白的涂层促进细胞的贴附和扩增，而不具有涂层的对照孔不支持细胞培养。
在第9天，将细胞在PBS中洗涤，并且在培养基中分别用钙黄绿素-AM和乙锭同型二聚体-1(存活力/细胞毒性试剂盒L3224，Molecular probes)染色30分钟，以检测存活细胞和死亡细胞。在倒置荧光显微镜(Nikon Ti-S)中以10×放大倍数拍摄显微照片。如图11中的上部显微照片中可观察到的，FNcc-RepCT(MiSP)-丝涂覆的孔被存活细胞覆盖，并且几乎没有死细胞(下部显微照片)。
实施例15-缺少C-末端结构域的蛛丝蛋白的涂层形成
将缺少任何C-末端(CT)结构域的蛋白Rep(SEQ ID NO:71)溶液在金表面上流动，使用QCM-D传感器进行分析。图12A示出了0.3mg/ml Rep在20mM Tris中的典型吸附行为。用20mM Tris缓冲液平衡后，表面被暴露于蛋白溶液。在最初的几分钟期间，蛋白-表面相互作用由于表面层的形成而导致快速频移。此后，批次蛋白与表面吸附的蛋白相互作用，以通过蛋白-蛋白相互作用形成更厚的涂层，如持续的斜率频移观察到的。该方法继续，只要批次中存在蛋白(140min)。我们将此解释为丝组装，即在初始表面层上形成组装的丝结构层，也适用于缺少C-末端结构域的蛛丝蛋白。当蛋白溶液被更换为缓冲溶液冲洗表面时，传感器的频率和耗散保持不变，这意指涂层的吸附质量和粘弹性特性被维持。
使用原子力显微术对吸附Rep蛋白45min的表面成像，其中表面形貌通过测量非常接近于正扫描样品上选择的区域的表面的针尖的偏转改变来确定。在Bruker DimensionFastScan仪器中，使用PeakForce轻敲模式在20mM Tris缓冲液中对蛋白涂层成像，在图12B中示出的。使用ScanAsyst流体+针尖。可观察到原纤维涂层，但与具有C-末端结构域的蛛丝蛋白的对应涂层相比较不均匀。
实施例16-用于细胞培养应用的重组蜘蛛丝蛋白的膜和湿涂层
纯化后，重组蜘蛛丝蛋白RepCT(SEQ ID NO:2)和RGD-RepCT(SEQ ID NO:72)的溶液经过滤灭菌(0.22μm)，并且通过离心过滤(Amicon Ultra，Millipore)浓缩。
通过将蛋白浓度为0.3mg/ml的溶液浇铸到96孔细胞培养板(Sarstedt，用于悬浮细胞)中，并且使其在无菌条件下在25℃和30％相对湿度(rh)下干燥过夜来制备膜。通过根据本发明的方法，通过用0.3mg/ml的蛋白溶液覆盖培养孔2h然后去除液体制备湿涂层。将膜和涂覆的表面两者用无菌的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤两次，并且与完全的细胞培养介质在37℃在5％CO2下预孵育1h，然后接种细胞。
来自青少年包皮的原代人类真皮成纤维细胞(HDF)(ECACC)在补充有5％胎牛血清(Sigma)和1％青霉素-链霉素(VWR)的DMEM F12ham(Sigma)中培养。将细胞在解冻后扩增7天，并且用台盼蓝检查细胞存活力，然后以20.000个存活细胞/cm2接种。使细胞在细胞培养箱中贴附膜或涂层1h，然后用预热的磷酸盐缓冲盐水(PBS)温和洗涤两次，然后用96％乙醇固定10min。在水中洗涤三次后，将细胞用在H2O中的0.1％结晶紫染色30min。在水中彻底洗涤后，将板干燥。
通过在倒置明视野显微镜中以2×和10×放大倍数拍摄显微照片，来记录与膜结合的细胞的贴附和形态。然后将颜色溶解在40μL 20％乙酸中10min，并且将35μL溶液转移到384孔板，用于在595nm处的光密度测量(TECAN Infinite M200)。
相同蛋白类型(WT 60％，RGD 100％)的膜和涂层之间贴附细胞的数目相当。然而，通常观察到分离的膜片，特别是在膜的边缘。对于通过根据本发明的湿涂层方法制备的对应涂层，从未观察到这种现象。
序列表
<110> 思百博技术股份公司
<120> 固体表面的蜘蛛丝涂层
<130> PC-21090162
<150> EP 16169789
<151> 2016-05-16
<150> EP 16192443
<151> 2016-10-05
<160> 72
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 789
<212> DNA
<213> Euprosthenops australis
<400> 1
ggtccgaatt caggtcaagg aggatatggt ggactaggtc aaggagggta tggacaaggt 60
gcaggaagtt ctgcagccgc tgccgccgcc gcagcagccg ccgcagcagg tggacaaggt 120
ggacaaggtc aaggaggata tggacaaggt tcaggaggtt ctgcagccgc cgccgccgcc 180
gcagcagcag cagcagctgc agcagctgga cgaggtcaag gaggatatgg ccaaggttct 240
ggaggtaatg ctgctgccgc agccgctgcc gccgccgccg ccgctgcagc agccggacag 300
ggaggtcaag gtggatatgg tagacaaagc caaggtgctg gttccgctgc tgctgctgct 360
gctgctgctg ccgctgctgc tgctgcagga tctggacaag gtggatacgg tggacaaggt 420
caaggaggtt atggtcagag tagtgcttct gcttcagctg ctgcgtcagc tgctagtact 480
gtagctaatt cggtgagtcg cctctcatcg ccttccgcag tatctcgagt ttcttcagca 540
gtttctagct tggtttcaaa tggtcaagtg aatatggcag cgttacctaa tatcatttcc 600
aacatttctt cttctgtcag tgcatctgct cctggtgctt ctggatgtga ggtcatagtg 660
caagctctac tcgaagtcat cactgctctt gttcaaatcg ttagttcttc tagtgttgga 720
tatattaatc catctgctgt gaaccaaatt actaatgttg ttgctaatgc catggctcaa 780
gtaatgggc 789
<210> 2
<211> 263
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(158)
<223> REP片段
<220>
<221> 结构域
<222> (159)..(165)
<223> 间隔区片段
<220>
<221> 结构域
<222> (166)..(263)
<223> CT片段
<400> 2
Gly Pro Asn Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
35 40 45
Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly
100 105 110
Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr
130 135 140
Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr
145 150 155 160
Val Ala Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg
165 170 175
Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met
180 185 190
Ala Ala Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala
195 200 205
Ser Ala Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu
210 215 220
Glu Val Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly
225 230 235 240
Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn
245 250 255
Ala Met Ala Gln Val Met Gly
260
<210> 3
<211> 98
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 3
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn
20 25 30
Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala
35 40 45
Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala
50 55 60
Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser
65 70 75 80
Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val
85 90 95
Met Gly
<210> 4
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 衍生自已知的MaSp1和MaSp2蛋白的共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(71)
<223> 已知物种变体中存在的序列长度
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> Glu
<400> 4
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val Gly Gln Ser Val Ala Gln Ala
85 90 95
Leu Gly Glu Phe
100
<210> 5
<211> 1110
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<220>
<221> 重复
<222> (7)..(19)
<220>
<221> 重复
<222> (20)..(42)
<220>
<221> 重复
<222> (43)..(56)
<220>
<221> 重复
<222> (57)..(70)
<220>
<221> 重复
<222> (71)..(83)
<220>
<221> 重复
<222> (84)..(106)
<220>
<221> 重复
<222> (107)..(120)
<220>
<221> 重复
<222> (121)..(134)
<220>
<221> 重复
<222> (135)..(147)
<220>
<221> 重复
<222> (148)..(170)
<220>
<221> 重复
<222> (171)..(183)
<220>
<221> 重复
<222> (184)..(197)
<220>
<221> 重复
<222> (198)..(211)
<220>
<221> 重复
<222> (212)..(234)
<220>
<221> 重复
<222> (235)..(248)
<220>
<221> 重复
<222> (249)..(265)
<220>
<221> 重复
<222> (266)..(279)
<220>
<221> 重复
<222> (280)..(293)
<220>
<221> 重复
<222> (294)..(306)
<220>
<221> 重复
<222> (307)..(329)
<220>
<221> 重复
<222> (330)..(342)
<220>
<221> 重复
<222> (343)..(356)
<220>
<221> 重复
<222> (357)..(370)
<220>
<221> 重复
<222> (371)..(393)
<220>
<221> 重复
<222> (394)..(406)
<220>
<221> 重复
<222> (407)..(420)
<220>
<221> 重复
<222> (421)..(434)
<220>
<221> 重复
<222> (435)..(457)
<220>
<221> 重复
<222> (458)..(470)
<220>
<221> 重复
<222> (471)..(488)
<220>
<221> 重复
<222> (489)..(502)
<220>
<221> 重复
<222> (503)..(516)
<220>
<221> 重复
<222> (517)..(529)
<220>
<221> 重复
<222> (530)..(552)
<220>
<221> 重复
<222> (553)..(566)
<220>
<221> 重复
<222> (567)..(580)
<220>
<221> 重复
<222> (581)..(594)
<220>
<221> 重复
<222> (595)..(617)
<220>
<221> 重复
<222> (618)..(630)
<220>
<221> 重复
<222> (631)..(647)
<220>
<221> 重复
<222> (648)..(661)
<220>
<221> 重复
<222> (662)..(675)
<220>
<221> 重复
<222> (676)..(688)
<220>
<221> 重复
<222> (689)..(711)
<220>
<221> 重复
<222> (712)..(725)
<220>
<221> 重复
<222> (726)..(739)
<220>
<221> 重复
<222> (740)..(752)
<220>
<221> 重复
<222> (753)..(775)
<220>
<221> 重复
<222> (776)..(789)
<220>
<221> 重复
<222> (790)..(803)
<220>
<221> 重复
<222> (804)..(816)
<220>
<221> 重复
<222> (817)..(839)
<220>
<221> 重复
<222> (840)..(853)
<220>
<221> 重复
<222> (854)..(867)
<220>
<221> 重复
<222> (868)..(880)
<220>
<221> 重复
<222> (881)..(903)
<220>
<221> 重复
<222> (904)..(917)
<220>
<221> 重复
<222> (918)..(931)
<220>
<221> 重复
<222> (932)..(945)
<220>
<221> 重复
<222> (946)..(968)
<220>
<221> 重复
<222> (969)..(981)
<220>
<221> 重复
<222> (982)..(998)
<220>
<221> 重复
<222> (999)..(1013)
<220>
<221> 重复
<222> (1014)..(1027)
<220>
<221> 重复
<222> (1028)..(1042)
<220>
<221> 重复
<222> (1043)..(1059)
<220>
<221> 重复
<222> (1060)..(1073)
<220>
<221> 重复
<222> (1074)..(1092)
<400> 5
Gln Gly Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln
20 25 30
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
50 55 60
Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ser Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln
85 90 95
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gln Gly Arg Tyr Gly
115 120 125
Gln Gly Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
130 135 140
Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gln
145 150 155 160
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
165 170 175
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln
180 185 190
Gly Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln
210 215 220
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly
245 250 255
Arg Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln
275 280 285
Gly Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gln Gly
305 310 315 320
Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
325 330 335
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
340 345 350
Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ala
355 360 365
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly
370 375 380
Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
405 410 415
Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
420 425 430
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly
435 440 445
Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Arg
465 470 475 480
Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
485 490 495
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
500 505 510
Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
515 520 525
Ser Gly Gln Gly Ser Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly
530 535 540
Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
545 550 555 560
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
565 570 575
Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
580 585 590
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly
595 600 605
Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
610 615 620
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr
625 630 635 640
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
645 650 655
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser
660 665 670
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser
675 680 685
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr
690 695 700
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
705 710 715 720
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala
725 730 735
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
740 745 750
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr
755 760 765
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
770 775 780
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Val
785 790 795 800
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
805 810 815
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr
820 825 830
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
835 840 845
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser
850 855 860
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser
865 870 875 880
Gly Gln Gly Ser Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr
885 890 895
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
900 905 910
Ala Ala Ala Ala Ser Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala
915 920 925
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
930 935 940
Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly
945 950 955 960
Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
965 970 975
Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
980 985 990
Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
995 1000 1005
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
1010 1015 1020
Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1025 1030 1035
Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln
1040 1045 1050
Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1055 1060 1065
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln
1070 1075 1080
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala
1085 1090 1095
Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser
1100 1105 1110
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 衍生自Euprosthenops australis MaSp1的内部重复的共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Ser
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> Tyr
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> Gln
<400> 6
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr
1 5 10 15
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser
20
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 衍生自Euprosthenops australis MaSp1的内部重复的共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> Arg
<220>
<221> 变体
<222> (14)..(14)
<223> Ser
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> Gly
<400> 7
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 衍生自Euprosthenops australis MaSp1的内部重复的共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> Gln
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> Arg
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> Ser
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> Val
<400> 8
Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Gly Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 9
Gly Pro Asn Ser Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Gly Lys Phe
1 5 10 15
Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Lys Ser Gly Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala
35 40 45
Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
50 55 60
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala
100 105 110
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly
115 120 125
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala
130 135 140
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln
145 150 155 160
Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala
165 170 175
Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val
180 185 190
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
195 200 205
Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn
210 215 220
Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala
225 230 235 240
Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala
245 250 255
Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser
260 265 270
Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val
275 280 285
Met Gly
290
<210> 10
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 10
ggtccgaatt caggaattgg taaatttttg cactcagcag gaaaatttgg aaaagctttt 60
gtgggagaga taatgaaatc aggatccgct agcggtcaag gaggatatgg tggactaggt 120
caaggagggt atggacaagg tgcaggaagt tctgcagccg ctgccgccgc cgcagcagcc 180
gccgcagcag gtggacaagg tggacaaggt caaggaggat atggacaagg ttcaggaggt 240
tctgcagccg ccgccgccgc cgcagcagca gcagcagctg cagcagctgg acgaggtcaa 300
ggaggatatg gccaaggttc tggaggtaat gctgctgccg cagccgctgc cgccgccgcc 360
gccgctgcag cagccggaca gggaggtcaa ggtggatatg gtagacaaag ccaaggtgct 420
ggttccgctg ctgctgctgc tgctgctgct gccgctgctg ctgctgcagg atctggacaa 480
ggtggatacg gtggacaagg tcaaggaggt tatggtcaga gtagtgcttc tgcttcagct 540
gctgcgtcag ctgctagtac tgtagctaat tcggtgagtc gcctctcatc gccttccgca 600
gtatctcgag tttcttcagc agtttctagc ttggtttcaa atggtcaagt gaatatggca 660
gcgttaccta atatcatttc caacatttct tcttctgtca gtgcatctgc tcctggtgct 720
tctggatgtg aggtcatagt gcaagctcta ctcgaagtca tcactgctct tgttcaaatc 780
gttagttctt ctagtgttgg atatattaat ccatctgctg tgaaccaaat tactaatgtt 840
gttgctaatg ccatggctca agtaatgggc 870
<210> 11
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<220>
<221> 二硫键
<222> (5)..(14)
<400> 11
Gly Pro Asn Ser Cys Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Cys Gly Ser
1 5 10 15
Ala Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
20 25 30
Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly
115 120 125
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
130 135 140
Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln
145 150 155 160
Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala
165 170 175
Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser
180 185 190
Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala
195 200 205
Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala
210 215 220
Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val
225 230 235 240
Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
245 250 255
Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met
260 265 270
Ala Gln Val Met Gly
275
<210> 12
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 12
ggtccgaatt catgcacagg tcgtggtgat tctccggcgt gcggatccgc tagcggtcaa 60
ggaggatatg gtggactagg tcaaggaggg tatggacaag gtgcaggaag ttctgcagcc 120
gctgccgccg ccgcagcagc cgccgcagca ggtggacaag gtggacaagg tcaaggagga 180
tatggacaag gttcaggagg ttctgcagcc gccgccgccg ccgcagcagc agcagcagct 240
gcagcagctg gacgaggtca aggaggatat ggccaaggtt ctggaggtaa tgctgctgcc 300
gcagccgctg ccgccgccgc cgccgctgca gcagccggac agggaggtca aggtggatat 360
ggtagacaaa gccaaggtgc tggttccgct gctgctgctg ctgctgctgc tgccgctgct 420
gctgctgcag gatctggaca aggtggatac ggtggacaag gtcaaggagg ttatggtcag 480
agtagtgctt ctgcttcagc tgctgcgtca gctgctagta ctgtagctaa ttcggtgagt 540
cgcctctcat cgccttccgc agtatctcga gtttcttcag cagtttctag cttggtttca 600
aatggtcaag tgaatatggc agcgttacct aatatcattt ccaacatttc ttcttctgtc 660
agtgcatctg ctcctggtgc ttctggatgt gaggtcatag tgcaagctct actcgaagtc 720
atcactgctc ttgttcaaat cgttagttct tctagtgttg gatatattaa tccatctgct 780
gtgaaccaaa ttactaatgt tgttgctaat gccatggctc aagtaatggg c 831
<210> 13
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 13
Met Gly Ser Ser Gly His His His His His His Met Val Asp Asn Lys
1 5 10 15
Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro
20 25 30
Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp
35 40 45
Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn
50 55 60
Asp Ala Gln Ala Pro Lys Leu Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Asn Ser
65 70 75 80
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
85 90 95
Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
130 135 140
Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln
165 170 175
Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly
195 200 205
Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser
210 215 220
Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser
225 230 235 240
Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala
245 250 255
Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro
260 265 270
Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly
275 280 285
Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr
290 295 300
Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro
305 310 315 320
Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln
325 330 335
Val Met Gly
<210> 14
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 14
atgggcagca gcggccatca tcatcatcat catatggtag acaacaaatt caacaaagaa 60
caacaaaacg cgttctatga gatcttacat ttacctaact taaacgaaga acaacgaaac 120
gccttcatcc aaagtttaaa agatgaccca agccaaagcg ctaacttgct agcagaagct 180
aaaaagctaa atgatgctca ggcgccgaaa ctggaagctc tgttccaggg tccgaattca 240
ggtcaaggtg gatatggtgg actaggtcaa ggaggatatg gacaaggtgc aggaagttct 300
gcagccgctg ccgccgccgc agcagccgcc gcagcaggtg gacaaggtgg acaaggtcaa 360
ggaggatatg gacaaggttc aggaggttct gcagccgccg ccgccgccgc agcagcagca 420
gcagctgcag cagctggacg aggtcaagga ggatatggtc aaggttctgg aggtaatgct 480
gctgccgcag ccgctgccgc cgccgccgcc gctgcagcag ccggacaggg aggtcaaggt 540
ggatatggta gacaaagcca aggtgctggt tccgctgctg ctgctgctgc tgctgctgcc 600
gctgctgctg ctgcaggatc tggacaaggt ggatacggtg gacaaggtca aggaggttat 660
ggtcagagta gtgcttctgc ttcagctgct gcgtcagctg ctagtactgt agctaattcg 720
gtgagtcgcc tctcatcgcc ttccgcagta tctcgagttt cttcagcagt ttctagcttg 780
gtttcaaatg gtcaagtgaa tatggcagcg ttacctaata tcatttccaa catttcttct 840
tctgtcagtg catctgctcc tggtgcttct ggatgtgagg tcatagtgca agctctactc 900
gaagtcatca ctgctcttgt tcaaatcgtt agttcttcta gtgttggata tattaatcca 960
tctgctgtga accaaattac taatgttgtt gctaatgcca tggctcaagt aatgggc 1017
<210> 15
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 15
Met Gly Ser Ser Gly His His His His His His Met Thr Tyr Lys Leu
1 5 10 15
Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val
20 25 30
Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn
35 40 45
Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr
50 55 60
Val Thr Glu Leu Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Asn Ser Gly Gln Gly
65 70 75 80
Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser
85 90 95
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln
100 105 110
Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg
130 135 140
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln
165 170 175
Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly
195 200 205
Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala
210 215 220
Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser Arg
225 230 235 240
Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser
245 250 255
Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn Ile Ile
260 265 270
Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala Ser Gly
275 280 285
Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala Leu Val
290 295 300
Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Val
305 310 315 320
Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val Met Gly
325 330 335
<210> 16
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 16
atgggcagca gcggccatca tcatcatcat catatgactt acaaacttgt tattaatggt 60
aaaacattga aaggcgaaac aactactgaa gctgttgatg ctgctactgc agaaaaagtc 120
ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt gacggtgaat ggacttacga cgatgcgact 180
aagaccttta cagttactga actggaagct ctgttccagg gtccgaattc aggtcaaggt 240
ggatatggtg gactaggtca aggaggatat ggacaaggtg caggaagttc tgcagccgct 300
gccgccgccg cagcagccgc cgcagcaggt ggacaaggtg gacaaggtca aggaggatat 360
ggacaaggtt caggaggttc tgcagccgcc gccgccgccg cagcagcagc agcagctgca 420
gcagctggac gaggtcaagg aggatatggt caaggttctg gaggtaatgc tgctgccgca 480
gccgctgccg ccgccgccgc cgctgcagca gccggacagg gaggtcaagg tggatatggt 540
agacaaagcc aaggtgctgg ttccgctgct gctgctgctg ctgctgctgc cgctgctgct 600
gctgcaggat ctggacaagg tggatacggt ggacaaggtc aaggaggtta tggtcagagt 660
agtgcttctg cttcagctgc tgcgtcagct gctagtactg tagctaattc ggtgagtcgc 720
ctctcatcgc cttccgcagt atctcgagtt tcttcagcag tttctagctt ggtttcaaat 780
ggtcaagtga atatggcagc gttacctaat atcatttcca acatttcttc ttctgtcagt 840
gcatctgctc ctggtgcttc tggatgtgag gtcatagtgc aagctctact cgaagtcatc 900
actgctcttg ttcaaatcgt tagttcttct agtgttggat atattaatcc atctgctgtg 960
aaccaaatta ctaatgttgt tgctaatgcc atggctcaag taatgggc 1008
<210> 17
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 17
Met Gly Ser Ser Gly His His His His His His Met Leu Ala Glu Ala
1 5 10 15
Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala
35 40 45
Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Leu Glu Ala Leu Phe Gln
50 55 60
Gly Pro Asn Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
100 105 110
Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
145 150 155 160
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly
165 170 175
Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr
195 200 205
Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr
210 215 220
Val Ala Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg
225 230 235 240
Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met
245 250 255
Ala Ala Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala
260 265 270
Ser Ala Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu
275 280 285
Glu Val Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly
290 295 300
Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn
305 310 315 320
Ala Met Ala Gln Val Met Gly
325
<210> 18
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 18
atgggcagca gcggccatca tcatcatcat catatgttag ctgaagctaa agtcttagct 60
aacagagaac ttgacaaata tggagtaagt gactattaca agaacctaat caacaatgcc 120
aaaactgttg aaggtgtaaa agcactgata gatgaaattt tagctgcatt acctctggaa 180
gctctgttcc agggtccgaa ttcaggtcaa ggtggatatg gtggactagg tcaaggagga 240
tatggacaag gtgcaggaag ttctgcagcc gctgccgccg ccgcagcagc cgccgcagca 300
ggtggacaag gtggacaagg tcaaggagga tatggacaag gttcaggagg ttctgcagcc 360
gccgccgccg ccgcagcagc agcagcagct gcagcagctg gacgaggtca aggaggatat 420
ggtcaaggtt ctggaggtaa tgctgctgcc gcagccgctg ccgccgccgc cgccgctgca 480
gcagccggac agggaggtca aggtggatat ggtagacaaa gccaaggtgc tggttccgct 540
gctgctgctg ctgctgctgc tgccgctgct gctgctgcag gatctggaca aggtggatac 600
ggtggacaag gtcaaggagg ttatggtcag agtagtgctt ctgcttcagc tgctgcgtca 660
gctgctagta ctgtagctaa ttcggtgagt cgcctctcat cgccttccgc agtatctcga 720
gtttcttcag cagtttctag cttggtttca aatggtcaag tgaatatggc agcgttacct 780
aatatcattt ccaacatttc ttcttctgtc agtgcatctg ctcctggtgc ttctggatgt 840
gaggtcatag tgcaagctct actcgaagtc atcactgctc ttgttcaaat cgttagttct 900
tctagtgttg gatatattaa tccatctgct gtgaaccaaa ttactaatgt tgttgctaat 960
gccatggctc aagtaatggg c 981
<210> 19
<211> 429
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 19
Met His His His His His His Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly
1 5 10 15
Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly
35 40 45
Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln
100 105 110
Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln
130 135 140
Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala
145 150 155 160
Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala
165 170 175
Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln
180 185 190
Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser
195 200 205
Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln
210 215 220
Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser
225 230 235 240
Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val
245 250 255
Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val Met Gly Gly Asn Ser Gly Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Ser Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu
275 280 285
Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys
290 295 300
Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp
305 310 315 320
Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu
325 330 335
Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys
340 345 350
Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser
355 360 365
Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn
370 375 380
Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala
385 390 395 400
Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly
405 410 415
Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
420 425
<210> 20
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 20
atgcatcatc atcatcatca tggtcaaggt ggatatggtg gactaggtca aggaggatat 60
ggacaaggtg caggaagttc tgcagccgct gccgccgccg cagcagccgc cgcagcaggt 120
ggacaaggtg gacaaggtca aggaggatat ggacaaggtt caggaggttc tgcagccgcc 180
gccgccgccg cagcagcagc agcagctgca gcagctggac gaggtcaagg aggatatggt 240
caaggttctg gaggtaatgc tgctgccgca gccgctgccg ccgccgccgc cgctgcagca 300
gccggacagg gaggtcaagg tggatatggt agacaaagcc aaggtgctgg ttccgctgct 360
gctgctgctg ctgctgctgc cgctgctgct gctgcaggat ctggacaagg tggatacggt 420
ggacaaggtc aaggaggtta tggtcagagt agtgcttctg cttcagctgc tgcgtcagct 480
gctagtactg tagctaattc ggtgagtcgc ctctcatcgc cttccgcagt atctcgagtt 540
tcttcagcag tttctagctt ggtttcaaat ggtcaagtga atatggcagc gttacctaat 600
atcatttcca acatttcttc ttctgtcagt gcatctgctc ctggtgcttc tggatgtgag 660
gtcatagtgc aagctctact cgaagtcatc actgctcttg ttcaaatcgt tagttcttct 720
agtgttggat atattaatcc atctgctgtg aaccaaatta ctaatgttgt tgctaatgcc 780
atggctcaag taatgggcgg gaattcaggt agcggcagcg gtagcgcagc cgggagcatc 840
accacgctgc ccgccttgcc cgaggatggc ggcagcggcg ccttcccgcc cggccacttc 900
aaggacccca agcggctgta ctgcaaaaac gggggcttct tcctgcgcat ccaccccgac 960
ggccgagttg acggggtccg ggagaagagc gaccctcaca tcaagctaca acttcaagca 1020
gaagagagag gagttgtgtc tatcaaagga gtgtgtgcta accgttacct ggctatgaag 1080
gaagatggaa gattactggc ttctaaatgt gttacggatg agtgtttctt ttttgaacga 1140
ttggaatcta ataactacaa tacttaccgg tcaaggaaat acaccagttg gtatgtggca 1200
ctgaaacgaa ctgggcagta taaacttgga tccaaaacag gacctgggca gaaagctata 1260
ctttttcttc caatgtctgc taagagc 1287
<210> 21
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 21
Met Gly Ser Ser Gly His His His His His His Met Met Gly Lys Ile
1 5 10 15
Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe Cys Asp Phe Leu
20 25 30
Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu Phe Tyr Leu Ala
35 40 45
Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala Gly Pro Glu Thr
50 55 60
Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp
65 70 75 80
Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg
85 90 95
Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys
100 105 110
Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys
115 120 125
Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr
130 135 140
Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn
145 150 155 160
Lys Asn Tyr Arg Met Pro Asn Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
165 170 175
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln
195 200 205
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr
225 230 235 240
Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg
260 265 270
Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
275 280 285
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly
290 295 300
Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser
305 310 315 320
Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser
325 330 335
Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly
340 345 350
Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser
355 360 365
Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val
370 375 380
Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser
385 390 395 400
Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn
405 410 415
Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val Met Gly
420 425
<210> 22
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 22
atgggcagca gcggccatca tcatcatcat catatgatgg gaaaaatcag cagtcttcca 60
acccaattat ttaagtgctg cttttgtgat ttcttgaagg tgaagatgca caccatgtcc 120
tcctcgcatc tcttctacct ggcgctgtgc ctgctcacct tcaccagctc tgccacggct 180
ggaccggaga cgctctgcgg ggctgagctg gtggatgctc ttcagttcgt gtgtggagac 240
aggggctttt atttcaacaa gcccacaggg tatggctcca gcagtcggag ggcgcctcag 300
acaggtatcg tggatgagtg ctgcttccgg agctgtgatc taaggaggct ggagatgtat 360
tgcgcacccc tcaagcctgc caagtcagct cgctctgtcc gtgcccagcg ccacaccgac 420
atgcccaaga cccagaagga agtacatttg aagaacgcaa gtagagggag tgcaggaaac 480
aagaactaca ggatgccgaa ttcaggtcaa ggtggatatg gtggactagg tcaaggagga 540
tatggacaag gtgcaggaag ttctgcagcc gctgccgccg ccgcagcagc cgccgcagca 600
ggtggacaag gtggacaagg tcaaggagga tatggacaag gttcaggagg ttctgcagcc 660
gccgccgccg ccgcagcagc agcagcagct gcagcagctg gacgaggtca aggaggatat 720
ggtcaaggtt ctggaggtaa tgctgctgcc gcagccgctg ccgccgccgc cgccgctgca 780
gcagccggac agggaggtca aggtggatat ggtagacaaa gccaaggtgc tggttccgct 840
gctgctgctg ctgctgctgc tgccgctgct gctgctgcag gatctggaca aggtggatac 900
ggtggacaag gtcaaggagg ttatggtcag agtagtgctt ctgcttcagc tgctgcgtca 960
gctgctagta ctgtagctaa ttcggtgagt cgcctctcat cgccttccgc agtatctcga 1020
gtttcttcag cagtttctag cttggtttca aatggtcaag tgaatatggc agcgttacct 1080
aatatcattt ccaacatttc ttcttctgtc agtgcatctg ctcctggtgc ttctggatgt 1140
gaggtcatag tgcaagctct actcgaagtc atcactgctc ttgttcaaat cgttagttct 1200
tctagtgttg gatatattaa tccatctgct gtgaaccaaa ttactaatgt tgttgctaat 1260
gccatggctc aagtaatggg c 1281
<210> 23
<211> 641
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 23
Met Gly Ser Ser Gly His His His His His His Met Asn Cys Cys Val
1 5 10 15
Lys Gly Asn Ser Ile Tyr Pro Gln Lys Thr Ser Thr Lys Gln Thr Gly
20 25 30
Leu Met Leu Asp Ile Ala Arg His Phe Tyr Ser Pro Glu Val Ile Lys
35 40 45
Ser Phe Ile Asp Thr Ile Ser Leu Ser Gly Gly Asn Phe Leu His Leu
50 55 60
His Phe Ser Asp His Glu Asn Tyr Ala Ile Glu Ser His Leu Leu Asn
65 70 75 80
Gln Arg Ala Glu Asn Ala Val Gln Gly Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Asn
85 90 95
Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Phe Leu Ser Tyr Arg Gln Leu Asp Asp Ile
100 105 110
Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys Gly Ile Glu Leu Ile Pro Glu Leu Asp
115 120 125
Ser Pro Asn His Met Thr Ala Ile Phe Lys Leu Val Gln Lys Asp Arg
130 135 140
Gly Val Lys Tyr Leu Gln Gly Leu Lys Ser Arg Gln Val Asp Asp Glu
145 150 155 160
Ile Asp Ile Thr Asn Ala Asp Ser Ile Thr Phe Met Gln Ser Leu Met
165 170 175
Ser Glu Val Ile Asp Ile Phe Gly Asp Thr Ser Gln His Phe His Ile
180 185 190
Gly Gly Asp Glu Phe Gly Tyr Ser Val Glu Ser Asn His Glu Phe Ile
195 200 205
Thr Tyr Ala Asn Lys Leu Ser Tyr Phe Leu Glu Lys Lys Gly Leu Lys
210 215 220
Thr Arg Met Trp Asn Asp Gly Leu Ile Lys Asn Thr Phe Glu Gln Ile
225 230 235 240
Asn Pro Asn Ile Glu Ile Thr Tyr Trp Ser Tyr Asp Gly Asp Thr Gln
245 250 255
Asp Lys Asn Glu Ala Ala Glu Arg Arg Asp Met Arg Val Ser Leu Pro
260 265 270
Glu Leu Leu Ala Lys Gly Phe Thr Val Leu Asn Tyr Asn Ser Tyr Tyr
275 280 285
Leu Tyr Ile Val Pro Lys Ala Ser Pro Thr Phe Ser Gln Asp Ala Ala
290 295 300
Phe Ala Ala Lys Asp Val Ile Lys Asn Trp Asp Leu Gly Val Trp Asp
305 310 315 320
Gly Arg Asn Thr Lys Asn Arg Val Gln Asn Thr His Glu Ile Ala Gly
325 330 335
Ala Ala Leu Ser Ile Trp Gly Glu Asp Ala Lys Ala Leu Lys Asp Glu
340 345 350
Thr Ile Gln Lys Asn Thr Lys Ser Leu Leu Glu Ala Val Ile His Lys
355 360 365
Thr Asn Gly Asp Glu Gly Pro Ala Ala Leu Gly Pro Asn Ser Gly Gln
370 375 380
Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly
385 390 395 400
Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly
405 410 415
Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Ser
420 425 430
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
435 440 445
Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly
465 470 475 480
Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala
485 490 495
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly
500 505 510
Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser
515 520 525
Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser
530 535 540
Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser
545 550 555 560
Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn Ile
565 570 575
Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala Ser
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Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala Leu
595 600 605
Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala
610 615 620
Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val Met
625 630 635 640
Gly
<210> 24
<211> 1923
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 24
atgggcagca gcggccatca tcatcatcat catatgaact gctgcgtgaa aggcaacagc 60
atttatccgc agaaaaccag caccaaacag accggcctga tgctggatat tgcgcgccat 120
ttttatagcc cggaagtgat taaaagcttt attgatacca ttagcctgag cggcggcaac 180
tttctgcatc tgcattttag cgatcatgaa aactatgcga ttgaaagcca tctgctgaac 240
cagcgcgcgg aaaacgcggt gcagggcaaa gatggcattt atattaaccc gtataccggc 300
aaaccgtttc tgagctatcg ccagctggat gatattaaag cgtatgcgaa agcgaaaggc 360
attgaactga ttccggaact ggatagcccg aaccacatga ccgcgatttt taaactggtg 420
cagaaagatc gcggcgtgaa atatctgcag ggcctgaaaa gccgccaggt ggatgatgaa 480
attgatatta ccaacgcgga tagcattacc tttatgcaga gcctgatgag cgaagtgatt 540
gatatttttg gcgataccag ccagcatttt catattggcg gcgatgaatt tggctatagc 600
gtggaaagca accatgaatt tattacctat gcgaacaaac tgagctattt tctggaaaaa 660
aaaggcctga aaacccgcat gtggaacgat ggcctgatta aaaacacctt tgaacagatt 720
aacccgaaca ttgaaattac ctattggagc tatgatggcg atacccagga taaaaacgaa 780
gcggcggaac gccgcgatat gcgcgtgagc ctgccggaac tgctggcgaa aggctttacc 840
gtgctgaact ataacagcta ttatctgtat attgtgccga aagcgagccc gacctttagc 900
caggatgcgg cgtttgcggc gaaagatgtg attaaaaact gggatctggg cgtgtgggat 960
ggccgcaaca ccaaaaaccg cgtgcagaac acccatgaaa ttgcgggcgc ggcgctgagc 1020
atttggggcg aagatgcgaa agcgctgaaa gatgaaacca ttcagaaaaa caccaaaagc 1080
ctgctggaag cggtgattca taaaaccaac ggcgatgaag gcccggcggc gctgggcccg 1140
aattcaggtc aaggtggata tggtggacta ggtcaaggag gatatggaca aggtgcagga 1200
agttctgcag ccgctgccgc cgccgcagca gccgccgcag caggtggaca aggtggacaa 1260
ggtcaaggag gatatggaca aggttcagga ggttctgcag ccgccgccgc cgccgcagca 1320
gcagcagcag ctgcagcagc tggacgaggt caaggaggat atggtcaagg ttctggaggt 1380
aatgctgctg ccgcagccgc tgccgccgcc gccgccgctg cagcagccgg acagggaggt 1440
caaggtggat atggtagaca aagccaaggt gctggttccg ctgctgctgc tgctgctgct 1500
gctgccgctg ctgctgctgc aggatctgga caaggtggat acggtggaca aggtcaagga 1560
ggttatggtc agagtagtgc ttctgcttca gctgctgcgt cagctgctag tactgtagct 1620
aattcggtga gtcgcctctc atcgccttcc gcagtatctc gagtttcttc agcagtttct 1680
agcttggttt caaatggtca agtgaatatg gcagcgttac ctaatatcat ttccaacatt 1740
tcttcttctg tcagtgcatc tgctcctggt gcttctggat gtgaggtcat agtgcaagct 1800
ctactcgaag tcatcactgc tcttgttcaa atcgttagtt cttctagtgt tggatatatt 1860
aatccatctg ctgtgaacca aattactaat gttgttgcta atgccatggc tcaagtaatg 1920
ggc 1923
<210> 25
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 25
Gly Pro Asn Ser Trp Trp Trp Trp Gly Arg Arg Pro Arg Pro Arg Pro
1 5 10 15
Arg Pro Gly Pro Ala Ala Leu Gly Ser Ala Ser Gly Gln Gly Gly Tyr
20 25 30
Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly
50 55 60
Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln
85 90 95
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly
115 120 125
Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
130 135 140
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
145 150 155 160
Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala
165 170 175
Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser
180 185 190
Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val
195 200 205
Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn
210 215 220
Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu
225 230 235 240
Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile
245 250 255
Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln
260 265 270
Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val Met Gly
275 280 285
<210> 26
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 26
ggtccgaatt catggtggtg gtggggccgc cgcccgcgcc cgcgcccgcg cccgggcccg 60
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ggacaaggtg caggaagttc tgcagccgct gccgccgccg cagcagccgc cgcagcaggt 180
ggacaaggtg gacaaggtca aggaggatat ggacaaggtt caggaggttc tgcagccgcc 240
gccgccgccg cagcagcagc agcagctgca gcagctggac gaggtcaagg aggatatggc 300
caaggttctg gaggtaatgc tgctgccgca gccgctgccg ccgccgccgc cgctgcagca 360
gccggacagg gaggtcaagg tggatatggt agacaaagcc aaggtgctgg ttccgctgct 420
gctgctgctg ctgctgctgc cgctgctgct gctgcaggat ctggacaagg tggatacggt 480
ggacaaggtc aaggaggtta tggtcagagt agtgcttctg cttcagctgc tgcgtcagct 540
gctagtactg tagctaattc ggtgagtcgc ctctcatcgc cttccgcagt atctcgagtt 600
tcttcagcag tttctagctt ggtttcaaat ggtcaagtga atatggcagc gttacctaat 660
atcatttcca acatttcttc ttctgtcagt gcatctgctc ctggtgcttc tggatgtgag 720
gtcatagtgc aagctctact cgaagtcatc actgctcttg ttcaaatcgt tagttcttct 780
agtgttggat atattaatcc atctgctgtg aaccaaatta ctaatgttgt tgctaatgcc 840
atggctcaag taatgggc 858
<210> 27
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 27
Met Gly Ser Ser Gly His His His His His His Met Ala Ser Thr Asp
1 5 10 15
Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ile Val Asn Ala Val Asn
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn Thr Gly Asn Phe
35 40 45
Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe Arg Thr Ile Asn
50 55 60
Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser
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Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Lys Ser
100 105 110
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115 120 125
Ser Ile Asp Gly Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg
130 135 140
Gln Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile Thr Phe Ser Asn
145 150 155 160
His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu Gly Ser Asn Trp
165 170 175
Ala Tyr Gln Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Asn Val Thr Val Trp Pro Asn Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
195 200 205
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln
225 230 235 240
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr
260 265 270
Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
275 280 285
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg
290 295 300
Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly
325 330 335
Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser
340 345 350
Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser
355 360 365
Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser
385 390 395 400
Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val
405 410 415
Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser
420 425 430
Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn
435 440 445
Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val Met Gly
450 455
<210> 28
<211> 1377
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 28
atgggcagca gcggccatca tcatcatcat catatggcta gcacagacta ctggcaaaat 60
tggactgatg ggggcggtat agtaaacgct gtcaatgggt ctggcgggaa ttacagtgtt 120
aattggtcta ataccggaaa ttttgttgtt ggtaaaggtt ggactacagg ttcgccattt 180
aggacgataa actataatgc cggagtttgg gcgccgaatg gcaatggata tttaacttta 240
tatggttgga cgagatcacc tctcatagaa tattatgtag tggattcatg gggtacttat 300
agacctactg gaacgtataa aggtactgta aaaagtgatg ggggtacgta tgacatatat 360
acaactacac gttataacgc accttccatt gatggcgatc gcactacttt tacgcagtac 420
tggagtgttc gccagtcgaa gagaccaacc ggaagcaacg ctacaatcac tttcagcaat 480
catgtgaacg catggaagag ccatggaatg aatctgggca gtaattgggc ttaccaagtc 540
atggcgacag aaggatatca aagtagtgga agttctaacg taacagtgtg gccgaattca 600
ggtcaaggtg gatatggtgg actaggtcaa ggaggatatg gacaaggtgc aggaagttct 660
gcagccgctg ccgccgccgc agcagccgcc gcagcaggtg gacaaggtgg acaaggtcaa 720
ggaggatatg gacaaggttc aggaggttct gcagccgccg ccgccgccgc agcagcagca 780
gcagctgcag cagctggacg aggtcaagga ggatatggtc aaggttctgg aggtaatgct 840
gctgccgcag ccgctgccgc cgccgccgcc gctgcagcag ccggacaggg aggtcaaggt 900
ggatatggta gacaaagcca aggtgctggt tccgctgctg ctgctgctgc tgctgctgcc 960
gctgctgctg ctgcaggatc tggacaaggt ggatacggtg gacaaggtca aggaggttat 1020
ggtcagagta gtgcttctgc ttcagctgct gcgtcagctg ctagtactgt agctaattcg 1080
gtgagtcgcc tctcatcgcc ttccgcagta tctcgagttt cttcagcagt ttctagcttg 1140
gtttcaaatg gtcaagtgaa tatggcagcg ttacctaata tcatttccaa catttcttct 1200
tctgtcagtg catctgctcc tggtgcttct ggatgtgagg tcatagtgca agctctactc 1260
gaagtcatca ctgctcttgt tcaaatcgtt agttcttcta gtgttggata tattaatcca 1320
tctgctgtga accaaattac taatgttgtt gctaatgcca tggctcaagt aatgggc 1377
<210> 29
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 29
Met Gly Ser Ser Gly His His His His His His Met Asp Pro Ser Lys
1 5 10 15
Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr
20 25 30
Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp
35 40 45
Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser
50 55 60
Arg Tyr Thr Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly
65 70 75 80
Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Arg Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg
85 90 95
Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala
100 105 110
Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Thr Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu
115 120 125
Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Arg Gly His Asp Thr Phe Thr Lys
130 135 140
Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val
145 150 155 160
Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln Gly Asn Ser Gly Gln
165 170 175
Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly
180 185 190
Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Ser
210 215 220
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
225 230 235 240
Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly
260 265 270
Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala
275 280 285
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly
290 295 300
Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser
305 310 315 320
Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser
325 330 335
Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser
340 345 350
Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn Ile
355 360 365
Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala Ser
370 375 380
Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala Leu
385 390 395 400
Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala
405 410 415
Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val Met
420 425 430
Gly
<210> 30
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 30
atgggcagca gcggccatca tcatcatcat catatggatc cgagcaaaga tagcaaagcg 60
caggtgagcg cggcggaagc gggcattacc ggcacctggt ataaccagct gggcagcacc 120
tttattgtga ccgcgggcgc ggatggcgcg ctgaccggca cctatgaaag cgcggtgggc 180
aacgcggaaa gccgctatac cctgaccggc cgctatgata gcgcgccggc gaccgatggc 240
agcggcaccg cgctgggctg gcgcgtggcg tggaaaaaca actatcgcaa cgcgcatagc 300
gcgaccacct ggagcggcca gtatgtgggc ggcgcggaag cgcgcattaa cacccagtgg 360
accctgacca gcggcaccac cgaagcgaac gcgtggaaaa gcaccctgcg cggccatgat 420
acctttacca aagtgaaacc gagcgcggcg agcattgatg cggcgaaaaa agcgggcgtg 480
aacaacggca acccgctgga tgcggtgcag caggggaatt caggtcaagg tggatatggt 540
ggactaggtc aaggaggata tggacaaggt gcaggaagtt ctgcagccgc tgccgccgcc 600
gcagcagccg ccgcagcagg tggacaaggt ggacaaggtc aaggaggata tggacaaggt 660
tcaggaggtt ctgcagccgc cgccgccgcc gcagcagcag cagcagctgc agcagctgga 720
cgaggtcaag gaggatatgg tcaaggttct ggaggtaatg ctgctgccgc agccgctgcc 780
gccgccgccg ccgctgcagc agccggacag ggaggtcaag gtggatatgg tagacaaagc 840
caaggtgctg gttccgctgc tgctgctgct gctgctgctg ccgctgctgc tgctgcagga 900
tctggacaag gtggatacgg tggacaaggt caaggaggtt atggtcagag tagtgcttct 960
gcttcagctg ctgcgtcagc tgctagtact gtagctaatt cggtgagtcg cctctcatcg 1020
ccttccgcag tatctcgagt ttcttcagca gtttctagct tggtttcaaa tggtcaagtg 1080
aatatggcag cgttacctaa tatcatttcc aacatttctt cttctgtcag tgcatctgct 1140
cctggtgctt ctggatgtga ggtcatagtg caagctctac tcgaagtcat cactgctctt 1200
gttcaaatcg ttagttcttc tagtgttgga tatattaatc catctgctgt gaaccaaatt 1260
actaatgttg ttgctaatgc catggctcaa gtaatgggc 1299
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 31
Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser
1 5 10 15
Val Ser
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 32
Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ala
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 33
Gly Ser Ala Met Gly Gln Gly Ser
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 34
Ser Ala Ser Ala Gly
1 5
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 细胞结合钛
<400> 35
Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 细胞结合钛
<400> 36
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 细胞结合钛
<220>
<221> misc_feature
<223> X =任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 37
Cys Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10
<210> 38
<211> 100
<212> PRT
<213> Euprosthenops sp
<400> 38
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Leu Val Gly Gln Ser Val Tyr Gln Ala
85 90 95
Leu Gly Glu Phe
100
<210> 39
<211> 98
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 39
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn
20 25 30
Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala
35 40 45
Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala
50 55 60
Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser
65 70 75 80
Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val
85 90 95
Met Gly
<210> 40
<211> 99
<212> PRT
<213> 三带金蛛(Argiope trifasciata)
<400> 40
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gly Ala Ala Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Thr Ser Leu Val Ser Ser Gly Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser
20 25 30
Asn Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly
35 40 45
Leu Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser
50 55 60
Ala Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ala Asn Ile Gly Gln Val Asn Ser
65 70 75 80
Ser Gly Val Gly Arg Ser Ala Ser Ile Val Gly Gln Ser Ile Asn Gln
85 90 95
Ala Phe Ser
<210> 41
<211> 89
<212> PRT
<213> 泉字云斑蛛(Cyrtophora moluccensis)
<400> 41
Ser His Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Ser Thr Asn Ser Ala Ala Leu Pro Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val
85
<210> 42
<211> 98
<212> PRT
<213> 几何寇蛛(Latrodectus geometricus)
<400> 42
Ser Ala Leu Ala Ala Pro Ala Thr Ser Ala Arg Ile Ser Ser His Ala
1 5 10 15
Ser Thr Leu Leu Ser Asn Gly Pro Thr Asn Pro Ala Ser Ile Ser Asn
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ala
35 40 45
Ser Ser Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Val Thr Ala
50 55 60
Leu Leu Thr Ile Ile Gly Ser Ser Asn Val Gly Asn Val Asn Tyr Asp
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gln Tyr Ala Gln Val Val Ser Gln Ser Val Gln Asn Ala
85 90 95
Phe Val
<210> 43
<211> 98
<212> PRT
<213> 黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)
<400> 43
Ser Ala Leu Ser Ala Pro Ala Thr Ser Ala Arg Ile Ser Ser His Ala
1 5 10 15
Ser Ala Leu Leu Ser Ser Gly Pro Thr Asn Pro Ala Ser Ile Ser Asn
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ala
35 40 45
Ser Ala Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Val Thr Ala
50 55 60
Leu Leu Thr Ile Ile Gly Ser Ser Asn Ile Gly Ser Val Asn Tyr Asp
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gln Tyr Ala Gln Val Val Thr Gln Ser Val Gln Asn Val
85 90 95
Phe Gly
<210> 44
<211> 93
<212> PRT
<213> 赫氏粒突蛛(Macrothele holsti)
<400> 44
Ser His Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Gly Gly Ser Thr Asn Ser Ala Ala Leu Pro Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asp Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val Gly Gln Ser Ala
85 90
<210> 45
<211> 98
<212> PRT
<213> 络新妇蛛(Nephila clavipes)
<400> 45
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ala Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile Gln Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val Gly Gln Ser Val Tyr Gln Ala
85 90 95
Leu Gly
<210> 46
<211> 89
<212> PRT
<213> 斑络新妇(Nephila pilipes)
<400> 46
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val
85
<210> 47
<211> 87
<212> PRT
<213> 马达加斯加金色球蜘蛛(Nephila madagascariensis)
<400> 47
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ala Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln
85
<210> 48
<211> 87
<212> PRT
<213> 带状褪金色圆网蜘蛛(Nephila senegalensis)
<400> 48
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln
85
<210> 49
<211> 89
<212> PRT
<213> 变异涡蛛(Octonoba varians)
<400> 49
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Pro Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val
85
<210> 50
<211> 89
<212> PRT
<213> 中华缕网蛛(Psechrus sinensis)
<400> 50
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Pro Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val
85
<210> 51
<211> 88
<212> PRT
<213> 长爪绿色焚光蜘蛛(Tetragnatha kauaiensis)
<400> 51
Ser Leu Leu Ser Ser Pro Ala Ser Asn Ala Arg Ile Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ala Leu Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Leu Ser Ser
20 25 30
Val Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Val Ser Ser Asn Ser Gly Gly Leu
35 40 45
Val Gly Cys Asp Thr Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Leu Val His Val Leu Ala Ser Ser Ser Gly Gly Gln Val Asn Leu Asn
65 70 75 80
Thr Ala Gly Tyr Thr Ser Gln Leu
85
<210> 52
<211> 88
<212> PRT
<213> 多色肖蛸(Tetragnatha versicolor)
<400> 52
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ala Ser Asn Ala Arg Ile Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ala Leu Ala Ser Gly Gly Ala Ser Ser Pro Gly Tyr Leu Ser Ser
20 25 30
Ile Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Val Ser Ser Asn Asn Asp Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Thr Val Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ala Ala Ala
50 55 60
Leu Val His Val Leu Ala Ser Ser Asn Ile Gly Gln Val Asn Leu Asn
65 70 75 80
Thr Ala Gly Tyr Thr Ser Gln Leu
85
<210> 53
<211> 89
<212> PRT
<213> 巨头地衣园蛛(Araneus bicentenarius)
<400> 53
Ser Arg Leu Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Thr Pro Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Ser Ala Val Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Val Gly Gln Ile Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ser Ala Gln Tyr Ala Gln Met Val
85
<210> 54
<211> 97
<212> PRT
<213> 悦目金蛛(Argiope amoena)
<400> 54
Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser
1 5 10 15
Thr Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Pro Ala Ser Leu Ser Asn Ala
20 25 30
Ile Gly Ser Val Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu Pro
35 40 45
Ser Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala Leu
50 55 60
Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Ser Ala
65 70 75 80
Ser Ser Gln Tyr Ala Arg Leu Val Gly Gln Ser Ile Ala Gln Ala Leu
85 90 95
Gly
<210> 55
<211> 82
<212> PRT
<213> 阿吉普奥兰提亚金蛛(Argiope aurantia)
<400> 55
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Thr Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Pro Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Ala Ile Ser Ser Val Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Ala Ser
<210> 56
<211> 98
<212> PRT
<213> 三带金蛛(Argiope trifasciata)
<400> 56
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Thr Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Pro Ala Ser Leu Ser Asn
20 25 30
Ala Ile Ser Ser Val Val Ser Gln Val Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Ala Ser Ser Gln Tyr Ala Gln Leu Val Gly Gln Ser Leu Thr Gln Ala
85 90 95
Leu Gly
<210> 57
<211> 89
<212> PRT
<213> 多型棘腹蛛(Gasteracantha mammosa)
<400> 57
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Gly Ala Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ala Leu Val Ala Ser Gly Pro Thr Ser Pro Ala Ala Val Ser Ser
20 25 30
Ala Ile Ser Asn Val Ala Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val Ser Ile Leu Ser Ser Ala Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ser Gly Gln Tyr Ala Ala Met Ile
85
<210> 58
<211> 90
<212> PRT
<213> 几何寇蛛(Latrodectus geometricus)
<400> 58
Ser Ala Leu Ser Ser Pro Thr Thr His Ala Arg Ile Ser Ser His Ala
1 5 10 15
Ser Thr Leu Leu Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Ile Ser Asn
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Ser Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Ile Thr Ala
50 55 60
Leu Ile Ser Ile Val Asp Ser Ser Asn Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gln Tyr Ala Gln Met Val Gly
85 90
<210> 59
<211> 98
<212> PRT
<213> 黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)
<400> 59
Ser Ala Leu Ser Ser Pro Thr Thr His Ala Arg Ile Ser Ser His Ala
1 5 10 15
Ser Thr Leu Leu Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ala Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Ser Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Ile Thr Ala
50 55 60
Leu Ile Ser Ile Leu Asp Ser Ser Ser Val Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gln Tyr Ala Gln Ile Val Gly Gln Ser Met Gln Gln Ala
85 90 95
Met Gly
<210> 60
<211> 97
<212> PRT
<213> 络新妇蛛(Nephila clavipes)
<400> 60
Ser Arg Leu Ala Ser Pro Asp Ser Gly Ala Arg Val Ala Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Ser Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Cys Val Thr Ile Leu Ser Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ala Ser Gln Phe Ala Gln Val Val Gly Gln Ser Val Leu Ser Ala
85 90 95
Phe
<210> 61
<211> 82
<212> PRT
<213> 马达加斯加金色球蜘蛛(Nephila madagascariensis)
<400> 61
Ser Arg Leu Ala Ser Pro Asp Ser Gly Ala Arg Val Ala Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Ser Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Cys Val Thr Ile Leu Ser Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ala
<210> 62
<211> 82
<212> PRT
<213> 带状褪金色圆网蜘蛛(Nephila senegalensis)
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 62
Ser Arg Leu Ala Ser Pro Asp Ser Gly Ala Arg Val Ala Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Ser Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Val Ile Xaa Asn Ala Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Xaa Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Cys Val Thr Ile Leu Ser Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ala
<210> 63
<211> 71
<212> PRT
<213> 褐灰色捕鱼蜘蛛(Dolomedes tenebrosus)
<400> 63
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ala Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Val Asp Ala Leu Pro Ser
20 25 30
Ile Ile Ser Asn Leu Ser Ser Ser Ile Ser Ala Ser Ala Thr Thr Ala
35 40 45
Ser Asp Cys Glu Val Leu Val Gln Val Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val Gln Ile Val Cys Ser
65 70
<210> 64
<211> 97
<212> PRT
<213> 褐灰色捕鱼蜘蛛(Dolomedes tenebrosus)
<400> 64
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ala Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Val Ala Ala Leu Pro Ser
20 25 30
Ile Ile Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ile Ser Ala Ser Ser Thr Ala Ala
35 40 45
Ser Asp Cys Glu Val Leu Val Gln Val Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ala Asn Val Gly Tyr Ile Asn Pro Glu
65 70 75 80
Ala Ser Gly Ser Leu Asn Ala Val Gly Ser Ala Leu Ala Ala Ala Met
85 90 95
Gly
<210> 65
<211> 93
<212> PRT
<213> 十字园蛛(Araneus diadematus)
<400> 65
Asn Arg Leu Ser Ser Ala Gly Ala Ala Ser Arg Val Ser Ser Asn Val
1 5 10 15
Ala Ala Ile Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Leu Pro Asn Val Ile Ser
20 25 30
Asn Ile Tyr Ser Gly Val Leu Ser Ser Gly Val Ser Ser Ser Glu Ala
35 40 45
Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Ser Ala Leu Ile His Val Leu
50 55 60
Gly Ser Ala Ser Ile Gly Asn Val Ser Ser Val Gly Val Asn Ser Ala
65 70 75 80
Leu Asn Ala Val Gln Asn Ala Val Gly Ala Tyr Ala Gly
85 90
<210> 66
<211> 98
<212> PRT
<213> 十字园蛛(Araneus diadematus)
<400> 66
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Ala Ala Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Leu Val Ser Asn Gly Gly Pro Thr Ser Pro Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Ser Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Ile Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Ile Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ala Asn Ile Gly Pro Val Asn Ser Ser
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ser Ala Ser Ile Val Gly Gln Ser Val Tyr Arg Ala
85 90 95
Leu Ser
<210> 67
<211> 98
<212> PRT
<213> 十字园蛛(Araneus diadematus)
<400> 67
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Lys His Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Ser Val Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val Ser Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ser Ala Gln Tyr Thr Gln Met Val Gly Gln Ser Val Ala Gln Ala
85 90 95
Leu Ala
<210> 68
<211> 94
<212> PRT
<213> 十字园蛛(Araneus diadematus)
<400> 68
Ser Val Tyr Leu Arg Leu Gln Pro Arg Leu Glu Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Gly Ala Ala Val Ser Gly
20 25 30
Ala Leu Asn Ser Leu Val Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Ala Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val Ala Ile Leu Ser Ser Ala Ser Ile Gly Gln Val Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Val Ser Gln Ser Thr Gln Met Ile Ser Gln Ala Leu Ser
85 90
<210> 69
<211> 93
<212> PRT
<213> 大腹园蛛(Araneus ventricosus)
<400> 69
Asn Arg Leu Ser Ser Ala Glu Ala Ala Ser Arg Val Ser Ser Asn Ile
1 5 10 15
Ala Ala Ile Ala Ser Gly Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ser Val Ile Ser
20 25 30
Asn Ile Tyr Ser Gly Val Val Ala Ser Gly Val Ser Ser Asn Glu Ala
35 40 45
Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Leu Leu Ser Ala Leu Val His Val Leu
50 55 60
Ser Ser Ala Ser Ile Gly Asn Val Ser Ser Val Gly Val Asp Ser Thr
65 70 75 80
Leu Asn Val Val Gln Asp Ser Val Gly Gln Tyr Val Gly
85 90
<210> 70
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 70
Gly Pro Asn Ser Cys Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Cys Gly Ser
1 5 10 15
Ala Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
20 25 30
Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly
115 120 125
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
130 135 140
Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln
145 150 155 160
Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Gly Ser Tyr Ala
165 170 175
Gly Ala Val Asn Arg Leu Ser Ser Ala Glu Ala Ala Ser Arg Val Ser
180 185 190
Ser Asn Ile Ala Ala Ile Ala Ser Gly Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ser
195 200 205
Val Ile Ser Asn Ile Tyr Ser Gly Val Val Ala Ser Gly Val Ser Ser
210 215 220
Asn Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Leu Leu Ser Ala Leu Val
225 230 235 240
His Val Leu Ser Ser Ala Ser Ile Gly Asn Val Ser Ser Val Gly Val
245 250 255
Asp Ser Thr Leu Asn Val Val Gln Asp Ser Val Gly Gln Tyr Val Gly
260 265 270
<210> 71
<211> 151
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 71
Gly Ser Gly Asn Ser Gly Ile Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
1 5 10 15
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln
35 40 45
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr
65 70 75 80
Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg
100 105 110
Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly
130 135 140
Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser
145 150
<210> 72
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 72
Gly Pro Asn Ser Arg Gly Asp Ala Gly Ala Ala Ser Gly Gln Gly Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly
35 40 45
Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln
65 70 75 80
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly
100 105 110
Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
130 135 140
Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala
145 150 155 160
Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser
165 170 175
Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val
180 185 190
Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn
195 200 205
Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu
210 215 220
Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile
225 230 235 240
Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln
245 250 255
Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val Met Gly
260 265 270

Claims (18)

1.一种用于用能够形成聚合固体结构的重组蜘蛛丝蛋白涂覆固体表面的方法，所述方法包括以下步骤：
-将所述固体表面暴露于所述重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液，并且从而在所述重组蜘蛛丝蛋白和所述固体表面之间不形成共价键的情况下形成吸附在所述固体表面上的所述重组蜘蛛丝蛋白的表面层；和
-另外将所述固体表面的所述表面层暴露于所述重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液，并且从而在所述表面层上形成所述重组蜘蛛丝蛋白的组装的丝结构层；
其中所述方法不包括蜘蛛丝蛋白的干燥进入。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在将所述固体表面或所述表面层暴露于所述重组蜘蛛丝蛋白的水性溶液的步骤之间或之后的一个或更多个洗涤步骤，其中每个洗涤步骤涉及去除邻近所涂覆的表面的可溶性重组蜘蛛丝蛋白。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述固体表面是为疏水性的材料，诸如与水具有大于30°的接触角θ，和/或具有pKa<7的所述固体表面的暴露的羟基基团。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述固体表面是选自由金属、金属合金、聚合物、矿物、玻璃和玻璃样材料、氨基硅烷、和疏水性烃组成的组的材料，诸如选自由钛、不锈钢、聚苯乙烯、羟基磷灰石、二氧化硅、APTES官能化二氧化硅、金、和烷基硫醇官能化金组成的组的材料。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述重组蜘蛛丝蛋白包含有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白部分或非蛛丝蛋白多肽部分。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述重组蜘蛛丝蛋白包含蛋白部分REP和CT以及任选地有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分；其中
REP是70至300个氨基酸残基的重复片段，选自由L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、和L(GA)nGL组成的组，其中
n是2至10的整数；
每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中所述氨基酸残基中的0至3个不是Ala，并且剩余的氨基酸残基是Ala；
每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40％的所述氨基酸残基是Gly；并且
每个单独的L区段是0至30个氨基酸残基的接头氨基酸序列；并且
CT是70至120个氨基酸残基的片段，与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:69具有至少70％的同一性。
7.一种用能够形成聚合固体结构的重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，其，其中所述重组蜘蛛丝蛋白涂层包括：
-在所述重组蜘蛛丝蛋白和所述固体表面之间不形成共价键的情况下吸附在所述固体表面上的所述重组蜘蛛丝蛋白的表面层；和
-在所述表面层上的所述重组蜘蛛丝蛋白的组装的丝结构层；
其中所述重组蜘蛛丝蛋白涂层具有小于50nm的厚度。
8.根据权利要求7所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，其中所述组装的丝结构层比所述表面层更粘稠。
9.根据权利要求7-8中任一项所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，其中所述组装的丝结构层呈纳米纤维的物理形式，优选地具有小于20nm，诸如10-20nm，的直径。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，其中所述重组蜘蛛丝蛋白涂层具有10-40nm的厚度。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，其中所述固体表面是为疏水性的材料，诸如与水具有大于30°的接触角θ，和/或具有pKa<7的所述固体表面的暴露的羟基基团。
12.根据权利要求11所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，其中所述固体表面是选自由金属、金属合金、聚合物、矿物、玻璃和玻璃样材料、氨基硅烷、和疏水性烃组成的组的材料，诸如选自由钛、不锈钢、聚苯乙烯、羟基磷灰石、二氧化硅、APTES官能化二氧化硅、金、和烷基硫醇官能化金组成的组的材料。
13.根据权利要求7-12中任一项所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，其中所述固体表面是生物材料、植入物或医学装置的表面。
14.根据权利要求7-13中任一项所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，其中所述重组蜘蛛丝蛋白包含有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白部分或非蛛丝蛋白多肽部分。
15.根据权利要求7-14中任一项所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，其中所述重组蜘蛛丝蛋白包含蛋白部分REP和CT以及任选地有功能地暴露的非蛛丝蛋白蛋白/多肽部分，其中
REP是70至300个氨基酸残基的重复片段，选自由L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、和L(GA)nGL组成的组，其中
n是2至10的整数；
每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中所述氨基酸残基中的0至3个不是Ala，并且剩余的氨基酸残基是Ala；
每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40％的所述氨基酸残基是Gly；并且
每个单独的L区段是0至30个氨基酸残基的接头氨基酸序列；并且
CT是70至120个氨基酸残基的片段，与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:69具有至少70％的同一性。
16.根据权利要求7-15中任一项所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，所述固体表面可通过根据权利要求1-6中任一项所述的方法制备。
17.根据权利要求7-16中任一项所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面，所述固体表面还包含贴附到所述重组蜘蛛丝蛋白涂层上生长的真核细胞。
18.根据权利要求7-16中任一项所述的用重组蜘蛛丝蛋白涂覆的固体表面作为用于体外细胞培养的基质的用途。
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