JP7168454B2 - 固体表面のスパイダーシルクコーティング - Google Patents
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Description
本発明は、本発明による組換えスパイダーシルクタンパク質が、生理的条件下で、すなわち、処理の何れかの工程中に変性条件無しで、固体表面との安定なコーティングを自発的に形成することから、固体表面のためのコーティングとして非常に有用であるという見識に基づいている。本明細書に示すように、最初から機能的である組換えスパイダーシルクタンパク質が、生理的条件下で機能的表面コーティングにされ得ることは大きな利点である。本発明による組換えスパイダーシルクタンパク質は、共有結合を必要とせずに表面上にフィブリル構造に自発的に自己集合する(Self-assemble)ことは注目すべきことである。本発明による組換えスパイダーシルクタンパク質の表面と初期層の間の共有結合の積極的な形成無しに、安定なコーティングが達成され得ることは、非常に驚くべきことである。これは、コーティングを形成する際にも、本発明の組換えスパイダーシルクタンパク質の生物学的特性が維持された簡単且つ、効果的なコーティング処理を可能にする。当該処理は、湿式コーティング処理である。これは、当該処理が、水性溶液の存在下で行われ、フィルムを形成するために表面上で溶液の何れかの乾燥(drying-in)工程を含まないことを意味する。得られるコーティングは、乾燥方法によって産生されるフィルムよりも有意に薄い。より薄いコーティングは、原材料の消費を減少させることからコスト面の理由で有利である。より薄いコーティングはまた、体内に導入された場合に外来化合物の負荷を減少させることから安全上の理由でも有利である。より薄いコーティングはまた、下地の表面とのより良好な直接的な接触を与えることにおいても有利である。これは、コーティングが表面から剥がれるリスクを減少させるため、コーティングの安定性に貢献する。コーティングの安定性は、インビボでの適用に重要であるコーティングの予備調製及び滅菌を可能にする。
-前記組換えスパイダーシルクタンパク質の水性溶液に前記固体表面を曝し、それによって、前記組換えスパイダーシルクタンパク質と前記固体表面の間に共有結合を形成すること無く、前記固体表面上に吸着された前記組換えスパイダーシルクタンパク質の表面層を形成する工程; 及び
-前記固体表面の前記表面層を前記組換えスパイダーシルクタンパク質の水性溶液にさらに曝し、それによって、前記表面層上に前記組換えスパイダーシルクタンパク質の集合したシルク構造層を形成する工程。
本発明による方法において、前記コーティング処理は、水性溶液中で起こる。これは、当該方法が、前記組換えスパイダーシルクタンパク質の前記水性溶液を表面上での乾燥の何れかの工程を含まないことを意味する。従って、当該方法は、スパイダーシルクタンパク質の乾燥を含まない。
・コーティングの迅速な製造
・コーティングの厚さが制御され得ること
・バッチ間のばらつきが少なく、再現性が向上したこと
・3次元オブジェクトの何れかの形状をコーティングすることが可能であること。
・より均一なコーティング表面
・薄いコーティング(厚さが、空気乾燥したフィルムでの1~2μmに比べて、典型的に50nm未満)、これは必要なタンパク質の量を減少させ、より良好な直接的な接触感覚が得られる
・高い含水率で粘性のある他の層、これはコーティングを生きた組織により似せる。
REPが、L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、及びL(GA)nGLからなる群から選択される70~300アミノ酸残基の反復フラグメントであり、ここで、
nが、2~10の整数であり;
各個々のAセグメントが、8~18アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、0~3アミノ酸残基がAlaではなく、残りのアミノ酸残基がAlaであり;
各個々のGセグメントが、12~30アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、少なくとも40%のアミノ酸残基がGlyであり; 及び
各個々のLセグメントが、0~30アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり;及び
CTが、配列番号3又は配列番号69に対して少なくとも70%の同一性を有する70~120アミノ酸残基のフラグメントである。
L(AG)nL、例えば、LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5L;
L(AG)nAL、例えば、LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5A6L;
L(GA)nL、例えば、LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5L; 又は
L(GA)nGL、例えば、LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5G6L。
前記組換えスパイダーシルクタンパク質と前記固体表面の間に共有結合を形成すること無く前記固体表面に吸着された前記組換えスパイダーシルクタンパク質の表面層; 及び
前記表面層上の前記組換えスパイダーシルクタンパク質の集合したシルク構造層;
を含む。
・より均一なコーティング表面
・薄いコーティング(厚さが、空気乾燥したフィルムでの1~2μmに比べて、典型的に50nm未満)、これは必要なタンパク質の量を減少させ、より良好な直接的な接触感覚が得られる
・高い含水率で粘性のある他の層、これはコーティングを生きた組織により似せる。
材料
タンパク質は、E. coli BL21株で組換え生産され、クロマトグラフィーを用いて精製された。タンパク質は、他の条件が記載されていない場合、20mMトリス緩衝液、pH8.0で用いられた。タンパク質溶液は、吸着測定の間氷上に保持された。1-ウンデカンチオール(1-undecanethiol)(Sigma Aldrich)を含むアルキルチオール溶液が、99.5%エタノール(Solveco)中に2mM溶液として調製された。ペトリ皿片をトルエンに溶解することによって2%ポリスチレン溶液を調製した。
水晶振動子マイクロバランスと散逸モニタリング(QCM-D)は、ATカット水晶振動子の圧電特性を利用して、発振周波数の変化及び脈流電圧の印加による振動の散逸をモニターする。水晶センサー上に質量が吸着されると、周波数が減少し、散逸が増加する。散逸変化を周波数変化と比較することにより、吸着層の粘弾特性が評価され得る。
エリプソメトリーは、表面で反射する光の変更の変化をモニターする。タンパク質が、表面に吸着するにつれて、光の分極が変化する。これをモニタリングすることにより、屈折率及び吸着された質量の変化が、計算され得る。アルキルチオール機能化金センサーは、QCM-Dモニター用のE1装置(Q-sense AB)及び吸収中のコーティングのタンパク質の誘電特性の変化を記録するためのエリプソメーター(Physics Instruments)を用いた同時データ収集を可能にするためQ-Senseエリプソメトリーモジュールに取付けられた。
表面プラズモン共鳴(SPR)において、クリスタルチップ上の薄い金層にプラズモン共鳴が生じる入射角が、記録される。分子がチップ表面と相互作用すると、この角度が変化し、これは、屈折率の変化と相関し、それによってチップ表面に近い質量変化に間接的に相関する。
QCM-D分析の後、吸着されたタンパク質を有するセンサーを原子間力顕微鏡イメージングに用いた。表面トポグラフィーは、試料上の選択された領域を走査している表面に近接したチップの偏差変化を測定することによって決定される。タンパク質コーティングは、Bruker Dimension FastScan装置でPeakForce Tappingモードを用いて20mMトリス緩衝液中でイメージ化された。ScanAsyst Fluid + tipsが用いられた。
ヒト起源の小血管(ヒト真皮微小血管内皮細胞、HDMEC、Promocell)由来の一次内皮細胞を、5%FBSを含有する内皮細胞増殖培地MV2(Promocell)で培養した。ヒト初代真皮線維芽細胞(HDFn、ECACC、UK)を、5%FBS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM F12中で培養した。細胞を、96ウェルプレート(Sarstedt Tc懸濁細胞)中のシルクコーティング上に5000/cm2で播種した。
2日目及び8日目に、細胞をPBSで洗浄し、生存細胞及び死滅細胞それぞれを培地中でCalcein-AM及びEthD-1(Live/dead Viability kit, Molecular probes)で30分間染色した。倒立蛍光顕微鏡(NikonTSi-u)を用い、倍率10倍で顕微鏡写真を撮影した。
0、3、8及び11日目の細胞生存率を、培養培地中1:10に希釈したアラマーブルーで2時間分析した。上清の蛍光強度をClarioStarプレートリーダーで励起/放射540/595で測定した。細胞を含まない培地をブランクとして使用し、これを値から差し引いた。ウェルは3連で行った。
組換えスパイダーシルクタンパク質RepCT(配列番号2)が、それぞれ、QCM-Dセンサー及びSPRセンサーを用いて金表面上に流された。図1は、アルキルチオール変性金センサーへのタンパク質吸着を示す。QCM-D(A)及びSPR(B)によって試験された0.1gのL-1RepCTの吸着、QCM-D(C)及びSPR(D)によって試験された0.1gのL-1プロテアーゼ3Cの吸着を示す。I、III及びVは、表面上でのタンパク質の流れの開始を示し、一方、時点II及びIVでは、表面を緩衝液ですすぐことを示す。
組換えスパイダーシルクタンパク質RepCT(配列番号2)の集合処理の能動依存性が、金表面上にタンパク質濃度を増加させることによって試験された。
吸着層の粘弾特性は、散逸(D)対周波数(f)の比を用いてQCM-D測定から導かれ得る。硬い層の形成は、低いD値、従って低いΔD/Δfをもたらし、粘性層の形成は高いΔD/Δfをもたらす。組換えスパイダーシルクタンパク質RepCT(配列番号2)について、最初の吸着層は、0.014(n=6、σ=0.017)のΔD/Δfをもたらし、集合相においては、ΔD/Δfは、0.118(n=6、σ=0.017)である。従って、最初の表面層は硬質であり、連続したシルクの集合は、より粘性のある層、集合したシルク構造層をもたらす。
組換えスパイダーシルクタンパク質RepCT(配列番号2)のコーティングの構造が、顕微鏡を用いて視覚化された。アルキルチオール化された金センサーは、QCM-D測定において吸着後に原子間力顕微鏡でイメージ化された。
組換えスパイダーシルクタンパク質RepCT(配列番号2)のコーティングのコーティング安定性は、PBS、0.1及び0.5MのHCl、0.1及び0.5MのNaOH、並びに20%及び70%エタノールをコーティング上に流すことにより、QCM-D測定中で評価された。これら洗浄の各々の間において、トリス緩衝液が表面上に流され、緩衝液バルクの効果を、コーティングの実際の変化から区別した。トリス緩衝液に戻した後の高い周波数への何れかの正味シフトは、タンパク質が洗い流されたことを示し得る。
臨床的に関連するインプラント材料を機能化する可能性を評価するために、抗菌ペプチドマガイニンI(MAG-RepCT; 配列番号9)及びフィブロネクチンモチーフ(FNcc RepCT; 配列番号11)と融合した組換えスパイダーシルクタンパク質のそれぞれが用いられた。QCM-Dにより、ポリスチレン、チタニウム及びステンレス・スティールコーティングされたセンサー上にそれらを流しながら、各シルクタイプの吸着をリアルタイムで調べた。両方のシルクタイプは、何れかの前処理無しで全ての表面に良好に吸着することが出来た。
本発明による組換えスパイダーシルクコーティングの細胞適合性を評価する目的で、真皮由来のヒト線維芽細胞及び内皮細胞をコーティング上で11日間増殖させ、その間アラマーブルーによって増殖をモニターした(図7A及びB)。2日及び8日後に、細胞は、生存細胞及び死滅細胞の存在を調査するために染色されたが、またマトリックス上の細胞形態及び細胞の広がりを可視化した(緑色染色)(図7C及びD)。
親和性ドメインを有する3つの異なるシルク融合体; Z-RepCT、C2-RepCT及びABD-RepCTは、QCM-Dセンサーを用いて金表面上に個別に流された。Z-RepCT(配列番号13; 図8A)は、Zドメイン、すなわち、スタフィロコッカス・アウレウス由来のタンパク質AのIgG結合ドメインBの操作された類似体と融合した組換えスパイダーシルクタンパク質である。C2-RepCT(配列番号15; 図8B)は、ブドウ球菌タンパク質GのFc結合ドメインB1に由来するC2と融合した組換えスパイダーシルクタンパク質である。ABD-RepCT(配列番号17; 図8C)は、ブドウ球菌タンパク質Gに由来するアルブミン結合ドメインと融合した組換えスパイダーシルクタンパク質である。
増殖因子を有する2つの異なるシルク融合体; RepCT-FGF(配列番号19)及びIGF1-RepCT(配列番号21)が、QCM-Dセンサーを用いて金表面上に個別に流された。図9は、20mMトリス中の0.1mg/mlのRepCT-FGFの典型的な吸着挙動を示す。時点Iで表面が、RepCT-FGFタンパク質溶液に曝され、時点IIで表面が、トリス緩衝液ですすがれた。
抗菌配列を有する2つの異なるシルク融合体; DspB-RepCT(配列番号23; バイオフィルム中のグリコシドを加水分解する酵素ディスパーションBを含む)及びWGR-RepCT(配列番号25; 操作された抗菌ペプチドを含む)は、タンパク質-タンパク質相互作用を確認するために、金表面に流され、QCM-Dセンサーを用いて分析された。
タンパク質吸着及びタンパク質-タンパク質相互作用を確認するために、scFVライブラリー由来の組換え抗体フラグメントと融合したシルクが金表面に流され、QCM-Dセンサーを用いて分析された。
酵素キシラナーゼ(Xyl-RepCT; 配列番号27)と融合したシルクが金表面上に流され、QCM-Dセンサーを用いて分析し、タンパク質吸着及びタンパク質-タンパク質相互作用を確認した。
タンパク質-タンパク質相互作用を検証するために、モノマーストレプトアビジン(M4-RepCT; 配列番号29)と融合したシルクが、金表面上に流され、QCM-Dセンサーを用いて分析された。
細胞培養用のコーティングは、96ウェル非処理プレート(Sarstedt)中で0.5時間滅菌濾過したFNcc-RepCT(MiSp)-シルクタンパク質(配列番号70)(0.3g L-1)をインキュベートすることによって調製された。液体を、除去し、ウェルを、トリス緩衝液(20mM)で2回洗浄し、滅菌条件で一晩乾燥させた。
何れかのC末端(CT)ドメインを欠くタンパク質Rep(配列番号71)の溶液が、QCM-Dセンサーを用いて金表面に流された。図12Aは、20mMトリス中の0.3mg/ml Repの典型的な吸着挙動を示す。20mMトリス緩衝液で平衡化した後、表面をタンパク質溶液に曝した。まさに最初の数分間の間、タンパク質-表面の相互作用は、表面層の形成のために速い周波数シフトをもたらす。その後、バルクタンパク質は、表面吸着タンパク質と相互作用し、タンパク質-タンパク質相互作用を介してより厚いコーティングを構築し、連続した傾きの周波数シフトとして示された。この処理は、タンパク質が、バルク中に存在する限り続く(140分)。これをシルクの集合、すなわちC末端ドメインを欠くスピドロインについても初期表面層へ集合したシルク構造層の形成と判断する。タンパク質溶液を緩衝溶液と交換して表面をすすぐと、センサーの周波数及び散逸は、変化しないままであり、これは、コーティングの吸着質量及び粘弾性が維持されることを意味する。
精製後、組換えスパイダーシルクタンパク質RepCT(配列番号2)及びRGD-RepCT(配列番号72)の溶液は、濾過滅菌され(0.22μm)、遠心濾過(Amicon Ultra, Millipore)により濃縮された。
Claims (15)
- 高分子固体構造を形成することが出来る組換えスパイダーシルクタンパク質で固体表面をコーティングする方法であって、
前記組換えスパイダーシルクタンパク質の水性溶液に前記固体表面を曝し、それによって、前記組換えスパイダーシルクタンパク質と前記固体表面の間に共有結合を形成すること無く、前記固体表面上に吸着された前記組換えスパイダーシルクタンパク質の表面層を形成する工程; 及び
前記固体表面の前記表面層を前記組換えスパイダーシルクタンパク質の水性溶液にさらに曝し、それによって、前記表面層上に前記組換えスパイダーシルクタンパク質の集合したシルク構造層を形成する工程
を含み、ここで、当該方法は、スパイダーシルクタンパク質の乾燥を含まず、かつ
前記集合したシルク構造層は、ナノフィブリルの物理形態である、方法。 - 前記固体表面又は前記表面層を前記組換えスパイダーシルクタンパク質の水性溶液に曝す工程の間又は後に1つ以上の洗浄工程をさらに含み、ここで、各洗浄工程が、前記コーティングされた表面に隣接する可溶性組換えスパイダーシルクタンパク質の除去を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記固体表面が、疎水性であり、例えば30°超の水との接触角θを有する材料であり、及び/又は前記固体表面が、その露出されたヒドロキシル基のpKaが7未満である材料である、請求項1又は2の何れか1項に記載の方法。
- 前記固体表面が、金属、金属合金、ポリマー、ミネラル、ガラス及びガラス様材料、アミノシラン、及び疎水性炭化水素からなる群から選択される材料であり、例えば、チタニウム、ステンレス・スティール、ポリスチレン、ヒドロキシアパタイト、二酸化ケイ素、APTES機能化二酸化ケイ素、金、及びアルキルチオール機能化金から選択される材料である、請求項3に記載の方法。
- 前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、機能的に露出された非スピドロインタンパク質部分又は非スピドロインポリペプチド部分を含む、請求項1~4の何れか1項に記載の
方法。 - 前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、タンパク質部分REP及びCT並びに任意で機能的に露出した非スピドロインタンパク質/ポリペプチド部分を含み、ここで、
REPが、L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、及びL(GA)nGLからなる群から選択される70~300アミノ酸残基の反復フラグメントであり、ここで、
nが、2~10の整数であり;
各個々のAセグメントが、8~18アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、0~3アミノ酸残基がAlaではなく、残りのアミノ酸残基がAlaであり;
各個々のGセグメントが、12~30アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、少なく
とも40%のアミノ酸残基がGlyであり; 及び
各個々のLセグメントが、0~30アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり;並びに
CTが、配列番号3又は配列番号69に対して少なくとも70%の同一性を有する70~120アミノ酸残基のフラグメントである、
請求項1~5の何れか1項に記載の方法。 - 高分子固体構造を形成することが出来る組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面を有する物品であって、ここで、前記組換えスパイダーシルクタンパク質コーティングが、
前記組換えスパイダーシルクタンパク質と前記固体表面の間に共有結合を形成すること無く前記固体表面に吸着された前記組換えスパイダーシルクタンパク質の表面層; 及び
前記表面層上の前記組換えスパイダーシルクタンパク質の集合したシルク構造層;
を含み、ここで、前記組換えスパイダーシルクタンパク質コーティングが、50nm未満の厚さを有し、かつ
前記集合したシルク構造層は、ナノフィブリルの物理形態である、
固体表面を有する物品。 - 前記集合したシルク構造層が、前記表面層より粘性が高い、請求項7に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面を有する物品。
- 前記ナノフィブリルが、20nm未満、例えば10~20nmの直径を有する、請求項7~8の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面を有する物品。
- 前記固体表面が、疎水性であり、例えば30°超の水との接触角θを有する材料であり、及び/又は前記固体表面が、その露出されたヒドロキシル基のpKaが7未満である材料である、請求項7~9の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面を有する物品。
- 前記固体表面が、金属、金属合金、ポリマー、ミネラル、ガラス及びガラス様材料、アミノシラン、及び疎水性炭化水素等からなる群から選択される材料であり、例えば、チタニウム、ステンレス・スティール、ポリスチレン、ヒドロキシアパタイト、二酸化ケイ素、APTES機能化二酸化ケイ素、金、及びアルキルチオール機能化金からなる群から選択される材料である、請求項10に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面を有する物品。
- 前記固体表面が、生体材料、インプラント又は医療機器の表面である、請求項7~11の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面を有する物品。
- 前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、機能的に露出された非スピドロインタンパク質部分又は非スピドロインポリペプチド部分を含む、請求項7~12の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面を有する物品。
- 前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、タンパク質部分REP及びCT並びに任意で機能的に露出した非スピドロインタンパク質/ポリペプチド部分を含み、ここで、
REPが、L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、及びL(GA)nGLからなる群から選択される70~300アミノ酸残基の反復フラグメントであり、ここで、
nが、2~10の整数であり;
各個々のAセグメントが、8~18アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、0~3アミノ酸残基がAlaではなく、残りのアミノ酸残基がAlaであり;
各個々のGセグメントが、12~30アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、少なくとも40%のアミノ酸残基がGlyであり; 及び
各個々のLセグメントが、0~30アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり; 並びに
CTが、配列番号3又は配列番号69に対して少なくとも70%の同一性を有する70~120アミノ酸残基のフラグメントである、
請求項7~13の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面を有する物品。 - インビトロ細胞培養のためのマトリックスとしての、請求項7~14の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面を有する物品の使用。
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