WO2013191492A1 - 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질이 코팅된 뼈 재생용 스캐폴드 - Google Patents

피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질이 코팅된 뼈 재생용 스캐폴드 Download PDF

Info

Publication number
WO2013191492A1
WO2013191492A1 PCT/KR2013/005462 KR2013005462W WO2013191492A1 WO 2013191492 A1 WO2013191492 A1 WO 2013191492A1 KR 2013005462 W KR2013005462 W KR 2013005462W WO 2013191492 A1 WO2013191492 A1 WO 2013191492A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
scaffold
fibronectin
osteocalcin
solution
bone regeneration
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/005462
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김해원
이재호
장준혁
Original Assignee
단국대학교 산학협력단
인하대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 단국대학교 산학협력단, 인하대학교 산학협력단 filed Critical 단국대학교 산학협력단
Publication of WO2013191492A1 publication Critical patent/WO2013191492A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/30—Inorganic materials
    • A61L27/32—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a scaffold for bone regeneration comprising a hydroxyapatite coated with a polymer scaffold surface and a fibronectin-osteocalcin fusion protein bonded to hydroxyapatite and a method for producing the same.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • Scaffolds for application in bone tissue engineering must meet several key conditions for optimized tissue formation of host tissues. These conditions include cell affinity, adequate porosity for nutrient and oxygen permeation, interfacial activity to promote cell adhesion and differentiation, and the like. In addition, ideally the scaffold should be continuously degraded and replaced by host cells. Extracellular matrix (ECM) molecules such as collagen are suitable scaffold materials.
  • ECM Extracellular matrix
  • synthetic degradable plastics such as polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL) and copolymers thereof have the advantage of being capable of accurate processing and being more economical and clinically widely available than naturally occurring materials.
  • Composite scaffolds consisting of PCL and bioactive ceramics such as hydroxyapatite (HA) or tricalcium phosphate (TCP) have increased biological capacity in bone regeneration, such as improved cell adhesion, differentiation of osteoblasts, and bone formation. Shows.
  • bioactive ceramics such as hydroxyapatite (HA) or tricalcium phosphate (TCP)
  • HA hydroxyapatite
  • TCP tricalcium phosphate
  • the biomimetic environment is suitable for both early stem cell adhesion and growth, and for continuous differentiation to mature into the phenotype of osteoblasts.
  • the present inventors have studied scaffolds that are suitable for both the attachment and continuous bone formation of early mesenchymal stem cells, and when the binding protein of fibronectin-osteocalcin is linked to a porous scaffold mineralized with hydroxyapatite, The present invention was completed by confirming that adhesion is increased and bone formation is promoted.
  • the present invention provides a scaffold for bone regeneration comprising hydroxyapatite coated with a polymer scaffold surface and fibronectin-osteocalcin fusion protein bonded to hydroxyapatite.
  • the present invention also provides a process for preparing a polymer scaffold, b) coating a polymer scaffold with hydroxyapatite, c) synthesizing a fibronectin-osteocalcin fusion protein, d) fibronectin-osteocalcin It provides a method for producing a scaffold comprising coating with a fusion protein.
  • the present invention provides a scaffold for bone regeneration comprising a polymer scaffold, a hydroxyapatite coated on the surface of the polymer scaffold, and a fibronectin-osteocalcin fusion protein combined with hydroxyapatite.
  • the material of the polymeric scaffold should have biodegradability that can be maintained until the scaffold fully functions and serves and then completely degraded in vivo.
  • preferred biodegradable polymers include polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polylactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA), polycaprolactone (PCL), and polycaprolactone (PCL). desirable.
  • fibronectin is a protein having a molecular weight of about 220 kDa, has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, includes several motifs including an RGD motif, and works with various integrins to regulate cell function. Means.
  • RGD is present in the ninth to tenth type III repeat units as cell adhesion motifs.
  • Fibronectin domains of the present invention are the ninth to tenth type III repeat units of fibronectin and comprise the RGD sequence.
  • the fibronectin domain may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • osteocalcin includes 2-3 gamma-carboxylglutamate (Gla) residues, and is a vitamin K-dependent calcium-binding non-collagenic protein having a molecular weight of about 5,900 Da. It means a protein having an amino acid sequence.
  • Osteocalcin in bone plays an important physiological role in bone metabolism, such as regulating local mineralization or controlling Ca 2+ movement between bone and body fluids. Osteocalcin is synthesized in osteoblasts and then glazed by vitamin K dependent carboxylase in the cells.
  • Gladized osteocalcin (Gla-OC) binds to hydroxyapatite (HA) in bone and accumulates in the bone matrix and is involved in bone formation.
  • Osteocalcin has a high affinity for hydroxyapatite
  • the osteocalcin domain of the present invention may comprise 18-95 amino acid sites that bind hydroxyapatite (HA).
  • HA hydroxyapatite
  • the osteocalcin domain may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the fusion protein binds to hydroxyapatite (HA) to promote integrin mediated cell adhesion, more specifically to promote osteoblast adhesion and maintenance on tooth and bone mineral components, and to promote osteoblast differentiation.
  • the fusion protein of the present invention may be a structure in which the osteocalcin domain is connected to the C terminus of the fibronectin domain or a structure in which the osteocalcin domain is connected to the N terminus of the fibronectin domain.
  • it has the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • Representative examples of the fibronectin-osteocalcin fusion protein are described in Korean Patent Publication No. 10-2012-0057429, which is incorporated by reference of the present invention.
  • the present invention to solve the above problems is a) preparing a polymer scaffold, b) coating the polymer scaffold with hydroxyapatite, c) synthesizing the fibronectin- osteocalcin fusion protein, d) a polymer
  • a polymer Provided are methods of making a scaffold comprising coating the scaffold with a fibronectin-osteocalcin fusion protein.
  • Step a) is a step of preparing a polymer scaffold.
  • the polymer scaffold used may be made of polyglyrolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polylactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA), polycaprolactone (PCL), and the like.
  • PGA polyglyrolic acid
  • PLA polylactic acid
  • PLGA polylactic acid-glycolic acid copolymer
  • PCL polycaprolactone
  • the resulting polymer scaffold has a three dimensional structure with pores of controlled size and arrangement.
  • Step b) is a step of coating the polymer scaffold with hydroxyapatite.
  • the coating increases the adhesion between the polymer scaffold and the fibronectin-osteocalcin fusion protein.
  • Step b) comprises a) alternately immersing the scaffold in CaCl 2 and Na 2 HPO 4 solution, and b) treating the mineralization solution at 35 ° C. for 1 to 10 days.
  • Step a) is a step of alternately immersing the scaffold in CaCl 2 and Na 2 HPO 4 solution to induce CaP nucleation.
  • the concentration of the CaCl 2 and NaHPO 4 solution is preferably 10 mM to 1000 mM.
  • Step b) is a step of forming hydroxyapatite on the polymer scaffold by treating the polymer scaffold in the mineralization solution.
  • the mineralization solutions used are Na +, K +, Mg 2+ , Ca 2+, Cl -, HCO 3.
  • the mineralization solution Na + 213.0 mM, K + 7.5 mM, Mg 2+ 2.25 mM, Ca 2+ 3.75 mM, Cl - 221.7 mM, HCO 3 - 6.3 mM, HPO 4 2- 1.5 mM and SO 4 is similar to the body fluid of 1.5mM, including 2- 0.75 mM.
  • the temperature of the mineralization solution of step b) is preferably 35 ° C., and the immersion time is 1 day to 10 days. If the temperature of the mineralization solution is lower or higher than 35 ° C., the temperature difference from the body temperature is large and thus does not provide a suitable environment for the reaction to occur.
  • Step c) is a step of synthesizing the fibronectin-osteocalcin fusion protein.
  • the fusion protein including the fibronectin domain and the osteocalcin domain may be prepared by a chemical peptide synthesis method known in the art, or the genes encoding the respective domains may be amplified by PCR (polymerase chain reaction) or synthesized by a known method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • By linking in frame (in frame) it can be expressed by operably linked and cloned in the expression vector.
  • the expression vector is a recombinant vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and refers to a gene construct containing essential regulatory elements operatively linked to express a gene insert.
  • Expression vectors of the present invention include expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, polyadenylation signals, and enhancers as elements generally possessed by suitable expression vectors. Initiation and termination codons are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the immunogenic target protein and must be functional in the individual when the gene construct is administered and must be in frame with the coding sequence.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • pBAC / His-FNIII9-10 / OC was prepared as an expression vector containing a gene encoding the fusion protein of the present invention.
  • the vector of the present invention may further comprise a protein tag, which can be optionally removed using an endopeptidase, to facilitate detection of the fusion protein.
  • tag refers to a molecule exhibiting quantifiable activity or properties, and refers to a polypeptide fluorescent substance such as a chemical fluorescent substance (fluoracer), a fluorescent protein (GFP) or a related protein such as fluorescein. It may be a fluorescent molecule included, or may be an epitope tag such as a Myc tag, a flag tag, a histidine tag, a leucine tag, an IgG tag, and a straptavidin tag. Suitable tag polypeptides generally have 6 or more amino acid residues and typically have about 8 to 50 amino acid residues, wherein 6 histidine tags were used in the present invention.
  • Step d) is a step of connecting the fibronectin-osteocalcin fusion polymer to the polymer scaffold by immersing the scaffold in a fibronectin-osteocalcin solution in PBS (phosphate buffered saline).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the concentration of fibronectin-osteocalcin in the PBS solution is preferably 100 ng / ml to 100 ⁇ g / ml.
  • the immersion time in the solution of the scaffold is preferably 8 hours to 24 hours. If the immersion time is shorter than 8 hours, a sufficient amount of fibronectin-osteocalcin fusion polymer is not bound to the scaffold, and if the immersion time is longer than 24 hours, it is already saturated and no more fibronectin-osteocalcin fusion polymer is bound to the scaffold. It is not efficient.
  • the present invention provides a scaffold for bone regeneration comprising a hydroxyapatite coated with a polymer scaffold surface and a fibronectin-osteocalcin fusion protein coupled to hydroxyapatite, and a method for preparing the same, which promotes adhesion and maintenance of osteoblasts.
  • a scaffold for bone regeneration comprising a hydroxyapatite coated with a polymer scaffold surface and a fibronectin-osteocalcin fusion protein coupled to hydroxyapatite, and a method for preparing the same, which promotes adhesion and maintenance of osteoblasts.
  • it can be usefully applied to bone tissue engineering and regenerative medicine by improving osteoblast differentiation.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of a PCL scaffold according to the present invention.
  • FIG. 2 is a graph of signal strength showing the amount of FN-OCN fusion protein bound to the PCL scaffold over immersion time.
  • 3 is a graph showing the degree of attachment of MSCs to PCL scaffolds to which FN-OCN fusion proteins are linked.
  • Figure 4 shows the mRNA expression of the osteogenic genes of each marker OPN, OCN, BSP in the FN-OCN-bound scaffold.
  • MSCs were isolated from the tibia and femur bone marrow of Sprague-Dawley rats. All protocols involving animals were conducted in accordance with the guidelines of the Animal Ethics Committee of Dankook University.
  • the bone marrow of tibia and femoral call was extracted from Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) containing 0.1% of Type I collagen and 0.2% of Dispase II.
  • HBBS Hank's Balanced Salt Solution
  • Mononuclear cells were obtained using a centrifuge and enzyme solution at 1500 rpm. Cells were placed in two parallel culture dishes at a concentration of 2 ⁇ 10 3 / cm 2 (one for proteum analysis and one for culture).
  • fetal bovine serum FBS; Hyclone, Logan UT
  • 2 mM l-glutamine 100 U / mL penicillin
  • 100 mL / mL streptomycin all purchased from Sigma-Aldrich, St. Louis
  • a-MEM a-Minimal Essential Medium
  • a three-dimensional PCL scaffold was prepared using an Ez-ROBO3 robocasting machine (Iwashita, Japan). Specifically, the solution was added to the syringe and maintained at 50 ° C. using a heating jacket. Thereafter, the solution was injected into a metal nozzle using a force-controlled plunger to control the mass flow rate. Partially controlled units operate to induce a two-dimensional fiber dispersion path with constant velocity. 2D fibers were laminated in multiple layers to create 3D porous scaffolds with controlled pore size and geometry. The fibers were then immersed in cold ethanol to effectively solidify the PCL solution. Thereafter, the scaffold was heat treated at 50 ° C., and the fibers were contact fused.
  • the gently stirred 1N NaOH scaffold was immersed to activate the surface and washed with distilled water.
  • the scaffolds were then alternately immersed in 150 mM CaCl 2 and 150 mM Na 2 HPO 4 solution to induce calcium phosphate nucleation. Between the alternating dipping procedures, the scaffolds were cleaned thoroughly.
  • the scaffolds from which CaP nuclei were generated were treated with mineralization solution (1.5 x simulated body fluid, 1.5 mM SBF (213.0 mM Na + , 7.5 mM K + , 2.25 mM Mg 2+ , 3.75 mM Ca 2+ , 221.7 mM Cl ⁇ , 6.3). was further treated at 37 ° C. for up to 7 days with mM HCO 3 ⁇ , 1.5 mM HPO 4 2- and 0.75 mM SO 4 2- ).
  • PCR primers were constructed as follows to recognize the ninth to tenth type III domains of human fibronectin (FNIII9-10) containing the specific cell binding sequence RGD.
  • FNIII9-10 forward primer 5'-CTCGAGCAACAATCAACAGTTTC-3 '(introduced SacI restriction site before N-terminus of FNIII9-10), FNIII9-10 reverse primer, 5'-CTCGAGTGGTTTGTCAATTTC-3' (COOH-terminus of FNIII9-10 SacI Restricted Sites).
  • PCR was performed with 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl 2 , 100 ⁇ g / ml gelatin, 0.2 mM dNTPs, 1.25 units of taq polymerase (iNtRON) and 50 pmol each of reverse and forward primers. It was performed in 30 ⁇ l reaction solution. PCR was performed by annealing at 55 ° C. for 1 minute, extending at 72 ° C. for 1 minute, and denaturing at 94 ° C. for 1 minute. After 30 repetitions, the amplified PCR product was digested with restriction enzyme SacI. After cleavage, the PCR product was linked to the SacI position of the pBAD / His-OC vector to generate the construct pBAD / His-FNIII9-10 / OC.
  • SacI restriction enzyme
  • Escherichia coli TOP10 cells were incubated overnight at 37 ° C. in LB-Amp medium.
  • A600 0.6
  • transcription induction was initiated with 0.02% (w / v) of the transcription inducer L-arabinose.
  • the bacteria were pelleted by centrifugation, lysed and sonicated.
  • the dissolved extracts were prepared by centrifugation in a refrigerated centrifuge at 14,000 xg for 30 minutes and the supernatant was transferred to a new tube.
  • Ni-NTA nickel-nitrilotriacetic acid
  • FN-OCN was linked to the mineralized PCL scaffold.
  • FN-OCN solution was prepared at a concentration of 1 ⁇ g / ml in phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • PCL-HA scaffolds were immersed in the solution for 2, 4, 8 and 16 hours at room temperature, respectively. Each hour the samples were washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) for 5 minutes. By immunolabelling, the amount of FN-OCN bound to the surface was measured. Scaffolds were incubated with rabbit anti-OCN antibody for 1 hour at room temperature.
  • Cultured MSCs were harvested by trypsinization, washed and re-suspended in standard growth media at a concentration of 1 ⁇ 10 5 / ml. 100 ⁇ l portions of cell containing media were mounted in each scaffold and incubated for various times to adhere the cells. In order to calculate the amount of cells that successfully adhered to the scaffold, all the cells that did not adhere to each time were collected and counted using a hemocytometer. The amount of adhered cells was judged as the inverse of the amount of non-bonded cells.
  • RNA samples (1 ⁇ g) were reversely transcribed into cDNA in 40 ⁇ l reaction using Quantitect RT kit (Qiagen) according to the manufacturer's protocol. The reaction proceeded at 95 ° C. for 5 minutes. Similar reaction mixtures containing no transcribed enzyme were prepared and used as samples to show no contaminated genomic DNA.
  • Microliter cDNA was PCR amplified using specific primers of mouse osteopontin and osteocalcin and a pre-mixed PCR kit (Bioneer, Daejon, Korea). The PCR reaction was repeated 40 times, 30 seconds at 95 ° C., 30 seconds at 55 ° C., 30 seconds at 75 ° C., and repeated three times for each cDNA. Representative PCR bands of each sample are shown. ( Figure 4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 고분자 스캐폴드 표면에 코팅된 하이드록시아파타이트 및 하이드록시아파타이트와 결합된 피브로넥틴-오스테오칼신 융합단백질을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드에 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 골세포의 부착 및 유지를 촉진시키고, 조골세포의 분화를 향상시켜 골 조직 공학 및 재생의학에 유용하게 적용할 수 있는 스캐폴드를 제공하기 위한 것이다.

Description

피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질이 코팅된 뼈 재생용 스캐폴드
본 발명은 고분자 스캐폴드 표면에 코팅된 하이드록시아파타이트 및 하이드록시아파타이트와 결합된 피브로넥틴-오스테오칼신 융합단백질을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
대량 골 결손의 치료는 현대 의학에서 중요한 과제이다. 재생 의학 및 조직 공학에 대한 연구가 계속되고 있으며, 줄기세포 기반의 치료가 임상에서의 골 재생을 위해 고려되고 있다. 이는 부분적 골 결손이 이미 상당히 진행되었거나 조직이 노화된 환자에게서 초기 조골세포 획득이 어렵다는 문제를 극복하였다. 중간엽 줄기세포(MSCs)는 뼈 형성 단백질과 같은 적절한 영양분이 공급되는 경우 조골세포의 표현형으로 바로 분화한다.
골 조직 공학에 적용하기 위한 스캐폴드는, 숙주 조직의 최적화된 조직 형성을 위해 핵심적인 몇 가지 조건을 만족해야 한다. 이 조건은 세포 친화력, 영양분과 산소가 투과하기 위한 적절한 공극률, 세포 부착 및 분화를 촉진시키기 위한 계면 활성 등을 포함한다. 또한, 이상적으로 스캐폴드는 연속적으로 분해되어 숙주 세포에 의해 대체되어야 한다. 콜라겐과 같은 세포외 기질(ECM)분자가 적절한 스캐폴드 재료이다. 그러나, 폴리유산(PLA), 폴리카프로락톤(PCL) 및 이의 공중합체와 같은 합성 분해성 플라스틱은 자연발생 물질에 비하여 정확한 가공이 가능하고, 보다 경제적이어서 임상적으로 널리 사용할 수 있다는 장점이 있다.
그러나, 합성 생체 고분자는 낮은 골 생체활성, 높은 소수성, 생체 단백질 및 세포에 대한 낮은 친화력을 가지기 때문에, 합성 생체고분자 스캐폴드는 골 조직 공학에 적합하도록 최적화 될 필요가 있다. 따라서, 생체활성을 증가시키기 위해 친수성 물질을 이용한 표면 개질과 같은 여러 시도가 있어왔다. 접착 단백질은 합성 고분자의 표면에 공유결합 하여 초기 세포 부착을 증가시킨다. 이러한 접착 단백질은 콜라겐이나 피브로넥틴을 포함한다. 그러나, 접착 단백질을 스캐폴드에 연결하는 것은 줄기세포가 조골세포로 분화하여 기능적인 골 조직을 형성하기 위해 적절한 표면 조건을 충분히 제공하지 못한다. 하이드록시아파타이트(HA) 또는 트리칼슘 포스페이트(TCP)와 같은 생체활성 세라믹과 PCL로 이루어진 복합 스캐폴드가 골 재생에 있어서 증가된 생물학적 수용력, 즉 개선된 세포 접착력, 조골세포의 기능 분화, 골 형성을 보여준다. 따라서, 생체활성 세라믹과 PCL의 복합 스캐폴드가 골 조직 공학에 있어 바람직하지만, 이는 초기 세포 반응 및 미분화된 줄기세포에 대해서는 선호되지 않을 수 있다. 이상적으로, 생체모방 환경은 초기 줄기 세포 접착 및 성장, 및 조골세포의 표현형으로 성숙하기 위한 연속적 분화 모두에 적합한 것이 바람직하다.
이에 본 발명자들은, 초기 중간엽 줄기 세포의 부착 및 연속적인 골형성 모두에 적합한 스캐폴드에 대해 연구하던 중, 하이드록시아파타이트로 미네랄화 된 다공성 스캐폴드에 피브로넥틴-오스테오칼신의 결합 단백질을 연결하는 경우 세포 부착성이 증가되고 골형성이 촉진된다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 고분자 스캐폴드 표면에 코팅된 하이드록시아파타이트 및 하이드록시아파타이트와 결합된 피브로넥틴-오스테오칼신 융합단백질을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 a) 고분자 스캐폴드를 제조하는 단계, b) 고분자 스캐폴드를 하이드록시아파타이트로 코팅하는 단계, c) 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질을 합성하는 단계, d) 고분자 스캐폴드를 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질로 코팅하는 단계를 포함하는 스캐폴드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 고분자 스캐폴드, 고분자 스캐폴드 표면에 코팅된 하이드록시아파타이트 및 하이드록시아파타이트와 결합된 피브로넥틴-오스테오칼신 융합단백질을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드를 제공한다.
상기 고분자 스캐폴드의 재료는 스캐폴드가 기능과 역할을 충분히 수행할 때까지 유지된 후 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성을 지녀야 한다. 이에, 바람직한 생분해성 고분자의 재료는 폴리글리롤산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL)등이 있으며 폴리카프로락톤(PCL)이 가장 바람직하다.
상기 피브로넥틴-오스테오칼신 융합단백질은 하이드록시아파타이트에 결합하고 인테그린 매개 세포부착을 촉진할 수 있다. 본 발명에서 "피브로넥틴(fibronectin)"은, 분자량이 약 220 kDa의 단백질로서 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고, RGD모티프를 비롯한 몇 개의 모티프들을 포함하며 다양한 인테그린과 작용하여 세포의 기능을 조절하는 단백질을 의미한다. 세포 표면 부착 수용체인 인테그린과 작용하는 피브로넥틴의 여러 가지 모티프 중 RGD는 세포 부착 모티프로서 9번째~10번째 타입Ⅲ 반복 단위에 존재한다. 본 발명의 피브로넥틴 도메인은 피브로넥틴의 9번째~10번째 타입Ⅲ 반복 단위이고 RGD 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 피브로넥틴도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 "오스테오칼신(osteocalcin)"은 감마-카르복실글루타민산(γ-carboxylglutamate: Gla) 잔기를 2-3개 포함하며 분자량 약 5,900 Da의 비타민 K의존성 칼슘 결합 비콜라겐성 단백질로서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 뼈 속의 오스테오칼신은 국소 무기질화 조절을 하거나 뼈와 체액간의 Ca2+의 움직임을 제어하는 등 뼈의 대사에 있어서 중요한 생리적 역할을 한다. 오스테오칼신은 조골세포에서 합성된 후 세포 내에서 비타민 K 의존성 탈탄산효소(carboxylase)에 의해 Gla화된다. Gla화된 오스테오칼신(Gla-OC)은 뼈 속의 히드록시아파타이트(hydroxyapatite,HA)와 결합하여 뼈 기질에 축적되어 뼈 형성에 관여하고 Gla화 되지 않은 오스테오칼신(Glu-OC)은 뼈 기질과의 친화성이 약하여 혈액으로 방출되어 뼈흡수의 지표가 된다. 오스테오칼신은 히드록시아파타이트에 대한 높은 친화도를 가지며, 본 발명의 오스테오칼신 도메인은 히드록시아파타이트(HA)에 결합하는 18-95 아미노산 부위를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 오스테오칼신 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 융합 단백질은 히드록시아파타이트(HA)에 결합하여 인테그린 매개세포 부착을 촉진하는 기능을 하고, 더욱 상세하게는 치아 및 뼈 무기질 성분에 조골세포 부착 및 유지를 촉진시키고, 조골세포의 분화를 증진시킨다. 본 발명의 융합 단백질은 피브로넥틴 도메인의 C 말단에 오스테오칼신 도메인이 연결된 구조 또는 피브로넥틴 도메인의 N 말단에 오스테오칼신 도메인이 연결된 구조일 수 있다. 바람직하게는, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진다. 상기 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질의 대표적인 예는 대한민국 특허공개번호 제10-2012-0057429호에 기재되어 있으며, 본 발명의 참조로서 포함된다.
또한, 상기과제를 해결하기 위해 본 발명은 a) 고분자 스캐폴드를 제조하는 단계, b) 고분자 스캐폴드를 하이드록시아파타이트로 코팅하는 단계, c) 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질을 합성하는 단계, d) 고분자 스캐폴드를 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질로 코팅하는 단계를 포함하는 스캐폴드의 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 a)는 고분자 스캐폴드를 제조하는 단계이다. 이때 사용되는 고분자 스캐폴드는 폴리글리롤산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL)등으로 이루어 질 수 있으며 폴리카프로락톤(PCL)이 가장 바람직하고, 제조된 고분자 스캐폴드는 조절된 크기와 배열의 기공을 가진 3차원 구조를 가진다.
상기 단계 b)는 고분자 스캐폴드를 하이드록시아파타이트로 코팅하는 단계이다. 상기 코팅에 의해 고분자 스캐폴드와 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질의 접착력이 증가하게 된다.
상기 단계 b)는 가) 스캐폴드를 CaCl2 및 Na2HPO4 용액에 교대로 침지시키는 단계, 나) 미네랄화 용액으로 35℃에서 1일 내지 10일동안 처리하는 단계로 이루어진다.
단계 가)는 스캐폴드를 CaCl2 및 Na2HPO4 용액에 교대로 침지시켜 CaP 핵 생성을 유도하는 단계이다. 이때, CaCl2 및 Na2HPO4 용액으로의 침지에 앞서 부드럽게 교반되는 NaOH에 침지시켜 활성화 시키는 것이 바람직하다. 남아있는 잔여물을 제거하기 위해 증류수로 깨끗이 세척하고 스캐폴드를 CaCl2 및 Na2HPO4 용액에 교대로 침지시킨다. 이때, 상기 CaCl2 및 NaHPO4 용액의 농도는 10 mM 내지 1000 mM 인것이 바람직하다.
단계 나)는 미네랄화 용액에서 고분자 스캐폴드를 처리하여 고분자 스캐폴드에 하이드록시아파타이트를 형성하는 단계이다.
이때 사용되는 미네랄화 용액은 Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, HCO3 -, HPO4 2-, SO4 2-를 포함하는 유사체액이다. 바람직하게는, 상기 미네랄화 용액은 Na+ 213.0 mM, K+ 7.5 mM, Mg2+ 2.25 mM, Ca2+ 3.75 mM, Cl- 221.7 mM, HCO3 - 6.3 mM, HPO4 2- 1.5 mM 및 SO4 2- 0.75 mM 을 포함하는 1.5mM의 유사체액이다.
단계 나)의 미네랄화 용액의 온도는 35℃, 침지시간은 1일 내지 10일인 것이 바람직하다. 미네랄화 용액의 온도가 35℃ 보다 낮거나 높은 경우, 체온과의 온도 차이가 커서 반응이 일어나기 위한 적절한 환경이 제공되지 못한다.
상기 단계 c)는 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질을 합성하는 단계이다. 이때 피브로넥틴 도메인 및 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합 단백질은 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 각 도메인을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 인프레임(in frame)으로 연결하여 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 클로닝하여 발현시킬 수 있다.
상기 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인헨서 같은 발현 조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
발현벡터는 통상의 모든 발현 벡터를 다 사용할 수 있다. 숙주 세포에 따라 서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 본 발명의 구체예에서, 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함한 발현 벡터로서 pBAC/His-FNⅢ9-10/OC를 제조하였다.
본 발명의 벡터는 융합단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "태그(tag)"란 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 말하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수 있고, Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그 및 스트랩타비딘 태그 등 에피톱 태그일 수도 있다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상적으로 약 8개 내지 50개의 아미노산 잔기를 가지는데, 본 발명에서는 6개의 히스티딘 태그를 사용하였다.
상기 단계 d)는 PBS(phosphate buffered saline) 안의 피브로넥틴-오스테오칼신 용액에 스캐폴드를 침지시켜, 고분자 스캐폴드에 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 고분자를 연결하는 단계이다. 이때, PBS 용액 중 피브로넥틴-오스테오칼신의 농도는 100 ng/ml 내지 100 ㎍/ml인것이 바람직하다.
또한, 스캐폴드의 용액 중 침지시간은 8시간 내지 24시간인 것이 바람직하다. 침지시간이 8시간보다 짧은 경우, 충분한 양의 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 고분자가 스캐폴드에 결합되지 못하고, 침지시간이 24시간보다 긴 경우, 이미 포화되어 더 이상의 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 고분자가 스캐폴드에 결합되지 못하므로 비효율적이다.
본 발명은 고분자 스캐폴드 표면에 코팅된 하이드록시아파타이트 및 하이드록시아파타이트와 결합된 피브로넥틴-오스테오칼신 융합단백질을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드 및 그 제조방법을 제공하며, 이는 조골세포의 부착 및 유지를 촉진시키고, 조골세포의 분화를 향상시켜 골 조직 공학 및 재생의학에 유용하게 적용할 수 있다.
도 1은, 본 발명에 따른 PCL 스캐폴드의 구조를 대략적으로 도시한 그림이다.
도 2는, 침지시간에 따라 PCL 스캐폴드에 결합된 FN-OCN 융합 단백질의 양을 나타내는 신호 세기의 그래프이다.
도 3은, FN-OCN 융합 단백질이 연결된 PCL 스캐폴드에 대한 MSCs 부착 정도를 나타내는 그래프이다.
도 4는, FN-OCN이 결합된 스캐폴드에서 각 마커 OPN, OCN, BSP의 골형성 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 쥐 골수의 중간엽 줄기세포(MSCs) 분리 및 배양
스프래그 다우리(Sprague-Dawley) 쥐의 경골 및 대퇴골의 골수로부터 MSCs 를 분리하였다. 동물에 관여된 모든 프로토콜은 단국대학교의 동물 윤리 위원회의 가이드라인에 따라 행하였다. 타입Ⅰ 콜라겐 0.1%와 디스파아제(dispase)II 0.2%를 포함하는 Hank's Balanced Salt Solution(HBBS)에서 경골 및 대퇴콜의 골수를 뽑아냈다. 1500 rpm의 원심분리기와 효소 용액을 사용하여 단핵세포를 수득하였다. 두 개의 평행한 배양 접시에 2×103/cm2 농도로 세포를 배치하였다(하나는 프로테움 분석용, 다른 하나는 배양용). 10%의 우태아혈청(FBS; Hyclone, Logan UT), 2 mM l-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 및 100 mL/mL 스트렙토마이신(모두 St. Louis의 Sigma-Aldrich 사로부터 구입)이 보충된 a-Minimal Essential Medium(a-MEM; WelGene, DaeGu, Korea)로 이루어진 일반적 성장배지에서, 37℃의 온도, 5% CO2를 포함하는 습기찬 공기에서 7일동안 배양하였다. 실험에는 2~3번 계대배양된 세포를 사용하였다.
실시예 2. PCL 스캐폴드의 로봇식 분사 및 HA 미네랄화.
50℃에서 아세톤에 PCL(MW = 80,000, Sigma-Aldrich)을 용해시켜 PCL 용액(PCL/acetone = 25 wt.%)을 제조하였다. Ez-ROBO3 robocasting machine (Iwashita, Japan)을 사용하여 3차원 구조의 PCL 스캐폴드를 제조하였다. 구체적으로, 용액을 시린지에 첨가하고 히팅 자켓을 이용하여 50℃로 유지하였다. 그 후, 용액을 force-controlled plunger를 이용한 금속노즐로 주입하여 질량 흐름 속도를 조절하였다. 부분적으로 조절된 단위가 작동하여 일정한 속도의 움직임으로 2차원 구조의 파이버 분산 경로를 유도하였다. 2D 파이버를 다층으로 적층하여, 조절된 기공크기와 기하학 구조를 가진 3D 다공성 스캐폴드를 생성하였다. 그 후, 파이버를 차가운 에탄올에 침지시켜 PCL 용액을 효과적으로 고체화하였다. 그 후, 스캐폴드를 50℃로 열처리 하여, 파이버를 접촉 융합시켰다.
스캐폴드의 미네랄화를 위하여, 부드럽게 교반되는 1N NaOH 스캐폴드를 침지시켜 표면을 활성화하고 증류수로 세척하였다. 그 후, 스캐폴드를 교대로 150 mM CaCl2 및 150 mM Na2HPO4 용액에 담구어 칼슘 포스페이트 핵 생성을 유도하였다. 교대 침지 과정 사이에, 스캐폴드를 깨끗이 세척하였다. CaP 핵이 생성된 스캐폴드를 미네랄화 용액(1.5 x simulated body fluid, 1.5 mM SBF (213.0 mM Na+, 7.5 mM K+, 2.25 mM Mg2+, 3.75 mM Ca2+, 221.7 mM Cl-, 6.3 mM HCO3 -, 1.5 mM HPO4 2- 및 0.75 mM SO4 2-))으로 37℃에서 7일까지 추가로 처리하였다.
실시예 3. FN-OCN 융합 단백질의 제작, 발현 및 정제
특정 세포 바인딩 서열 RGD를 포함하는 인간 피브로넥틴(FNⅢ9-10)의 9~10번째 타입Ⅲ 도메인을 인식하기 위해 PCR 프라이머를 하기와 같이 제작하였다. FNⅢ9-10 정방향 프라이머, 5'- CTCGAGCAACAATCAACAGTTTC-3'(FNⅢ9-10의 N-말단앞에 SacⅠ제한 사이트 도입), FNⅢ9-10 역방향 프라이머, 5'- CTCGAGTGGTTTGTCAATTTC-3' (FNⅢ9-10의 COOH-말단에 SacⅠ제한 사이트 포함). PCR을 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 100㎍/ml 젤라틴, 0.2mM dNTPs, 1.25 유닛의 taq polymerase(iNtRON) 및 역방향, 정방향 프라이머 각 50 pmol을 포함하는 30㎕ 반응 용액에서 수행하였다. PCR은 55℃에서 1분 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장, 94℃에서 1분 동안 변성으로 수행하였다. 30회 반복수행 후, 상기 증폭된 PCR 산물을 제한효소 SacⅠ로 절단하였다. 절단 후, PCR 산물을 pBAD/His-OC 벡터의 SacⅠ 위치에 연결하여, 구조물 pBAD/His-FNⅢ9-10/OC를 생성하였다.
재조합 FNⅢ9-10/OC의 발현을 위해, Escherichia　coli TOP10 세포를 LB-Amp 배지에서 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. A600 = 0.6에 도달했을 때, 전사 유도물질 L-아라비노스의 0.02%(w/v)로 전사 유도를 개시하였다. 3시간 후에, 원심분리기로 박테리아를 펠렛화하였고, 용해분리하고 초음파처리하였다. 14,000 x g에서 30분간 냉장 원심분리기에서 원심분리하여 용해된 추출물을 준비하고, 상등액은 새로운 튜브에 옮겼다.
헥사히스티딘 태그를 결합하여(단백질의 아미노말단에 위치), 니켈-나이트릴로트라이아세트산(Ni-NTA) 레진 컬럼(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 초음파처리된 박테리아 상등액으로부터 분리된 조단백질을 정제하였다. 재조합 단백질의 정제 정도는 변성조건하에 10%(v/v) 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 용해된 단백질의 쿠마시 블루염색(Coomassie bule staining)으로 확인하였다
실시예 4. 미네랄화된 PCL 스캐폴드에 FN-OCN 융합 단백질 연결
PCL 스캐폴드의 표면에 생성된 미네랄 HA상은 OCN에 대하여 높은 결합 친화성을 가진다. 그러므로, 도 1에 도시된 바와 같이, 미네랄화된 PCL 스캐폴드에 FN-OCN을 연결하였다. 최적의 코팅 시간을 결정하기 위해, FN-OCN 용액을 phosphate buffered saline(PBS) 중 1 ㎍/ml의 농도로 준비하였다. PCL-HA 스캐폴드를 상온에서 각각 2,4,8,16 시간동안 용액에 침지시켰다. 각 시간마다 샘플을 PBS로 세척하고, 5분 동안 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 고정시켰다. immunolabelling에 의해, 표면에 결합된 FN-OCN의 양을 측정하였다. 스캐폴드를 상온에서 1시간 동안 토끼 항-OCN 항체(rabbit anti-OCN antibody)로 배양시켰다. PBS로 여러 번 세척한 후, 형광 신호 발생을 위해 두 번째 항체, goat anti-rabbit Rhod labeled antibody를 적용하였다. LSM700 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 FN-OCN이 코팅된 PCL-HA 스캐폴드의 라벨링 세기를 측정하였다. 붉은색 형광 신호의 세기로 PCL-HA 표면에 코팅된 FN-OCN의 상대적 양을 계산하였다. 그 결과, 8시간 이상 코팅한 경우 형광강도의 세기가 포화됨을 알 수 있었다.(도 2)
실시예 5. 중간엽 줄기세포(MSCs)의 접착력 평가
배양된 MSCs를 트립신처리에 의해 수확하고, 세척하고, 표준성장배지에 1 x 105/ml의 농도르 재-현탁시켰다. 세포 함유 배지의 100 μl 부분을 각 스캐폴드에 장착하고 다양한 시간 동안 배양하여 세포를 접착시켰다. 스캐폴드에 성공적으로 접착된 세포의 양을 계산하기 위하여, 각 시간마다 접착되지 않은 모든 세포를 모으고 히머사이타미터(hemocytometer)를 이용하여 계산하였다. 접착된 세포의 양은 비접착된 세포의 양의 반대로 판단하였다.
그 결과, FN-OCN이 결합된 스캐폴드가 결합되지 않은 스캐폴드에 비해 MSC 접촉량이 많으며, 8시간 후에는 약 80~90%의 세포가 스캐폴드에 부착됨을 확인하였다.(도 3)
실시예 6. 유전자 발현의 RT-PCR 분석
21일 동안 배양한 후, 세포를 트립신처리로 수확하고, 세척하고, 원심분리로 펠렛화하고, 사용하기 전까지 -80℃에서 저장하였다. 전체 RNA는 RNeasy mini kit 74104 RNA isolation kit(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 각각의 세포 펠렛으로부터 분리하였다. RNA 샘플(1μg)을 제조사의 프로토콜에 따라 Quantitect RT kit(Qiagen)을 사용하여 40μl 반응(reaction)에서 cDNA로 반대로 전사하였다. 반응은 5분 동안 95℃에서 진행하였다. 반대로 전사된 효소를 포함하지 않는 유사한 반응 혼합물을 제조하고, 오염된 유전체 DNA가 없음을 보여주기 위한 견본으로 사용하였다. 마이크로리터의 cDNA를 쥐 오스테오폰틴 및 오스테오칼신의 구체적인 프라이머와 pre-mixed PCR kit(Bioneer, Daejon, Korea)를 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 반응을 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 75℃에서 30초로 40회 반복수행하였고, 각각의 cDNA마다 세번 반복하였다. 각 샘플의 대표적인 PCR 밴드를 나타내었다. (도 4)

Claims (16)

  1. 고분자 스캐폴드;
    상기 고분자 스캐폴드 표면에 코팅된 하이드록시아파타이트; 및
    상기 하이드록시아파타이트와 결합된 피브로넥틴-오스테오칼신 융합단백질을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고분자 스캐폴드는 폴리글리롤산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL)중 어느 하나로 이루어진 뼈 재생용 스캐폴드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 피브로넥틴-오스테오칼신 융합단백질은 하이드록시아파타이트에 결합하고 인테그린 매개 세포부착을 촉진하는 뼈 재생용 스캐폴드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 피브로넥틴의 도메인은 피브로넥틴의 9 내지 10번째 타입Ⅲ 반복단위이고 RGD서열을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 오스테오칼신의 도메인은 하이드록시아파타이트에 결합하는 18-95 아미노산 부위를 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 피브로넥틴의 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 뼈 재생용 스캐폴드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 오스테오칼신의 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 뼈 재생용 스캐폴드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 피브로넥틴-오스테오칼신의 융합단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 뼈 재생용 스캐폴드.
  9. a) 고분자 스캐폴드를 제조하는 단계;
    b) 고분자 스캐폴드를 하이드록시아파타이트로 코팅하는 단계;
    c) 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질을 합성하는 단계;
    d) 고분자 스캐폴드를 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질로 코팅하는 단계를 포함하는 스캐폴드의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단계 b)의 코팅 단계는
    가) 상기 스캐폴드를 CaCl2 및 Na2HPO4 용액에 교대로 침지시키는 단계
    나) 미네랄화 용액으로 35℃에서 1일 내지 10일 동안 처리하는 단계
    로 이루어지는 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 가)의 CaCl2 및 NaHPO4 용액의 농도는 10 mM 내지 1000 mM인 제조 방법.
  12. 제10항에 있어서, 단계 나)의 미네랄화 용액은 Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, HCO3 -, HPO4 2-. SO4 2-를 포함하는 유사체액인 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 미네랄화 용액은 Na+ 213.0 mM, K+ 7.5 mM, Mg2+ 2.25 mM, Ca2+ 3.75 mM, Cl- 221.7 mM, HCO3 - 6.3 mM, HPO4 2- 1.5 mM 및 SO4 2- 0.75 mM 을 포함하는 1.5mM의 유사체액인 제조 방법.
  14. 제9항에 있어서, 단계 d)는 PBS(phosphate buffered saline) 안의 피브로넥틴-오스테오칼신 용액에 스캐폴드를 침지시켜 코팅하는 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 피브로넥틴-오스테오칼신 용액의 농도는 100 ng/ml 내지 100 ㎍/ml인 제조 방법.
  16. 제14항에 있어서, 침지시간은 8시간 내지 24시간인 제조 방법.
PCT/KR2013/005462 2012-06-20 2013-06-20 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질이 코팅된 뼈 재생용 스캐폴드 WO2013191492A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2012-0066411 2012-06-20
KR1020120066411A KR101317515B1 (ko) 2012-06-20 2012-06-20 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질이 코팅된 뼈 재생용 스캐폴드

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013191492A1 true WO2013191492A1 (ko) 2013-12-27

Family

ID=49638282

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/005462 WO2013191492A1 (ko) 2012-06-20 2013-06-20 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질이 코팅된 뼈 재생용 스캐폴드

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101317515B1 (ko)
WO (1) WO2013191492A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160061533A (ko) * 2014-11-21 2016-06-01 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물
CN114832164A (zh) * 2022-05-07 2022-08-02 山东大学 一种3d打印双相磷酸钙支架及其制备方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190111612A (ko) 2018-03-23 2019-10-02 강릉원주대학교산학협력단 오스테오칼신을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100044363A (ko) * 2008-10-22 2010-04-30 단국대학교 산학협력단 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 및 이의 제조방법
KR20120017225A (ko) * 2010-08-18 2012-02-28 한국기계연구원 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법
KR20120057429A (ko) * 2010-11-26 2012-06-05 단국대학교 산학협력단 치아 및 뼈 재생을 위한 융합 단백질

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100044363A (ko) * 2008-10-22 2010-04-30 단국대학교 산학협력단 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 및 이의 제조방법
KR20120017225A (ko) * 2010-08-18 2012-02-28 한국기계연구원 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법
KR20120057429A (ko) * 2010-11-26 2012-06-05 단국대학교 산학협력단 치아 및 뼈 재생을 위한 융합 단백질

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM, MI GYEONG, THESIS FOR MASTER'S DEGREE, December 2010 (2010-12-01), DANKOOK UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL, BIO- NANO SCIENCE MAJOR *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160061533A (ko) * 2014-11-21 2016-06-01 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR101649801B1 (ko) * 2014-11-21 2016-08-22 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물
CN114832164A (zh) * 2022-05-07 2022-08-02 山东大学 一种3d打印双相磷酸钙支架及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101317515B1 (ko) 2013-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Georgopoulou et al. Chitosan/gelatin scaffolds support bone regeneration
Schacht et al. Processing of recombinant spider silk proteins into tailor-made materials for biomaterials applications
US9597359B2 (en) Production of dentin, cementum and enamel by cells
EP2344631B1 (en) Method and device for activating stem cells
Oliveira et al. Autonomous osteogenic differentiation of hASCs encapsulated in methacrylated gellan-gum hydrogels
CN104884468B (zh) 附加有胶原结合性分子的改造层粘连蛋白及其利用
KR101265492B1 (ko) 줄기세포를 혈관세포로 분화시키는 방법 및 이를 이용한 생체 내 혈관신생 유도
CN105408361B (zh) 硫酸乙酰肝素
CN101248171A (zh) 通过组织非特异性碱性磷酸酶分离成人多潜能细胞
KR101094445B1 (ko) 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 섬유아세포 성장인자의 재조합 단백질 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법
Lee et al. Tethering bi-functional protein onto mineralized polymer scaffolds to regulate mesenchymal stem cell behaviors for bone regeneration
Zafar et al. Silk fibroin/alumina nanoparticle scaffold using for osteogenic differentiation of rabbit adipose-derived stem cells
KR102053895B1 (ko) 세포의 부착, 증식과 분화를 촉진하는 신규 펩티드 fnin3 및 이의 용도
JP6856618B2 (ja) 接着性ペプチド
CN107249599A (zh) 硫酸乙酰肝素用于皮肤修复和/或再生
WO2013191492A1 (ko) 피브로넥틴-오스테오칼신 융합 단백질이 코팅된 뼈 재생용 스캐폴드
Akdere et al. Boron mediated 2D and 3D cultures of adipose derived mesenchymal stem cells
CN109563474B (zh) 整合的细胞
Peters et al. Engineered mosaic protein polymers; a simple route to multifunctional biomaterials
CN109937251B (zh) 由多能干细胞向体细胞的分化诱导方法
JP6125494B2 (ja) 温度感受性の生物活性なバイオポリマーおよび細胞を回収する関連する方法
KR20120057429A (ko) 치아 및 뼈 재생을 위한 융합 단백질
JP2017043547A (ja) ポリペプチドを結合した成長因子及びその利用
KR101972988B1 (ko) 피불린-1 단백질을 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물
KR101654878B1 (ko) SMOC1의 EC(extracellular calcium binding) 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 조골세포 분화 촉진용 조성물 및 그의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13807009

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13807009

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1