KR20160061533A - 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 제3형 피브로넥틴 유래 9/10번 도메인을 포함하여, 세포부착, 세포증식 및 골형성 분화를 현저하게 촉진시킬 수 있는 효과를 나타내는 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현용 벡터, 상기 벡터가 도입되어, 상기 융합단백질을 생산할 수 있는 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 생산하는 방법, 상기 융합 단백질을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 융합 단백질을 포함하는 골 또는 치아 재생용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질은 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 포함하여, 세포부착, 세포증식 및 골형성 분화와 같은 다양한 세포활성을 더욱 활성화시킬 수 있음을 확인하였으므로, 골질환의 예방 또는 치료 뿐만 아니라, 손상된 골 또는 치아를 재생하는데에도 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물{Fusion protein comprising collagen binding domain, osteocalcin domain and fibronectin domain, and pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 제3형 피브로넥틴 유래 9/10번 도메인을 포함하여, 세포부착, 세포증식 및 골형성 분화를 현저하게 촉진시킬 수 있는 효과를 나타내는 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현용 벡터, 상기 벡터가 도입되어, 상기 융합단백질을 생산할 수 있는 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 생산하는 방법, 상기 융합 단백질을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 융합 단백질을 포함하는 골 또는 치아 재생용 약학 조성물에 관한 것이다.

대량 골 결손의 치료는 현대 의학에서 중요한 과제이다. 재생 의학 및 조직공학에 대한 연구가 계속되고 있으며, 줄기세포 기반의 치료가 임상에서의 골 재생을 위해 고려되고 있다. 이는 부분적 골 결손이 이미 상당히 진행되었거나 조직이 노화된 환자에게서 초기 조골세포 획득이 어렵다는 문제를 극복하였다. 중간엽 줄기세포(MSCs)는 뼈 형성 단백질과 같은 적절한 영양분이 공급되는 경우 조골세포의 표현형으로 바로 분화한다.

골 조직 공학에 적용하기 위한 스캐폴드는, 숙주 조직의 최적화된 조직 형성을 위해 핵심적인 몇 가지 조건을 만족해야 한다. 이 조건은 세포 친화력, 영양분과 산소가 투과하기 위한 적절한 공극률, 세포 부착 및 분화를 촉진시키기 위한 계면 활성 등을 포함한다. 또한, 이상적으로 스캐폴드는 연속적으로 분해되어 숙주세포에 의해 대체되어야 한다. 콜라겐과 같은 세포외 기질(ECM)분자가 적절한 스캐폴드 재료이다. 그러나, 폴리유산(PLA), 폴리카프로락톤(PCL) 및 이의 공중합체와 같은 합성 분해성 플라스틱은 자연발생 물질에 비하여 정확한 가공이 가능하고, 보다 경제적이어서 임상적으로 널리 사용할 수 있다는 장점이 있다.

그러나, 합성 생체 고분자는 낮은 골 생체활성, 높은 소수성, 생체 단백질 및 세포에 대한 낮은 친화력을 가지기 때문에, 합성 생체고분자 스캐폴드는 골 조직 공학에 적합하도록 최적화 될 필요가 있다. 따라서, 생체활성을 증가시키기 위해 친수성 물질을 이용한 표면 개질과 같은 여러 시도가 있어왔다. 접착 단백질은 합성 고분자의 표면에 공유결합 하여 초기 세포 부착을 증가시킨다. 이러한 접착 단백질은 콜라겐이나 피브로넥틴을 포함한다. 그러나, 접착 단백질을 스캐폴드에 연결하는 것은 줄기세포가 조골세포로 분화하여 기능적인 골 조직을 형성하기 위해 적절한 표면 조건을 충분히 제공하지 못한다. 하이드록시아파타이트(HA) 또는 트리칼슘 포스페이트(TCP)와 같은 생체활성 세라믹과 PCL로 이루어진 복합 스캐폴드가 골 재생에 있어서 증가된 생물학적 수용력, 즉 개선된 세포 접착력, 조골세포의 기능 분화, 골 형성을 보여준다. 따라서, 생체활성 세라믹과 PCL의 복합 스캐폴드가 골 조직 공학에 있어 바람직하지만, 이는 초기 세포 반응 및 미분화된 줄기세포에 대해서는 선호되지 않을 수 있다. 이상적으로, 생체모방 환경은 초기 줄기 세포 접착 및 성장, 및 조골세포의 표현형으로 성숙하기 위한 연속적 분화 모두에 적합한 것이 바람직하다.

이에 초기 중간엽 줄기 세포의 부착 및 연속적인 골형성 모두에 적합한 스캐폴드를 개발하기 위하여, 다양한 연구가 수행되어 왔다. 예를 들어, 한국특허공개 제2012-0036217호에는 합성 생체고분자에 젤라틴-아파타이트를 혼합하여 얻은 혼합물을 전기방사함으로써 젤라틴-아파타이트-생체고분자로 구성된 복합체 골 조직 재생용 나노섬유를 제조하는 방법이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2012-0036218호에는 반대 상으로서 캠핀을 사용하는 상분리법을 이용하여 나노섬유상 구조의 생체 고분자를 제조하는 방법과, 반대 상으로서 캠핀을 사용하는 상분리법을 이용하고 일반적인 스캐폴딩 방법을 적용함으로써 나노섬유상 구조를 가지는 3D 스캐폴드를 제조하는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2012-0057429호에는 피브로넥틴 도메인 및 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합 단백질, 및 상기 단백질을 포함하는 뼈 또는 치아 재생용 조성물 및 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국특허등록 제1317515호에는 고분자 스캐폴드 표면에 코팅된 하이드록시아파타이트 및 하이드록시아파타이트와 결합된 피브로넥틴-오스테오칼신 융합단백질을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드 및 이의 제조 방법이 개시되어 있다.

특히, RGD 서열을 포함하는 피브로넥틴 도메인과 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합 단백질의 경우, 이에 포함된 오스테오칼신으로 인하여, 피브로넥틴 자체가 갖는 세포결합 활성이 현저하게 증진되었음을 확인하였다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 피브로넥틴 도메인과 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합 단백질이 나타내는 세포결합 활성 등의 세포활성이 보다 향상된 융합단백질을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 오스테오칼신 도메인 및 제3형 피브로넥틴 유래 9/10번 도메인에 더불어 콜라겐 결합도메인을 포함하는 융합 단백질을 콜라겐이 결합된 지지체와 함께 사용하여 줄기세포를 배양할 경우, 줄기세포의 부착, 증식 및 골분화유도 등의 향상된 세포활성을 나타내도록 유도함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터가 도입되어, 상기 융합단백질을 생산할 수 있는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질, 콜라겐이 결합된 지지체 및 줄기세포를 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질, 콜라겐이 결합된 지지체 및 줄기세포를 포함하는 골 또는 치아 재생용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 조골세포에 대한 결합 및 유지를 촉진시키고, 조골세포의 분화를 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는, RGD 서열을 포함하는 피브로넥틴 도메인과 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합 단백질을 개발한 바 있다(한국특허공개 제2012-0057429호). 상기 개발된 융합 단백질이 나타내는 세포결합 활성 등의 세포활성이 보다 향상된 융합단백질을 개발하고자, 상기 융합단백질에 부가하기 위한 다양한 융합파트너에 대한 연구를 수행하던 중, 콜라겐 결합 도메인(collagen binding domain, CBD)에 주목하게 되었다. 본 발명자들은 상기 CBD가 콜라겐이 결합된 지지체와 결합하여, 줄기세포를 보다 안정적으로 배양하는 매개체로서 사용할 수 있을 것으로 예상하고, 상기 CBD, 오스테오칼신 도메인 및 제3형 피브로넥틴 유래 9/10번 도메인을 포함하는 융합단백질을 제작하고, 상기 융합단백질을 종래의 콜라겐 결합 지지체에 부가하여 상기 융합단백질에 포함된 CBD를 사용하여 상기 지지체에 결합된 콜라겐에 연결된 형태의 새로운 지지체를 제작하였다. 상기 제작된 새로운 지지체를 사용하여 줄기세포를 배양하고 그의 특성을 분석한 결과, 상기 지지체를 통해 배양된 줄기세포는 부착능, 증식능 및 골세포분화능의 측면에서 종래의 지지체에 배양된 줄기세포 보다도 현저히 향상된 효과를 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 세포부착, 세포증식 및 골형성 분화를 현저하게 촉진시킬 수 있는 효과를 나타내어, 골질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 골 또는 치아 재생용 약학 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 제3형 피브로넥틴 유래 9/10번 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

본 발명의 용어 "콜라겐 결합 도메인(collagen binding domain, CBD)"이란, 콜라겐의 전체 또는 일부영역과 결합할 수 있는 펩타이드 단편으로 구성된 도메인을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 콜라겐 결합 도메인은 특별히 제한되지 않으나, 콜라겐분해효소(collagenase)로 부터 유래된 콜라겐 결합 도메인이 될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 용어 "오스테오칼신(osteocalcin, OC)"이란, 감마-카르복실글루타민산(γ-carboxylglutamate: Gla) 잔기를 2-3 개 포함하고, 95개의 아미노산 서열로 구성된, 분자량 약 5.9kDa의 비타민 K 의존성 칼슘 결합 비콜라겐성 단백질을 의미한다. 생리적으로, 상기 오스테오칼신은 골조직의 석회화를 국소적으로 조절하거나 또는 골에 침적되는 칼슘이온의 흡수와 방출을 조절하는 역할을 수행한다. 상기 오스테오칼신의 구체적인 아미노산 서열 또는 그를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보는 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스(GenBank Accession No. NM_199173, NM_031368.4, NP_954642, NP_112736.3 등)에서 얻을 수 있는데, 예를 들어, 오스테오칼신은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 OC의 전체 아미노산 서열 또는 부분 아미노산 서열을 사용하여, 융합단백질을 구성할 수 있다. 이때, OC의 부분 아미노산 서열은 이를 포함하는 융합단백질이 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열 중에서, 19 내지 95번 아미노산으로 구성된 서열이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "피브로넥틴(fibronectin, FN)"이란, 고등 동물의 세포 표면, 혈액, 세포외기질 등에 존재하고, 220 내지 250kDa의 분자량을 갖는 당단백질을 의미하는데, 이황화결합으로 인하여 이량체 또는 사량체의 형태로 존재한다. 상기 FN은 주로 간에서 합성되어 혈액으로 분비되는 이중합체 형태의 혈장 피브로넥틴과 섬유아세포에서 합성되어 세포외기질 또는 세포막으로 분비되는 사중합체 형태의 세포성 피브로넥틴으로 구별된다. 상기 FN을 코딩하는 유전자는 한 종류이지만, 상기 유전자는 RNA 스플라이싱이 발생하는 지역이 3개 부위에서 발생할 수 있어, 가능한 조합으로는 약 20종류의 단백질을 합성할 수 있다. 피브로넥틴을 코딩하는 유전자는 구조적으로 6개의 제1형 피브로넥틴 도메인, 3개의 제2형 피브로넥틴 도메인, 제3형 피브로넥틴 1 내지 14번 도메인, IIICS 도메인, 제3형 피브로넥틴 15번 도메인 및 3개의 제1형 피브로넥틴 도메인으로 구성된다. 상기 구성요소 중에서 제3형 피브로넥틴의 9번째 및 10번 도메인은 RGD 및 PHSRN의 특이적 영역을 포함하여 세포의 표면에 존재하는 인테그린(ανβ3 및 α5β1)과의 결합을 통해, 결합시키는 역할을 수행할 수 있다고 알려져 있다. 기능적인 측면에서 FN은 세포결합, 세포증식, 세포형태 조절, 세포이동, 손상회복 등의 다양한 생리적 작용에 관여한다고 알려져 있다. 상기 피브로넥틴의 구체적인 아미노산 서열 또는 그를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보는 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스(GenBank Accession No. NP_002017, NP_001263337, NM_002026, NM_001276408 등)에서 얻을 수 있는데, 예를 들어, 피브로넥틴은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제3형 피브로넥틴 유래 9/10번(FNⅢ_9-10) 도메인(서열번호 4)을 사용하여 융합단백질을 구성할 수 있다.

본 발명의 용어 "융합단백질"이란, 상기 CBD, OC 도메인 및 및 FNⅢ_9-10 도메인을 포함하도록 인위적으로 합성된 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 융합단백질에 포함된 CBD, OC 도메인 및 및 FNⅢ_9-10 도메인의 배열 순서는 상기 융합단백질이 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 CBD, OC 도메인 및 및 FNⅢ_9-10 도메인의 순서로 구성될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

또한, 상기 각 도메인은 상호 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다. 상기 링커는 상기 융합단백질이 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 잘구부러지는(flexible) 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 상기 링커를 코딩하는 핵산을 각 도메인을 코딩하는 핵산 사이에 인프레임(in frame)으로 연결하여 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 발현시킬 수 있다.

아울러, 상기 융합단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

끝으로, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 구성하는 각 도메인의 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 도메인을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 융합단백질 (CBD)OC-FN을 콜라겐과 함께 PCL 지지체에 가하여 상기 융합단백질이 결합된 지지체를 제작하고(실시예 2-3), 이의 특성을 확인한 결과, 지지체의 표면에 상기 융합단백질이 적절하게 분산되어 결합된 섬유상의 콜라겐이 네트워크 형상을 구성하고(도 2a 내지 2d), 지지체당 평균 120 mg의 단백질이 결합되며(도 2e), 상기 지지체를 PBS에 침지하고 28일 동안 방치할 경우, 콜라겐은 약 60% 이상이 손실되지만(도 2g), 상기 융합단백질은 손실되지 않음을(도 2h) 확인하였다.

또한, 상기 융합단백질이 결합된 지지체에 줄기세포를 접종하고 배양할 경우, 줄기세포의 부착능이 향상되고(도 3a), 줄기세포가 확산되어 세포의 둘레길이 및 면적이 증가함(도 3b 및 3c)을 확인하였다. 또한, 줄기세포의 증식활성(도 4a) 및 증식율(도 4b)이 향상되고, 상기 지지체를 완전히 덥도록 증식하면서 ECM 단백질이 대량으로 분비되어, 세포골격을 형성하는 F-액틴의 수준이 증가함(도 4c 내지 4e)을 확인하였다.

아울러, 상기 융합단백질이 결합된 지지체에 줄기세포를 접종하고 골분화를 유도할 경우, 배양초기의 ALP 활성이 증가하고(도 5a), 무기질화 수준이 향상되며(도 5b), 상기 무기질에는 칼슘과 인이 대량으로 포함되어 있음(도 5c)을 확인하였다.

끝으로, 골손상 랫트 모델을 이용하여, 손상된 두개골 부위에 상기 융합단백질이 결합되고 줄기세포가 접종된 지지체를 이식한 다음(도 6a) 이의 치료효과를 micro-CT(μCT) 분석(도 6b), 손상조직의 물리적 특성 분석(도 6c) 및 조직학적 분석(도 6d)을 통해 평가한 결과, 상기 융합단백질의 함량이 증가할 수록 향상된 골손상 치료효과를 나타냄을 확인하였다.

상기 연구결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 융합단백질이 결합된 지지체에 줄기세포를 접종하면, 상기 줄기세포는 인테그린(ανβ3 및 α5β1)을 통해 FN의 부착성 모듈인 III의 9-10 도메인 서열을 특이적으로 인식하여 상기 융합단백질과 빠르게 결합하고, 이를 통하여 콜라겐이 결합된 지지체에 부착된 다음, 세포골격을 확장시켜서 이러한 구조를 유지시킨다. 이같이, 줄기세포가 접종되고 융합단백질이 결합된 지지체를 체내의 손상된 골부위에 이식하면, 줄기세포가 증식된 후, 골분화가 유도되면서, BSP 및 OPN과 같은 다양한 ECM 분자를 분비하는 동안, 상기 융합단백질에 포함된 OC 도메인은 줄기세포의 골분화, 특히, 배지 또는 생체내 체액에 존재하는 칼슘의 흡착 및 축적에 의해 마지막 무기질화 단계를 진행함으로써, 결과적으로는 골형성에 기여할 수 있을 것으로 분석되었다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 세포부착, 세포증식 및 골분화 유도활성의 측면에서 우수한 활성을 나타내는 신규한 단백질임을 알 수 있었다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 상기 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열이 될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 융합단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 상기 폴리뉴클레오티드를 6개의 히스티딘 태그가 포함된 pBAD 벡터에 도입하여 발현벡터 pBAD-HisA-CBD-OC-FNIII9-10를 제작하였다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 융합단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주역시 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 대장균 TOP10 균주를 숙주로서 사용하였다.

상기 형질전환체는 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 융합단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 융합단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 D형 젖산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다. 대체로 D형 젖산은 배양 배지 중으로 배출되지만, 경우에 따라서는 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

아울러, 배양물로부터 상기 융합단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 융합단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 융합단백질인 (CBD)OC-FN을 코딩하는 유전자를 증폭시키고, pBAD-HisA-OC-FNIII9-10 벡터에 도입하여, 발현벡터 pBAD-HisA-CBD-OC-FNIII9-10을 제작한 다음, 상기 제작된 발현벡터 pBAD-HisA-CBD-OC-FNIII9-10을 대장균 TOP10에 도입하여 형질전환시킴으로써, 상기 융합단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 형질전환체를 제작하고, 상기 제작된 형질전환체를 배양하였으며, 이로부터 생산된 융합단백질을 Ni-NTA 컬럼 크로마토 그래피에 적용하여 정제함으로써, 목적하는 융합단백질 (CBD)OC-FN을 수득하였다(도 1a). 상기 수득한 융합단백질을 대상으로, 전기영동 분석 및 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과, 상기 융합단백질은 약 50 kDa의 크기를 갖는 단백질임을 확인하였다(도 1b).

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질, 콜라겐이 결합된 지지체 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 골 또는 치아 재생용 약학 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 세포부착, 세포증식 및 골분화 유도활성의 측면에서 우수한 활성을 나타내는 신규한 단백질임을 확인하였으므로, 상기 융합단백질을 콜라겐이 결합된 지지체 및 줄기세포와 함께 사용할 경우, 골조직의 퇴화, 손실, 붕괴 등의 증상이 수반되는 다양한 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 손상된 골 또는 치아를 재생시키기 위한 약학 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 용어 "지지체(scaffold)"란, 세포배양시 안정적인 세포의 접종 및 배양을 수행할 수 있도록, 세포가 부착되는 기반성분을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 지지체는 콜라겐과 결합되어 세포에 대한 결합친화성을 갖는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 PCL(Poly(e-caprolactone)), PLA(polylactic acid), PGA(Poly-γ-glutamic acid), PHB(polyhydroxybutyrate), PHV(Poly(hydroxy valerate)), PDO(poly(P-dioxanone)) 또는 이들의 공중합체 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multpotent stem cells)로 분류할 수 있고, 줄기세포의 유래조직에 따라 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 역분화줄기세포로 분류할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 본 발명에서 제공하는 나노구조가 형성된 배양지지체에 접종되어 분화될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 성체로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 골수, 지방조직, 치아, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 태아로부터 유래한 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간의 지방조직 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 용어 "골질환"이란, 조골세포 및 파골세포의 불균형으로 인해 유발되어 골조직의 장애를 초래하거나 또는 골조직을 파괴하는 질환을 의미하는데, 상기 골 관련 질환은 본 발명에서 제공하는 융합단백질에 의하여 증상이 예방, 개선, 경감 또는 치료될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 성장기 발육부진, 골절, 구루병(rickets), 골연화증(osteomalacia), 척추측만증(scoliosis), 골반변형(pelvic deformity), 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 갑상선기능항진증(hyperparathyroidism), 파제트병(Paget disease), 전이성 골암(metastatic bone cancers) 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "골질환의 예방 또는 치료"란 상기 골 관련 질환의 발병을 예방하거나 또는 상기 질환의 발병에 의한 증세를 호전하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하는데, 골질환 증상의 예방, 감소, 개선, 그 증상의 고통 경감, 골질환 발생율 감소 또는 치료결과를 증가시키는 환자의 어떠한 다른 변화를 모두 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 이식제 및 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 이식제 또는 외용제의 형태로 제형화될 때, 사용되는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물에 포함된 상기 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 10 내지 90 중량%, 보다 바람직하게는 30 내지 85 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물의 환부에 손상부위를 회복시킬 수 있는 수준으로 이식되거나 또는 투여될 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 골 손상이 발생된 개체에 이식 또는 투여하는 단계를 포함하는 골질환을 예방 또는 치료하거나, 손상된 골 또는 치아를 재생하는 방법을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있으므로, 상기 조성물은 골질환을 예방 또는 치료하거나, 또는 손상된 골 또는 치아를 재생하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "개체"란 골질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 골 손상을 회복 또는 재생시킬 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 이식 또는 주사방법 등의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 골질환을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여시에는 위산에 의하여 상기 융합단백질이 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 융합단백질은 콜라겐 결합도메인, 오스테오칼신 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 포함하여, 세포부착, 세포증식 및 골형성 분화와 같은 다양한 세포활성을 더욱 활성화시킬 수 있음을 확인하였으므로, 골질환의 예방 또는 치료 뿐만 아니라, 손상된 골 또는 치아를 재생하는데에도 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1a는 융합단백질 (CBD)OC-FN의 3차원 구조를 나타내는 개략도이다.
도 1b는 제작된 약 50kDa의 (CBD)OC-FN를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 1c는 콜라겐의 농도 및 반응온도에 따른 탁도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 서로 다른 함량의 (CBD)OC-FN을 포함하는 Col-(CBD)OC-FN 용액의 탁도변화를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체에 포함된 섬유상 콜라겐에 의해 형성된 네트워크 형상을 고해상도 SEM을 사용하여 수행한 결과를 나타내는 사진으로서, 우측상단의 창사진은 Sirius Red 염색분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2b는 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체의 표면을 SEM을 사용하여 촬영한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2c는 고해상도 SEM을 사용하여 PCL 지지체에 형성된 섬유상 구조를 나타내는 사진이다.
도 2d는 콜라겐 구조에 대한 (CBD)OC-FN의 분산수준을 분석한 결과를 나타내는 TEM 사진으로서, 검은색 점은 (CBD)OC-FN를 나타낸다.
도 2e는 융합단백질 (CBD)OC-FN의 처리여부에 따른 지지체에 결합된 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2f는 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체의 제작시 지지체와 용액상에 존재하는 (CBD)OC-FN의 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2g는 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체에서 시간의 경과에 따른 콜라겐의 손실량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2h는 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체에서 시간의 경과에 따른 지지체에 잔류하는 (CBD)OC-FN의 함량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 각각의 PCL 지지체에 대한 줄기세포(rMSCs)의 부착성을 배양시간의 경과에 따라 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 각각의 PCL 지지체에서 배양된 줄기세포(rMSCs)에서 발현된 세포부착에 관여하는 세포골격 단백질의 일종인 빈쿨린(vinculin)을 면역염색하여 세포형태의 변화를 배양시간의 경과에 따라 비교한 결과를 나타내는 사진으로서, 녹색은 면역염색된 빈쿨린을 나타내고, 적색은 F-액틴을 나타내며, 청색은 핵을 나타낸다.
도 3c는 각각의 PCL 지지체에서 배양된 줄기세포(rMSCs)의 확산에 따른 세포의 둘레길이 및 세포면적의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 각각의 PCL 지지체에서 14일 동안 배양된 줄기세포(rMSCs)의 증식활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 각각의 PCL 지지체에서 14일 동안 배양된 줄기세포(rMSCs)의 증식율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 1OCFN에서 14일 동안 배양된 rMSCs를 SEM으로 촬영한 사진이다.
도 4d는 1OCFN에서 14일 동안 배양된 rMSCs의 절단부를 SEM으로 촬영한 사진이다.
도 4e는 1OCFN에서 14일 동안 배양된 rMSCs을 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5a는 각각의 PCL 지지체에서 28일 동안 골분화가 유도된 줄기세포(rMSCs)를 대상으로 배양시간의 경과에 따른 ALP의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 각각의 PCL 지지체에서 골분화가 유도된 줄기세포(rMSCs)를 대상으로 골분화유도시간의 경과에 따른 무기질화의 수준을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 5c는 1㎍의 (CBD)OC-FN가 결합된 지지체(1OCFN)에서 28일 동안 골분화가 유도된 rMSCs에서 생성된 무기질을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 두개골이 손상된 랫트 모델(좌측) 및 손상부에 각 지지체에서 배양된 줄기세포를 이식한 랫트모델(우측)의 두개골 손상부위를 나타내는 사진이다.
도 6b는 두개골 손상부에 각각의 지지체에서 배양된 줄기세포를 이식하고 6주 경과된 랫트의 두개골 손상부위를 대상으로 micro-CT (μCT) 분석을 수행한 결과를 나타내는 Micro-CT 3D 재구성 사진이다.
도 6c는 두개골 손상부에 각각의 지지체에서 배양된 줄기세포를 이식하고 6주 경과된 랫트의 두개골 손상부위를 대상으로 두개골 조직의 부피, 골의 표면적 및 골표면의 밀도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6d는 두개골 손상부에 각각의 지지체에서 배양된 줄기세포를 이식하고 6주 경과된 랫트의 두개골 손상부위를 대상으로 조직학적 검사를 수행한 결과를 나타내는 현미경사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 융합단백질 ( CBD ) OC - FN 의 생산 및 정제

(CBD)OC-FN을 생성하기 위하여, OC-FN DNA를 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 증폭시켰다. 이때, PCR은 30 사이클(55 ℃ 1분, 72 ℃ 2분 및 94 ℃ 1분)의 조건으로 수행하였다.

CBD-OC-Sac F: 5'-GGCGAGCTCACCAAAAAAACCCTGCGTACCCTCGAGTACCTGTATCAATGGCTG-3'(서열번호 7)

the pBAD-His R: 5'-ACGGCGTTTCACTTCTGAGT-3'(서열번호 8)

증폭된 PCR 산물을 제한효소 SacI/HindIIII로 절단하고, pBAD-HisA-OC-FNIII9-10 벡터에 도입하여, 발현벡터 pBAD-HisA-CBD-OC-FNIII9-10를 제작하였다. 상기 제작된 발현벡터를 TOP10 대장균에 도입하고, 도입된 대장균은 암피실린이 포함된 LB 배지에 접종한 후, 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양물의 흡광도(A600)가 0.6이 될 때, L-아라비노스(0.02% w/v)를 처리하고, 20 ℃에서 6시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 원심분리(6,000 x g, 10분)하여 침전된 균체를 수득하고, 파쇄한 다음, 초음파를 처리하여 세포파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 세포파쇄물을 원심분리(14,000 x g, 30분)하여 얻어진 상등액을 니켈-니트릴로트리아세트산 레진(nickel-nitrilotriacetic acid resin, Invitrogen)이 충진된 컬럼크로마토그래피에 적용하여 (CBD)OC-FN을 제작하고(도 1a), 상기 제작된 (CBD)OC-FN을 웨스턴블럿 분석을 통해 검증하였다.

도 1a는 융합단백질 (CBD)OC-FN의 3차원 구조를 나타내는 개략도이고, 도 1b는 제작된 약 50kDa의 (CBD)OC-FN를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.

상기 도 1a에서 보듯이 본 발명에서 제공하는 재조합 융합단백질 (CBD)OC-FN은 FN 도메인, OC 도메인 및 CBD로 구성되는데, 상기 FN(fibronectin) 도메인은 제3형의 9번째 및 10번 도메인으로서 RGD 및 PHSRN의 특이적 영역을 포함하여 세포의 표면에 존재하는 인테그린(ανβ3 및 α5β1)과의 결합을 통해, 세포와 상기 융합단백질을 결합시키는 역할을 수행하고; 상기 OC(osteocalcin) 도메인은 카르복시글루타메이트 잔기를 고정시키고, 칼슘이온에 대한 친화성을 나타내며; CBD(collagen binding domain)는 세포외 기질의 주요 구성성분 중의 하나로서, 콜라겐에 대한 친화성을 나타내어 이에 포함된 TKKTLRT 펩타이드를 통해 콜라겐과 결합하는 효과를 나타낸다.

따라서, 상기 융합단백질은 콜라겐과 세포간의 결합을 매개하는 매개체로서의 역할을 수행하도록 설계되었다.

실시예 2: 재조합 융합단백질 ( CBD ) OC - FN 이 결합된 PCL 지지체의 제작

실시예 2-1: PCL 지지체의 제작

RD(Ez-ROBO3, Iwashita)를 사용하여 다공성 PCL 지지체를 제작하였다. 대략적으로, PCL(MW 80,000, Sigma-Aldrich)을 아세톤에 용해시키고, 50 ℃에서 분쇄하여 PCL 슬러리를 수득하였다. 상기 수득한 슬러리를 온도-자켓을 사용하여 반응온도를 유지하는 에탄올에 주사바늘(0.33 mm)을 통해 사출하고 고형화시켜서 PCL 섬유를 수득하고, 상기 수득한 PCL 섬유를 이용하여 9 x 9 mm의 단층구조를 6층으로 중첩시켜서, PCL 지지체를 제작하였다.

실시예 2-2: 콜라겐이 결합된 PCL 지지체의 제작

제1형 콜라겐 용액을 다양한 농도를 나타내도록 PBS로 희석하고 25 ℃ 또는 37 ℃에서 반응시켜서 섬유상의 콜라겐을 포함하는 현탁액을 수득하였다. 상기 수득한 현탁액에 포함된 섬유상 콜라겐의 수준은 탁도시험(turbidity test)을 통해 확인하였다. 이때, 흡광도는 313 nm에서 측정하였다(도 1c)

도 1c는 콜라겐의 농도 및 반응온도에 따른 탁도의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 1c에서 보듯이, 10% 콜라겐을 25 ℃에서 반응시킬 경우, 가장 효과적으로 섬유상의 콜라겐을 제작할 수 있음을 확인하였다.

한편, 상기 제작된 PCL 지지체를 수화시키고, 가교제(EDC-NHS)를 처리한 다음, 상기 수득한 콜라겐 현탁액을 가하고 실온에서 반응시켜서, 콜라겐이 결합된 PCL 지지체를 제작하였다.

실시예 2-3: 콜라겐+( CBD ) OC - FN 이 결합된 PCL 지지체의 제작

상기 결정된 10% 콜라겐을 25 ℃에서 반응시켜서 섬유상의 콜라겐을 제작하면서, 상기 정제된 (CBD)OC-FN을 서로 다른 농도로 가하여, Col-(CBD)OC-FN 용액을 수득하였다. 대략적으로, (CBD)OC-FN과 콜라겐을 1:100, 1:200 또는 1:1000(w/w)로 혼합하여 Col-(CBD)OC-FN 용액을 수득하고, 상기 Col-(CBD)OC-FN 용액의 탁도를 분석하였다(도 1d).

도 1d는 서로 다른 함량의 (CBD)OC-FN을 포함하는 Col-(CBD)OC-FN 용액의 탁도변화를 나타내는 그래프이다. 도 1d에서 보듯이, 탁도의 변화는 모든 시료에서 유사하게 나타났고, (CBD)OC-FN의 농도가 증가함에 따라, 다소 감소하는 양상을 나타냄을 확인하였다.

상기 제작된 PCL 지지체를 수화시키고, 가교제(EDC-NHS)를 처리한 다음, 상기 수득한 Col-(CBD)OC-FN 용액을 가하고 실온에서 반응시켜서, 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체를 제작하였다.

실시예 3: 콜라겐+( CBD ) OC - FN 이 결합된 PCL 지지체의 특성 분석

실시예 3-1: SEM 분석

상기 실시예 2-3에서 제작된 PCL 지지체를 대상으로 SEM(scanning electron microscopy, JSM-6510, JEOL, Japan)과 고해상도 SEM(HR-SEM; MIRAII LMH, TESCAN, Czech Republic)을 사용한 SEM 분석을 수행하고, 상기 제작된 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체에 포함된 콜라겐의 함량을 확인하기 위하여 Sirius Red 염색분석을 수행하였다.(도 2a 내지 2c).

도 2a는 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체에 포함된 섬유상 콜라겐에 의해 형성된 네트워크 형상을 고해상도 SEM을 사용하여 수행한 결과를 나타내는 사진으로서, 우측상단의 창사진은 Sirius Red 염색분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이고, 도 2b는 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체의 표면을 SEM을 사용하여 촬영한 결과를 나타내는 사진이며, 도 2c는 고해상도 SEM을 사용하여 PCL 지지체에 형성된 섬유상 구조를 나타내는 사진이다. 도 2a 내지 2c에서 보듯이, 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체는 지지체의 표면에 네트워크 형상의 구조를 형성하여 결합됨을 확인하였다.

실시예 3-2: TEM 분석

콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체에 포함된 콜라겐 구조에 대한 (CBD)OC-FN의 분산수준을 평가하기 위하여, Cu-grit 상에 Col-(CBD)OC-FN 용액을 점적한 후, 항-OC 항체가 결합된 Au 나노입자(ab154873, abcam)로 면역염색하고, TEM으로 평가하였다(도 2d).

도 2d는 콜라겐 구조에 대한 (CBD)OC-FN의 분산수준을 분석한 결과를 나타내는 TEM 사진으로서, 검은색 점은 (CBD)OC-FN를 나타낸다. 도 2d에서 보듯이, 약 20 nm²의 단일 점이 50/㎟개 존재하며, 전체적으로 콜라겐 섬유에서 (CBD)OC-FN가 적절하게 분산되었음을 확인하였다.

실시예 3-3: 단백질 결합량 분석

실시예 2-2 및 2-3에서 제작된 각각의 PCL 지지체를 대상으로, 각 지지체에 결합된 단백질의 결합량을 비교하였다. 구체적으로, 피크린산에 포화용해시킨 Direct red 80 (365548, Sigma)을 각 지지체에 가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 각 지지체를 0.01 N HCl로 세척하고, 200 ㎕의 0.5 M NaOH를 가하여 지지체에 결합된 단백질을 포함하는 용출액을 수득하였다. 상기 수득한 용출액을 대상으로 540nm에서 흡광도를 측정하고, 표준곡선을 사용하여 정량하였다(도 2e).

도 2e는 융합단백질 (CBD)OC-FN의 처리여부에 따른 지지체에 결합된 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2e에서 보듯이, 융합단백질 (CBD)OC-FN의 처리여부와 상관없이 지지체당 평균 120 mg의 단백질이 결합되었는데, 이는 최초 사용된 콜라겐(200 ㎍)의 약 65%에 해당함을 확인하였다.

아울러, 실시예 2-3에서 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체를 제작할 경우, Col-(CBD)OC-FN 용액과 지지체를 반응시킨 후, 지지체에 결합된 (CBD)OC-FN의 함량과 용액에 잔류하는 (CBD)OC-FN의 함량을 비교하였다(도 2f).

도 2f는 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체의 제작시 지지체와 용액상에 존재하는 (CBD)OC-FN의 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2f에서 보듯이, 용액보다는 지지체에 더 많은 (CBD)OC-FN가 포함되어 있음을 확인하였다.

실시예 3-4: 안정성 분석

상기 실시예 2-3에서 제작된 PCL 지지체를 PBS에 침지하고 28일 동안 보존하면서, 지지체에 잔류하는 콜라겐과 (CBD)OC-FN 함량을 비교하였다.

먼저, 콜라겐의 함량은 콜라겐 항체를 사용한 ELISA 방법을 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 측정된 흡광도를 표준곡선에 적용하여 산출하였다(도 2g).

도 2g는 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체에서 시간의 경과에 따른 콜라겐의 손실량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2g에서 보듯이, 콜라겐 분해가 경시적으로 확인되었는데, 1주 경과된 시점에서는 약 30%가 손실되고, 2주 경과된 시점에서는 45% 이상이 손실되며, 4주 경과된 시점에서는 60%이상이 손실됨을 확인하였다.

다음으로. (CBD)OC-FN 함량은 상기 지지체에 항-OC 항체를 가하고(1:200, SC-365797, Santacruz), 비특이적 결합을 억제한 다음, 항-마우스-Alexa Fluor 555 (1:500, A21422, Invitrogen)를 사용하여 형광면역염색을 수행하고, 이를 공초점 현미경(CLSM, Carl Zeiss 510L, Germany)을 사용하여 형광사진을 촬영하였다. 촬영된 사진의 형광강도를 image J program (NIH)을 사용하여 측정하였다(도 2h).

도 2h는 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체에서 시간의 경과에 따른 지지체에 잔류하는 (CBD)OC-FN의 함량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2h에서 보듯이, 시간이 경과하여도 지지체에 결합된 (CBD)OC-FN의 함량은 감소되지 않음을 알 수 있었다.

실시예 4: 콜라겐+( CBD ) OC - FN 이 결합된 PCL 지지체를 이용한 줄기세포의 배양

실시예 4-1: 랫트유래 줄기세포( rMSCs )의 준비

4주령 랫트의 대퇴골과 경골로부터 골수를 회수하고, 이에 제1형 콜라게나제를 처리하였다. 상기 반응물을 여과 및 원심분리한 다음, 세포를 회수하고, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 α-MEM 배지에 접종하였으며, 5% CO₂ 및 37 ℃에서 배양하였다. 부착되지 않은 세포를 제거하고, 부착된 세포를 포화될 때까지 배양한 다음, 3세대 계대배양물을 이후의 연구에 사용하였다.

실시예 4-2: 콜라겐+( CBD ) OC - FN 이 결합된 PCL 지지체에 대한 랫트유래 줄기세포( rMSCs )의 접종

1㎍의 (CBD)OC-FN을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-3의 방법으로 콜라겐+(CBD)OC-FN이 결합된 PCL 지지체(1OCFN)를 제작하고, 상기 제작된 지지체를 멸균시킨 다음, 상기 실시예 4-1에서 준비된 rMSCs를 1 x 10⁵ 세포수/100 ㎕의 농도로 상기 지지체에 접종하고, 1시간 동안 배양하였으며, 시료를 48웰 플레이트로 옮기고, 800 ㎕의 배지를 가하였으며, 매일 배지를 교체하면서 배양하였다. 이때, 대조군으로는 상기 실시예 2-1에서 제작된 PCL 지지체(PCL) 및 실시예 2-2에서 제작된 PCL 지지체(Col)에 rMSCs를 접종하여 배양한 것을 사용하였다.

실시예 4-3: 줄기세포 부착능 평가

상기 실시예 4-2에서 배양된 실험군과 각 대조군의 rMSCs가 각각의 지지체에 부착된 수준을 MTS 분석법으로 확인하였다. 대략적으로, 각 지지체에서 2, 4 및 8시간 동안 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 새로운 배양용기에 옮긴다음, 400 ㎕ MTS 용액을 가하고 37 ℃에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 200 ㎕의 반응물을 96웰 플레이트에 옮기고 590 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 3a).

도 3a는 각각의 PCL 지지체에 대한 줄기세포(rMSCs)의 부착성을 배양시간의 경과에 따라 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3a에서 보듯이, PCL로만 구성된 지지체(PCL)보다는 콜라겐이 결합된 지지체(Col)가 줄기세포에 대한 부착능이 우수하고, 상기 Col보다는 1㎍의 (CBD)OC-FN가 결합된 지지체(1OCFN)가 줄기세포에 대한 부착능이 더욱 우수함을 확인하였다.

실시예 4-4: 줄기세포의 형태 평가

상기 실시예 4-2에서 2시간 또는 4시간 동안 배양된 실험군과 각 대조군의 rMSCs에 4% 포르말린을 처리하여 고정시키고, 0.2% Triton X100를 처리하여 세포막을 약화시켰다. 이어, 항-빈쿨린 항체(1:200 dilution, ab18058, abcam)를 1차 항체로 사용하고, FITC(fluorescein isothiocynate)가 표지된 항체(sc-2010, SantaCruz)를 2차 항체로 이용한 면역염색을 수행하여 각 줄기세포의 빈쿨린을 면역형광염색하였다. 아울러, 줄기세포의 핵은 DAPI(P36935, Invitrogen)로 염색하고, F-액틴은 팔로이딘(A22283, Invitrogen)으로 염색한 다음, CLSM으로 형광사진을 촬영하여 데이터를 수득하고, 상기 수득한 데이터의 형광값은 Zen 2009 image program을 사용하여 분석함으로써, 구체적인 세포의 크기를 분석하였다(도 3b).

도 3b는 각각의 PCL 지지체에서 배양된 줄기세포(rMSCs)에서 발현된 세포부착에 관여하는 세포골격 단백질의 일종인 빈쿨린(vinculin)을 면역염색하여 세포형태의 변화를 배양시간의 경과에 따라 비교한 결과를 나타내는 사진으로서, 녹색은 면역염색된 빈쿨린을 나타내고, 적색은 F-액틴을 나타내며, 청색은 핵을 나타낸다. 도 3b에서 보듯이, PCL로만 구성된 지지체(PCL)에서 배양된 줄기세포는 배양시간이 경과하여도 세포의 형태변화가 확인되지 않았으나, 콜라겐이 결합된 지지체(Col) 또는 1㎍의 (CBD)OC-FN가 결합된 지지체(1OCFN)에서 배양된 줄기세포는 배양시간이 경과한 후에는 원래의 세포로부터 형태가 확산되었으며, Col 보다는 1OCFN에서 배양된 줄기세포가 상대적으로 높은 수준의 세포확산을 나타냄을 확인하였다.

이러한 세포의 확장시에 줄기세포의 형태는 불규칙적으로 변화하였으므로, 세포의 확산수준을 비교하기 위하여, 세포의 둘레길이 및 세포의 면적을 비교하였다(도 3c).

도 3c는 각각의 PCL 지지체에서 배양된 줄기세포(rMSCs)의 확산에 따른 세포의 둘레길이 및 세포면적의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3c에서 보듯이, 세포의 둘레길이 및 세포면적 모두, PCL보다는 Col에서 배양된 줄기세포가 높은 수준을 나타내었고, 상기 Col보다는 1OCFN에서 배양된 줄기세포가 높은 수준을 나타내었는데, 구체적으로, PCL에서 배양된 줄기세포 대비, Col 또는 1OCFN에서 배양된 줄기세포의 둘레길이는 각각 약 3.9배 또는 5.2배 높은 수준을 나타내고, 세포면적은 각각 약 4.6배 또는 8.6배 높은 수준을 나타내었으며, Col에서 배양된 줄기세포 대비, 1OCFN에서 배양된 줄기세포의 둘레길이는 약 1.3배 높은 수준을 나타내고, 세포면적은 약 2.8배 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 4-5: 줄기세포의 증식활성 평가

상기 실시예 4-2에서 14일 동안 배양된 실험군과 각 대조군의 rMSCs의 증식활성을 MTS 분석법으로 측정하고, 이를 비교하였다(도 4a).

도 4a는 각각의 PCL 지지체에서 14일 동안 배양된 줄기세포(rMSCs)의 증식활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4a에서 보듯이, 7일 동안 배양된 rMSCs는 PCL로만 구성된 지지체(PCL)보다는 콜라겐이 결합된 지지체(Col) 또는 1㎍의 (CBD)OC-FN가 결합된 지지체(1OCFN)에서 배양된 경우에 보다 높은 수준의 증식활성을 나타내었고, Col 보다는 1OCFN에서 배양된 경우에 보다 높은 수준의 증식활성을 나타냄을 확인하였다. 또한, 7일 내지 14일 동안 배양된 rMSCs는 여전히 PCL보다는 Col 또는 1OCFN에서 배양된 경우에 보다 높은 수준의 증식활성을 나타내었으나, PCL에서 배양된 경우에는 증식수준이 꾸준히 증가한 반면, Col 또는 1OCFN에서 배양된 경우에는 증식활성이 둔화되었고, 1OCFN 보다는 Col에서 배양된 경우에 보다 높은 수준의 증식활성을 나타냄을 확인하였다.

상기 도 4a의 결과를 확인하기 위하여, 각 실험군 및 대조군의 rMSCs의 증식율을 비교하였다(도 4b).

도 4b는 각각의 PCL 지지체에서 14일 동안 배양된 줄기세포(rMSCs)의 증식율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4b에서 보듯이, Col 또는 1OCFN에서 배양된 경우에는 7일 이후에 증식율이 감소하는 반면, PCL에서 배양된 경우에는 7일 이후에 증식율이 급격히 증가함을 확인하여, 상기 도 4a의 결과와 실질적으로 동일한 결과를 확인할 수 있었다.

한편, 1OCFN에서 14일 동안 배양된 rMSCs의 형태를 확인하기 위하여, 상기 배양된 각 rMSCs를 팔로이딘 및 DAPI를 사용하여, F-액틴과 핵을 각각 염색하고, 이의 표면 또는 절단부를 SEM으로 촬영하고(도 4c 및 4d), 공초점 현미경(CLSM)으로 촬영하였다(도 4e).

도 4c는 1OCFN에서 14일 동안 배양된 rMSCs를 SEM으로 촬영한 사진이고, 도 4d는 1OCFN에서 14일 동안 배양된 rMSCs의 절단부를 SEM으로 촬영한 사진이며, 도 4e는 1OCFN에서 14일 동안 배양된 rMSCs을 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.

도 4c 내지 4e에서 보듯이, 1OCFN에서 14일 동안 배양된 rMSCs는 1OCFN의 표면을 완전히 덮도록 증식하였음을 확인하였다. 또한, 공초점 현미경으로 확인한 결과, 팔로이딘으로 염색된 F-액틴이 현저하게 증가함을 확인하였으므로, rMSCs의 배양과정 중에 rMSCs로부터 ECM 단백질이 대량으로 분비되어, 세포골격을 형성하는 F-액틴의 수준이 증가하였을 것으로 분석되었다.

실시예 5: 콜라겐+( CBD ) OC - FN 이 결합된 PCL 지지체를 이용한 줄기세포의 골분화 유도

실시예 5-1: ALP ( Alkaline phosphatase )의 활성평가

FN은 줄기세포의 골분화를 촉진한다고 알려져 있으므로, 1㎍의 (CBD)OC-FN가 결합된 지지체(1OCFN)에서 배양된 줄기세포(rMSCs)를 대상으로, 초기 골분화 마커로 알려진 ALP(Alkaline phosphatase)의 활성을 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4-2에서 14일 동안 배양된 실험군과 각 대조군의 rMSCs에 골분화배지(sodium ascorbic acid, sodium beta-glycero phosphate 및 dexamethasone을 포함하는 배지)를 가하고, 28일 동안 배양하였다. 상기 배양 중 7일, 14일 또는 21일이 경과된 시점에서 시료를 채취하고, 채취된 시료에 포함된 세포를 RIPA 완충액으로 용해시켰으며, 용해물에 기질액(20 mM p-nitro phenol phosphate, 1.5 M 2-amino-2methyl-1-propanol 및 1.0 mM MgCl₂)을 처리하고, 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 시료를 얼음에서 냉각시키고, 100 ㎕ 1 M NaOH를 가하여 반응을 종료시켰다. 405 nm에서 흡광도를 측정하고, 니트로페놀 표준곡선을 이용하여 ALP을 정량하였다(도 5a).

도 5a는 각각의 PCL 지지체에서 28일 동안 골분화가 유도된 줄기세포(rMSCs)를 대상으로 배양시간의 경과에 따른 ALP의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5a에서 보듯이, 7일 및 14일 동안 골분화가 유도된 rMSCs는 PCL로만 구성된 지지체(PCL)보다는 콜라겐이 결합된 지지체(Col) 또는 1㎍의 (CBD)OC-FN가 결합된 지지체(1OCFN)에서 배양된 경우에 보다 높은 ALP 수준을 나타내었고, Col 보다는 1OCFN에서 배양된 경우에 보다 높은 ALP 수준을 나타냄을 확인하였다. 한편, 21일 동안 배양된 rMSCs는 PCL에서 배양된 경우에는 ALP 수준이 다소 증가하였으나, Col 또는 1OCFN에서 배양된 경우에는 ALP 수준이 급격하게 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과는 ALP가 초기 골분화마커이기 때문에, 14일 이상 배양된 rMSC는 ALP의 활성이 감소하고, 골분화의 후기 및 무기질화에 필요한 다른 ECM이 분비되기 때문에 나타난 것으로 분석되었다.

실시예 5-2: 무기질화 수준 평가

상기 실시예 5-1에서 14일, 21일 또는 28일 동안 골분화가 유도된 rMSCs를 대상으로, Alizarin red S (ARS) 염색을 수행하여, 무기질화 수준을 평가하였다.

먼저, Alizarin red S 염료를 증류수에 용해시키고, 이에 10% (v/v) 암모늄 히드록사이드를 적정하여 pH를 4.2 - 4.4로 조절하였다. 상기 염료액을 28일 동안 골분화가 유도된 rMSCs에 가하고, 5분 동안 반응시킨 다음, 시료를 물로세척하고 건조시켰다. 상기 건조된 시료에 400 ㎕의 10% CPC(cetylpyridinium chloride)를 가하여, 염색된 칼슘을 추출하고, 추출된 칼슘시료를 대상으로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 무기질화의 수준을 평가하였다(도 5b).

도 5b는 각각의 PCL 지지체에서 골분화가 유도된 줄기세포(rMSCs)를 대상으로 골분화유도시간의 경과에 따른 무기질화의 수준을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 5b에서 보듯이, PCL로만 구성된 지지체(PCL)보다는 콜라겐이 결합된 지지체(Col)에서 배양된 줄기세포의 무기질화 수준이 우수하고, 상기 Col보다는 1㎍의 (CBD)OC-FN가 결합된 지지체(1OCFN)에서 배양된 줄기세포의 무기질화 수준이 더욱 우수함을 확인하였다.

실시예 5-3: 무기질 분석

상기 실시예 5-1에서 1㎍의 (CBD)OC-FN가 결합된 지지체(1OCFN)에서 28일 동안 골분화가 유도된 rMSCs를 소결시켜서, 무기질 성분을 수득하고, 상기 수득한 무기질 성분을 EDA가 구비된 TEM을 사용하여 분석하였다(도 5c).

도 5c는 1㎍의 (CBD)OC-FN가 결합된 지지체(1OCFN)에서 28일 동안 골분화가 유도된 rMSCs에서 생성된 무기질을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5c에서 보듯이, 1㎍의 (CBD)OC-FN가 결합된 지지체(1OCFN)에서 28일 동안 골분화가 유도된 rMSCs에서는 칼슘과 인이 높은 수준으로 포함되어 있고, Ca/P의 비율은 1.507임을 확인하였다.

상술한 결과로부터, 본 발명에서 제공하는 지지체를 사용할 경우 줄기세포의 골분화과정에서 칼슘과 인이 특이적으로 축적됨을 알 수 있었는데, 이는 골분화유도시에 줄기세포로부터 ECM 성분이 대량으로 분비되고, 분비된 ECM에 의하여 칼슘 및 인의 축적이 유도되기 때문인 것으로 분석되었다. 또한, 본 발명에서 제공하는 지지체에 결합된 융합단백질인 (CBD)OC-FN에 포함된 OC 도메인이 칼슘의 축적을 추가로 유도하기 때문에, 인 보다 칼슘의 함량이 많은 것으로 분석되었다.

실시예 6: 콜라겐+( CBD ) OC - FN 이 결합된 PCL 지지체의 골손상 치료효과 평가

실시예 6-1: 골손상 랫트 모델의 제작

10주령의 수컷 Sprague-Dawley 랫트에 케타민(80 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)의 혼합물을 근육주사하여 마취시켰다. 마취된 랫트의 두개골의 모발을 제거하고, 포비돈과 70% 에탄올을 처리하여 소독하였다. 소독된 두개골의 선형 시상정중 피부를 절개하고,

피부와 골막의 전체 두께 플랩을 증가시켜서 천공하기에 적절한 영역을 확보한 다음, 두개골의 중앙부위에 두개의 직경 5mm의 손상을 유발시켰다.

상기 손상된 부위에 PCL로만 구성된 지지체에서 배양된 줄기세포(PCL), 콜라겐이 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(Col), 1㎍의 콜라겐+(CBD)OC-FN가 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(1OCFN), 10㎍의 콜라겐+(CBD)OC-FN가 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(1O0CFN) 또는 100㎍의 콜라겐+(CBD)OC-FN가 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(100OCFN)를 각각 이식하고, 피하조직을 흡수성 물질(4-0 Vicryl, Ethicon, Norderstedt, Germany)로 봉합하고, 피부절개부를 비흡수성 물질(4-0Dafilon, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany)로 봉합하였다(도 6a). 이때, 대조군(-)으로는 골손상후 아무런 줄기세포도 이식하지 않은 마우스를 사용하였다.

도 6a는 두개골이 손상된 랫트 모델(좌측) 및 손상부에 각 지지체에서 배양된 줄기세포를 이식한 랫트모델(우측)의 두개골 손상부위를 나타내는 사진이다.

실시예 6-2: micro - CT (μ CT ) 분석

상기 실시예 6-1에서 제작된 골손상 랫트 모델을 6주 동안 사육하면서, 사육기간 동안 감염, 염증 및 외관적으로 악성 반응을 모니터링하였다. 6주가 경과한 후, 상기 각 랫트를 희생시키고, 두개골 주위의 피부를 적출하고, 절개된 조직과 그의 주변 주직을 회수하였다. 회수된 조직을 10% 중화된 포르말린으로 실온에서 24시간 동안 고정시키고, micro-CT(μCT) 분석을 수행하였다(도 6b). 이때, micro-CT 분석은 다음과 같이 수행하였다: μCT 사진으로 시료를 촬영하고, 신규한 골형성의 정량사진 분석을 위하여 손상 봉합부를 측정하였다. 회수된 시료를 12.56 ㎛의 카메라 픽셀과, 1 mm 알루미늄 필터, 0.5°의 회전스텝, 180°의 회전각을 갖는 평균 프레임의 조건으로 μCT scanner(Skyscan 1176; Skyscan, Aartselaar, Belgium)로 스캔하였다. 튜브전압은 65 kV이고, 전류는 385 μA이며, 노출시간은 279 ms의 조건으로 X-ray 촬영을 수행하였다. 관심영역에서 새로이 생성된 골의 부피비율을 측정하고, 3D μCT 사진을 컴퓨터 분석프로그램(CTAn, Skyscan) 을 사용하여 재구성하였다.

도 6b는 두개골 손상부에 각각의 지지체에서 배양된 줄기세포를 이식하고 6주 경과된 랫트의 두개골 손상부위를 대상으로 micro-CT (μCT) 분석을 수행한 결과를 나타내는 Micro-CT 3D 재구성 사진이다. 도 6b에서 보듯이, 대조군(-)에서는 골손상 부위가 회복되지 않았으나, PCL로만 구성된 지지체에서 배양된 줄기세포(PCL)가 이식된 경우에는 손상된 부위가 일부 회복되었으며, 콜라겐이 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(Col)가 이식된 경우에는 PCL 보다도 높은 수준으로 손상된 부위가 회복되었고, 1㎍의 콜라겐+(CBD)OC-FN가 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(1OCFN)가 이식된 경우에는 Col 보다도 높은 수준으로 손상된 부위가 회복되었으며, 10㎍의 콜라겐+(CBD)OC-FN가 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(1O0CFN)가 이식된 경우에는 1OCFN 보다도 높은 수준으로 손상된 부위가 회복되었고, 100㎍의 콜라겐+(CBD)OC-FN가 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(100OCFN)가 이식된 경우에는 10OCFN 보다도 높은 수준으로 손상된 부위가 회복됨을 확인하였다.

실시예 6-3: 손상조직의 물리적 특성 분석

상기 실시예 6-2에서 회수한 두개골 조직의 부피, 골의 표면적 및 골표면의 밀도를 각각 측정하고 비교하였다(도 6c).

도 6c는 두개골 손상부에 각각의 지지체에서 배양된 줄기세포를 이식하고 6주 경과된 랫트의 두개골 손상부위를 대상으로 두개골 조직의 부피, 골의 표면적 및 골표면의 밀도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6c에서 보듯이, 모든 비교항목에서

PCL로만 구성된 지지체에서 배양된 줄기세포(PCL)가 이식된 경우보다는 콜라겐이 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(Col)가 이식된 경우에 높은 수준을 나타내었고, Col이 이식된 경우보다는 OCFN이 이식된 경우에 보다 높은 수준을 나타내었으며, OCFN의 함량이 증가할 수록 보다 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.

다만, 1OCFN가 이식된 경우에는 Col이 이식된 경우보다 전체적으로 낮은 수준으로 손상된 부위가 회복되었는데, 이는 생체내 치료효과를 나타내기 위한 OCFN의 함량이 부족하기 때문인 것으로 분석되었다.

실시예 6-4: 조직학적 분석

상기 실시예 6-2에서 회수한 두개골 조직에 RapidCal™ 용액을 사용하여 두개골 시료로부터 칼슘을 제거하고, 에탄올을 이용하여 탈수시킨 다음, 파라핀으로 포매시켰다. 이를 5㎛의 두께로 절단하여 박편을 수득하고, 이를 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 다음 광학현미경 하에서 40배율로 조직학적 검사를 수행하였다(도 6d).

도 6d는 두개골 손상부에 각각의 지지체에서 배양된 줄기세포를 이식하고 6주 경과된 랫트의 두개골 손상부위를 대상으로 조직학적 검사를 수행한 결과를 나타내는 현미경사진이다. 도 6d에서 보듯이, PCL로만 구성된 지지체에서 배양된 줄기세포(PCL)가 이식된 경우보다는 콜라겐이 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(Col)가 이식된 경우에 손상된 두개골 부위의 골두께가 증가하고, Col이 이식된 경우보다는 OCFN이 이식된 경우에 손상된 두개골 부위의 골두께가 보다 높은 수준으로 증가하였으며, OCFN의 함량이 증가할 수록 보다 손상된 두개골 부위의 골두께가 보다 높은 수준으로 증가함을 확인하였다.

특히, 100㎍의 콜라겐+(CBD)OC-FN가 결합된 지지체에서 배양된 줄기세포(100OCFN)가 이식된 골조직을 확대하여 조직분석을 수행한 결과, 지지체 표면은 새로이 형성된 골과 결합조직의 연계없이 직접적으로 접촉하였고, 100OCFN에서 새로이 형성된 골은 성숙된 형태를 나타내면서 내벽의 골아세포와 밀착하였으며, 라멜라구조의 골을 형성하였고, 일부에서는 느슨한 형태의 골매트릭스를 포함하였는데, 이는 시간의 경과에 따라 재형성과정에 의하여 라멜라성 골로 대체될 수 있는 것으로 분석되었다. 아울러, 골수는 100OCFN이 이식된 경우에만 형성됨을 확인하였다.

상술한 결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 융합단백질이 결합된 지지체에 줄기세포를 접종하면, 상기 줄기세포는 인테그린(ανβ3 및 α5β1)을 통해 FN의 부착성 모듈인 III의 9-10 도메인 서열을 특이적으로 인식하여 상기 융합단백질과 빠르게 결합하고, 이를 통하여 콜라겐이 결합된 지지체에 부착된 다음, 세포골격을 확장시켜서 이러한 구조를 유지시킨다. 이같이, 줄기세포가 접종되고 융합단백질이 결합된 지지체를 체내의 손상된 골부위에 이식하면, 줄기세포가 증식된 후, 골분화가 유도되면서, BSP 및 OPN과 같은 다양한 ECM 분자를 분비하는 동안, 상기 융합단백질에 포함된 OC 도메인은 줄기세포의 골분화, 특히, 배지 또는 생체내 체액에 존재하는 칼슘의 흡착 및 축적에 의해 마지막 무기질화 단계를 진행함으로써, 결과적으로는 골형성에 기여할 수 있을 것으로 분석되었다.

<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Fusion protein comprising collagen binding domain, osteocalcin domain and fibronectin domain, and pharmaceutical composition comprising the same <130> KPA140867-KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant collagen binding domain <400> 1 Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr 1 5 <210> 2 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant osteocalcin <400> 2 Met Arg Thr Leu Ser Leu Leu Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ala Leu Cys 1 5 10 15 Leu Ser Asp Leu Thr Asp Ala Lys Pro Ser Gly Pro Glu Ser Asp Lys 20 25 30 Ala Phe Met Ser Lys Gln Glu Gly Asn Lys Val Val Asn Arg Leu Arg 35 40 45 Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Pro Ser Pro Asp Pro Leu Glu Pro Thr 50 55 60 Arg Glu Gln Cys Glu Leu Asn Pro Ala Cys Asp Glu Leu Ser Asp Gln 65 70 75 80 Tyr Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Lys Arg Ile Tyr Gly Ile Thr Ile 85 90 95 <210> 3 <211> 2328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant fibronectin <400> 3 Lys Ser Lys Arg Gln Ala Gln Gln Met Val Gln Pro Gln Ser Pro Val 1 5 10 15 Ala Val Ser Gln Ser Lys Pro Gly Cys Tyr Asp Asn Gly Lys His Tyr 20 25 30 Gln Ile Asn Gln Gln Trp Glu Arg Thr Tyr Leu Gly Asn Val Leu Val 35 40 45 Cys Thr Cys Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Phe Asn Cys Glu Ser Lys Pro 50 55 60 Glu Ala Glu Glu Thr Cys Phe Asp Lys Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Val Gly Asp Thr Tyr Glu Arg Pro Lys Asp Ser Met Ile Trp Asp Cys 85 90 95 Thr Cys Ile Gly Ala Gly Arg Gly Arg Ile Ser Cys Thr Ile Ala Asn 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Gly Gln Ser Tyr Lys Ile Gly Asp Thr Trp Arg 115 120 125 Arg Pro His Glu Thr Gly Gly Tyr Met Leu Glu Cys Val Cys Leu Gly 130 135 140 Asn Gly Lys Gly Glu Trp Thr Cys Lys Pro Ile Ala Glu Lys Cys Phe 145 150 155 160 Asp His Ala Ala Gly Thr Ser Tyr Val Val Gly Glu Thr Trp Glu Lys 165 170 175 Pro Tyr Gln Gly Trp Met Met Val Asp Cys Thr Cys Leu Gly Glu Gly 180 185 190 Ser Gly Arg Ile Thr Cys Thr Ser Arg Asn Arg 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Asp Val Pro Arg 85 90 95 Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp 100 105 110 Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu 115 120 125 Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys 130 135 140 Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile 145 150 155 160 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys 165 170 175 Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 180 <210> 5 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant fusion protein <400> 5 Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Leu Glu Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly 1 5 10 15 Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Glu Val Cys 20 25 30 Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln 35 40 45 Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val Gly Thr Gly Leu Asp Ser 50 55 60 Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val 65 70 75 80 His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His 85 90 95 His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His 100 105 110 Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr 115 120 125 Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu 130 135 140 Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val 145 150 155 160 Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala 165 170 175 Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn 180 185 190 Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr 195 200 205 Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala 210 215 220 Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile 225 230 235 240 Asn Tyr Arg Thr <210> 6 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of recombinant fusion protein <400> 6 ggtgcggtag ttgatggaga tgggcttgga ggaggcgggg gagtcgccgc ggccggtgac 60 ggcgtagacg gtgatggtgt agtcgacgcc gggcttgagg ccggagatgg tggcggtgga 120 cttggagccg gggacggtga actcctggac gggggagttg ccgccggtct cgccgtaggt 180 gatgcggtag tagcggacgg tgacggcggg ggcgtcccag gagatgagga gggaggtggg 240 ggtggcggcg acgacctcga ggtcgcgggg gacgtcggag acggtggact gctggccgat 300 gaggaggggg gactcctcgc ggccgttgag ggcgacgatg gagacgacgt actcggtgcc 360 gggggtgagg ttggtgaggg tgatggagtt gcgggagtgg gggacgcggt cctcgcgggg 420 gcggccggag aagtgctcgg ggtggtggcg gatgcggtag ccggtgatgg tggcgcgggg 480 ggcgatccag tggacggtga aggagttggc ggtgatgtcg gagaagtcga tgccggtggg 540 ggagtcgagg ccggtgccga cggggccgta gaagcggcgg taggcctcct ggaagccgat 600 gtggtcggcg agctcgtcgc agtcggggtt gagctcgcag acctcgcggc ggggctcgag 660 ggggtcgggg taggggacgg gggcgccgag ccactggtag aggtactcga gggtgcggag 720 ggtcttcttg gt 732 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggcgagctca ccaaaaaaac cctgcgtacc ctcgagtacc tgtatcaatg gctg 54 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acggcgtttc acttctgagt 20

Claims (16)

1. 콜라겐 결합 도메인(collagen binding domain, CBD), 오스테오칼신(osteocalcin, OC) 도메인 및 제3형 피브로넥틴 유래 9/10번(FNⅢ_9-10) 도메인을 포함하는 융합단백질.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 콜라겐 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합단백질.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 오스테오칼신 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합단백질.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 제3형 피브로넥틴 유래 9/10번(FNⅢ_9-10) 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합단백질.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 융합단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합단백질
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 융합단백질은 세포부착, 세포증식 및 골분화 유도활성을 나타내는 것인 융합단백질.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
   
8. 제7항에 있어서,
   서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
   
9. 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
   
10. 제9항의 발현벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체.
    
11. (a) 제10항의 형질전환체를 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,
    (b) 상기 배양물로부터 제1항의 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 제1항의 융합단백질의 생산방법.
    
12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합단백질, 콜라겐이 결합된 지지체 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
13. 제12항에 있어서,
    상기 지지체는 PCL(Poly(e-caprolactone)), PLA(polylactic acid), PGA(Poly-γ-glutamic acid), PHB(polyhydroxybutyrate), PHV(Poly(hydroxy valerate)), PDO(poly(P-dioxanone)), 이들의 공중합체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
    
14. 제12항에 있어서,
    상기 줄기세포는 골수, 지방조직, 치아, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁 또는 태아로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것인 약학 조성물.
    
15. 제12항에 있어서,
    상기 골질환은 성장기 발육부진, 골절, 구루병(rickets), 골연화증(osteomalacia), 척추측만증(scoliosis), 골반변형(pelvic deformity), 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 갑상선기능항진증(hyperparathyroidism), 파제트병(Paget disease), 전이성 골암(metastatic bone cancers) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
    
16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합단백질, 콜라겐이 결합된 지지체 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골 또는 치아 재생용 약학 조성물.

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