JP7012970B2 - 神経損傷治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、神経細胞を培養させる際の足場材を含む培養材とそれを用いた神経損傷治療剤に関するものである。

現在、損傷を受けた中枢神経を回復させることが求められている。これを実現するためには、神経細胞の培養、生体内における神経細胞の生存維持および生体内における神経細胞の突起伸長を促し、神経回路を再構築させる必要がある。

神経のなかでも脳や脊髄といった中枢神経系は、損傷を受けた場合、自然に修復されることはないとされている。これは、中枢神経系の神経細胞は、分裂増殖しにくいという性質であること、生体反応により損傷部位にグリア瘢痕と呼ばれる硬く柔軟性を欠いた線維組織が生じ、神経線維がこれを超えて伸長することができないためである。また、生体内には神経突起の伸長を阻害する因子（例えば、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧ、ＯＭｇｐ、Ｓｅｍａ３Ａなど）が存在し、これらの因子の作用により神経突起の伸長が阻害されるという原因もあげられる。

神経細胞は他の細胞と違い、細胞体と細胞体から延びる軸索およびこれらに付随する細胞で構成されている。したがって神経細胞の培養には、神経細胞の生存維持以外に軸索などの伸長も促進される必要がある。

しかし、従来細胞培養に使用されている血清を含有する培地では、神経細胞、神経芽細胞、神経幹細胞といった脆弱な細胞の増殖を促進するには不十分であり、さらに、血清含有培地は、非神経細胞の増殖を著しく促進するため、培養した全細胞に占める非神経細胞の割合が極めて高く不都合になるという問題があった。そこで、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤を培地１リットル当たり少なくとも２ｍｇ含有させた神経細胞培養用培地が提案されている（特許文献１）。

特許文献２には、ポリ乳酸などの生体吸収性ポリマーとコラーゲンを含有させた組成物を、板状、糸状、網状構造に成型した神経再生ガイドについて開示されている。特許文献２では、これをラットの坐骨神経切断部に移植し、一定期間経過後の神経を取り出し、目視にて坐骨神経の再生を確認している。

また、特許文献３には、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸／乳酸共重合体からなる群より選択される生分解性高分子からなる繊維状構造体の一端に針状磁性体を結合させてなる移植用足場材、または生分解性高分子からなる繊維状構造体の内腔に針状磁性体を挿入させてなる移植用足場材が開示されている。

特許文献３では、脊髄損傷ラットにこの足場構造体を移植した場合にラットの運動回復が認められた点を、ＢＢＢ（Ｂａｓｓｏ Ｂｅａｔｔｉｅ Ｂｒｅｓｎａｈａｎ）スコア（運動麻痺の評価スコア）により示している。

これらの文献が示すように、神経細胞は軸索といった突起の伸長を必要とするため、培養（体内における成長を含め）には生体親和性または生体分解性のある足場が必要とされる。

コラーゲンは特許文献２にも紹介されているように、生体親和性があり、また入手も容易な材料である。コラーゲンには多くのタイプがあることが知られている。コラーゲンは、α鎖の３重らせん構造を有している。特許文献４には、所定の酵素によりこのα鎖の末端を切断することにより作製した低接着性コラーゲン（Ｌｏｗ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ：以下「ＬＡＳＣｏｌ」と呼ぶ。）が記載されている。ＬＡＳＣｏｌは、細胞培養のための足場の材料として知られている（特許文献４）。

従来のコラーゲンを用いている足場と比べて、ＬＡＳＣｏｌを用いている足場を利用することにより、培養したい細胞の凝集塊（スフェロイド）を形成し、培養したい細胞をより生体内に近い三次元的な状態で培養することができる（特許文献４）。また、このＬＡＳＣｏｌは、幹細胞の分化促進に効果がある（特許文献５）。

なお、増殖因子であるＴＧＦ－β１を用いた中枢神経損傷治療剤としては、特許文献６のものが紹介されている。

特開平０７－０４６９８２号公報 特開２００７－１７７０７４号公報 特開２０１４－０１４３８２号公報 国際公開第２０１５／１６７００３号 国際公開第２０１５／１６７００４号 国際公開第２０１０／０２４４３２号

Ｋ． Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．６８， ｐｐ．８６１－８６７， ２００４

しかし、上述のコラーゲン、ＬＡＳＣｏｌなどが、神経細胞の生存維持、突起伸長に効果があるか不明であった。また、損傷を受けた中枢神経を回復させるために、簡易に患部（損傷した脊髄など）へ投与できる形態も知られていなかった。

そこで、ＬＡＳＣｏｌが神経細胞の生存維持および軸索の伸長に効果があるという知見を得ることによって、本発明は完成されたものである。

より具体的には、本発明に係る神経損傷治療剤は、
ＬＡＳＣｏｌを含む神経損傷治療剤であって、
前記ＬＡＳＣｏｌは、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの下記（Ａ）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列においてα１鎖においてＹ _１ とＹ _２ との間の化学結合が切断されている若しくは、下記（Ｂ）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列においてα２鎖のＧとＸ _３ との間の化学結合切断されているコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む、神経損傷治療剤である。
（Ａ）－Ｙ _１ －Ｙ _２ －Ｙ _３ －Ｇ－Ｙ _４ －Ｙ _５ －Ｇ－Ｙ _６ －Ｙ _７ －Ｇ－Ｙ _８ －Ｙ _９ －Ｇ－（配列番号１）；
（但し、Ｇはグリシンであり、Ｙ _１ ～Ｙ _９ は、任意のアミノ酸である）
（Ｂ）－Ｇ－Ｘ _１ －Ｘ _２ －Ｇ－Ｘ _３ －Ｘ _４ －Ｇ－Ｘ _５ －Ｘ _６ －Ｇ－（配列番号２）；
（但し、Ｇはグリシンであり、Ｘ _１ ～Ｘ _６ は、任意のアミノ酸である）

なお、本発明は、上記神経損傷治療剤を用いた神経損傷治療方法を提供することができる。

本発明に係る神経細胞培養材および神経損傷治療剤に含有されている成分（ＬＡＳＣｏｌ）は、毒性がなく生体親和性も高い。

また、本発明に係る神経損傷治療剤では、ｐＨ調整および温度を上げることで、ＬＡＳＣｏｌが液体状からゲル状態に形態が移行する。したがって、液体で注入できるので、より簡易に患部（損傷した脊髄など）へ投与でき、治療の際の侵襲性が低い。また、体内に注入された後、患部に滞留しやすい。その結果、神経細胞が成長する間、投与回数を減らすことができ、患者の負担も少ない。

このような投与ができるのは、含有されている成分（ＬＡＳＣｏｌ）が従来のコラーゲンに比べて、高濃度であっても粘性が低いという特性、また線維形成速度が遅いという特性、によるものと考えられる。これらの特性は、「所定の酵素処理により、３本鎖らせん構造を保持しつつ、α鎖の末端（アレルギー反応を起こしやすいテロペプチド領域）が切断されている、ＬＡＳＣｏｌの構造」によると考えられる。

濃度が異なるＬＡＳＣｏｌ溶液の弾性率の時間変化を示すグラフである。 ＬＡＳＣｏｌの濃度の違いによるひずみと応力の関係を示すグラフである。 ＬＡＳＣｏｌコート群（図中、ＬＡＳＣｏｌと標記）、アテロコラーゲンコート群（図中、Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎと標記）、ポリ－Ｌ－リシンコート群（図中、ＰＬＬと標記）及びコントロール群（図中、Ｎｏｎ－ｃｏａｔｅｄと標記）にて、神経細胞を４８時間培養した結果を示す位相差顕微鏡写真である。 図３のＬＡＳＣｏｌコート群の神経細胞のＳＥＭ拡大写真である。 図４のさらにＳＥＭ拡大写真である。 図３のアテロコラーゲンコート群の神経細胞のＳＥＭ拡大写真である。 図６のさらにＳＥＭ拡大写真である。 図３のポリ－Ｌ－リシンコート群の神経細胞のＳＥＭ拡大写真である。 図８のさらにＳＥＭ拡大写真である。 ＬＡＳＣｏｌコート群（図中、ＬＡＳＣｏｌと標記）、アテロコラーゲンコート群（図中、Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎと標記）及びコントロール群（図中、Ｎｏｎ－ｃｏａｔｅｄと標記）にて、アストロサイトを培養した場合の細胞数を計測した結果を示すグラフである。 ＬＡＳＣｏｌコート群（図中、ＬＡＳＣｏｌと標記）、アテロコラーゲンコート群（図中、Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎと標記）、ポリ－Ｌ－リシンコート群（図中、ＰＬＬと標記）及びコントロール群（図中、Ｎｏｎ－ｃｏａｔｅｄと標記）にて、骨髄間質細胞を７日間培養した結果を示す位相差顕微鏡写真である。 ＬＡＳＣｏｌコート群（図中、ＬＡＳＣｏｌと標記）及びコントロール群（図中、Ｎｏｎ－ｃｏａｔｅｄと標記）にて、骨髄間質細胞を培養した場合の細胞数を計測した結果を示すグラフである。 ＬＡＳＣｏｌコート群（図中、ＬＡＳＣｏｌと標記）及びアテロコラーゲンコート群（図中、Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎと標記）にて、マクロファージを４８時間培養した結果を示す位相差顕微鏡写真である。 ＬＡＳＣｏｌ投与群（図中、ＬＡＳＣｏｌと標記）及びコントロール群（図中、ＰＢＳと標記）でのＢＢＢ運動評価尺度の評価の結果を示すグラフである。 脊髄の損傷部分のアストロサイトを抗ＧＦＡＰ抗体で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 再生した脊髄の損傷部分の神経を抗リン酸化ＧＡＰ－４３抗体で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 アテロコラーゲンのスポンジサンプルを埋植し２週間後の脊髄の断面を染色した写真である。 図１７の拡大写真である。 ＬＡＳＣｏｌスポンジサンプルを埋植し２週間後の脊髄の断面を染色した写真である。 図１９の拡大写真である。 スポンジサンプル中の神経軸索の量を断面写真から求めたグラフである。

以下に本発明に係る神経細胞培養材および神経損傷治療剤について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。

本発明に係る神経細胞培養材および神経損傷治療剤の材料として用いられるＬＡＳＣｏｌは、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む。また、ＬＡＳＣｏｌのみであってもよい。この分解物は、コラーゲンが持つ細胞との接着性が弱くなり、低接着性に変わる性質を有する。

ＬＡＳＣｏｌは、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素で分解することによって得られる。そして、分解する際の条件によって、含まれるペプチド配列が異なる。すなわち、ＬＡＳＣｏｌは、分解の条件によって、異なる種類のＬＡＳＣｏｌが得られる。

本発明で利用できるＬＡＳＣｏｌの特徴は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの下記（Ａ）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列において、Ｙ_１とＹ_２の間の化学結合が切断されているα鎖の組み合わせからなる点である。
（Ａ）－Ｙ_１－Ｙ_２－Ｙ_３－Ｇ－Ｙ_４－Ｙ_５－Ｇ－Ｙ_６－Ｙ_７－Ｇ－Ｙ_８－Ｙ_９－Ｇ－（配列番号１）；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｙ_１～Ｙ_９は、任意のアミノ酸である）。

コラーゲンのトリプルヘリカルドメインは、－Ｇ－Ｘ－Ｙ－（Ｇはグリシンで、ＸおよびＹは任意のアミノ酸）という配列が連続していることが知られている。上記の配列では、「－Ｙ_３－Ｇ－Ｙ_４－Ｙ_５－」中の「Ｇ」がトリプルヘリカルドメインのＮ末端側のグリシンを表している。上記の配列をみてわかるように、Ｙ_１とＹ_２との間の化学結合の切断とは、トリプルヘリカルドメインの外側で切断が行われていることがわかる。後述するように、分解条件が異なるとトリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じる。本発明で用いられるＬＡＳＣｏｌの１つは、トリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じているＬＡＳＣｏｌである。以下これをＬＡＳＣｏｌ－Ａと呼ぶ。

本発明に係る神経細胞培養材および神経損傷治療剤で利用されるＬＡＳＣｏｌは、特に神経細胞を生存維持若しくは突起を伸長させる際に好適に利用することができる。後述する実施例でも示すように、ＬＡＳＣｏｌ－Ａは、神経細胞以外の細胞を培養する能力は非常に低い。しかし、神経細胞を生存維持させ、神経線維の伸長を促進させる能力がある。

なお、分解の条件によって、以下のＬＡＳＣｏｌが得られることが知られている。コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの下記（Ｂ）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列においてＸ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合若しくはＸ_６とＧとの間の化学結合が切断されているα鎖の組み合わせからなる。

（Ｂ）－Ｇ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｇ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｇ－（配列番号２）；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ_１～Ｘ_６は、任意のアミノ酸である）。これをＬＡＳＣｏｌ－Ｂと呼ぶ。ＬＡＳＣｏｌ－Ｂは、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じている。配列番号２番では「－Ｇ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｇ－」のＧがトリプルヘリカルドメインのＮ末端側のグリシンである。もちろん、他のペプチドが含まれるＬＡＳＣｏｌもあり得る。神経細胞の生存維持および突起伸長が行われる点でＬＡＳＣｏｌ－Ａは、現在知られているＬＡＳＣｏｌ中で最も好適である。しかし、他のＬＡＳＣｏｌを排除するものではない。

また、神経細胞培養材および神経損傷治療剤には、神経細胞の成長因子が含まれていてもよい。

本発明に係る神経細胞培養材および神経損傷治療剤で利用されるＬＡＳＣｏｌは、酸性状態で溶液として保存が可能である。そして、ｐＨおよび濃度を調整し、体温まで温度を上げることで、ゲル状となる。ゲル状になることで、ＬＡＳＣｏｌは、体内での拡散が抑制され、長期間患部で神経細胞を培養する効果を発揮する。なお、本発明において、神経細胞の培養は、例えば神経細胞が生体内に近い形態で生存でき（好適に生存でき）、軸索（神経突起）を伸長させることができることも含む。

ゲル状となったときの弾性率は、溶液中のＬＡＳＣｏｌの濃度、ｐＨ、および温度に比例する。後述する実施例では、ｐＨおよび濃度を調整し、液体の状態でシリンジに吸引し、患部に注射で投与し、患部内でゲル状にさせる例を示す。しかし、本発明に係る神経細胞培養材および神経損傷治療剤で利用されるＬＡＳＣｏｌは、膜状や、スポンジ状にして、患部に埋め込んでもよい。なお、膜状、スポンジ状とは、ＬＡＳＣｏｌを所定の形状にしたもの（形状体ともいう。）をいう。

後述するように本発明で用いるＬＡＳＣｏｌは、濃度３．５ｍｇ／ｍｌ（後述する「実用弾性率」で２０Ｐａ）以上であれば、ゲル状を呈するといえる。したがって、神経細胞培養材および神経損傷治療剤として利用されるＬＡＳＣｏｌは、濃度３．５ｍｇ／ｍｌ以上であれば、体内に投与した際に、停留し、神経細胞を再生させることができる。

ＬＡＳＣｏｌの作製方法に関する知見としては、ＬＡＳＣｏｌ－ＢもＬＡＳＣｏｌ－Ａもほぼ同じである。そこで、どちらにも共通する知見については、単にＬＡＳＣｏｌとして説明する。また、以下の説明で「分解物」とはＬＡＳＣｏｌを意味する。

＜ＬＡＳＣｏｌの材料＞
ＬＡＳＣｏｌの材料になるコラーゲンまたはアテロコラーゲンは、特に限定されず、周知のコラーゲンおよびアテロコラーゲンであればよい。

コラーゲンとしては、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒト、ラットまたはマウスなど）、鳥類（例えば、ニワトリなど）、または、魚類（例えば、サメ、コイ、ウナギ、マグロ（例えば、キハダマグロ）、ティラピア、タイ、サケなど）または爬虫類（例えば、スッポン）のコラーゲンを用いることができる。

本発明で用いるコラーゲンは、例えば、上記哺乳類または鳥類の真皮、腱、骨または筋膜などに由来するコラーゲン、上記魚類の皮膚または鱗などに由来するコラーゲン、上記爬虫類の真皮、腱、骨などに由来するコラーゲンを用いることができる。

また、ＬＡＳＣｏｌの作製に用いるアテロコラーゲンとしては、上記哺乳類、鳥類、魚類または爬虫類のコラーゲンをプロテアーゼ（例えば、ペプシンなど）によって処理して得られる、コラーゲン分子のアミノ末端および／またはカルボキシル末端からテロペプチドが部分的に除去されているアテロコラーゲンを用いることができる。

これらのなかでは、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヒトまたはラットのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを好ましく用いることができる。また、ブタ、ウシまたはヒトのコラーゲンまたはアテロコラーゲンをＬＡＳＣｏｌの材料として更に好ましく用いることができる。

また、ＬＡＳＣｏｌの材料として魚類のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることもできる。魚類を用いれば、材料を簡便に、安全に、かつ大量に入手可能であり、ヒトに対してよりウイルスフリーの安全なコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物（ＬＡＳＣｏｌ）を提供することができる。

なお、ＬＡＳＣｏｌの材料として魚類のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いる場合には、サメ、コイ、ウナギ、マグロ（例えば、キハダマグロ）、ティラピア、タイまたはサケのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることが好ましく、マグロ、ティラピア、タイまたはサケのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることが更に好ましい。

ＬＡＳＣｏｌの材料としてアテロコラーゲンを用いる場合、熱による変性温度が、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上であるアテロコラーゲンを用いることが好ましい。例えば、分解物の材料として魚類のアテロコラーゲンを用いる場合、マグロ（例えば、キハダマグロ）またはティラピア、コイなどのアテロコラーゲンは熱変性温度が２５℃以上であるので、これらのアテロコラーゲンを用いることが好ましい。

上記構成であれば、本実施の形態の神経細胞培養材および神経損傷治療剤の変性温度（ゲル状体になる温度）を、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上に調節することができる。その結果、上記構成であれば、貯蔵時の安定性、利用時の安定性に優れた神経細胞培養材および神経損傷治療剤を実現することができる。

これらのコラーゲンまたはアテロコラーゲンは、周知の方法によって入手することができる。例えば、哺乳類、鳥類または魚類のコラーゲンに富んだ組織をｐＨ２～４程度の酸性溶液に投入することによって、コラーゲンを溶出することができる。更に、当該溶出液にペプシンなどのプロテアーゼを添加して、コラーゲン分子のアミノ末端および／またはカルボキシル末端のテロペプチドを、部分的に除去する。更に、当該溶出液に塩化ナトリウムなどの塩を加えることによって、アテロコラーゲンを沈殿させることができる。

ＬＡＳＣｏｌを得るには、コラーゲンまたはアテロコラーゲンに酵素を作用させて、これらの材料を分解する。しかし、既にトリプルヘリカルドメイン内の化学結合が切断されているコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を作製する（例えば、化学合成法、組み換えタンパク質の発現）ことでＬＡＳＣｏｌを得ることもできる。

以下に、上述したコラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって分解しＬＡＳＣｏｌを得る方法について説明する。

上記酵素としては特に限定されないが、例えば、システインプロテアーゼを用いることが好ましい。

システインプロテアーゼとしては、塩基性アミノ酸量よりも酸性アミノ酸量の方が多いシステインプロテアーゼ、酸性領域の水素イオン濃度において活性であるシステインプロテアーゼを用いることが好ましい。

このようなシステインプロテアーゼとしては、アクチニダイン［ＥＣ ３．４．２２．１４］、パパイン［ＥＣ ３．４．２２．２］、フィシン［ＥＣ ３．４．２２．３］、ブロメライン［ＥＣ ３．４．２２．３２］、カテプシンＢ［ＥＣ ３．４．２２．１］、カテプシンＬ［ＥＣ ３．４．２２．１５］、カテプシンＳ［ＥＣ ３．４．２２．２７］、カテプシンＫ［ＥＣ ３．４．２２．３８］、カテプシンＨ［ＥＣ ３．４．２２．１６］、アロライン、カルシウム依存性プロテアーゼなどを挙げることが可能である。なお、鍵括弧内は酵素番号である。

これらの中では、アクチニダイン、パパイン、フィシン、カテプシンＫ、アロラインまたはブロメラインを用いることが好ましく、アクチニダイン、パパイン、フィシン、カテプシンＫを用いることが更に好ましい。

上述した酵素は、公知の方法によって入手することができる。例えば、化学合成による酵素の作製；細菌、真菌、各種動植物の細胞または組織からの酵素の抽出；遺伝子工学的手段による酵素の作製；などによって入手することができる。勿論、市販の酵素を用いることも可能である。

コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって分解することによって切断を行う場合には、例えば、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の方法にしたがって切断工程を行うことができる。以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の方法は、あくまでも切断工程の一例であって、ＬＡＳＣｏｌの製造方法は、これら（ｉ）～（ｉｉｉ）の方法に限定されない。

なお、以下の（ｉ）および（ｉｉ）の方法で、ＬＡＳＣｏｌ－Ｂを得ることができる。また、以下の（ｉｉｉ）の方法は、ＬＡＳＣｏｌ－ＡとＬＡＳＣｏｌ－Ｂを得ることができる。
（ｉ）高濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。
（ｉｉ）高濃度の塩と接触させた後の酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法。
（ｉｉｉ）低濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。

上述した（ｉ）の方法の具体例としては、例えば、高濃度の塩を含む水溶液中で、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法を挙げることができる。

上述した（ｉｉ）の方法の具体例としては、例えば、高濃度の塩を含む水溶液と酵素とを予め接触させ、その後、当該酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法を挙げることができる。

上述した（ｉｉｉ）の方法の具体例としては、例えば、低濃度の塩を含む水溶液中で、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法を挙げることができる。上記水溶液の具体的な構成としては特に限定されないが、例えば、水を用いることが可能である。

上記塩の具体的な構成としては特に限定されないが、塩化物を用いることが好ましい。塩化物としては、特に限定されないが、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌまたはＭｇＣｌ_２を用いることが可能である。

上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は特に限定されないが、高いほど好ましいといえる。例えば、当該濃度は、２００ｍＭ以上であることが好ましく、５００ｍＭ以上であることがより好ましく、１０００ｍＭ以上であることがより好ましく、１５００ｍＭ以上であることがより好ましく、２０００ｍＭ以上であることが最も好ましい。

上記低濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は特に限定されないが、低いほど好ましいといえる。例えば、当該濃度は、２００ｍＭよりも低いことが好ましく、１５０ｍＭ以下であることがより好ましく、１００ｍＭ以下であることがより好ましく、５０ｍＭ以下であることがより好ましく、略０ｍＭであることが最も好ましい。

上記水溶液（例えば、水）に溶解させるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの量は特に限定されないが、例えば、１０００重量部～１００００重量部の水溶液に対して、１重量部のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを溶解させることが好ましい。

上記構成であれば、水溶液に対して酵素が加えられた場合、当該酵素とコラーゲンまたはアテロコラーゲンとを効率よく接触させることができる。そして、その結果、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素によって効率よく分解することができる。

上記水溶液に加える酵素の量は特に限定されないが、例えば、１００重量部のコラーゲンまたはアテロコラーゲンに対して、１０重量部～２０重量部の酵素を加えることが好ましい。

上記構成であれば、水溶液中の酵素の濃度が高いので、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって効率よく分解することができる。

水溶液中でコラーゲンまたはアテロコラーゲンと酵素とを接触させるときの他の条件（例えば、水溶液のｐＨ、温度、接触時間など）も特に限定されず、適宜、設定することができるが以下の範囲であることが好ましい。なお、以下にこれらの条件の好ましい範囲について例示する。

１）水溶液のｐＨは、ｐＨ２．０～７．０が好ましく、ｐＨ３．０～６．５が更に好ましい。水溶液のｐＨを上述した範囲に保つために、水溶液に対して周知のバッファーを加えることが可能である。上記ｐＨであれば、水溶液中にコラーゲンまたはアテロコラーゲンを均一に溶解することができ、その結果、酵素反応を効率よく進めることができる。

２）温度は特に限定されず、用いる酵素に応じて温度を選択すればよい。例えば、当該温度は、１５℃～４０℃であることが好ましく、２０℃～３５℃であることがより好ましい。

３）接触時間は特に限定されず、酵素の量、および／または、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの量に応じて接触時間を選択すればよい。例えば、当該時間は、１時間～６０日間であることが好ましく、１日間～７日間であることがより好ましく、３日間～７日間であることがさらに好ましい。

なお、水溶液中でコラーゲンまたはアテロコラーゲンと酵素とを接触させた後、必要に応じて、ｐＨを再調整する工程、酵素を失活させる工程、および、不純物を除去する工程からなる群より選択される少なくとも１つの工程を経てもよい。

また、上記不純物を除去する工程は、物質を分離するための一般的な方法によって行うことができる。上記不純物を除去する工程は、例えば、透析、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、または、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどによって行うことができる。

本発明に係る神経細胞培養材は、例えば、ＬＡＳＣｏｌを含む溶液を培養皿に最初にコートし、次にＤ－ＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）などの培地を培養皿に入れ、神経細胞を播種するように用いられる。

本発明に係る神経損傷治療剤は、神経を損傷し一定時間経過した後に、損傷個所を確認し、患部に投与される。例えば、脊髄の場合、脊損直後ではなく、一定時間経過した後に、脊損した箇所をレントゲンなどで確認したのち、注射などにより患部に投与される。なお、この際には、神経損傷治療剤に含まれるＬＡＳＣｏｌは、所定以上の弾性率（後述する実用弾性率）を有するのが望ましい。弾性率が低い状態であると、ＬＡＳＣｏｌが患部にとどまらず流れてしまうおそれがあるからである。

本発明に係る神経細胞培養材若しくは神経損傷治療剤は、乾燥状態（粉末および形状体を含む）やゲル状態で供給される。また、本発明に係る神経細胞培養材若しくは神経損傷治療剤を所定の濃度で使用するとは、乾燥状態のＬＡＳＣｏｌに対して一定の溶媒を加える指示が添付若しくは通知され、その結果、本発明に係る好適な濃度のＬＡＳＣｏｌになる場合も含まれる。

本明細書で「投与」とは、患部を介して患者に治療剤を与えること、をいう。そのため、本発明に係る治療剤の投与は、注射に限らず、例えば、切開により切開した部位に治療剤を挿入すること、患部に治療剤を塗布することなども含む。また、本発明に係る神経損傷治療剤は、本発明に係る神経損傷治療剤を用いた神経損傷の治療方法とも言える。

本発明を用いて治療する神経の損傷は、中枢神経および末梢神経の領域で、交通事故、スポーツ事故、転倒等の事故による外傷の他、脊髄腫瘍やヘルニア等の疾病に起因する損傷なども含まれる。

＜ＬＡＳＣｏｌを含む溶液の作製＞
塩化ナトリウムの濃度が０ｍＭと１５００ｍＭである５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を準備した。なお、当該水溶液の溶媒として、水を用いた。

アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、非特許文献１参照）。

次いで、塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ブタ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ブタ由来のＩ型コラーゲンを含む当該溶液を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献１参照）。

上述した分解物をラウリル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。

次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。

なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。

表１に、塩濃度が０ｍＭと１５００ｍＭの場合のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。

表１に示すように、塩濃度が低いと（０ｍＭ）、「ＧＰＭＧＰＳＧＰＲＧ・・・」で表されるトリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じ、塩濃度が高いと（１５００ｍＭ）、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じる。配列番号３では、左から３番目のグリシン（Ｇ）からトリプルヘリカルドメインが始まる。０ｍＭの時に生成したものがＬＡＳＣｏｌ－Ａの溶液であり、１５００ｍＭで生成したものがＬＡＳＣｏｌ－Ｂの溶液である。以下の実施例ではＬＡＳＣｏｌ－Ａの溶液をＬＡＳＣｏｌの溶液として使用した。

なお、ＬＡＳＣｏｌ－Ａは、α２鎖でも切断が生じる。表２において、配列番号５は、α２鎖のアミノ酸末端部分を示す。配列番号５では「・・ＧＰＭＧＬＭＧ・・・」の左端のグリシン（Ｇ）からトリプルヘリカルドメインが始まる。そしてＬＡＳＣｏｌ－Ａの作成条件である塩濃度が０ｍＭの時のα２鎖の末端を配列番号６に示す。これは配列番号２を参照し、ＧとＸ_３との間の化学結合が切断されていることに相当する。

つまり、ＬＡＳＣｏｌ－Ａはα１鎖ではトリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じているが、α２鎖ではトリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じている。ＬＡＳＣｏｌ－Ａは配列番号３若しくは配列番号６のいずれかの切断を有していればよい。

図１には、ＬＡＳＣｏｌを含む溶液の弾性特性（複素弾性率における貯蔵弾性率Ｇ’）を示す。横軸は時間（分）であり、縦軸は貯蔵弾性率Ｇ’（Ｐａ）である。図１（ａ）と図１（ｂ）は、横軸は同じであるが、縦軸が異なる。図１（ｂ）の縦軸のスケールは図１（ａ）より大きい。図１（ａ）および図１（ｂ）のそれぞれの曲線はＬＡＳＣｏｌの濃度の違いを表す。濃度の異なるＬＡＳＣｏｌ溶液は、最終濃度が２．１ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．９ｍｇ／ｍＬ（以上図１（ａ））、２１ｍｇ／ｍｌ（図１（ｂ）になるように５ｍＭの塩酸溶液で調製した。

これらＬＡＳＣｏｌは、酸性溶液中に５℃から１０℃で保存される。この状態ではＬＡＳＣｏｌは液状で保存できる。図１は、ＬＡＳＣｏｌにｐＨ調整剤と濃度調整液を加え、ｐＨをほぼ７．４に調整した後に、動的粘弾性測定装置（レオメーター、ＨＡＡＫＥ ＭＡＲＳ ＩＩＩ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）にセットし、３７℃に昇温後測定した結果である。周波数１Ｈｚ、振り幅６°／秒、ひずみ量１％の測定条件とした。なお、昇温は数秒で完了する。

図１（ａ）を参照して、何れの濃度の場合も、測定開始した直後の貯蔵弾性率Ｇ’は低かった。その後、どの濃度においても、貯蔵弾性率Ｇ’は上昇し、約１０分後で飽和値に近くなった。一方、図１（ｂ）では、測定開始１分で飽和値まで貯蔵弾性率Ｇ’は上昇し、その後緩やかに下降し飽和した。図１および図２より明らかなように、濃度を高くすることで貯蔵弾性率Ｇ’が上昇するまでの時間も短くなった。

このことから、ｐＨおよび濃度を調整し、温度を上昇させるとＬＡＳＣｏｌを含む溶液の貯蔵弾性率Ｇ’は、濃度に応じた所定の値まで上昇することがわかった。また、ＬＡＳＣｏｌを所定濃度に調製し、３７℃にしてから３０分経過するとほぼ貯蔵弾性率は安定した値となることがわかった。そこで、この時の貯蔵弾性率をＬＡＳＣｏｌの「実用弾性率」と呼ぶ。

ＬＡＳＣｏｌは適切な条件に暴露することで、弾性率が測定できないゾルから弾性率を定量できるゲルに性状が変化し、特に生体に注入する上でインジェクタブルゲルとして利用できることが示された。

図２はレオメーターで３７℃で３０分経過した後の「ひずみ（レオメーターの駆動側の回転方向の変位）」と「応力（レオメータの受動側が受ける応力）」の関係を表すものである。左縦軸はひずみφ（ｒａｄ）であり、右縦軸は応力Ｍ（μＮｍ）であり、横軸はマシンステップ数であり無単位であるが、５００ステップで１秒に相当する。すなわち、図２の各図は、５×１０^－４ｒａｄから－５×１０^－４ｒａｄまでの往復を１秒かけて測定したものである。

図２（ａ）は、ＬＡＳＣｏｌ濃度が２．１ｍｇ／ｍｌの場合であり、図２（ｂ）はＬＡＳＣｏｌ濃度が３．５ｍｇ／ｍｌであり、図２（ｃ）はＬＡＳＣｏｌ濃度が５．６ｍｇ／ｍｌである。それぞれの実用弾性率は、８Ｐａ、２０Ｐａ、７０Ｐａであった。ＬＡＳＣｏｌ濃度が２．１ｍｇ／ｍｌ（図２（ａ））では、ひずみに対して応力の応答性はほとんどなかった。つまりＬＡＳＣｏｌは、液体に近い状態といえる。ＬＡＳＣｏｌ濃度が３．５ｍｇ／ｍｌ（図２（ｂ））に上昇すると、ひずみに相当する応力の応答性が見られた。

ＬＡＳＣｏｌの濃度がさらに上がると（図２（ｃ））、応力は加えられたひずみと同期するようになった。なお、ひずみと応力の位相がずれるのは、ゲルが損失弾性率を持つからである。したがって、図２（ｂ）のＬＡＳＣｏｌ濃度が３．５ｍｇ／ｍｌの時点でゲル状を呈するようになると判断できた。これは実用弾性率では、２０Ｐａに相当した。

また、神経損傷治療剤に利用する場合は、ゲル状になった際の貯蔵弾性率は、２０Ｐａが下限であると考えられる。ＬＡＳＣｏｌは細胞の足場としての機能も有しているため、１か所にある程度貯留している必要がある。２０Ｐａより低い弾性では、ＬＡＳＣｏｌはゲルとしての挙動をしないため、患部に停留することが困難と考えられるからである。

＜神経細胞の培養＞
上記のようにして作製したＬＡＳＣｏｌ溶液を用いて神経細胞の生存維持能について確認した。２４ウェルマイクロプレートにＬＡＳＣｏｌ、アテロコラーゲン、ポリ－Ｌ－リシン（以下「ＰＬＬ」ともいう。）をコートした。なお、コントロールとして何もコートしていないＮｏｎ－ｃｏａｔｅｄのウェルも用意した。これらのウェルに新生仔ラット海馬由来神経細胞（間葉系幹細胞ではなく、分化が終了した神経細胞、以下単に「神経細胞」と呼ぶ。）をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ／Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、以下「ＮＢ／Ｂ２７」と呼ぶ）に懸濁して、播種した。

ＰＬＬは、細胞膜上と培養皿との電荷を介した接着を促進する。したがって、市販のプラスチックプレートに一般的に施されている親水性の亢進処理だけでは接着性が不十分である神経細胞を接着することができる。ＰＬＬは神経細胞の培養時によく用いられている。

培養４８時間後の状態を顕微鏡観察した結果を図３に示す。なお、写真中右下のスケールバーは、１００μｍに相当する。図３（ａ）はＬＡＳＣｏｌ溶液でコートしたもの（ＬＡＳＣｏｌコート群）、図３（ｂ）はアテロコラーゲン溶液でコートしたもの（アテロコラーゲンコート群：「Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ」と表示）、図３（ｃ）はＰＬＬ溶液でコートしたもの（ＰＬＬコート群）、図３（ｄ）は何もコートしていないもの（Ｎｏｎ－ｃｏａｔｅｄ群）の結果である。

図３（ａ）では、円形のものが密に存在しており、それらの間を長糸状のものが伸びている。円形のものは神経細胞の細胞体であり、長糸状のものは神経細胞から延びる突起（神経突起）である。

図３（ｂ）では、神経細胞の細胞体は多く見られるが、図３（ａ）ほどは多くない。図３（ｃ）、図３（ｄ）と順に神経細胞の細胞体の数は、少なくなっている。また、神経細胞から延びる神経突起の数および長さも、図３（ａ）から図３（ｄ）までの順に少なくなっていることが確認された。以上のことから、神経細胞はＬＡＳＣｏｌ上で良好に生存することができ、神経突起を伸長させることができることがわかった。

次に２０ｍｍ×２０ｍｍのスライドガラス上にＬＡＳＣｏｌ溶液、アテロコラーゲン溶液、ＰＬＬ溶液をコートし、神経細胞を播種した。そして２４時間後に走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察した。具体的には、培養標本を４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定し、アルコールで脱水し、イソアミルアセテート（ｉｓｏａｍｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）に浸漬して液化二酸化炭素で限界点乾燥（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｐｏｉｎｔ ｄｒｙｉｎｇ）した。その後、白金パラジウム（ｐｌａｔｉｎｕｍ ｐａｌｌａｄｉｕｍ）でコーティングし、日立Ｓ５０００ＳＥＭで観察した。

図４にＬＡＳＣｏｌコート群の神経細胞のＳＥＭ観察像を示す。右下のスケールバーは２０μｍである。線維状に密集したＬＡＳＣｏｌを背景に、神経細胞（図４中の符号「Ｎ」の部分）から複数の神経軸索と呼ばれる突起が伸びているのが確認された（図中矢頭）。各軸索の突起途中には神経細胞の活動に必要不可欠な成長円錐（図中四角内）が形成されていた。

図５は、図４の成長円錐を拡大したＳＥＭ像である。右下のスケールバーは５μｍである。成長円錐は高い運動能をもっており、複数の細長い神経突起が伸長することで他の神経細胞間でネットワークを作り、やがてシナプスを形成する。

ＬＡＳＣｏｌ上で形成された成長円錐から長い糸状仮足（フィロポディア：矢頭）が複数伸びていることから、この成長円錐は活発に活動していることが示された。また，フィロポディアからさらに伸長した軸索に新たな成長円錐が形成されていた（矢印）。しかも突起は綺麗な表面を有しており、突起としての典型的な形状を形成していた。このような状態で神経突起が伸長していれば、神経細胞が好適に培養されている状態の一形態と言える。

さらに成長円錐の下層には、ＬＡＳＣｏｌの線維が密に形成されており、各フィロポディアがそのＬＡＳＣｏｌ線維と明確に接着していた。このことから神経細胞の活発な活動にはＬＡＳＣｏｌからのシグナルが関与していると考えられる。

図６はアテロコラーゲンコート群にて神経細胞を播種した場合の結果を示す。右下のスケールバーは２０μｍである。神経細胞（符号「Ｎ」の部分）から神経突起（矢頭）が伸長していたが、その本数はＬＡＳＣｏｌコート群（図４）よりも明らかに少なくかつ短いことが示された。

図７は、図６の成長円錐を拡大したＳＥＭ像である。右下のスケールバーは５μｍである。突起の先端に形成している成長円錐は歪に変形していた。フィロポディア（矢頭）も明確に形成されておらず、神経細胞は活発な運動能をもつ状態ではなかった。また、神経細胞の下層にコートされているアテロコラーゲンとの接着もＬＡＳＣｏｌコート群（図５）に比べると不十分であった。

図８にはＰＬＬコート群の神経細胞の結果を示す。右下のスケールバーは２０μｍである。神経細胞（符号「Ｎ」の部分）から伸長している突起は６本と多いが、突起の形状は一般的な突起と違い、異常な形態であった（矢頭）。その神経突起から無数の短い突起がさらに出ていた。しかし、この形態は本来の神経細胞の突起では見られないものである。

図９は、図８の成長円錐を拡大したＳＥＭ像である。右下のスケールバーは５μｍである。成長円錐の形成は、不完全であった。全体的に神経細胞は突起を伸ばそうとしているように見える。しかし、その伸長は、抑えられ、短くなっていた。ＰＬＬコート群での神経細胞には突起がきれいに伸長せず、異常な複数の枝状突起が見られていた。

以上のことから、ＬＡＳＣｏｌは、神経細胞を好適に生存させるのに効果的であるばかりでなく、神経細胞からの突起の伸長にも効果を奏することがわかった。

＜ＬＡＳＣｏｌコート群での他の細胞の培養＞
（１）アストロサイト
ＬＡＳＣｏｌ上でアストロサイトの培養を試みた場合の結果を示す。９６ウェルマイクロプレートにＬＡＳＣｏｌおよびアテロコラーゲンをコートした。コントロール群としてＮｏｎ－ｃｏａｔｅｄも用意した。次にラット大脳由来のアストロサイトを３×１０^４、１×１０^５個／ｍＬで播種し、４８時間後にＷＳＴ－１法で細胞数を測定した。ＷＳＴ－１法は、比色定量法ＭＴＴ法の一つである。ＭＴＴ法は、ＭＴＴや類似の色素をホルマザン色素（紫色）へ還元する酵素活性を測定する比色定量法である。

なお、ＷＳＴ－１法は、生細胞中のミトコンドリア脱水素酵素によるテトラゾリウム塩（ＷＳＴ－１）のホルマザン色素への変換を基本としており、ホルマザン色素溶液の吸光度と生細胞数との間には直線的な関係がある。したがって、吸光度を測定することで細胞数を定量的に測定することが，できる。結果を図１０に示す。

図１０を参照して、横軸は播種した細胞数毎のコート材毎の細胞数を示し、縦軸は４５０ｎｍの吸光度を示す。播種した細胞数に関わらず、ＬＡＳＣｏｌをコートした培養皿では、アテロコラーゲンおよびＮｏｎ－ｃｏａｔｅｄより、有意に細胞数は少なかった。

アストロサイトは神経細胞以外の中枢系の細胞（グリア細胞）であるので、図１０の結果は、ＬＡＳＣｏｌは、グリア細胞の増殖を抑制していると言える。

グリア細胞は、神経組織の病変部において増えることが知られている。脊椎といった神経が集合している部分の損傷個所にグリア細胞が増えると、神経線維はこれを超えて伸長することができず、結果、神経は切断されたままとなる。ＬＡＳＣｏｌは、グリア細胞の増殖を抑制するので、神経線維の伸長を亢進させることができると考えられる。

（２）骨髄間質細胞
ＬＡＳＣｏｌ溶液、アテロコラーゲン溶液、ＰＬＬ溶液を塗布し、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ／ＭＳＣＧＭ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（Ｌｏｎｚａ社製）を加えたディッシュ上に骨髄間質細胞を３×１０^３個／ｍｌの濃度で播種し、７日後に観察を行った。結果を図１１に示す。図１１（ａ）は、ＬＡＳＣｏｌ溶液を塗布したもの（ＬＡＳＣｏｌコート群）であり、図１１（ｂ）はアテロコラーゲン溶液を塗布したもの（アテロコラーゲンコート群）であり、図１１（ｃ）はＰＬＬ溶液を塗布したもの（ポリ－Ｌ－リシンコート群：ＰＬＬコート群）であり、図１１（ｄ）はノンコートのもの（Ｎｏｎ－ｃｏａｔｅｄ、コントロール群）である。なお、写真中右下のスケール線は１００μｍに相当する。図１１（ａ）のＬＡＳＣｏｌコート群では、細い紡錘形の細胞体から突起が伸びているものが散見された。これが骨髄間質細胞である。細胞の密度は１０％程度である。

図１１（ｂ）のアテロコラーゲンコート群、図１１（ｃ）のＰＬＬコート群、図１１（ｄ）のＮｏｎ－ｃｏａｔｅｄ群では、長い紡錘形の骨髄間質細胞が互いに接着して密に存在していた。これらの細胞は疎の状態から底面を覆い尽くすまで盛んに増殖をしたことがわかる。

以上のことから、ＬＡＳＣｏｌコート群（図１１（ａ））では、骨髄間質細胞は十分に接着することができず、アテロコラーゲンコート群、ＰＬＬコート群及びＮｏｎ－ｃｏａｔｅｄ群よりも増殖は見られないと結論できる。

また、ＬＡＳＣｏｌ上では、骨髄間質細胞の増殖は見られないという傾向をさらに確認した。４８ウェルマイクロプレートにＬＡＳＣｏｌ溶液をコートした。骨髄間質細胞を１×１０^５、３×１０^４、１×１０^４、３×１０^３個／ウェルで播種した。２４時間後にＬｕｎａ自動細胞計測装置（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて細胞数を計測した。なお、コントロール群として、Ｎｏｎ－ｃｏａｔｅｄのものも用意した。

また、ＬＡＳＣｏｌ溶液を９６ウェルマイクロプレートにコートし、骨髄間質細胞を１×１０^５、５×１０^４、２×１０^４、１×１０^４個／ウェルで播種した。２日後に、ＷＳＴ－１法によるアッセイを行った。

図１２に結果を示す。図１２（ａ）は、細胞数計測の結果である。横軸は播種した細胞数（個／ウェル）であり、縦軸は２４時間後の細胞数（×１０^４個）である。播種した細胞数が多い時にＬＡＳＣｏｌコート群（図中「Ｌ」で示した。）での培養はコントロール群（Ｎｏｎ－ｃｏａｔｅｄ）の場合に対して有意に細胞数の低下が見られた。

図１２（ｂ）は、ＷＳＴ－１法の結果である。横軸は播種した細胞数（個／ウェル）であり、縦軸は４５０ｎｍの吸光度である。ここでも、播種した細胞数が多い場合、ＬＡＳＣｏｌコート群（図中「Ｌ」で示した。）での培養はコントロール群（Ｎｏｎ－ｃｏａｔｅｄ）の場合に対して有意に細胞数が低下するのを確認できた。

以上のことから、ＬＡＳＣｏｌ上では、骨髄間質細胞の増殖は低い傾向であることがわかった。

（３）マクロファージ
ＬＡＳＣｏｌ上でマクロファージの培養を試みた場合の結果を示す。８ウェルチャンバーにＬＡＳＣｏｌまたはアテロコラーゲンをコートした。次にラット腹腔マクロファージを２×１０^５個／ｍＬ播種した。４８時間後に観察した。図１３に結果を示す。

図１３（ａ）は、ＬＡＳＣｏｌコート群の場合を示し、図１３（ｂ）はアテロコラーゲンコート群の場合を示す。それぞれスケールバーは１００μｍを示す。図１３（ａ）において、矢印で示した球状の細胞（例示として３カ所示した。）が、マクロファージである。図１３（ａ）中には数えるほどしか確認できなかった。一方、図１３（ｂ）では、細胞は明らかに図１３（ａ）より多く確認することができた。なお、図１３（ｂ）では、矢印を示していない。

以上のことから、ＬＡＳＣｏｌ上では、アストロサイト、骨髄間質細胞、マクロファージはほとんど増殖することはできなかった。これらのことから、ＬＡＳＣｏｌは神経細胞に対して細胞生存作用および神経突起伸長作用を発揮することがわかった。したがって、ＬＡＳＣｏｌは神経細胞培養材として、好適に利用することができると言える。特に、ＬＡＳＣｏｌ上では、非神経細胞はほとんど培養できないので、ＬＡＳＣｏｌを用いた神経細胞培養材は、他の細胞が混じっていても神経細胞を実際に近い状態で培養させることができる。

＜ｉｎ ｖｉｖｏでの確認＞
以上のようにｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＬＡＳＣｏｌコート群では、神経細胞は好適に培養されると考えられる。この効果が生体内でも発揮されれば、神経細胞の再生にとって、有用な薬剤となり得る。そこで、ＬＡＳＣｏｌの生体内での神経細胞培養能を調べた。

（１）脊髄損傷モデルの作製
９週齢の雌のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを用いた。後述する各群は７匹ずつで構成した。圧挫損傷は、標準的なニューヨーク大学の重量落下装置を使用した。装置の条件は、１０ｇ、落下高さ７．５ｃｍである。与えた衝撃は１回とした。

投与としては、損傷から１週間後にＬＡＳＣｏｌ溶液又はリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：以後単に「ＰＢＳ」ともいう）を１０μＬ、脊髄の損傷部に投与した。この時ＬＡＳＣｏｌ溶液の温度は室温であった。投与方法は、脳定位固定装置の上にラットを乗せて、固定したインスリン用シリンジをねじ式のインジェクタでゆっくりと押し出して試料を投与した。２分程度静置した後針を抜いた。これは、標準的な細胞移植の際に行うのと同じ方法である。

その際、脊髄損傷部に注入するＬＡＳＣｏｌ溶液は、あらかじめ実用弾性率を測定（レオメーター、ＨＡＡＫＥ ＭＡＲＳ ＩＩＩ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）し、５００Ｐａ～６００Ｐａ（３７℃、ｐＨ７．４）になるように調製した。すでに説明したように、この値はレオメーターでは、３７℃になってから３０分後の値である。また５００Ｐａという実用弾性率は蜂蜜程度の粘りである。

図１４に投与後のラットの状態をＢＢＢ（Ｂａｓｓｏ Ｂｅａｔｔｉｅ Ｂｒｅｓｎａｈａｎ）運動評価尺度によって評価した結果を示す。ＢＢＢ運動評価尺度の評価は、２１段階評価法 （０：完全麻痺～２１：正常）を用いた。また、ＢＢＢスコアは特に後ろ足の状態に着目した。図１３を参照して、横軸は投与後の時間（週）であり、縦軸はＢＢＢスコアである。白丸はＰＢＳ投与群（上述のＰＢＳを投与した群）であり、黒丸はＬＡＳＣｏｌ投与群（上述のＬＡＳＣｏｌ溶液を投与した群）である。ＢＢＢスコアはゼロが最も症状が重く、数値が大きくなると健常状態に近づく。

ラットは３週目まで急激に回復し、その後は緩やかな回復基調を示した。５週以降ＬＡＳＣｏｌ投与群のＢＢＢスコアは１１であり、ＰＢＳ投与群のＢＢＢスコアは９であった。つまり、ＬＡＳＣｏｌ投与群は、ＰＢＳ投与群と比較してＢＢＢスコアでおよそ２違うほど良好な回復を示した。ここで、スコア９とは、静止状態では足底をつけて体重をかけるが、歩行中は体重をかけないレベルである。一方、スコア１１になると、高頻度あるいは連続的な荷重歩行をするレベルである。特に２週目と５週目についてＬＡＳＣｏｌ投与群は、ＰＢＳ投与群に対して有意な回復を確認した。

ＢＢＢを測定した実験とは別に６週例のＳＤラットに圧挫損傷を与えた後直ちにＬＡＳＣｏｌを投与して８日目の脊髄の損傷部分の組織観察を行った。図１５にはアストロサイトを抗ＧＦＡＰ（Ｇｌｉａｌ Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体（ウサギポリクローナル抗体）を一次抗体として染色した結果を示す。

また図１６には、再生神経を抗リン酸化ＧＡＰ－４３（ｐＧＡＰ－４３；ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４３）抗体（マウスモノクローナル抗体）を一次抗体として染色した結果を示す。リン酸化ＧＡＰ－４３は軸索が伸長する際に観察されるタンパク質である。図１５および図１６は同一スライスをＧＦＡＰとｐＧＡＰ－４３で二重染色したもので、同一部分を見ているといえる。

なお、染色は、ｎｏｎ－ｌａｂｅｌの一次抗体に対して、蛍光ラベルされた二次抗体で染色した。より具体的には、アストロサイトを染色した抗ＧＦＡＰ抗体に対しては、波長４８８ｎｍ（緑色）の蛍光色素を結合させたヤギによる抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣＦ ４８８Ａ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ）を二次抗体として用いた。

抗リン酸化ＧＡＰ－４３抗体に対しては、波長５４６ｎｍ（赤）の蛍光色素を結合させたヤギによる抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）を二次抗体として用いた。また、蛍光顕微鏡はＡｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ１ 顕微鏡で、画像取得はＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた（共に （Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ） 社製。）。

図１５を参照する。スケールバーは５００μｍを表す。図１５（ｂ）は、圧挫損傷を与えて直ちにＬＡＳＣｏｌ（７ｍｇ／ｍｌ）溶液を損傷部に１０μｌ投与して８日目の脊髄を４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で固定し、１０μｍ厚での矢状断スライスを免疫組織化学染色したものを示す。アストロサイトマーカーであるＧＦＡＰ（グリア線維酸性
タンパク質）に対する抗体で染色した。

図１５（ｂ）では、ＧＦＡＰに対する抗体で染色された部分が明るい緑色に染色される。このＧＦＡＰに対する抗体で染まらない部分（陰性部分）が損傷部である。損傷部の中心部を白丸で囲った。

一方、ＧＦＡＰに対する抗体で染色された部分を黒色にし、その他の部分を白になるように画像処理したのが図１５（ａ）である。したがって、図１５（ａ）では損傷部は、黒丸で囲ったうちの、白色部分である。

図１６を参照する。スケールバーは５００μｍを表す。図１６（ｂ）は図１５（ｂ）の連続切片を再生神経マーカーであるリン酸化ＧＡＰ４３（ｐＧＡＰ４３）に対する抗体で染色した像を示す（ＧＦＡＰとｐＧＡＰ４３の二重染色のうちｐＧＡＰ４３のみの像）。図１６（ｂ）は、ｐＧＡＰ４３に対する抗体で染色された部分が赤く染色される。図１６（ｂ）中の白丸は図１５（ｂ）の白丸と同じ部分である。

一方、ｐＧＡＰ４３に対する抗体で染色された部分を黒色にし、その他の部分を白に画像処理したのが図１６（ａ）である。図１６（ｂ）の白丸の部分は図１６（ａ）で黒丸で囲った。したがって、図１６（ａ）の黒丸で囲った部分は、図１５（ａ）の黒丸と同じ部分である。

図１５（ａ）と図１６（ａ）を参照すると、図１５（ａ）でのＧＦＡＰ陰性部分（白色部分）が図１６（ａ）でｐＧＡＰ４３陽性である（黒色部分）ことがわかる。つまり、脊髄の損傷部分に再生軸索が伸びてきていたことがわかる。

アストロサイトが消失しＧＦＡＰ陰性になった部分（図１５（ａ）の白色部分）が損傷部である。ｐＧＡＰ４３は、中枢神経の再生軸索に特異的なタンパク質である。図１５（ａ）のアストロサイトの無い部分（損傷部：図１５（ａ）の白色部分）に、図１６では、再生軸索の存在（図１６（ａ）の黒色部分）が確認された。

したがって、脊髄損傷のラットがＬＡＳＣｏｌ溶液の投与によって、損傷部分に神経細胞が再生され、回復をしたと結論できる。

次にＬＡＳＣｏｌを乾燥し、一定形状のスポンジ状にした場合の効果について調べた。用いたスポンジサンプルは、濃度の異なるＬＡＳＣｏｌとアテロコラーゲンを乾燥したものである。乾燥前のＬＡＳＣｏｌの濃度は３０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌであり、乾燥前のアテロコラーゲンの濃度は２０ｍｇ／ｍｌとした。また、それぞれのスポンジサンプルを、ＬＡ３０、ＬＡ５０、ＡＣ２０と呼ぶ。表３に各スポンジサンプルの乾燥する前の濃度を示す。また、各サンプルは直径２～３ｍｍ、長さ５ｍｍの形状に調製した。

９週齢の雌ＳＤｒａｔの第８－９胸椎レベル（圧挫損傷の時と同じ場所）の脊髄の一部（上下方向に約５ｍｍ、中心から左右方向に約１ｍｍ）を切除し、その部分に直ちにスポンジサンプルをピンセットで埋植した。スポンジサンプルはそれぞれ３個体に対して埋植した（ｎ＝３で実験した。）。

埋植から２週間後に全ての個体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）灌流による脱血後、４％ＰＦＡ（パーフルオロアルコキシアルカン）で灌流固定した。損傷部（埋植部）を含む脊髄を採取し、４％ＰＦＡで１日浸漬固定後、３０％ｓｕｃｒｏｓｅ（ショ糖）に置換し、Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ（登録商標）ＦＳＣ２２包埋コンパウンド（Ｌｅｉｃａ社製）で包埋した。それをクリオスタットを用いて１０μｍの厚さでｈｏｒｉｚｏｎｔａｌに切り出した。

切片をＰＢＳで洗浄後、３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ Ｈｉｓｔｏ （Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を用いて５分間室温で透過処理およびブロッキング処理を行った。１次抗体として、Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－βＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （神経細胞マーカー，Ａｂｃａｍ， ａｂ１８２０７）とＭｏｕｓｅ ａｎｔｉ－Ｔｙｐｅ Ｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（埋植したＬＡＳＣｏｌおよびＡｔｅｌｏＣｏｌの検出用，Ｓｉｇｍａ，Ｃ２４５６）を用いて１：２００の濃度で、室温で一晩反応させた。

二次抗体はＣＦ４８８Ａ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （Ｂｉｏｔｉｕｍ）とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１：２００の濃度で、室温で３０分反応させた。細胞の核は０．３μＭ ＤＡＰＩで染色した。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ／Ｐｌｕｓ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いてカバーガラスをかけた後、蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ１ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｗｉｔｈ ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察し画像データを取得した。

図１７にＡＣ２０を埋植し２週間後の写真を示す。図１７（ａ）はβ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（軸索を染色）、Ｃｏｌ１（コラーゲンを染色）、ＤＡＰＩ（細胞核を染色）を合成したものである。図１７（ｂ）は、β－Ｔｕｂｕｌｉｎ（軸索を染色）とＣｏｌ１（コラーゲンを染色）を合成したものである。図１７（ｃ）はβ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（軸索を染色）だけの写真であり、図１７（ｄ）はＣｏｌ１（コラーゲンを染色）だけの写真である。

図１７（ｄ）の中央で黒く見える部分がスポンジサンプルＡＣ２０である。埋植して２週間後でも、このように明確な形状を保持していた。また、図１７（ｃ）には、図１７（ｄ）で黒く示される部分にまったく染色された部分がなかった。つまり、アテロコラーゲンのスポンジサンプルＡＣ２０の中には、神経軸索は伸長してこなかった。

図１８は図１７の各写真中四角で囲った部分を拡大したものである。図１８（ａ）は、β－Ｔｕｂｕｌｉｎ（軸索を染色）とＣｏｌ１（コラーゲンを染色）を合成したものである。図１８（ｂ）はβ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（軸索を染色）だけの写真であり、図１８（ｃ）はＣｏｌ１（コラーゲンを染色）だけの写真である。図１８（ｃ）で黒い網状に示されるアテロコラーゲンのスポンジサンプルと図１８（ｂ）で黒く示される神経軸索には、重なっている部分がなかった。つまり、拡大観察してみても、アテロコラーゲンのスポンジサンプルＡＣ２０の中には、神経軸索は伸長している痕跡は見つからなかった。

図１９および図２０は、スポンジサンプルＬＡ３０を埋植した場合の写真である。図１９（ａ）はβ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（軸索を染色）、Ｃｏｌ１（コラーゲンを染色）、ＤＡＰＩ（細胞核を染色）を合成したものである。図１９（ｂ）は、β－Ｔｕｂｕｌｉｎ（軸索を染色）とＣｏｌ１（コラーゲンを染色）を合成したものである。図１９（ｃ）はβ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（軸索を染色）だけの写真であり、図１９（ｄ）はＣｏｌ１（コラーゲンを染色）だけの写真である。

また図２０は図１９中の四角部分の拡大写真である。図２０（ａ）は、β－Ｔｕｂｕｌｉｎ（軸索を染色）とＣｏｌ１（コラーゲンを染色）を合成したものである。図２０（ｂ）はβ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（軸索を染色）だけの写真であり、図２０（ｃ）はＣｏｌ１（コラーゲンを染色）だけの写真である。

図１９（ｄ）の中央で濃く示されているのがＬＡ３０である。埋設後２週間でも染色写真で確認できる程度に形状を維持していた。図１９（ｃ）および図２０（ｂ）は、軸索神経の染色図であるが、ＬＡ３０の存在位置に軸索神経の染色が確認された。特に図２０（ｂ）では、明らかにスポンジサンプル中に黒い染色部分が確認できた。

このことから、埋植したＬＡＳＣｏｌのスポンジサンプルには、神経軸索が伸長したことが確認された。

図２１には、埋植したスポンジサンプル中の神経軸索の量を、Ｃｏｌ１の存在領域中のβ－Ｔｕｂｕｌｉｎの占める面積の割合として求めたもの（神経密度（Ａｅｒａ％））を示す。

横軸は各スポンジサンプルである。アテロコラーゲンのスポンジサンプルであるＡＣ２０では、Ｃｏｌ１中にβ－Ｔｕｂｕｌｉｎはほとんどなかった。一方、ＬＡＳＣｏｌのスポンジサンプルでは、スポンジサンプル中に軸索が見出された。また、ＬＡＳＣｏｌの濃度が３０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌの中では、濃度が３０ｍｇ／ｍｌの場合（ＬＡ３０）が最も軸索の面積が大きかった。

乾燥前のＬＡＳＣｏｌ濃度が高いと密なスポンジサンプルとなる。したがって、図２１の結果から、再生された神経の軸索が伸長するには、構造的に適度に細かいスペースを有するスポンジ状ＬＡＳＣｏｌが好適であると考えられる。

以上のことからＬＡＳＣｏｌ（ゲルおよび乾燥物）は、神経損傷治療剤として好適に利用できることがわかった。なお、神経細胞は、どの部位の神経細胞であっても、同様の性質を有するので、ＬＡＳＣｏｌは、中枢神経である脊髄損傷治療剤だけでなく、末梢神経を含む神経損傷治療剤として好適に利用することができる。

本発明に係る神経細胞培養材は、神経細胞を培養する際の足場材若しくは添加剤として好適に利用することができる。また、本発明に係る神経損傷治療剤は、脊髄損傷を受けた場合に切断された神経の損傷部分の再生治療に好適に利用することができる。さらに、他の部位における神経細胞の再生治療剤としても利用することができる。

Claims (4)

1. ＬＡＳＣｏｌを含む神経損傷治療剤であって、
   前記ＬＡＳＣｏｌは、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの下記（Ａ）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列においてα１鎖においてＹ _１ とＹ _２ との間の化学結合が切断されている若しくは、下記（Ｂ）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列においてα２鎖のＧとＸ _３ との間の化学結合切断されているコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む、神経損傷治療剤。
   （Ａ）－Ｙ _１ －Ｙ _２ －Ｙ _３ －Ｇ－Ｙ _４ －Ｙ _５ －Ｇ－Ｙ _６ －Ｙ _７ －Ｇ－Ｙ _８ －Ｙ _９ －Ｇ－（
   配列番号１）；
   （但し、Ｇはグリシンであり、Ｙ _１ ～Ｙ _９ は、任意のアミノ酸である）
   （Ｂ）－Ｇ－Ｘ _１ －Ｘ _２ －Ｇ－Ｘ _３ －Ｘ _４ －Ｇ－Ｘ _５ －Ｘ _６ －Ｇ－（配列番号２）；
   （但し、Ｇはグリシンであり、Ｘ _１ ～Ｘ _６ は、任意のアミノ酸である）
2. 前記ＬＡＳＣｏｌは乾燥されていることを特徴とする請求項１に記載された神経損傷治療剤。
3. グリア細胞の増殖を抑制する請求項１または２の何れかの請求項に記載された神経損傷治療剤。
4. 前記神経が脊髄であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか一の請求項に記載された神経損傷治療剤。

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