CN102949750A - 双层电纺仿生骨膜及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明属于组织工程骨修复领域，特别涉及静电丝制备仿生骨膜的技术，方法具体为：将多糖基质的溶液和高分子蛋白混合并充分搅拌，得内膜电纺液；将所述多糖基质的溶液作外膜电纺液；应用静电纺丝装置将所得外膜电纺液制备外膜电纺丝；所述仿生骨膜至少含有两层，其中一层为仿生骨膜内膜，另一层为基于静电纺丝制备的多糖类基质外膜；本发明用多糖基质作载体，对内层膜起保护和阻隔周围环境不利骨质重建的干扰因素；内层用共混纺方法把前期工作中获得有效增强MSCs粘附、增殖效率和生长活力的rFN/CDH融合蛋白包埋在低分子量壳聚糖纳米纤维中，随着壳聚糖纤维降解吸收，膜材料表面暴露出融合蛋白rFN/CDH。

Description

双层电纺仿生骨膜及其制备

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及组织工程骨修复领域。

背景技术

“静电纺丝”一般简称为“静电纺”、“电纺”。1934年，Formalas发明了用静电力制备聚合物纤维的实验装置并申请了专利，其专利公布了聚合物溶液如何在电极间形成射流，这是首次详细描述利用高压静电来制备纤维装置的专利，被公认为是静电纺丝技术制备纤维的开端。但是，从科学基础来看，这一发明可视为静电雾化或电喷的一种特例，其概念可以追溯到1745年。静电雾化与静电纺丝的最大区别在于二者采用的工作介质不同，静电雾化采用的是低粘度的牛顿流体，而静电纺丝采用的是较高粘度的非牛顿流体。所以，静电纺丝是高分子流体静电雾化的特殊形式，此时雾化分裂出的物质不是微小液滴，而是聚合物微小射流，可以运行相当长的距离，最终固化成纤维，原理图详见图1。

大段骨缺损的治疗仍旧是骨科界的难题，当前此领域的研究多聚焦于骨替换材料的改进、良好种子细胞的选择及相应复合技术的开发，尚少关注在植入材料周围包覆一层仿生骨膜，进而探讨该仿生骨膜在植入体周围微环境下的分子作用机制。静电纺丝是制备纳米纤维最重要且最简单的方法，它的优势是能高效率地获得无纺布形式的电纺膜。目前，很多高分子物质已经通过静电纺丝方法成功制备得到电纺膜，但是由于材料本身性能的局限性，限制了它们的应用。为了改善静电纺丝材料的性能和拓宽应用范围，特别是改善在生物材料中的应用性能。我们研究了将rFN/CDH融合蛋白包埋在壳聚糖中电纺制备双层膜，外层为壳聚糖纳米纤维膜，内层为包埋有rFN/CDH的壳聚糖纳米纤维膜。壳聚糖是唯一的碱性天然多糖，是甲壳素脱以乙酰基的衍生物，分子链上具有众多自由氨基，因而可形成聚阳离子电解质。壳聚糖有优良的生物相容性及抗菌、防腐、止血、促进伤口愈合、抑制溃疡等功能，成膜性好，机械强度高，具有生物可降解性。rFN/CDH(双嗜性分子重组纤维连接蛋白/钙粘附蛋白)是以FN和CDH11作为前体分子，通过基因拼接，融合得到的新型蛋白，它能够显著的增强骨髓间充质干细胞的黏附、增值和分化的能力。得到的复合纳米纤维膜可用做仿生骨膜，增强骨损伤修复的效果。到目前为止尚未见报道用电纺技术制备rFN/CDH和壳聚糖双层复合纳米纤维方法。

发明内容

本发明的目的在于提供仿生骨膜的制备方法，该方法是利用静电纺丝技术纺织仿生骨膜，为纳米级纺丝构成的骨膜。

本发明的另一目的在于提供仿生骨膜、仿生骨膜内膜的材料。该材料亲和性高。能在预期的时间降解，利于释放富集骨髓MSCs和成骨细胞的高分子蛋白。

本发明还有一目的，在于提供所述方法制备的骨膜，该骨膜为纳米级的，该骨膜除了高分子蛋白层之外，还包括保护层。

基于静电纺丝制备仿生骨膜的方法，具体包括以下步骤：

A内膜电纺液和外膜电纺液的制备

将多糖基质的溶液和高分子蛋白混合并充分搅拌，得内膜电纺液；将所述多糖基质的溶液作外膜电纺液；

B外膜电纺丝的制备

应用静电纺丝装置将步骤A所得外膜电纺液在电压为20-25kV、注射泵流速为0.3-0.5mL/小时、接收距离为10-15厘米条件下制备得到外膜电纺丝；

C仿生骨膜的制备

在步骤B所得的外膜电纺丝框架下，应用静电纺丝装置制备内膜电纺丝，内膜电纺丝的工艺参数是：将步骤A所述外膜电纺液在电压20-23kV、注射泵流速0.3-0.5ml/小时、接收距离10-20cm的条件下制备内膜电纺丝；

所述制备的内外两层电纺膜，为仿生骨膜。

优选的，步骤A中，所述高分子蛋白为骨形态发生蛋白、纤连蛋白和FN/CDH融合蛋白中的任一种或多种，它们对骨断端处内源性骨髓的骨髓间充质干细胞(MSCs)募集、诱导矿化成骨能力。优选的，步骤A中，所述多糖基质的溶液为聚乙烯醇PVA、聚乳酸PLLA和壳聚糖中的任一种或多种，多糖基质对内层膜起保护和阻隔周围环境不利骨质重建的干扰因素；骨膜外层用高分子量壳聚糖电纺纳米纤维膜，内层用低分子量壳聚糖包埋高分子蛋白制备纳米纤维膜。外层纤维膜降解吸收慢，利于保持膜的完整性，阻隔周围肌肉组织中成纤维细胞等对成骨细胞矿化、骨痂形成的影响；内层膜降解快，利于释放高分子蛋白，在仿生骨膜内层富集骨髓MSCs和成骨细胞等。

进一步，步骤中所述内膜电纺液具体为：所述质量体积分数为3％分子量为88000-102000的壳聚糖溶液和浓度为1-10mg/ml的rFN/CDH融合蛋白溶液以5∶1体积比例混合；所述外膜电纺液为质量体积分数为2％分子量为240000-260000的壳聚糖溶液，所述rFN/CDH融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

进一步，步骤A中所述壳聚糖溶液具体为壳聚糖溶液是以水稀释后的冰乙酸作为溶剂的。

仿生骨膜内膜材料，所述仿生骨膜的内膜材料由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的rFN/CDH融合蛋白包埋于多糖类基质中而成。

进一步，所述多糖类基质为质量体积分数为3％分子量是88000-102000的壳聚糖溶液，所述rFN/CDH融合蛋白为浓度为1-10mg/ml的rFN/CDH融合蛋白溶液，所述多糖类基质与所述rFN/CDH融合蛋白以5∶1体积比例混合。

由所述仿生骨膜内膜材料制备得到的仿生骨膜内膜。

含所述的仿生骨膜内膜的仿生骨膜，所述仿生骨膜至少含有两层，其中一层为仿生骨膜内膜，另一层为基于静电纺丝制备的多糖类基质外膜。

进一步，所述仿生骨膜为两层。

本发明的有益效果在于：1)包覆在骨缺损修复材料周围的仿生骨膜不但适合骨种子细胞在其表面增殖分化，还能募集骨伤环境中的MSCs、成骨细胞并使之驻留在仿生骨膜材料表面参与骨组织重建。2)本方法用壳聚糖等多糖基质作载体，静电纺丝技术制备纳米纤维双层仿生骨膜，外层是高分子量纯壳聚糖纳米纤维膜，对内层膜起保护和阻隔周围环境不利骨质重建的干扰因素；内层用共混纺方法把前期工作中获得有效增强MSCs粘附、增殖效率和生长活力的融合蛋白rFN/CDH包埋在低分子量壳聚糖纳米纤维中，随着壳聚糖纤维降解吸收，膜材料表面暴露出融合蛋白rFN/CDH。

附图说明

图1为静电纺丝技术的原理示意图。

图2为仿生骨膜的使用示意图。

图3为仿生骨膜的照片。

图4为细胞在仿生骨膜上生长的照片。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

骨膜是骨表面除关节外所被覆的坚固的结缔组织包膜。在骨端和肌腱附着部位，非常致密地附着在骨上。其它部位的骨膜厚，容易从骨上剥离。骨膜由两部分构成，外层由胶原纤维紧密结合而成，富有血管、神经，有营养和感觉作用。内层也称形成层，胶原纤维较粗，并含有细胞。生长中的骨膜，在其内面有成骨细胞整齐排列，具有造骨细胞的功能，参与骨的增粗生长，对骨的生长(长长，长粗)和增生(断裂愈合)有重要作用。在老化的骨膜内细胞数减少，也不具备造骨细胞的机能，但在骨的再生过程中可恢复造骨能力，从骨膜向骨组织中进入的粗大纤维称为夏贝氏纤维(Sharpey′s fiber)。在肌肉、腱的附着部位纤维多，可以深入到骨组织中，但在其它部位，夏贝氏纤维数少。代替骨的骨膜系由软骨膜变化而来。内有神经和血管为骨组织提供营养。

rFN/CDH融合蛋白的制备详见申请号为200910103100.6，名称为“纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白、制备方法及应用”的中国发明专利。所述FN/CDH融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

静电纺丝技术，可参照徐松秀的硕士学位论文《静电纺丝纳米纤维的研究》

实施例一

步骤1：将0.8g的壳聚糖(分子量为240000)溶于40ml浓度(以体积百分数计)为25％冰乙酸水溶液，配成浓度为2％(g/ml)的A壳聚糖溶液；将1.2g分子量为88000的壳聚糖溶于40ml浓度(以体积百分数计)为50％冰乙酸水溶液，配成浓度为3％(g/ml)的B壳聚糖溶液，微热磁力搅拌2小时得到透明浅黄色壳聚糖冰乙酸溶液。

步骤2：将10mg的rFN/CDH融合蛋白溶于1ml去离子水，常温下搅拌至完全溶解，得到浓度为10mg/ml的rFN/CDH蛋白溶液。

步骤3：制备内外膜电纺液体：将B壳聚糖溶液和rFN/CDH蛋白溶液以5∶1体积比例混合，得到rFN/CDH蛋白和壳聚糖混合溶液，常温搅拌，得到内膜电纺液体；A壳聚糖溶液作为外膜电纺液体。

步骤4：rFN/CDH/壳聚糖/聚乙烯醇静电纺丝：将步骤(3)得到的内、外膜电纺液体分别加入到10ml注射器中，并将其固定在注射泵上，距针头15cm距离处放置竖直接地的铝箔进行接收。先纺外膜，外膜纺丝条件：电压24～25kV，注射泵流速0.4ml/h，接收距离15cm；纺完外膜后，在外膜表面上继续电纺内膜，内膜纺丝条件电压22kV，注射泵流速0.4ml/h，接收距离15cm。以此得到rFN/CDH和壳聚糖的复合纳米纤维及双层仿生骨膜。

在双层仿生骨膜的基础上，纺织多层仿生骨膜。

实施例二

步骤1：将1.2g壳聚糖(分子量为260000)溶于40ml浓度为25％冰乙酸水溶液，配成浓度为2％(g/ml)的A壳聚糖溶液；将1.2g壳聚糖(分子量为102000)溶于40ml浓度为50％冰乙酸水溶液，配成浓度为3％(g/ml)的B壳聚糖溶液，微热磁力搅拌2小时得到透明浅黄色壳聚糖冰乙酸溶液。

步骤2：将5mg的rFN/CDH融合蛋白溶于1ml去离子水，常温下搅拌至完全溶解，得到浓度为5mg/ml的rFN/CDH蛋白溶液。

步骤3：制备内外膜电纺液体：将B壳聚糖溶液和rFN/CDH蛋白溶液以5∶1体积比例混合，得到rFN/CDH蛋白和壳聚糖混合溶液，常温搅拌，得到内膜电纺液体；A壳聚糖溶液作为外膜电纺液体。

步骤4：rFN/CDH/壳聚糖/聚乙烯醇静电纺丝：将步骤(3)得到的内、外膜电纺液体分别加入到注射器中，并将其固定在注射泵上，距针头20cm距离处放置竖直接地的铝箔进行接收。先纺外膜，外膜纺丝条件：电压24～25kV，注射泵流速0.4ml/h，接收距离15cm；纺完外膜后，在外膜表面上继续电纺内膜，内膜纺丝条件电压22kV，注射泵流速0.4ml/h，接收距离15cm。以此得到rFN/CDH和壳聚糖的复合纳米纤维及双层仿生骨膜。

实施例三

步骤中所述内膜电纺液具体为：所述3％分子量为88000-102000的壳聚糖溶液和浓度为1-10mg/ml的rFN/CDH融合蛋白溶液以5∶1体积比例混合；所述外膜电纺液为质量体积分数为2％分子量为240000-260000的壳聚糖溶液，所述rFN/CDH融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

步骤1：将0.8g壳聚糖(分子量为250000)溶于40ml浓度为25％冰乙酸水溶液，配成浓度为2％(g/ml)的A壳聚糖溶液；将0.8g壳聚糖(分子量为90000)溶于40ml体积浓度为50％冰乙酸水溶液，配成浓度为3％(g/ml)的B壳聚糖溶液，微热磁力搅拌2小时得到透明浅黄色壳聚糖冰乙酸溶液。

步骤2：将10mg的rFN/CDH融合蛋白溶于1ml去离子水，常温下搅拌至完全溶解，得到浓度为10mg/ml的rFN/CDH蛋白溶液。

步骤3：制备内外膜电纺液体：将B壳聚糖溶液和rFN/CDH蛋白溶液以5∶1体积比例混合，得到rFN/CDH蛋白和壳聚糖混合溶液，常温搅拌，得到内膜电纺液体；A壳聚糖溶液作为外膜电纺液体。

步骤4：rFN/CDH/壳聚糖/聚乙烯醇静电纺丝：将步骤(3)得到的内、外膜电纺液体分别加入到注射器中，并将其固定在注射泵上，距针头10cm距离处放置竖直接地的铝箔进行接收。先纺外膜，外膜纺丝条件：电压24～25kV，注射泵流速0.4ml/h，接收距离15cm；纺完外膜后，在外膜表面上继续电纺内膜，内膜纺丝条件电压22kV，注射泵流速0.4ml/h，接收距离15cm。以此得到rFN/CDH和壳聚糖的复合纳米纤维及双层仿生骨膜。

实施例四

所述双层仿生骨膜的结构示意图由图2所示，由近骨髓腔1的植入材料2侧的仿生骨膜内膜3和覆盖在仿生骨膜内膜3之外(远骨髓腔的植入材料侧)的多糖类基质外膜4组成，高分子蛋白5(rFN/CDH蛋白)被包埋于所述仿生骨膜内膜3之中，所述仿生骨膜内膜3是由内膜电纺丝织成，内膜电纺丝是运用静电纺丝技术制备而成。外膜电纺丝构成了多糖类基质外膜。充当内膜电纺液的要求是：1.能够满足基本静电纺丝技术的电纺液的粘度；2.为多糖材料；3.多糖材料中包埋有高分子蛋白，高分子蛋白具有亲和力。充当外膜电纺液的基本条件是：1.能够满足基本静电纺丝技术的电纺液的粘度；2.为多糖材料。所述双层仿生骨膜的照片由图3所示。外层是高分子量纯壳聚糖纳米纤维膜，对内层膜起保护和阻隔周围环境不利骨质重建的干扰因素；内层用共混纺方法把前期工作中获得有效增强MSCs粘附、增殖效率和生长活力的融合蛋白rFN/CDH包埋在低分子量壳聚糖纳米纤维中，随着壳聚糖纤维降解吸收，膜材料表面暴露出融合蛋白rFN/CDH。

将骨髓间充质干细胞细胞接种于所述双层仿生骨膜。图4为细胞在材料表面生长4天后的扫面电镜照片。从图片可以看到，材料表面的细胞都已长满，细胞伸展为多种形态，用伪足紧贴附于材料表面，扫面电镜下没有观察到细胞有趋向于调亡的迹象。这表明仿生骨膜材料具有良好的生物相容性，对细胞的贴壁生长、繁殖没有明显的影响。包覆在骨缺损修复材料周围的仿生骨膜适合骨种子细胞在其表面增殖分化，还能募集骨伤环境中的MSCs、成骨细胞并使之驻留在仿生骨膜材料表面参与骨组织重建。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.基于静电纺丝制备仿生骨膜的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A内膜电纺液和外膜电纺液的制备

将多糖基质的溶液和高分子蛋白混合并充分搅拌，得内膜电纺液；将所述多糖基质的溶液作外膜电纺液；

B外膜电纺丝的制备

应用静电纺丝装置将步骤A所得外膜电纺液在电压为20-25kV、注射泵流速为0.3-0.5mL/小时、接收距离为10-15厘米条件下制备得到外膜电纺丝；

C仿生骨膜的制备

在步骤B所得的外膜电纺丝框架下，应用静电纺丝装置制备内膜电纺丝，内膜电纺丝的工艺参数是：将步骤A所述外膜电纺液在电压20-23kV、注射泵流速0.3-0.5ml/小时、接收距离10-20cm的条件下制备内膜电纺丝；

所述制备的内外两层电纺膜，为仿生骨膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中，所述高分子蛋白为骨形态发生蛋白、纤连蛋白和FN/CDH融合蛋白中的任一种或多种，所述FN/CDH融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A中，所述多糖基质的溶液为聚乙烯醇PVA、聚乳酸PLLA和壳聚糖中的任一种或多种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤中所述内膜电纺液具体为：所述质量体积分数为3％分子量为88000-102000的壳聚糖溶液和浓度为1-10mg/ml的rFN/CDH融合蛋白溶液以5∶1体积比例混合；所述外膜电纺液为质量体积分数为2％分子量为240000-260000的壳聚糖溶液，所述rFN/CDH融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述壳聚糖溶液具体为壳聚糖溶液是以水稀释后的冰乙酸作为溶剂的。

6.仿生骨膜内膜材料，其特征在于，所述仿生骨膜的内膜材料由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的rFN/CDH融合蛋白包埋于多糖类基质中而成。

7.根据权利要求6所述的仿生骨膜内膜材料，其特征在于，所述多糖类基质为质量体积分数为3％分子量为88000-102000的壳聚糖溶液，所述rFN/CDH融合蛋白为浓度为1-10mg/ml的rFN/CDH融合蛋白溶液，所述多糖类基质与所述rFN/CDH融合蛋白以5∶1体积比例混合。

8.由权利要求7或6所述仿生骨膜内膜材料制备得到的仿生骨膜内膜。

9.含有权利要求8所述的仿生骨膜内膜的仿生骨膜，其特征在于，所述仿生骨膜至少含有两层，其中一层为仿生骨膜内膜，另一层为基于静电纺丝制备的多糖类基质外膜。

10.根据权利要求9所述的仿生骨膜内膜的仿生骨膜，其特征在于：所述仿生骨膜为两层。

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