CN105327401B - 丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法，包括外层纺丝液的制备、内层纺丝液的制备、双层仿骨膜材料的制备，所得到的双层纤维膜浸泡于浓度为70‑100%的甲醇／水溶液中进行后处理，得到不溶于水的双层仿骨膜材料。所制备的双层仿骨膜材料可用于骨修复，包裹骨缺损部位。本发明的优势在于：内外层基材相同，层与层之间相容较好；内层与外层分别模拟骨膜的结构进行设计，具有双层结构，外层为丝素负载生长因子，内层为丝素复合羟基磷灰石，分别起到促血管生成和促骨生长能力；双层膜采用静电纺丝技术制备而成，能更好模拟骨膜的微纳米纤维网络结构。
Description
技术领域
本发明涉及仿骨膜材料的制备方法，具体涉及丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法。本方法属于生物材料领域，所制备的材料可广泛用于骨组织修复。
背景技术
人工骨修复材料植入体内后，充分的营养输送对于材料的降解以及组织再生、血管化都至关重要。有研究表明组织液在三维人工骨支架材料中的渗透厚度在0.5cm左右，但支架材料的厚度往往大于这个值，因此大块的支架材料不利于组织液渗透以及细胞向支架深层长入。自体骨的主要优点在于其表面有一层骨膜，其中丰富的微血管能让骨头重新恢复血供，从而在移植部位快速促进骨愈合，因此自体骨修复成功率高。骨膜有内外两层结构，外层主要由胶原纤维紧密结合而成，富有血管网，使骨骼具有活性，并参与骨膜的成骨活动，是成骨关键所在；内层由较粗的胶原纤维、成骨细胞、内皮细胞、干细胞构成，对骨的生长（长长，长粗）和增生（断裂愈合）有重要作用。由此可见，骨膜作为重要界面，能增加骨与周围组织间的融合、利于成骨细胞生长、为骨组织供血等作用，而骨膜的缺失正是自体骨难以自愈合以及异体骨或人工骨材料修复骨缺损失败的重要原因。Hoffman MD等通过使用可降解PEG水凝胶制备的组织工程骨膜用于异体移植骨表面，发现与直接使用异体移植相比，血管化程度增加了2.4倍，软骨内骨化程度增加了2.8倍，生物力学强度增加了1.8倍(Hoffman, M. D., et al. (2013). "The effect of mesenchymal stem cellsdelivered via hydrogel-based tissue engineered periosteum on bone allografthealing." Biomaterials 34(35): 8887-8898.)。Frohbergh, M. E.等通过静电纺丝的方法构建了壳聚糖-羟基磷灰石复合膜，该膜为不能承重的骨材料提供了一个仿骨膜的环境，有利于成骨细胞的生长、增殖和分化，并显示出了很好的骨诱导性(Frohbergh, M. E., etal. (2012). "Electrospun hydroxyapatite-containing chitosan nanofiberscrosslinked with genipin for bone tissue engineering." Biomaterials 33(36):9167-9178.)。而我国兰州大学的赵琳等也尝试用SIS（小肠黏膜下层）作为人工骨膜用于CSD的修复，结果表明复合BMSCs（骨髓间充质干细胞）后对1.5cm长的骨缺损具有明显的修复作用，在12周时可见成熟的骨髓腔形成(Zhao, L., et al. (2011). "Comparativestudy between tissue-engineered periosteum and structural allograft in rabbitcritical-sized radial defect model." Journal of Biomedical Materials ResearchPart B: Applied Biomaterials 97B(1): 1-9.)。这些研究成果证实了采用仿骨膜材料修复骨缺损的可行性，为骨组织修复提供了新思路。
通常组织结构较为复杂，很多组织如血管、皮肤都具有多层结构，这些复杂结构为组织提供了特定的生物环境，为了利用组织工程原理更好的仿生设计组织修复材料，则需要尽可能模拟组织特定的几何结构。模拟组织结构的组织工程支架的构建以及关键因子的掺入(Liu, X., et al. (2014). "Delivery of Growth Factors Using a Smart PorousNanocomposite Scaffold to Repair a Mandibular Bone Defect." Biomacromolecules15(3): 1019-1030.)对于组织修复的成功更为有利。然而，当前报道的仿骨膜材料还仅限于单层结构材料的研究，且较少与其他活性物质复合，尚没有很好的模拟骨膜结构与功能。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法。
为实现这样的目的，本发明通过如下技术方案实现：
一种丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）外层纺丝液的制备： 血管内皮生长因子（VEGF）活化后，加入到纯丝素水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到丝素（SF）/VEGF 纺丝液；
（2）内层纺丝液的制备：在水溶液体系中以丝素为模板，采用共沉淀法合成羟基磷灰石（SF/HA）纳米粒，然后将SF/HA 纳米粒加入到SF 水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到HA/SF纺丝液；
（3）双层仿骨膜材料的制备：接收装置接地后，控制接收距离为10-20厘米，注射器内装入内层纺丝液，加正高压，调节液体流速，得到厚度为0.01-0.1毫米的纤维膜，然后更换注射器内纺丝液为外层纺丝液，加正高压，调节液体流速，得到总厚度为0.05-0.2毫米的双层纤维膜；
（4）所得到的双层纤维膜浸泡于浓度为70-100%的甲醇／水溶液中进行后处理，得到不溶于水的双层仿骨膜材料。
所述VEGF／SF质量比为2ng/mg-20ng/mg。
所述HA/SF质量比为0.01mg/mg-0.1mg/mg。
所述外层纺丝液质量浓度为35%-40%。
所述内层纺丝液质量浓度为30％-36%。
所述正高压为10-30kV。
所述外层液体流速为0.1-1mL/h。
所述内层液体流速为0.1-0.5 mL/h。
本发明目的在于模拟骨膜的双层结构特点，提供双层仿骨膜材料的制备方法，所制备的双层仿骨膜材料可用于骨修复，包裹骨缺损部位。
本发明的优势在于：（1）内外层基材相同，层与层之间相容较好；（2）内层与外层分别模拟骨膜的结构进行设计，具有双层结构，外层为丝素负载生长因子，内层为丝素复合羟基磷灰石，分别起到促血管生成和促骨生长能力；（3）双层膜采用静电纺丝技术制备而成，能更好模拟骨膜的微纳米纤维网络结构。
附图说明
附图1为双层仿骨膜材料设计示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1：
（1）外层纺丝液的制备：VEGF （血管内皮生长因子）活化后，VEGF／SF质量比为2ng/mg加入到纯丝素水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到浓度为38%的SF（丝素）/VEGF 纺丝液；
（2）内层纺丝液的制备：向浓度为0.1%的丝素蛋白水溶液中，加入0.1mol/L的磷酸氢二铵水溶液，然后缓慢加入0.1mol/L硝酸钙溶液，并调节pH=10左右，控制钙磷摩尔比为1.67，控制丝素与羟基磷灰石质量比为0.2，反应两小时后，将溶液离心分离得到沉淀，然后用乙醇反复离心洗涤，冷冻干燥得到 SF/HA（羟基磷灰石）纳米粒，然后将SF/HA 纳米粒加入到SF 水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到浓度为35%的HA/SF纺丝液；
（3）双层仿骨膜材料的制备：接收装置接地后，控制接收距离为15厘米，注射器内装入内层纺丝液，加正15kV高压，调节液体流速为1mL/h，得到厚度为0.1毫米的纤维膜，然后更换注射器内纺丝液为外层纺丝液，加正20kV高压，调节液体流速为0.2 mL/h，得到总厚度为0.02毫米的双层纤维膜；
（4）所得到的双层纤维膜浸泡于浓度为90%的甲醇／水溶液中进行后处理，得到不溶于水的双层仿骨膜材料。
实施例2：
（1）外层纺丝液的制备：VEGF （血管内皮生长因子）活化后，VEGF／SF质量比为10ng/mg加入到纯丝素水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到浓度为40%的SF（丝素）/VEGF 纺丝液；
（2）内层纺丝液的制备：向浓度为0.1%的丝素蛋白水溶液中，加入0.1mol/L的磷酸氢二铵水溶液，然后缓慢加入0.1mol/L硝酸钙溶液，并调节pH=10左右，控制钙磷摩尔比为1.67，控制丝素与羟基磷灰石质量比为0.2，反应两小时后，将溶液离心分离得到沉淀，然后用乙醇反复离心洗涤，冷冻干燥得到 SF/HA（羟基磷灰石）纳米粒，然后将SF/HA 纳米粒加入到SF 水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到浓度为30%的HA/SF纺丝液；
（3）双层仿骨膜材料的制备：接收装置接地后，控制接收距离为15厘米，注射器内装入内层纺丝液，加正15kV高压，调节液体流速为1mL/h，得到厚度为0.03毫米的纤维膜，然后更换注射器内纺丝液为外层纺丝液，加正20kV高压，调节液体流速为0.2 mL/h，得到总厚度为0.1毫米的双层纤维膜；
（4）所得到的双层纤维膜浸泡于浓度为90%的甲醇／水溶液中进行后处理，得到不溶于水的双层仿骨膜材料。
实施例3：
（1）外层纺丝液的制备：VEGF （血管内皮生长因子）活化后，VEGF／SF质量比为20ng/mg加入到纯丝素水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到浓度为40%的SF（丝素）/VEGF 纺丝液；
（2）内层纺丝液的制备：向浓度为0.1%的丝素蛋白水溶液中，加入0.1mol/L的磷酸氢二铵水溶液，然后缓慢加入0.1mol/L硝酸钙溶液，并调节pH=10左右，控制钙磷摩尔比为1.67，控制丝素与羟基磷灰石质量比为0.2，反应两小时后，将溶液离心分离得到沉淀，然后用乙醇反复离心洗涤，冷冻干燥得到 SF/HA（羟基磷灰石）纳米粒，然后将SF/HA 纳米粒加入到SF 水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到浓度为30%的HA/SF纺丝液；
（3）双层仿骨膜材料的制备：接收装置接地后，控制接收距离为15厘米，注射器内装入内层纺丝液，加正15kV高压，调节液体流速为0.5mL/h，得到厚度为0.05毫米的纤维膜，然后更换注射器内纺丝液为外层纺丝液，加正20kV高压，调节液体流速为0.5 mL/h，得到总厚度为0.1毫米的双层纤维膜；
（4）所得到的双层纤维膜浸泡于浓度为90%的甲醇／水溶液中进行后处理，得到不溶于水的双层仿骨膜材料。
实施例4：
（1）外层纺丝液的制备：VEGF （血管内皮生长因子）活化后，VEGF／SF质量比为10ng/mg加入到纯丝素水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到浓度为40%的SF（丝素）/VEGF 纺丝液；
（2）内层纺丝液的制备：向浓度为0.1%的丝素蛋白水溶液中，加入0.1mol/L的磷酸氢二铵水溶液，然后缓慢加入0.1mol/L硝酸钙溶液，并调节pH=10左右，控制钙磷摩尔比为1.67，控制丝素与羟基磷灰石质量比为0.2，反应两小时后，将溶液离心分离得到沉淀，然后用乙醇反复离心洗涤，冷冻干燥得到 SF/HA（羟基磷灰石）纳米粒，然后将SF/HA 纳米粒加入到SF 水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到浓度为35%的HA/SF纺丝液；
（3）双层仿骨膜材料的制备：接收装置接地后，控制接收距离为20厘米，注射器内装入内层纺丝液，加正25kV高压，调节液体流速为0.5mL/h，得到厚度为0.05毫米的纤维膜，然后更换注射器内纺丝液为外层纺丝液，加正15kV高压，调节液体流速为0.5 mL/h，得到总厚度为0.1毫米的双层纤维膜；
（4）所得到的双层纤维膜浸泡于浓度为90%的甲醇／水溶液中进行后处理，得到不溶于水的双层仿骨膜材料。
实施例5：
（1）外层纺丝液的制备：VEGF （血管内皮生长因子）活化后，VEGF／SF质量比为10ng/mg加入到纯丝素水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到浓度为36%的SF（丝素）/VEGF 纺丝液；
（2）内层纺丝液的制备：向浓度为0.1%的丝素蛋白水溶液中，加入0.1mol/L的磷酸氢二铵水溶液，然后缓慢加入0.1mol/L硝酸钙溶液，并调节pH=10左右，控制钙磷摩尔比为1.67，控制丝素与羟基磷灰石质量比为0.2，反应两小时后，将溶液离心分离得到沉淀，然后用乙醇反复离心洗涤，冷冻干燥得到 SF/HA（羟基磷灰石）纳米粒，然后将SF/HA 纳米粒加入到SF 水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到浓度为32%的HA/SF纺丝液；
（3）双层仿骨膜材料的制备：接收装置接地后，控制接收距离为15厘米，注射器内装入内层纺丝液，加正15kV高压，调节液体流速为0.5mL/h，得到厚度为0.1毫米的纤维膜，然后更换注射器内纺丝液为外层纺丝液，加正20kV高压，调节液体流速为0.2 mL/h，得到总厚度为0.2毫米的双层纤维膜；
（4）所得到的双层纤维膜浸泡于浓度为90%的甲醇／水溶液中进行后处理，得到不溶于水的双层仿骨膜材料。
Claims (1)
1.一种丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）外层纺丝液的制备： 血管内皮生长因子（VEGF）活化后，加入到纯丝素水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到丝素（SF）/VEGF 纺丝液；
（2）内层纺丝液的制备：在水溶液体系中以丝素为模板，采用共沉淀法合成丝素羟基磷灰石（SF/HA）纳米粒，然后将SF/HA 纳米粒加入到SF 水溶液中，60℃下搅拌浓缩得到HA/SF纺丝液；
（3）双层仿骨膜材料的制备：接收装置接地后，控制接收距离为10-20厘米，注射器内装入内层纺丝液，加正高压，调节液体流速，得到厚度为0.01-0.1毫米的纤维膜，然后更换注射器内纺丝液为外层纺丝液，加正高压，调节液体流速，得到总厚度为0.05-0.2毫米的双层纤维膜；
（4）所得到的双层纤维膜浸泡于浓度为70-100%的甲醇／水溶液中进行后处理，得到不溶于水的双层仿骨膜材料；
所述VEGF／SF质量比为2ng/mg-20ng/mg；
所述HA/SF质量比为0.01mg/mg-0.1mg/mg；
所述外层纺丝液质量浓度为35%-40%；
所述内层纺丝液质量浓度为30％-36%；
所述正高压为10-30kV；
所述外层液体流速为0.1-1mL/h；
所述内层液体流速为0.1-0.5 mL/h。
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