CN113975469B - 一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜及其制备方法 - Google Patents

一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜及其制备方法，由下到上依次为nHA/SF层、SF层和nZnO/SF层，其中nHA/SF层为覆载羟基磷石灰的丝素蛋白纤维，SF为丝素蛋白纤维，nZnO/SF为覆载氧化锌的丝素蛋白纤维。由基质材料SF作为中间层，提供良好的生物相容性和机械性能，为骨再生提供了足够的时间和空间；氧化锌纳米颗粒(nZnO)加在该三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的外层，提供了良好的抗菌性能；羟基磷灰石纳米颗粒(nHA)加在该功能膜的内层，促进成骨细胞分化和矿化，发挥了良好的促进骨再生的能力。具备良好的生物相容性、骨再生能力和抗菌活性的GBR膜，使其在GBR工程有一定运用潜能。

Description

一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜及其制备方法，属于生物复合材料技术领域。
背景技术
近年来，引导骨组织再生术(guide bone regeneration，GBR)已成为临床上最常用的修复口腔颌面部骨缺损的方法之一。GBR的原理是使用屏障膜(guide boneregeneration membrane，GBRM)阻止上皮结缔组织细胞长入骨缺损区，为骨组织再生提供密闭的空间和充足的时间。作为GBR的重要组成部分，传统的GBRM的主要功能是物理屏障，分离骨缺损与相邻软组织。随着科学技术的发展和骨再生效果的需求，理想的屏障膜还应具备良好的生物相容性、机械性能和成骨性能。此外，由于口腔环境中微生物种类繁多，微生物感染常常导致GBR失败，骨再生效果不佳。因此，理想的GBR膜还应具备一定的抗菌性能，以控制感染，提高GBR的治疗效果。
目前，研究用于GBRM的材料很多，比如聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA),聚(ε-己内酯)(poly(ε-caprolactone)，PCL)，胶原蛋白，明胶及其共聚物等。从蚕茧中提取的天然丝素蛋白(silk fibroin，SF)，因其具有良好的生物相容性、优异的机械性能和降解性能，已广泛应用于生物医学和生物技术等领域，比如作为伤口敷料、药物载体和组织工程支架等。SF可加工性强，经过不同的制备工艺可以形成凝胶、薄膜、海绵、纤维和微球等结构。
静电纺丝是一种技术简单且价格低廉的聚合物加工技术，通过该技术制备的纤维直径在数微米到数纳米之间，形成的支架材料具有较高的比表面积和可调节的孔隙率，能够模拟天然细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，为细胞生长提供良好的微环境，因此该技术广泛用于制备组织工程支架。此外，通过调节静电纺丝溶液的成分可以调节纳米纤维的直径和生物活性等，通过控制静电纺丝纤维的排列方向从而调控机械性能等，形成具有多级结构多功能的生物活性材料。例如，He et al.用两个对称有序的纳米纤维表层和一个随机排列的芯层制备了一种具有分级结构的引导组织再生膜(guide tissueregeneration membrane，GTRM)。该GTRM的两个表层具有适宜的孔隙率，促进细胞的黏附和生长；纳米纤维随机排列的芯层结构为材料提供良好的机械性能，支撑上层结缔组织，以防上层结缔组织塌陷，为组织再生提供生长空间。
GBR的最终目的是获得良好的骨再生效果，因此理想的GBRM应具有局部促进骨再生的能力。
尽管在GBR中使用GBRM取得了相当显著的骨再生效果，但组织再生高度依赖于无感染的局部环境。由于口腔环境中微生物种类繁多，因此，具有抗菌活性的GBRM对GBR来说至关重要。近来，抗生素被加入到GBRM中，赋予它们抗菌活性。但抗生素的频繁使用会产生耐药性，因此，开发利用一种更安全的抗菌剂以替代抗生素用于GBR由为重要。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，本发明还提供了其制备方法。
为了实现上述第一目的，本发明的技术方案为：一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，其特征在于，由下到上依次为nHA/SF层、SF层和nZnO/SF层，其中nHA/SF层为覆载羟基磷石灰的丝素蛋白纤维，SF为丝素蛋白纤维，nZnO/SF为覆载氧化锌的丝素蛋白纤维。
复合纳米纤维膜由基质材料SF作为中间层，提供良好的生物相容性和机械性能，为骨再生提供了足够的时间和空间；氧化锌纳米颗粒(nZnO)加在该三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的外层，提供了良好的抗菌性能；羟基磷灰石纳米颗粒(nHA)加在该功能膜的内层，促进成骨细胞分化和矿化，发挥了良好的促进骨再生的能力。
本发明的第二目的是这样实现的：一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，按照如下方法制备：
(1)丝素蛋白纤维制备：蚕丝脱胶得到丝素蛋白纤维；
(2)丝素蛋白溶解液制备：将丝素蛋白纤维溶解于溴化锂溶液中,制得丝素蛋白纤维和溴化锂的混合溶液，透析，得到丝素蛋白溶液；
(3)丝素蛋白溶液浓缩：将丝素蛋白水溶液离心去除杂质沉淀，然后浓缩装置浓缩形成大于9％的丝素溶液；
(4)丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液制备，PEO加去离子水配制成溶液；将PEO溶液加入丝素溶液中，形成丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液；
(5)用GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒(nHA)；
(6)羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备,将GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒与丝素溶液混合得到羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液；
(7)氧化锌-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备,将氧化锌加入到丝素溶液中，配置氧化锌丝素电纺溶液；
(8)采用静电纺丝技术将步骤(6)、步骤(4)和步骤(7)中纺丝溶液按顺序制成底层为nHA/SF、中间层为SF、上层nZnO/SF的多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜。
(9)所述的多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜除去PEO，冻干，即获得静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜。
上述方案中，步骤(1)为：将桑蚕茧去蛹后的茧层剪成茧片，放入Na2CO3沸水溶液中进行脱胶处理，然后将已成纤维状的蚕茧去除，彻底清洗后拧干，干燥得到脱胶的丝素蛋白纤维。
上述方案中，步骤(2)为：将脱胶的纤维状丝素蛋白加入摩尔浓度为9-10mol/L的LiBr溶液中，温度60-70℃，浸泡溶解后经透析获得质量百分比浓度为5-7％的丝素蛋白溶液。
上述方案中，步骤(4)中，PEO溶液的浓度为4-6％(w/v)；将PEO溶液加入到丝素溶液中，搅拌，形成丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液。
上述方案中，丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液中SF:PEO为3:1(w/w)，增加黏性。
上述方案中，步骤(5)中，用GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒的方法为：在GPTMS-乙醇溶液中加入羟基磷灰石，在60-70℃下搅拌反应，溶液在对流炉下烘干，蒸发乙醇，然后真空烘箱中干燥得到GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒(GPTMS-nHA)。
上述方案中，氧化锌丝素电纺溶液的配制方法为：将氧化锌悬浮于去离子水中，超声得到水悬浮液，然后氧化锌水悬浮液与SF溶液混合，搅拌过夜，再加入PEO溶液，达到SF:PEO＝3:1(w/w)，搅拌过夜，形成nZnO/SF静电纺丝溶液，备用。
上述方案中，羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备为：将GPTMS-nHA悬浮在去离子水中，超声得到水悬浮液；然后GPTMS-nHA溶液与S丝素溶液混合，搅拌过夜；再加入PEO溶液，达到SF:PEO为3:1(w/w))增加黏性，搅拌，形成羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液(nHA/SF静电纺丝溶液)，备用。羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液中，GPTMS-nHA的质量为丝素蛋白纤维的质量的20％。
静电纺丝技术为：首先将含nHA/SF溶液置于注射器中，选用17号平口针头，在电压为14Kv，接受距离为15cm，纺丝流量为0.5-1mL/h的条件下采用静电纺丝制备nHA/SF膜；再将SF溶液置于注射器中，选用17号针头，在电压为14Kv，接受距离为15cm，纺丝流量为0.5-1mL/h的条件下采用静电纺丝制备SF膜；相同参数，再将nZnO/SF进行电纺，制成底层底层为nHA/SF,中间层为SF,上层nZnO/SF的三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜。
上述方案中，步骤(9)为：将多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜浸泡于甲醇中，诱导丝素蛋白β折叠，形成稳定结构，然后浸泡在去离子水中，除去PEO，经冷冻干燥，即形成多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜。
本发明从蚕茧中提取具有良好生物相容性和机械性能的SF作为基质材料，通过序列电纺载nZnO的SF混合溶液(nZnO/SF)、SF溶液、载nHA的SF混合溶液(nHA/SF)，制备一种新型多功能三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜(nZnO/SF/nHA)。一方面，nZnO/SF作为外层，直接与口腔中的结缔组织和牙龈组织相邻，发挥抗菌作用，控制局部伤口感染；另一方面，nHA/SF作为内层，直接与骨缺损区接触并诱导骨再生；而中间层由纯SF基质组成，屏障上皮细胞的长入，为骨再生提供一个密闭的空间。这种独特的三明治样层次结构旨在适应口腔软组织和硬组织之间的组织学复杂性。
有益效果：
(1)本发明的底层为nHA/SF,中间层为SF,上层nZnO/SF的三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜中，所使用的原材料廉价易得。
(2)本发明的底层为nHA/SF,中间层为SF,上层nZnO/SF的三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜中，采用静电纺丝技术，方法操作简单，可调、重复性好，耗时较少，可获得直径和孔径在纳米级的膜材料。
(3)该方法使羟基磷灰石纳米颗粒分散于丝素蛋白纤维纳米纤维膜内部，有效地解决现有技术中掺羟基磷灰石纳米颗粒聚集的问题，有效提高材料的机械性能。
(4)该方法使氧化锌纳米颗粒分散于丝素蛋白纤维纳米纤维膜内部，形成氧化锌缓释的作用，有效提高材料可控的长期稳定的抗菌性能。
(5)本发明丝素蛋白纤维复合材料，通过羟基磷灰石对骨代谢的作用，其能促进成骨细胞的分化增生，可以在制备骨修复材料中应用，作为GBR膜下层，促进骨形成、再生。通过缓释氧化锌的作用，局部抗菌，止血，促进表面伤口愈合。
(6)本发明制备的底层为nHA/SF,中间层为SF,上层nZnO/SF的三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜中，丝素蛋白复合纳米纤维生物膜纤维为纳米结构，具有一定的空隙，有利于细胞长入，该纳米纤维膜与天然骨细胞外基质(ECM)形态结构相似，能够促进细胞附着和干细胞分化，促进骨组织再生，有望应用于GBR。
(7)本发明制备的底层为nHA/SF,中间层为SF,上层nZnO/SF的三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜中，SF和SF-ZnO抑制、隔绝成纤维细胞的长入，用于GBR，有效隔绝周围结缔组织的长入，更好的给与底部骨再生时间和空间，更有利于种植体周围骨结合，缺损区骨再生。
附图说明
图1为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜示意图。
图2为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的直观图像
图3为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的应变曲线。
图4为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的弹性模量柱状图。
图5为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的断裂韧性效果图。
图6为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的成骨性能效果图。
图7为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的抗菌性能效果图。
图8为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的体内成骨性能效果图。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图，对本发明作进一步说明：
本发明的GPTMS为γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷的简称。
PEO为聚环氧乙烷。
实施例1
一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，由下到上依次为nHA/SF层、SF层和nZnO/SF层，其中nHA/SF层为覆载羟基磷石灰的丝素蛋白纤维，SF为丝素蛋白纤维，nZnO/SF为覆载氧化锌的丝素蛋白纤维。
制备方法为：
(1)丝素蛋白纤维制备：将桑蚕茧去蛹后的茧层剪成茧片，放入0.02mol/L的Na2CO3沸水溶液中进行脱胶处理，然后将已成纤维状的蚕茧去除，彻底清洗后拧干，放入37℃恒温干燥烘箱中干燥得到脱胶的丝素蛋白纤维。
(2)丝素蛋白溶解液制备：将脱胶的纤维状丝素蛋白加入摩尔浓度为10mol/L的LiBr溶液中，温度60-70℃，浸泡溶解后经透析获得质量百分比浓度为6％的丝素蛋白溶液。
(3)丝素蛋白溶液浓缩：将丝素蛋白水溶液离心去除杂质沉淀，然后浓缩装置浓缩形成9％的丝素溶液。
(4)丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液制备
将5g PEO(MW 900,000)溶解于100ml去离子水中，室温磁力搅拌5d，配置成5％(w/v)的PEO溶液。
将1.5ml PEO(5％,w/v)溶液加入到2.5ml 9wt.％SF溶液(丝素溶液)中，达到(SF:PEO＝3:1(w/w)增加黏性，搅拌过夜，形成丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液，备用。
(5)用GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒(nHA)，在2％(v/v)GPTMS-乙醇溶液中加入nHA，在60-70℃下120rpm搅拌2h。溶液在对流炉120℃下烘干2h，蒸发乙醇。然后GPTMS-nHA在120℃真空烘箱中干燥24h。干燥储存，备用。
(6)羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备,将GPTMS-nHA悬浮在去离子水中，超声5min得到浓度为20wt.％的水悬浮液。然后0.225ml GPTMS-nHA溶液与2.5ml9wt.％SF溶液混合，搅拌过夜，再加入1.5ml5％(w/v)的PEO溶液，达到SF:PEO＝3:1(w/w)，增加黏性，搅拌过夜，形成nHA/SF静电纺丝溶液，备用。
(7)氧化锌-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备,将氧化锌悬浮于去离子水中，超声5min得到浓度为20wt.％的水悬浮液。然后0.225ml氧化锌水悬浮液溶液与2.5ml 9wt.％SF溶液混合，搅拌过夜，再加入1.5ml5％(w/v)的PEO溶液，达到SF:PEO＝3:1(w/w)，增加黏性，搅拌过夜，形成nZnO/SF静电纺丝溶液，备用。
(8)采用静电纺丝技术将步骤(6)、步骤(4)和步骤(7)中纺丝溶液按顺序制成底层为nHA/SF、中间层为SF、上层nZnO/SF的多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜。具体的首先将含2ml nHA/SF溶液置于注射器中，选用17号平口针头，在电压为14Kv，接受距离为15cm，纺丝流量为0.5-1mL/h的条件下采用静电纺丝制备nHA/SF膜；再将SF溶液置于注射器中，选用17号针头，在电压为14Kv，接受距离为15cm，纺丝流量为0.5-1mL/h的条件下采用静电纺丝制备SF膜；相同参数，再将nZnO/SF进行电纺，制成底层为nHA/SF,中间层为SF,上层nZnO/SF的三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜。
(9)多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜在甲醇中浸泡15min，诱导丝素蛋白β折叠，形成稳定结构；然后浸泡在去离子水中48h，除去PEO。经过-20℃预冷2h，-80℃预冷12h，放入-50℃冷冻干燥机中干燥，即形成多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜。
实施例2
一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，由下到上依次为nHA/SF层、SF层和nZnO/SF层，其中nHA/SF层为覆载羟基磷石灰的丝素蛋白纤维，SF为丝素蛋白纤维，nZnO/SF为覆载氧化锌的丝素蛋白纤维。
制备方法为：
(1)丝素蛋白纤维制备：将桑蚕茧去蛹后的茧层剪成茧片，放入0.02mol/L的Na2CO3沸水溶液中进行脱胶处理，然后将已成纤维状的蚕茧去除，彻底清洗后拧干，放入37℃恒温干燥烘箱中干燥得到脱胶的丝素蛋白纤维。
(2)丝素蛋白溶解液制备：将脱胶的纤维状丝素蛋白加入摩尔浓度为9mol/L的LiBr溶液中，温度60-70℃，浸泡溶解后经透析获得质量百分比浓度为7％的丝素蛋白溶液。
(3)丝素蛋白溶液浓缩：将丝素蛋白水溶液离心去除杂质沉淀，然后浓缩装置浓缩形成9％的丝素溶液。
(4)丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液制备
将6g PEO(MW 900,000)溶解于100ml去离子水中，室温磁力搅拌5d，配置成6％(w/v)的PEO溶液。
将1.25ml PEO(6％,w/v)溶液加入到2.5ml 9wt.％SF溶液中，达到SF:PEO＝3:1(w/w)增加黏性，搅拌过夜，形成丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液，备用。
(5)用GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒(nHA)，在2％(v/v)GPTMS-乙醇溶液中加入nHA，在60-70℃下120rpm搅拌2h。溶液在对流炉120℃下烘干2h，蒸发乙醇。然后GPTMS-nHA在120℃真空烘箱中干燥24h。干燥储存，备用。
(6)羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备,将GPTMS-nHA悬浮在去离子水中，超声5min得到浓度为20wt.％的水悬浮液。然后0.225ml GPTMS-nHA溶液与2.5ml9wt.％SF溶液混合，搅拌过夜，再加入1.25ml6％(w/v)的PEO溶液，达到SF:PEO＝3:1(w/w)，增加黏性，搅拌过夜，形成nHA/SF静电纺丝溶液，备用。
(7)氧化锌-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备,将氧化锌悬浮于去离子水中，超声5min得到浓度为20wt.％的水悬浮液。然后0.225ml氧化锌水悬浮液溶液与2.5ml 9wt.％SF溶液混合，搅拌过夜，再加入1.25ml 6％(w/v)的PEO溶液，达到SF:PEO＝3:1(w/w)，增加黏性，搅拌过夜，形成nZnO/SF静电纺丝溶液，备用。
(8)采用静电纺丝技术将步骤(6)、步骤(4)和步骤(7)中纺丝溶液按顺序制成底层为nHA/SF、中间层为SF、上层nZnO/SF的多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜。具体的首先将含2ml nHA/SF溶液置于注射器中，选用17号平口针头，在电压为14Kv，接受距离为15cm，纺丝流量为0.5-1mL/h的条件下采用静电纺丝制备nHA/SF膜；再将SF溶液置于注射器中，选用17号针头，在电压为14Kv，接受距离为15cm，纺丝流量为0.5-1mL/h的条件下采用静电纺丝制备SF膜；相同参数，再将nZnO/SF进行电纺，制成底层为nHA/SF,中间层为SF,上层nZnO/SF的三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜。
(9)多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜在甲醇中浸泡15min，诱导丝素蛋白β折叠，形成稳定结构；然后浸泡在去离子水中48h，除去PEO。经过-20℃预冷2h，-80℃预冷12h，放入-50℃冷冻干燥机中干燥，即形成多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜。
实施例3
一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，由下到上依次为nHA/SF层、SF层和nZnO/SF层，其中nHA/SF层为覆载羟基磷石灰的丝素蛋白纤维，SF为丝素蛋白纤维，nZnO/SF为覆载氧化锌的丝素蛋白纤维。
制备方法为：
(1)丝素蛋白纤维制备：将桑蚕茧去蛹后的茧层剪成茧片，放入0.02mol/L的Na2CO3沸水溶液中进行脱胶处理，然后将已成纤维状的蚕茧去除，彻底清洗后拧干，放入37℃恒温干燥烘箱中干燥得到脱胶的丝素蛋白纤维。
(2)丝素蛋白溶解液制备：将脱胶的纤维状丝素蛋白加入摩尔浓度为9.3mol/L的LiBr溶液中，温度60-70℃，浸泡溶解后经透析获得质量百分比浓度为5％的丝素蛋白溶液。
(3)丝素蛋白溶液浓缩：将丝素蛋白水溶液离心去除杂质沉淀，然后浓缩装置浓缩形成9％的丝素溶液。
(4)丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液制备
将4g PEO(MW 900,000)溶解于100ml去离子水中，室温磁力搅拌5d，配置成4％(w/v)的PEO溶液。
将1.875ml PEO(4％,w/v)溶液加入到2.5ml 9wt.％SF溶液中，达到SF:PEO＝3:1(w/w)增加黏性，搅拌过夜，形成丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液，备用。
(5)用GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒(nHA)，在2％(v/v)GPTMS-乙醇溶液中加入nHA，在60-70℃下120rpm搅拌2h。溶液在对流炉120℃下烘干2h，蒸发乙醇。然后GPTMS-nHA在120℃真空烘箱中干燥24h。干燥储存，备用。
(6)羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备,将GPTMS-nHA悬浮在去离子水中，超声5min得到浓度为20wt.％的水悬浮液。然后0.225ml GPTMS-nHA溶液与2.5ml9wt.％SF溶液混合，搅拌过夜，再加入1.875ml4％(w/v)的PEO溶液，达到SF:PEO＝3:1(w/w)，增加黏性，搅拌过夜，形成nHA/SF静电纺丝溶液，备用。
(7)氧化锌-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备,将氧化锌悬浮于去离子水中，超声5min得到浓度为20wt.％的水悬浮液。然后0.225ml氧化锌水悬浮液溶液与2.5ml 9wt.％SF溶液混合，搅拌过夜，再加入1.875ml 4％(w/v)的PEO溶液，达到SF:PEO＝3:1(w/w)，增加黏性，搅拌过夜，形成nZnO/SF静电纺丝溶液，备用。
(8)采用静电纺丝技术将步骤(6)、步骤(4)和步骤(7)中纺丝溶液按顺序制成底层为nHA/SF、中间层为SF、上层nZnO/SF的多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜。具体的首先将含2ml nHA/SF溶液置于注射器中，选用17号平口针头，在电压为14Kv，接受距离为15cm，纺丝流量为0.5-1mL/h的条件下采用静电纺丝制备nHA/SF膜；再将SF溶液置于注射器中，选用17号针头，在电压为14Kv，接受距离为15cm，纺丝流量为0.5-1mL/h的条件下采用静电纺丝制备SF膜；相同参数，再将nZnO/SF进行电纺，制成底层为nHA/SF,中间层为SF,上层nZnO/SF的三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜。
(9)多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜在甲醇中浸泡15min，诱导丝素蛋白β折叠，形成稳定结构；然后浸泡在去离子水中48h，除去PEO。经过-20℃预冷2h，-80℃预冷12h，放入-50℃冷冻干燥机中干燥，即形成多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜。
对本发明的理化性能、抗菌性能和体内外成骨性能进行研究结果如图3-8所示：
图3-5展示了该膜的机械性能，应变曲线及弹性模量和断裂韧性统计分析显示，nHA/SF的弹性模量最高(25.7MPa)，而nZnO/SF/nHA膜的断裂伸长率(3.97％)和nZnO/SF膜的断裂伸长率(5.32％)均高于SF膜。nHA的加入提高了膜的弹性模量，nZnO的加入则提高了材料的断裂韧性。
图6为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的成骨性能效果图，采用Real-time PCR检测MC3T3-E1细胞的成骨分化，ALP染色检测MC3T3-E1细胞的成骨分化。从图6可以看出，三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的成骨性能最好。
图7为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的抗菌性能效果图，图中显示A:对照组(CTR)，SF，nZnO/SF和nZnO/SF/nHA膜培养24小时后的菌落照片；对金黄色葡萄球菌(B)和大肠杆菌(C)的抗菌能力(OD630)。从图中可以看出，本发明的三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌(B)和大肠杆菌(C)有较强的抗菌能力。
图8为静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的体内成骨性能效果图。展示了Micro-CT分析术后12周体内骨再生情况。A：Micro-CT图像。B：Micro-CT定量分析。注:BV/TV，骨体积分数；Tb.Th，骨小梁厚度；Tb.Sp，骨小梁分离；*p<0.05，**p<0.01。本发明的三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜的体内成骨性能优良。
本发明不局限于上述实实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，其特征在于：由下到上依次为nHA/SF层、SF层和nZnO/SF层，其中nHA/SF层为覆载羟基磷石灰的丝素蛋白纤维，SF为丝素蛋白纤维，nZnO/SF为覆载氧化锌的丝素蛋白纤维；按照如下方法制备：
(1) 丝素蛋白纤维制备：蚕丝脱胶得到丝素蛋白纤维;
(2) 丝素蛋白溶解液制备：将丝素蛋白纤维溶解于溴化锂溶液中,制得丝素蛋白纤维和溴化锂的混合溶液，透析，得到丝素蛋白溶液；
(3) 丝素蛋白溶液浓缩：将丝素蛋白水溶液离心去除杂质沉淀，然后浓缩装置浓缩形成大于等于9 % 的丝素溶液；
(4) 丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液制备， PEO加去离子水配制成溶液；将PEO溶液加入丝素溶液中，形成丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液；
(5) 用GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒（nHA）；
(6) 羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备,将GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒与丝素溶液混合得到羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液；用GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒的方法为：在GPTMS-乙醇溶液中加入羟基磷灰石，在60-70℃下搅拌反应，溶液在对流炉下烘干，蒸发乙醇，然后真空烘箱中干燥得到GPTMS修饰羟基磷灰石纳米颗粒（GPTMS-nHA）；
(7) 氧化锌-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备,将氧化锌悬浮于去离子水中，超声得到水悬浮液，然后氧化锌水悬浮液与SF溶液混合，搅拌过夜，再加入PEO溶液，达到 SF:PEO =3:1 w/w，搅拌过夜，形成nZnO/SF静电纺丝溶液，备用；
(8) 采用静电纺丝技术将步骤(6) 、步骤(4)和步骤 (7)中纺丝溶液按顺序制成底层为nHA/SF、中间层为SF、上层nZnO/SF的多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜；
（9) 将多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜浸泡于甲醇中，诱导丝素蛋白β折叠，形成稳定结构，然后浸泡在去离子水中，除去PEO，经冷冻干燥，即形成多层丝素蛋白复合纳米纤维生物膜。
2.根据权利要求1所述静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，其特征在于，步骤（1）为：将桑蚕茧去蛹后的茧层剪成茧片，放入Na2CO3沸水溶液中进行脱胶处理，然后将已成纤维状的蚕茧去除，彻底清洗后拧干，干燥得到脱胶的丝素蛋白纤维。
3.根据权利要求2所述静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，其特征在于，步骤（2）为：将脱胶的纤维状丝素蛋白加入摩尔浓度为9-10mol/L的LiBr溶液中，温度60-70°C，浸泡溶解后经透析获得质量百分比浓度为5-7%的丝素蛋白溶液。
4.根据权利要求3所述静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，其特征在于：步骤（4）中，PEO溶液的浓度为4-6%w/v；将 PEO溶液加入到丝素溶液中，搅拌，形成丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液。
5.根据权利要求4所述静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，其特征在于：丝素蛋白纳米纤维膜静电纺丝溶液中 SF:PEO 为3:1 w/w。
6.根据权利要求5所述静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，其特征在于，羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液制备为：将GPTMS-nHA悬浮在去离子水中，超声得到水悬浮液；然后GPTMS-nHA溶液与丝素溶液混合，搅拌过夜；再加入PEO溶液，达到 SF:PEO 为3:1 w/w增加黏性，搅拌，形成羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液（nHA/SF静电纺丝溶液），备用。
7.根据权利要求6所述静电纺丝三明治样丝素蛋白复合纳米纤维膜，其特征在于：羟基磷灰石-丝素蛋白纤维混合纺丝溶液中，GPTMS-nHA的质量为丝素蛋白纤维的质量的20%。
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