CN114225116A - 一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜及其制备方法,所述制备方法包括如下步骤:(1)通过静电纺丝制备包括微米级纤维和纳米级纤维的复合纤维支架;所述微米级纤维的纺丝液为聚己内酯溶液,所述纳米级纤维的纺丝液为透明质酸和胶原的混合溶液;(2)对所述纤维支架进行交联处理,得到所述人工骨膜的纤维层;(3)将所述纤维层依次浸泡于多巴胺溶液和生长因子溶液中,得到所述人工骨膜。本发明提供的人工骨膜能够缓慢、且持续释放透明质酸和生长因子,从而满足骨组织修复后期的需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,特别涉及一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜及其制备方法。
背景技术
骨膜是骨表面除关节外所被覆的坚固的结缔组织包膜,是很多功能细胞的天然来源,这些细胞可以向不同的细胞系定向分化以满足不同的修复要求。骨膜中有大量的血管网,使骨骼具有活性,并参与成骨活动,是成骨关键所在;此外骨膜中还拥有众多细胞及生长因子以作用于修复,对骨生长和增生有重要作用。骨膜的缺失正是自体骨难以自愈合以及异体骨或人工骨材料修复骨缺损失败的重要原因。因而,有必要在体外制备能够模拟天然骨膜的结构与功能的人工骨膜。
透明质酸(HA)是一种高分子量的直链粘多糖,是关节液和关节软骨的主要成分,在正常的组织功能和发育过程中具有重要作用,多项研究表明,HA具有抑制软骨基质被破坏和促进软骨基质合成的作用,促进骨间充质细胞再生、趋化、增殖与分化,并可作用于骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和骨桥蛋白(OPN)从而诱导成骨。生长因子是一类通过与特异性高亲和的细胞膜受体结合后,调节细胞生长与其他细胞功能的多效应的多肽类物质,生长因子能够促进生成大量的成骨细胞、抑制破骨细胞,治疗骨质酥松、股骨头坏死、关节炎等。
骨膜、透明质酸(HA)和生长因子在天然骨生长、骨折愈合、骨再生过程中均有重要的作用。目前,临床上采取诱导骨膜的方式进行骨修复,效果较好,但临床上可使用的人工骨膜较少,且透明质酸(HA)和生长因子在人体中易被降解吸收,很难保证骨组织修复后期的需求。因此,有必要研究一种能够缓慢、持续释放透明质酸(HA)和生长因子的人工骨膜,以改善现有人工骨膜在临床治疗上的难题。
发明内容
为了解决上述问题,本发明实施例提供了一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜及其制备方法,该人工骨膜能够缓慢、且持续释放透明质酸和生长因子,从而满足骨组织修复后期的需求。
第一方面,本发明提供了一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
(1)通过静电纺丝制备包括微米级纤维和纳米级纤维的复合纤维支架;所述微米级纤维的纺丝液为聚己内酯溶液,所述纳米级纤维的纺丝液为透明质酸和胶原的混合溶液;
(2)对所述复合纤维支架进行交联处理,得到所述人工骨膜的纤维层;
(3)将所述纤维层依次浸泡于多巴胺溶液和生长因子溶液中,得到所述人工骨膜。
优选地,在步骤(1)中,所述聚己内酯溶液的质量浓度为200~300g/L;
所述聚己内酯溶液的溶剂为体积比为5:1的三氯甲烷和无水甲醇的混合溶剂;
其中,所述聚己内酯溶液中聚己内酯的重均分子量为2~20万。
优选地,在步骤(1)中,所述混合溶液由胶原溶液和透明质酸溶液混合而成;其中;所述胶原溶液的溶剂为六氟异丙醇,所述透明质酸溶液的溶剂为体积比为7:3的六氟异丙醇和甲酸的混合溶剂;
所述混合溶液中所述透明质酸的质量浓度为0.4~2g/L,所述胶原的质量浓度为32~40g/L。
优选地,在步骤(1)中,所述透明质酸的分子量为800~1200kDa。
优选地,所述步骤(1)包括如下子步骤:
(11)将所述聚己内酯溶液和所述混合溶液分别注入两个注射器中,且每个注射器均与一个注射泵相连接;
(12)将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将所述铝箔作为接收基底材料,同时开启两个注射泵,在所述铝箔上通过静电纺丝形成所述复合纤维支架;
其中,所述复合纤维支架中所述微米级纤维的直径为7~15μm,所述纳米级纤维的直径为500~1000nm。
优选地,在步骤(12)中,采用所述聚己内酯溶液进行所述静电纺丝的注射泵流速为1~4mL/h,电压为11~17kV,接收距离为15~22cm,接收器的转速为180~240r/min;
采用所述混合溶液进行所述静电纺丝的注射泵流速为0.5~2mL/h,电压为15~22kV,接收距离为9~15cm,接收器的转速为180~240r/min。
优选地,在步骤(12)中,所述静电纺丝的时间为1.5~5h。
优选地,所述步骤(2)包括如下子步骤:
将所述复合纤维支架置于浓度为2~30mmol/L的交联液中并于-5~0℃下交联4~12h,然后用纯化水进行清洗后,再进行冷冻干燥处理,得到所述人工骨膜的纤维层;
其中,所述交联液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液;优选地,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:4。
优选地,所述步骤(3)包括如下子步骤:
(31)将多巴胺盐酸溶于10mM的Tris缓冲液和无水乙醇的混合液中,得到所述多巴胺溶液;其中,所述Tris缓冲液的pH为8.5;
(32)将所述纤维层浸泡于所述多巴胺溶液中,并在18~25℃下放置8~24h,然后用纯化水进行清洗,再进行风干处理;以及将所述纤维层再浸泡于所述生长因子溶液中,在-5~0℃下放置8~24h,然后用纯化水进行清洗,再进行干燥处理,得到所述人工骨膜。
优选地,所述多巴胺溶液的浓度为0.5~4mg/mL;
所述生长因子溶液的浓度为5~30μg/mL;
所述生长因子为重组人骨形成蛋白-2、小球藻生长因子、富血小板血浆或富血小板纤维蛋白中的至少一种。
优选地,在步骤(31)中,所述Tris缓冲液和所述无水乙醇的体积比为(7~9):(1~3);
在步骤(32)中,所述干燥处理的温度为35~38℃,时间为10~18h。
第二方面,本发明提供了一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜,采用上述第一方面任一所述的制备方法制备得到。
本发明与现有技术相比至少具有如下有益效果:
(1)本发明将聚己内酯溶液和透明质酸和胶原的混合溶液分别通过静电纺丝一步法制得包括微米级纤维和纳米级纤维的复合纤维支架,微米级纤维的聚己内酯作为纤维支架的主要骨架部分,纳米级的透明质酸和胶原均匀分布在微米级纤维的骨架之间,经交联后,胶原的降解速率变慢,随着胶原的降解,透明质酸能够实现缓慢、持续的释放;同时,通过多巴胺溶液将生长因子接枝到纤维支架表面,根据纤维层本身的降解特点,因此生长因子也能够实现缓慢、持续释放;
(2)本发明中的微米级纤维聚己内酯具有良好的生物相容性,且降解产物无毒;同时微米级纤维能够允许纤维细胞通过,并且纳米级纤维的内部含有大量的胶原和透明质酸,不仅可以引导细胞黏附和爬行,而且可以促进软骨基质的合成;
(3)本发明中的透明质酸和生长因子的协同作用可以促进骨再生细胞的增殖和分化,并且生长因子和透明质酸的释放速度与骨膜的生成速度相匹配,能够满足骨组织修复后期的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的一种纤维支架的显微镜图;
图2是本发明实施例提供的一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜的显微镜图;
图3是本发明实施例1和实施例7提供的人工骨膜的透明质酸的释放速率图;
图4是本发明实施例1和对比例2提供的人工骨膜的生长因子的释放速率图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明第一方面提供了一种可缓释透明质酸的人工骨膜的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
(1)通过静电纺丝制备包括微米级纤维和纳米级纤维的复合纤维支架;所述微米级纤维的纺丝液为聚己内酯溶液,所述纳米级纤维的纺丝液为透明质酸和胶原的混合溶液;
(2)对所述复合纤维支架进行交联处理,得到所述人工骨膜的纤维层;
(3)将所述纤维层依次浸泡于多巴胺溶液和生长因子溶液中,得到所述人工骨膜。
透明质酸和生长因子在天然骨生长、骨折愈合以及骨再生过程中具有重要的应用前景,然而在现有技术中,透明质酸和生长因子在人体组织中易被降解,因而不能满足骨组织修复后期的需求。
为了解决上述问题,本发明通过将胶原溶液和透明质酸溶液混合制得混合溶液,之后将混合溶液和聚己内酯溶液分别通过静电纺丝制得同时包括纳米级纤维和微米级纤维的复合纤维支架,纤维支架中微米级纤维和纳米级纤维相互交错,且呈均匀分布状态;之后将纤维支架进行交联处理,胶原的降解速率减慢,因此透明质酸能够随着胶原的降解而缓慢持续释放。为了降低生长因子的降解速度,本发明采用多巴胺溶液沉积在纤维层上,之后将生长因子通过接枝反应固定在纤维层表面,进而实现了生长因子的缓慢、持续释放。如此,当骨折或骨缺损发生时,本发明制备的人工骨膜中的生长因子和透明质酸可以通过协同作用,促进软骨基质合成并且诱导成骨。
根据一些优选的实施方式,在步骤(1)中,所述聚己内酯溶液的质量浓度为200~300g/L(例如,可以为200g/L、220g/L、240g/L、250g/L、260g/L、280g/L或300g/L);
所述聚己内酯溶液的溶剂为体积比为5:1的三氯甲烷和无水甲醇的混合溶剂;
其中,所述聚己内酯溶液中聚己内酯的重均分子量为2~20万(例如,可以为2万、5万、8万、10万、12万、14万、15万、18万或20万)。
本发明中的聚己内酯具有良好的生物相容性,且降解后产物无毒,不会对人体产生危害。本发明主要是通过控制聚己内酯溶液的浓度从而控制静电纺丝的纤维直径,从而通过静电纺丝得到微米级纤维,由于微米级纤维的孔隙率较大,以其作为纤维支架有利于细胞的爬行和各营养物质之间的交换。若聚己内酯溶液的浓度过高,则纺丝后的纤维直径过大,从而无法使得纳米级纤维和微米级纤维均匀分布;若聚己内酯溶液的浓度过低,又会使得纤维的孔隙率降低,不利于细胞的生长和爬行。
同时,需要说明的是,为了保证聚己内酯溶液能够在静电纺丝过程中均匀成丝,且纺丝后的纤维膜具备一定的力学性能,并能够在预期时间内降解,本发明中采用的聚己内酯的重均分子量为2~20万;同时,为了保证喷丝均匀且连续,通过选用体积比为5:1的三氯甲烷和无水甲醇的混合溶剂来配置聚己内酯溶液。
根据一些优选的实施方式,在步骤(1)中,所述混合溶液由胶原溶液和透明质酸溶液混合而成;其中;所述胶原溶液的溶剂为六氟异丙醇,所述透明质酸溶液的溶剂为体积比为7:3的六氟异丙醇和甲酸的混合溶剂;
所述混合溶液中所述透明质酸的质量浓度为0.4~2g/L(例如,可以为0.4g/L、0.5g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L或2g/L),所述胶原的质量浓度为32~40g/L(例如,可以为32g/L、33g/L、34g/L、35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L或40g/L)。
由于胶原易溶解于六氟异丙醇,而透明质酸在六氟异丙醇中不易溶解,但可溶于六氟异丙醇和甲酸的混合溶剂中。在本发明中,将透明质酸溶液与胶原溶液混合为混合溶液,并将混合溶液通过静电纺丝制成纳米级纤维,其一,纳米级纤维和微米级纤维均匀分布形成复合纤维支架,微米级纤维在纤维支架中主要起到支撑支持作用,并且有利于细胞爬行;其二,纳米级纤维内部包含大量的胶原和透明质酸,有利于细胞的黏附,为细胞的爬行和增殖提供了附着点;其三,与单独的透明质酸相比,胶原的降解速度较慢,因此随着胶原的降解,纳米级纤维逐渐降解,透明质酸便能够缓慢、持续的释放;其四,与纳米级纤维相比,微米级纤维的聚己内酯的降解速度较慢,随着纳米级纤维的降解,微米级纤维的周围出现空洞,微米级纤维仍能维持一个空间使细胞继续爬行和增殖。
需要说明的是,在本发明中,为了能够使胶原和透明质酸的降解周期相匹配,并且透明质酸能够在降解周期内缓慢、持久释放,本发明混合溶液中的胶原溶液的质量浓度为32~40g/L,透明质酸的质量浓度为0.4~2g/L;若透明质酸的质量浓度过低,则无法有效促进骨间质细胞的再生、增殖与分化;若透明质酸的质量浓度过高,则胶原的含量则相对较少,进而无法使得透明质酸缓慢持久释放。
根据一些优选的实施方式,在步骤(1)中,所述透明质酸的分子量为800~1200kDa(例如,可以为800kDa、850kDa、900kDa、950kDa、1000kDa、1100kDa或1200kDa)。
需要说明的是,在本发明中,为了进一步降缓透明质酸的降解速度,本发明将透明质酸的分子量控制在800~1200kDa;同时经本实验证实,若透明质酸的分子量低于上述范围,则透明质酸在前期会发生突释,无法缓慢持久释放,从而无法满足骨组织修复后期的需求;若透明质酸的分子量高于上述范围,则会增加混合溶液的纺丝难度。
根据一些优选的实施方式,所述步骤(1)包括如下子步骤:
(11)将所述聚己内酯溶液和所述混合溶液分别注入两个注射器中,且每个注射器均与一个注射泵相连接;
(12)将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将所述铝箔作为接收基底材料,同时开启两个注射泵,在所述铝箔上通过静电纺丝形成所述复合纤维支架;
其中,所述复合纤维支架中所述微米级纤维的直径为7~15μm(例如,可以为7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm或15μm),所述纳米级纤维的直径为500~1000nm(例如,可以为500nm、600nm、700nm、800nm、900nm或1000nm)。
在本发明中,将聚己内酯溶液、胶原和透明质酸的混合溶液同时进行静电纺丝,便能通过一步法一体化得到均匀分布微米级纤维和纳米级纤维的复合纤维支架,该制备方法简单易操作,一方面该复合纤维支架材料不同易分层;另一方面微纳复合的纤维结构,更利于细胞的粘附、爬行和增殖,细胞首先粘附、增殖在纳米级纤维表面,随着纳米级纤维的降解,因此孔径增大,细胞可继续爬行至材料内部,呈现一个动态修复过程。
为了观察纤维支架中的微米级纤维和纳米级纤维的分布情况,本发明在配置聚己内酯(PCL)溶液时,将荧光染料Dil(细胞膜橙红色荧光探针)混入PCL电纺溶液中,在配置胶原(Col)和透明质酸(HA)的混合溶液时,将荧光染料Dio(细胞膜绿色荧光探针)混入到Col/HA的混合溶液中,然后进行静电纺丝得到复合纤维支架后,通过激光扫描共聚焦纤维镜观察纤维支架中的两种纤维的分布情况,如图1所示,可以发现,复合纤维支架中的红色的微米级纤维和绿色的纳米级纤维相互交错,且呈均匀分布状态。
根据一些优选的实施方式,在步骤(12)中,采用所述聚己内酯溶液进行所述静电纺丝的注射泵流速为1~4mL/h(例如,可以为1mL/h、1.5mL/h、2mL/h、2.5mL/h、3mL/h、3.5mL/h或4mL/h),电压为11~17kV(例如,可以为11kV、12kV、13kV、14kV、15kV、16kV或17kV),接收距离为15~22cm(例如,可以为15cm、16cm、17cm、18cm、19cm、20cm、21cm或22cm),接收器的转速为180~240r/min(例如,可以为180r/min、190r/min、200r/min、210r/min、220r/min、230r/min或240r/min);
采用所述混合溶液进行所述静电纺丝的注射泵流速为0.5~2mL/h(例如,可以为0.5mL/h、1mL/h、1.5mL/h或2mL/h,电压为15~22kV(例如,可以为15kV、16kV、17kV、18kV、19kV、20kV、21kV或22kV),接收距离为9~15cm(例如,可以为9cm、10cm、11cm、12cm、13cm、14cm或15cm),接收器的转速为180~240r/min(例如,可以为180r/min、190r/min、200r/min、210r/min、220r/min、230r/min或240r/min)。
在本发明中,在静电纺丝过程中,分别使用规格为10mL和2.5mL的注射器装载聚己内酯溶液和胶原和透明质酸的混合溶液,之后在注射器上连接21#的注射针头,并将注射器固定于微量注射泵上,分别调整注射器的高度以及针头与接收器之间的距离,将高压静电装置接头与注射针头连接,设置注射器内径和液体流速等参数。并在控制纺丝液的质量浓度的基础上,进一步调节注射泵流速、电压、接收距离、接收器转速等静电纺丝参数,以进一步控制纤维的直径,得到均匀分布有纳米级纤维和微米级纤维的复合纤维支架。
根据一些优选的实施方式,在步骤(12)中,所述静电纺丝的时间为1.5~5h(例如,可以为1.5h、2h、3h、4h或5h)。
需要说明的是,在本发明中,通过静电纺丝的时间,可以对纤维支架膜(即复合纤维支架)的厚度进行控制,本发明中的纤维支架膜的厚度优选为0.3~0.8mm。在实际使用中,纤维支架膜的厚度也可以根据实际需求进行设计。同时,在进行静电纺丝时的纺丝环境的温度为室温(例如,可以为18℃、19℃、20℃、22℃、23℃或25℃),相对湿度为40~55%(例如,可以为40%、42%、44%、45%、46%、48%、50%、52%或55%),如此既可以防止相对湿度较高时,溶剂会浓缩在纤维表面,从而影响纤维形态;又可防止相对湿度较低时,挥发溶剂可能会迅速干燥而在静电力的作用下出现纤维乱飞的现象。
根据一些优选的实施方式,所述步骤(2)包括如下子步骤:
将所述复合纤维支架置于浓度为2~30mmol/L(例如,可以为2mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、28mmol/L或30mmol/L)的交联液中并于-5~0℃(例如,可以为-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃)下交联4~12h(例如,可以为4h、6h、8h、10h或12h),然后用纯化水进行清洗后,再进行冷冻干燥处理,得到所述人工骨膜的纤维层;
其中,所述交联液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液;优选地,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:4。
需要说明的是,为了进一步降低胶原的降解速度,本发明对复合纤维支架进行了交联处理,交联之后不仅使得纤维支架的结构更加稳固,并且随着胶原的降解速度的降低,使得透明质酸的释放速度也随之降低。
同时需要说明的是,为了维持胶原和透明质酸的生物活力,同时保证纤维层中的结构不发生形变,本发明中的冷冻干燥方法采用阶段式冷冻干燥,主要包括冷冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段,各个阶段的工艺条件如下:
预冻阶段:目标温度为-12~-8℃,降温速率为3~4℃/min,该目标温度下的保温时长为250~280min;
第一升华阶段进行抽真空,真空度为50~120Pa,包括四个升温阶梯,分别为:
-4~-2℃,升温速率为0.2~0.3℃/min,恒温时长为200~220min;
1~2℃,升温速率为0.1~0.2℃/min,恒温时长为200~220min;
4~6℃,升温速率为0.3~0.4℃/min,恒温时长为160~180min;
8~10℃,升温速率为0.4~0.5℃/min,恒温时长为160~180min;
第二升华阶段进行抽真空,真空度为50~120Pa,包括五个升温阶梯,分别为:
14~16℃,升温速率为1~1.2℃/min,恒温时长为120~140min;
20~22℃,升温速率为1~1.2℃/min,恒温时长为120~140min;
36~38℃,升温速率为1.6~1.8℃/min,恒温时长为70~80min;
42~45℃,升温速率为1.6~1.8℃/min,恒温时长为70~80min;
55~60℃,升温速率为0.8~1℃/min,恒温时长:每隔1小时进行终点判断,至终点判断合格为止;终点判断为≤0.5Pa/10min;
降温阶段:目标温度为室温(例如,可以为25℃),降温速率为4~6℃/min。
根据一些优选的实施方式,所述步骤(3)包括如下子步骤:
(31)将多巴胺盐酸溶于10mM的Tris缓冲液和无水乙醇的混合液中,得到所述多巴胺溶液;其中,所述Tris缓冲液的pH为8.5;
(32)将所述纤维层浸泡于所述多巴胺溶液中,并在18~25℃(18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃)下放置8~24h(例如,可以为8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h或24h),然后用纯化水进行清洗,再进行风干处理;以及将所述纤维层再浸泡于所述生长因子溶液中,在-5~0℃(例如,可以为-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃)下放置8~24h(例如,可以为8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h或24h),然后用纯化水进行清洗,再进行干燥处理,得到所述人工骨膜。
需要说明的是,为了将生长因子固定到纤维层上,使得生长因子和透明质酸协同作用,共同诱导成骨,本发明首先采用多巴胺溶液黏附于纤维层表面,由于多巴胺可以在水溶液中自聚成聚多巴胺,从而能够沉积在本发明中的纤维层表面;同时由于多巴胺能够分泌儿茶酚胺或儿茶酚醌等基团,而这些基团能够直接和生长因子中的氨基发生接枝反应进行结合,从而将生长因子固定到纤维层表面,根据纤维层自身的降解特点,因此也能够使生长因子按照特定的速度释放,在体内局部区域产生作用并维持一定时间。
根据一些优选的实施方式,所述多巴胺溶液的浓度为0.5~4mg/mL(例如,可以为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL或4mg/mL);
所述生长因子溶液的浓度为5~30μg/mL(例如,可以为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL或30μg/mL);
所述生长因子为重组人骨形成蛋白-2、小球藻生长因子、富血小板血浆或富血小板纤维蛋白中的至少一种。
需要说明的是,本发明主要是通过多巴胺溶液将生长因子固定于纤维层表面,并通过控制多巴胺溶液和生长因子的浓度,实现生长因子的稳固固定和缓慢释放。若多巴胺溶液的浓度低于上述范围,则多巴胺溶液则不能稳固的沉积在纤维层表面,进而不能有效将生长因子接枝到纤维层表面;若多巴胺溶液的浓度过高,则不能使生长因子进行缓慢持久释放。同时,若生长因子浓度低于上述范围,则不能有效的与透明质酸发生协同作用,更好的诱导成骨;若生长因子的浓度高于上述范围,则在后期的清洗过程中,生长因子易流失,进而无法发挥其作用。
需要说明的是,本发明中,生长因子为重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)、小球藻生长因子(CGF)、富血小板血浆(PRP)或富血小板纤维蛋白(PRF)中的至少一种;其中,至少一种即为任意一种或几种以任意比例进行混合。
根据一些优选的实施方式,在步骤(31)中,所述Tris缓冲液和所述无水乙醇的体积比为(7~9):(1~3);
在步骤(32)中,所述干燥处理的温度为35~38℃(例如,可以为35℃、36℃、37℃或38℃),时间为10~18h(例如,可以为10h、12h、14h、16h或18h)。
需要说明的是,为了防止胶原发生溶胀,在配置多巴胺溶液时,在Tris缓冲液中加入了无水乙醇;其中,Tris缓冲液和无水乙醇的体积比为(7~9):(1~3)(例如,可以为7:1、7:2、7:3、8:1、9:1、8:2、8:3、9:2或9:3)。
为了观察生长因子是否接枝到纤维层上,本发明在生长因子溶液中加入异硫氰酸荧光素(FITC)对生长因子进行标记,并对接枝生长因子后的人工骨膜进行激光扫描共聚显微镜观察,如图2所示,可以看出,本发明中的绿色的生长因子均匀的分布在黑色的纤维层表面。
第二方面,本发明还提供了一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜,采用上述第一方面任一所述的制备方法制备得到。
为了更加清楚地说明本发明的技术方案及优点,下面通过几个实施例对一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜及其制备方法进行详细说明。
以下实施例中,I型胶原均通过如下方法制备得到:
(a)剔除牛跟腱上多余的筋膜、脂肪、肌肉等,用自来水冲洗干净后置于冷冻盒中进行冷冻;
(b)将冷冻的牛跟腱切薄片进行翻洗至液体澄清;
(c)酶解:将清洗干净的牛跟腱薄片进行酶解,充分搅拌,酶解时间不少于72h;
(d)盐析:将酶解后的溶液离心,取其上清液,将上清液加入到氯化钠溶液中,析出白色絮状胶原蛋白,过滤清洗后沥干水分;
(e)透析:将盐析后的材料灌入透析袋中,将透析袋置于0.05mol/L的乙酸溶液中透析液6天;再将透析袋置于0.0005mol/L的乙酸溶液中透析5天;从第12天开始将透析袋置于0.000005mol/L的乙酸溶液中透析至pH为5~6之间,根据需要可每天换一次透析液;
(f)冷冻干燥:将透析袋中的胶原凝胶溶液进行冷冻干燥,制备I型胶原。
以下实施例中,冷冻干燥均通过采用如下干燥工艺:
预冻阶段:目标温度为-12℃,降温速率为4℃/min,该目标温度下的保温时长为280min;
第一升华阶段进行抽真空,真空度为80Pa,包括四个升温阶梯,分别为:
-4℃,升温速率为0.2℃/min,恒温时长为220min;
1℃,升温速率为0.2℃/min,恒温时长为200min;
4℃,升温速率为0.4℃/min,恒温时长为180min;
8℃,升温速率为0.4℃/min,恒温时长为160min;
第二升华阶段进行抽真空,真空度为100Pa,包括五个升温阶梯,分别为:
14℃,升温速率为1.2℃/min,恒温时长为120min;
20℃,升温速率为1.2℃/min,恒温时长为120min;
36℃,升温速率为1.6℃/min,恒温时长为70min;
42℃,升温速率为1.8℃/min,恒温时长为70min;
55℃,升温速率为1℃/min,恒温时长:每隔1小时进行终点判断,至终点判断合格为止;终点判断为≤0.5Pa/10min;
降温阶段:目标温度为室温(25℃),降温速率为4℃/min。
实施例1
(1)通过静电纺丝制备纤维支架:
(11)a.称取一定质量的聚己内酯,加入至体积比为5:1的三氯甲烷和无水甲醇的混合溶剂中搅拌溶解,得到质量浓度为250g/L的聚己内酯溶液;其中,聚己内酯的重均分子量为2万;
b.将I型胶原加入至六氟异丙醇中搅拌溶解,得到胶原溶液;将透明质酸加入至体积比为7:3的六氟异丙醇和甲酸的混合溶剂中搅拌至溶解,得到透明质酸溶液;将胶原溶液和透明质酸溶液进行混合,得到混合溶液;其中,混合溶液中透明质酸的质量浓度为2g/L,胶原的质量浓度为32g/L,透明质酸的分子量为950kDa;
c.将步骤a中配制好的聚己内酯溶液注入10mL的注射器中,将步骤b中配制好的混合溶液2.5mL的注射器中,每个注射器上均连接有一个21#不锈钢钝头针,将装有步骤a配制的聚己内酯溶液的注射器固定在静电纺丝设备的A注射泵上,将装有步骤b配制的混合溶液的注射器固定在静电纺丝设备的B注射泵上;
(12)将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将铝箔作为接收基底材料,将高压静电装置接头分别与A注射泵和B注射泵上的注射器针头相连,调节静电纺丝参数,同时打开A注射泵和B注射泵,在铝箔上纺丝1.5h后,关闭A、B注射泵及其他相关运行按钮,再将铝箔去除,得到纤维支架;
其中,A注射泵的静电纺丝参数为:流速为2mL/h,接收距离为20cm,电压为17KV,接收器转速为180r/min;B注射泵的静电纺丝参数为:流速为1mL/h,接收距离为15cm,电压为17KV,接收器转速为180r/min;
(2)制备人工骨膜的纤维层:
将步骤(1)得到的纤维支架置于浓度为30mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(质量比为1:4)的水溶液中,并于0℃下交联12h,然后用纯化水进行清洗3次后,再次进行冷冻干燥处理,得到人工骨膜的纤维层;
(3)制备人工骨膜:
(31)将多巴胺盐酸溶于10mM的Tris缓冲液(pH为8.5)和无水乙醇的混合液中,得到浓度为1mg/mL的多巴胺溶液;其中,Tris缓冲液和无水乙醇的体积比为8:2;
(32)将纤维层浸泡于多巴胺溶液中,在25℃下放置24h,然后用纯化水清洗5次,于室温(25℃)下,风干表面水分;之后将纤维层再浸泡于10μg/mL的重组人骨形成蛋白-2溶液中,在0℃下放置24h,之后用纯化水清洗5次,再将其放置于37℃的干燥箱中烘干12h,得到可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜。
实施例2
(1)通过静电纺丝制备纤维支架:
(11)a.称取一定质量的聚己内酯,加入至体积比为5:1的三氯甲烷和无水甲醇的混合溶剂中搅拌溶解,得到质量浓度为200g/L的聚己内酯溶液;其中,聚己内酯的重均分子量为5万;
b.将I型胶原加入至六氟异丙醇中搅拌溶解,得到胶原溶液;将透明质酸加入至体积比为7:3的六氟异丙醇和甲酸的混合溶剂中搅拌至溶解,得到透明质酸溶液;将胶原溶液和透明质酸溶液进行混合,得到混合溶液;其中,混合溶液中透明质酸的质量浓度为1.5g/L,胶原的质量浓度为34g/L,透明质酸的分子量为900kDa;
c.将步骤a中配制好的聚己内酯溶液注入10mL的注射器中,将步骤b中配制好的混合溶液2.5mL的注射器中,注射器上均连接有一个21#不锈钢钝头针,将装有步骤a配制的聚己内酯溶液的注射器固定在静电纺丝设备的A注射泵上,将装有步骤b配制的混合溶液的注射器固定在静电纺丝设备的B注射泵上;
(12)将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将铝箔作为接收基底材料,将高压静电装置接头分别与A注射泵和B注射泵上的注射器针头相连,调节静电纺丝参数,同时打开A注射泵和B注射泵,在铝箔上纺丝1.6h后,关闭A、B注射泵及其他相关运行按钮,再将铝箔去除,得到纤维支架;
其中,A注射泵的静电纺丝参数为:流速为3mL/h,接收距离为22cm,电压为15KV,接收器转速为200r/min;B注射泵的静电纺丝参数为:流速为2mL/h,接收距离为10cm,电压为17KV,接收器转速为200r/min;
(2)制备人工骨膜的纤维层:
将步骤(1)得到的纤维支架置于浓度为20mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(质量比为1:4)的水溶液中,并于-3℃下交联8h,然后用纯化水进行清洗3次后,再次进行冷冻干燥处理,得到人工骨膜的纤维层;
(3)制备人工骨膜:
(31)将多巴胺盐酸溶于10mM的Tris缓冲液(pH为8.5)和无水乙醇的混合液中,得到浓度为2mg/mL的多巴胺溶液;其中,Tris缓冲液和无水乙醇的体积比为7:3;
(32)将纤维层浸泡于多巴胺溶液中,在20℃下放置20h,然后用纯化水清洗5次,于室温(25℃)下,风干表面水分;之后将纤维层再浸泡于20μg/mL的小球藻生长因子溶液中,在-1℃下放置22h,之后用纯化水清洗5次,再将其放置于36℃的干燥箱中烘干10h,得到可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜。
实施例3
(1)通过静电纺丝制备纤维支架:
(11)a.称取一定质量的聚己内酯,加入至体积比为5:1的三氯甲烷和无水甲醇的混合溶剂中搅拌溶解,得到质量浓度为300g/L的聚己内酯溶液;其中,聚己内酯的重均分子量为10万;
b.将I型胶原加入至六氟异丙醇中搅拌溶解,得到胶原溶液;将透明质酸加入至体积比为7:3的六氟异丙醇和甲酸的混合溶剂中搅拌至溶解,得到透明质酸溶液;将胶原溶液和透明质酸溶液进行混合,得到混合溶液;其中,混合溶液中透明质酸的质量浓度为1g/L,胶原的质量浓度为34g/L,透明质酸的分子量为850kDa;
c.将步骤a中配制好的聚己内酯溶液注入10mL的注射器中,将步骤b中配制好的混合溶液2.5mL的注射器中,注射器上均连接有一个21#不锈钢钝头针,将装有步骤a配制的聚己内酯溶液的注射器固定在静电纺丝设备的A注射泵上,将装有步骤b配制的混合溶液的注射器固定在静电纺丝设备的B注射泵上;
(12)将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将铝箔作为接收基底材料,将高压静电装置接头分别与A注射泵和B注射泵上的注射器针头相连,调节静电纺丝参数,同时打开A注射泵和B注射泵,在铝箔上纺丝1.8h后,关闭A、B注射泵及其他相关运行按钮,再将铝箔去除,得到纤维支架;
其中,A注射泵的静电纺丝参数为:流速为1mL/h,接收距离为16cm,电压为13KV,接收器转速为220r/min;B注射泵的静电纺丝参数为:流速为0.5mL/h,接收距离为8cm,电压为20KV,接收器转速为220r/min;
(2)制备人工骨膜的纤维层:
将步骤(1)得到的纤维支架置于浓度为15mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(质量比为1:4)的水溶液中,并于-3℃下交联8h,然后用纯化水进行清洗3次后,再次进行冷冻干燥处理,得到人工骨膜的纤维层;
(3)制备人工骨膜:
(31)将多巴胺盐酸溶于10mM的Tris缓冲液(pH为8.5)和无水乙醇的混合液中,得到浓度为3mg/mL的多巴胺溶液;其中,Tris缓冲液和无水乙醇的体积比为9:1;
(32)将纤维层浸泡于多巴胺溶液中,在22℃下放置12h,然后用纯化水清洗5次,于室温(25℃)下,风干表面水分;之后将纤维层再浸泡于30μg/mL的富血小板血浆溶液中,在-5℃下放置16h,之后用纯化水清洗5次,再将其放置于35℃的干燥箱中烘干12h,得到可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜。
实施例4
实施例4与实施例1基本相同,其不同之处在于:在步骤(11)中,聚己内酯溶液的浓度为280g/L,混合溶液中,胶原的质量浓度为40g/L,透明质酸的质量浓度为0.5g/L,透明质酸的分子量为800kDa。
实施例5
实施例5与实施例1基本相同,其不同之处在于:在步骤(11)中,混合溶液中透明质酸的分子量为1000kDa;在步骤(31)中,多巴胺溶液的浓度为0.5mg/mL;在步骤(32)中,生长因子为富血小板纤维蛋白,并且生长因子溶液的浓度为5μg/mL。
实施例6
实施例6与实施例1基本相同,其不同之处在于:在步骤(11)中,混合溶液中透明质酸的分子量为1300kDa;在步骤(32)中,生长因子为重组人骨形成蛋白-2和小球藻生长因子,生长因子溶液的浓度为2.5μg/mL。
实施例7
实施例7与实施例1基本相同,其不同之处在于:在步骤(11),混合溶液中的透明质酸的分子量为40kDa。
对比例1
对比例1与实施例1基本相同,其不同之处在于:将步骤(11)中的混合溶液替换为透明质酸溶液。
对比例2
对比例2与实施例1基本相同,其不同之处在于:在步骤(3)中,仅将纤维层浸泡于生长因子溶液中。
将实施例1至7以及对比例1至2所制备的人工骨膜分别进行生长因子和透明质酸释放速率测试:
透明质酸的释放速率测试:将制得的人工骨称重并记录后,置于1mL无菌PBS缓冲液中,并于37℃保存;之后分别在预先设置的11个时间点(1、3、5、7、14、21、28、35、45、55和65天)收集上清液,并重新加入1mL新鲜的无菌PBS缓冲液,之后将收集到的上清液进行比色测定;透明质酸经水解作用生成的糖醛酸在硫酸中可与咔唑试剂发生缩合反应,产生紫红色化合物,其显色强度与糖醛酸含量成正比,因而用于比色定量。
生长因子的释放速率测试:将制得的人工骨膜称重并记录后,置500μL无菌PBS缓冲液中,并于37℃保存;之后分别在预先设置的8个时间点(8h、24h、72h、96h、120h、144h和168h)取出100μL PBS,然后再重新加入100μL新鲜PBS,并将取出后的PBS使用BCA试剂盒检测PBS中的生长因子含量。
由图3和图4可以看出,随着时间的增加,本发明实施例1的人工骨膜,透明质酸和生长因子的释放速率均呈现规律性的缓慢上升,并且透明质酸和生长因子的释放速率与骨膜的生长速度相匹配,能够很好的满足临床中骨组织修复后期的需求;实施例2至6中得到的人工骨膜,其透明质酸和生长因子的释放速率与实施例1中的释放速率呈现相似规律,且透明质酸和生长因子的释放速率与骨膜的生长速度相匹配,能够很好的满足临床中骨组织修复后期的需求;在实施例7中,当透明质酸的分子量较小时,由图3中可以发现,人工骨膜的中透明质酸的释放速率明显升高,并且在前期出现突释现象;在对比例1,若不采用胶原与透明质酸的混合溶液,仅将透明质酸进行静电纺丝,则透明质酸的释放速率明显较快,且在体内会被快速降解;在对比例2中,由图4可以发现,若不采用多巴胺溶液对生长因子进行固定,则生长因子的释放速率呈现显著增加,并在48h左右出现突释,释放率达到最大。
需要说明的是,图1和图2的原图为具有颜色的附图。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
(1)通过静电纺丝制备包括微米级纤维和纳米级纤维的复合纤维支架;所述微米级纤维的纺丝液为聚己内酯溶液,所述纳米级纤维的纺丝液为透明质酸和胶原的混合溶液;
(2)对所述纤维支架进行交联处理,得到所述人工骨膜的纤维层;
(3)将所述纤维层依次浸泡于多巴胺溶液和生长因子溶液中,得到所述人工骨膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中:
所述聚己内酯溶液的质量浓度为200~300g/L;
所述聚己内酯溶液的溶剂为体积比为5:1的三氯甲烷和无水甲醇的混合溶剂;
其中,所述聚己内酯溶液中聚己内酯的重均分子量为2~20万。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中:
所述混合溶液由胶原溶液和透明质酸溶液混合而成;其中;所述胶原溶液的溶剂为六氟异丙醇,所述透明质酸溶液的溶剂为体积比为7:3的六氟异丙醇和甲酸的混合溶剂;
所述混合溶液中所述透明质酸的质量浓度为0.4~2g/L,所述胶原的质量浓度为32~40g/L;
和/或
所述透明质酸的分子量为800~1200kDa。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
所述步骤(1)包括如下子步骤:
(11)将所述聚己内酯溶液和所述混合溶液分别注入两个注射器中,且每个注射器均与一个注射泵相连接;
(12)将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将所述铝箔作为接收基底材料,同时开启两个注射泵,在所述铝箔上通过静电纺丝形成所述复合纤维支架;
其中,所述复合纤维支架中所述微米级纤维的直径为7~15μm,所述纳米级纤维的直径为500~1000nm。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,
在步骤(12)中,采用所述聚己内酯溶液进行所述静电纺丝的注射泵流速为1~4mL/h,电压为11~17kV,接收距离为15~22cm,接收器的转速为180~240r/min;
采用所述混合溶液进行所述静电纺丝的注射泵流速为0.5~2mL/h,电压为15~22kV,接收距离为9~15cm,接收器的转速为180~240r/min;和/或
在步骤(12)中,所述静电纺丝的时间为1.5~5h。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
所述步骤(2)包括如下子步骤:
将所述复合纤维支架置于浓度为2~30mmol/L的交联液中并于-5~0℃下交联4~12h,然后用纯化水进行清洗后,再进行冷冻干燥处理,得到所述人工骨膜的纤维层;
其中,所述交联液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液;优选地,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:4。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
所述步骤(3)包括如下子步骤:
(31)将多巴胺盐酸溶于10mM的Tris缓冲液和无水乙醇的混合液中,得到所述多巴胺溶液;其中,所述Tris缓冲液的pH为8.5;
(32)将所述纤维层浸泡于所述多巴胺溶液中,并在18~25℃下放置8~24h,然后用纯化水进行清洗,再进行风干处理;以及将所述纤维层再浸泡于所述生长因子溶液中,在-5~0℃下放置8~24h,然后用纯化水进行清洗,再进行干燥处理,得到所述人工骨膜。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
所述多巴胺溶液的浓度为0.5~4mg/mL;
所述生长因子溶液的浓度为5~30μg/mL;
所述生长因子为重组人骨形成蛋白-2、小球藻生长因子、富血小板血浆或富血小板纤维蛋白中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,
在步骤(31)中,所述Tris缓冲液和所述无水乙醇的体积比为(7~9):(1~3);
在步骤(32)中,所述干燥处理的温度为35~38℃,时间为10~18h。
10.一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜,其特征在于,采用权利要求1至9中任一所述的制备方法制备得到。
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