CN111333710B - C20orf24蛋白缺失突变体及其应用 - Google Patents

C20orf24蛋白缺失突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种C20orf24蛋白缺失突变体及其应用。一种C20orf24蛋白缺失突变体，为缺失了Rab5ip结构域的C20orf24蛋白；其氨基酸序列为MSGGRRKEEPPQPQLANGALKVSVWSKVLRSDAAW EDKDEFLDGVLYLYFSNYLQIDEEEYGGTWELTKEGFMTSFALFMVIWIIFYTAIHYD。C20orf24蛋白缺失突变体具有抑制癌细胞增殖生长的作用，同时将其应用于制备治疗癌症药物中，显示其广阔的使用价值。

Description

C20orf24蛋白缺失突变体及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种C20orf24蛋白缺失突变体及其应用。
背景技术
结直肠癌是世界上最难治疗的疾病之一，有发病率高，致死率高和存活预后差等特点。现在主流的治疗方法是手术加放化疗结合的方法，在靶向治疗领域，应用比较多的有血管生成因子(VEGF)抑制剂贝伐单抗和表皮生长因子受体阻滞剂帕尼单抗、西妥昔单抗和艾洛替尼。尽管如此，临床疗效仍不理想，化疗耐药和毒副作用的发生影响了癌症病人的预后，进一步开发针对致癌基因靶向药物势在必行。
在结直肠癌中，Ras/MAPK信号通路在目前研究最为活跃的致癌通路之一，该通路的相关突变，如Ras和Raf蛋白的突变都在大多患者癌组织中都可以观察到。Ras/MAPK信号通路在胚胎的发育,细胞的分化、增殖、死亡等生物学过程中具有重要的调节作用，MAPK(mitogen-activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶)家族是这一信号通路的主要成员。它包括了一系列蛋白激酶的级联反应:Ras与GTP结合后被激活,使Raf募集到细胞膜并与之结合,随后MEK、MAPK依次被磷酸化激活,MAPK活化一些转录因子、蛋白激酶等,引发多种生物学效应。该通路在肿瘤的分裂、存活、迁移以及侵袭能力等方面有重要的调节作用,主要参与各种生长因子、细胞因子、丝裂原以及激素受体活化后的信号转导。其异常激活常见于人类肿瘤中。目前，靶向该Ras的相关药物目前仍非常有限。
位于EGFR与Ras之间，存在着另一重要的小GTP酶——RAB5A蛋白，与其他GTP酶一样，在发挥功能时不断进行GTP/GDP循环。RAB5A蛋白作为囊泡运输的分子开关，当与GTP结合时处于活性状态称之为“开”，当与GDP结合时处于失活状态称之为“关”。近几年，人们发现很多参与调控RAB5蛋白GTP/GDP循环的因子。调控该蛋白的活性，能够直接影响下游的Ras-MAPK通路，因此针对药物开发难度较大的Ras-MAPK通路，靶向RAB5蛋白能够为肿瘤治疗提供一个新的契机。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供C20orf24蛋白缺失突变体，C20orf24(Chromosome 20Open Reading Frame 24)定位于人类20号染色体的一个基因，该基因的蛋白证据在2012年被证实。
本发明的另一目的在于提供上述C20orf24蛋白缺失突变体的应用。
为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：
一种C20orf24蛋白缺失突变体，优选为缺失了Rab5ip结构域的C20orf24蛋白；更优选为缺失了第44-79位氨基酸序列的C20orf24蛋白，其氨基酸序列为MSGGRRKEEPPQPQLANGALKVSVWSKVLRSDAAWEDKDEFLDGVLYLYFSNYLQIDEEEYGGTWELTKEGFMTSFALFMVIWIIFYTAIHYD。
一种多核苷酸，优选为以下多核苷酸中的至少一种：
(1)编码所述的C20orf24蛋白缺失突变体的多核苷酸；
(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。
一种载体，优选包含所述的多核苷酸。
一种遗传工程化的宿主细胞，优选包含上述的载体。
所述的C20orf24蛋白缺失突变体在制备治疗癌症药物中的应用，这是基于本发明人研究发现，C20orf24蛋白缺失突变体(C20orf24-DD)通过N和C端结构域与Rab5竞争性相互作用，从而抑制癌细胞增殖生长。
所述的癌症包括但不限于结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、肾癌和头颈癌。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明首次发现了C20orf24蛋白缺失突变体，并发现其具有抑制癌细胞增殖生长的作用，同时将其应用于制备治疗癌症药物中，显示其广阔的使用价值。
附图说明
图1为C20orf24对结直肠癌细胞HCT116和HT29增殖的影响图：其中，A为C20orf24在HCT116和HT29细胞中过表达成功图；B为C20orf24促进HCT116和HT29细胞克隆增殖图；C为C20orf24促进HCT116和HT29细胞克隆增殖的数目统计图。
图2为干扰C20orf24对结直肠癌细胞HCT116和HT29增殖的影响图：其中，A为HCT116和HT29细胞中干扰C20orf24后的效果图；B为HCT116和HT29细胞中干扰C20orf24后对肿瘤生长抑制的效果图；sh-Ctrl表示对照组(包含质粒pLKO.1-Control)；sh-#1表示包含质粒pLKO.1-shC20orf24-#1的实验组；sh-#2表示包含质粒pLKO.1-shC20orf24-#2的实验组。
图3为C20orf24与Rab5相互作用的效果图。
图4为C20orf24及其突变体C20orf24-DD对Rab5活性的影响图；C20orf24-HA表示包含pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒的实验组；C20orf24-DD-HA表示包含C20orf24缺失突变体(C20orf24-DD)重组质粒的实验组。
图5为C20orf24及其突变体C20orf24-DD对MEK-ERK通路及EGFR内吞的影响图。C20orf24-HA表示包含pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒的实验组；C20orf24-DD-HA表示包含C20orf24缺失突变体(C20orf24-DD)重组质粒的实验组。
图6为C20orf24、C20orf24-DD、Rab5(S34N)对肿瘤生长的影响图：其中，A为C20orf24、C20orf24-DD、Rab5(S34N)对肿瘤生长的影响的效果图；B为C20orf24、C20orf24-DD、Rab5(S34N)对肿瘤体积的影响图；Control表示对照；C20orf24表示包含pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒的实验组；C20orf24-DD表示包含C20orf24缺失突变体(C20orf24-DD)重组质粒的实验组；C20orf24/Rab5(S34N)表示包含C20orf24缺失突变体(C20orf24-DD)重组质粒的实验组。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒的构建：在pLVX-IRES-ZsGreen1载体(Clontech,Cat#632187)的骨架上构建pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24的重组质粒，利用同源重组方法，采用C112-ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒(诺唯赞，Cat#C112-01)，将C20orf24，mCherry-HA两基因片段按照mCherry-HA-C20orf24顺序插入到pLVX-IRES-ZsGreen1载体中，具体如下：
(1)提取人类结直肠癌HCT116细胞(购于中国科学院上海生科院细胞资源中心)总RNA，将其反转录产物作为cDNA模板；通过PCR扩增实验、胶回收纯化获得C20orf24(GenBank登录号NM_018840.5)基因片段；PCR引物为C20orf24 UP和C20orf24 DW。
C20orf24 UP：5’-ATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTAGCGGCGGGCGGCGG-3’；
C20orf24 DW：5’-CGCTCTAGAACTAGTCTCGAGTCAGTCATAATGGATGGCAG-3’。
PCR反应体系为50μL：浓度为1μg/uL的cDNA模板1μL、浓度为10μM的C20orf24 UP 1μL、浓度为10μM的C20orf24 DW1μL、PCR Mix(2×)25uL、灭菌纯水(ddH2O)至50μL。
PCR反应条件如下：98℃3min；98℃10s、60℃15s、72℃15s，共35个循环；最后，72℃3min；4℃30min。
(2)以pLVX-mCherry-N1空载(购于武汉淼灵生物科技公司)为模板，通过PCR扩增实验、胶回收纯化获得mCherry-HA基因片段；PCR引物为mCherry-HA UP和mCherry-HA DW。
mCherry-HA UP:5’-ATTTCCGGTGAATTCCTCGAGGCCACCATGGTGAGC-3’；
mCherry-HA DW:5’-GACGAGCTGTACAAGCTCGAGACTAGTTCTAGAGCGGCCGCGGATCCAATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT-3’。
PCR反应体系为50μL：pLVX-mCherry-N1空载10ng、浓度为10μM的mCherry-HA UP1μL、浓度为10μM的mCherry-HA DW 1μL、PCR Mix(2×)25uL、灭菌纯水(ddH2O)至50μL。
PCR反应条件如下：98℃3min；98℃10s、60℃15s、72℃15s，共35个循环；最后，72℃3min；4℃30min。
(3)对pLVX-IRES-ZsGreen1载体(Clontech,Cat#632187)进行XhoI单酶切反应，酶切体系如表1所示，37℃金属浴中静置15min，然后分别进行胶回收纯化，得到带限制性内切酶粘性末端的pLVX-IRES-ZsGreen1线性化载体。
表1pLVX-IRES-ZsGreen1 载体的酶切体系
Figure BDA0002399477630000041
(4)将C20orf24基因片段、mCherry-HA基因片段和pLVX-IRES-ZsGreen1线性化载体通过同源重组连接酶连接，连接体系如表2所示，连接条件如下：37℃连接30min。
表2C20orf24基因片段、mCherry-HA基因片段和pLVX-IRES-ZsGreen1线性化载体的连接体系
Figure BDA0002399477630000042
(5)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体如下：取连接产物20μL与50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(OD值为0.5)轻轻混合，冰上静置10min；42℃水浴90s，冰上静置10min；加入400μL LB培养基，37℃、200rpm摇瓶培养45min。
(6)取200μL菌液涂在LB固体培养基平板上，挑选6个单克隆，接种于加有氨苄青霉素的LB培养基的12孔板中，37℃摇菌4～5h；然后进行菌液PCR筛选阳性单克隆：以菌液为模板，mCherry-HA UP和C20orf24 DW为菌落PCR引物，进行PCR扩增；接着进行凝胶电泳，筛选阳性单克隆；最后将阳性单克隆扩大培养：一部分提取质粒，送公司测序；另一部分保种：-80℃液氮罐中保存。
2、C20orf24缺失突变体重组质粒的构建：在构建好的pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒的基础上对其进行结构域缺失，将C20orf24上的编码R ab5ip domain(第44-79位氨基酸)的序列进行切除，从而构建缺失体(C20orf24-DD)重组质粒。
(1)利用同源重组方法，采用C112-ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒(诺唯赞，Cat#C112-01)构建，具体如下：
结合ClonExpress II重组反应系统(诺唯赞生物科技有限公司)设计扩增特异引物，分别为C20orf24-DD PF和C20orf24-DD PR；
C20orf24-DD PF：5’-GATGAATTTTTAGATGGAGTCCTGTACCTCTACTTC-3’；
C20orf24-DD PR：5’-ATCTAAAAATTCATCCTTATCCTCCCAGGCCGCGTC-3’。
利用高保真PCR聚合酶进行反向PCR扩增，以C20orf24-DD PF和C20orf24-DD PR为引物，以pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24为模板，获得含有目的基因C20orf24-DD的线性化载体，线性化载体通过连接酶ExnaseTMⅡ连接，连接体系如表3所示，连接条件如下：37℃连接0.5h，之后立即置冰浴中冷却5min，然后将连接产物20μL与100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(OD值为0.5)轻轻混合，冰上静置30min；42℃水浴90s，冰水浴孵育2min；加入450μL LB培养基，37℃孵育10min充分复苏，37℃、200rpm摇瓶培养45min。取100μL菌液均匀涂布在含有加有氨苄青霉素的LB培养基平板上，平板倒置，于37℃过夜培养。用无菌的牙签将单个菌落挑至50μL新鲜的LB培养基中，混匀，挑选3个候选单克隆扩大培养：一部分提取质粒，送公司测序；另一部分保种：-80℃液氮罐中保存。
表3 C20orf24-DD基因片段和线性化载体的连接体系
Figure BDA0002399477630000051
3、pEGFP-RAB5A(S34N)重组质粒的构建：在质粒pEGFP-RAB5A(购于武汉淼灵生物科技公司)的基础上，利用同源重组方法，采用C112-ClonExpress II One Step CloningKit试剂盒(诺唯赞，Cat#C112-01)构建，具体如下：
结合ClonExpress II重组反应系统(诺唯赞生物科技有限公司)设计扩增特异引物，分别为S34N PF和S34N PR；
S34N PF：5’-GTTGGCAAAAACAGCCTAGTGCTTCGTTTTGTGAAA-3’；
S34N PR：5’-CTGGGAGAGTCCGCTGTTGGCAAAAACAGCCTAGTG-3’。
利用高保真PCR聚合酶进行反向PCR扩增，以pEGFP-RAB5A为模板，通过引物S34NPF和S34N PR，获得含有目的基因RAB5A(S34N)的线性化载体，将线性化载体通过连接酶ExnaseTMⅡ连接，连接体系如表3所示，连接条件如下：37℃连接0.5h，之后立即置冰浴中冷却5min，然后将20μL连接产物与100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(OD值为0.5)轻轻混合，冰上静置30min；42℃水浴90s，冰水浴孵育2min；加入450μL LB培养基，37℃孵育10min充分复苏，37℃、200rpm摇瓶培养45min。取100μL菌液均匀涂布在含有G418的LB培养基平板上，平板倒置，于37℃过夜培养。用无菌的牙签将单个菌落挑至50μL新鲜的LB培养基中，混匀，取候选的3个单克隆扩大培养：一部分提取质粒，送公司测序；另一部分保种：-80℃液氮罐中保存。
4、克隆形成实验
(1)转染
①pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒转染到人结肠癌--HCT116和HT29细胞株
将上述制备得到的pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒用Lip3000按照Lip3000说明书分别转染到人结肠癌--HCT116和HT29细胞株(购于中国科学院上海生科院细胞资源中心)，得到细胞株1(pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒转染HCT116)、细胞株2(pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒转染HT29)。
②C20orf24缺失突变体(C20orf24-DD)重组质粒转染到人结肠癌--HCT116和HT29细胞株
本步骤与步骤①相同，区别仅在于：质粒为C20orf24缺失突变体(C20orf24-DD)重组质粒，得到细胞株3(C20orf24-DD)重组质粒转染HCT116)、细胞株4(C20orf24-DD)重组质粒转染HT29)。
③空载质粒pLVX-IRES-ZsGreen转染到人结肠癌--HCT116和HT29细胞株
本步骤与步骤①相同，区别仅在于：质粒为空载质粒pLVX-IRES-ZsGreen，得到细胞株5(空载质粒pLVX-IRES-ZsGreen转染HCT116)、细胞株6(空载质粒pLVX-IRES-ZsGreen转染HT29)。
④pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒及pEGFP-RAB5A(S34N)重组质粒转染到人结肠癌--HCT116和HT29细胞株
本步骤与步骤①相同，区别仅在于：质粒为pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒及pEGFP-RAB5A(S34N)重组质粒，得到细胞株7(pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒及pEGFP-RAB5A(S34N)重组质粒转染HCT116)、细胞株8(pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24重组质粒及pEGFP-RAB5A(S34N)重组质粒转染HT29)。
(2)用细胞消化液(0.25％胰酶，GIBCO，每100万细胞用1mL)将生长良好的细胞株1、2、5、6消化成单细胞，重悬混匀，并用血球计数板计数；
(3)在6孔板中铺板，每个孔铺500个细胞，每个样品铺3个复孔，加入2mL DMEM完全培养基混匀，隔3天更换一次新鲜的DMEM完全培养基；
(4)10～14天后，去除6孔板中的培养基，用PBS溶液(0.01M、pH＝7.4)洗一次；
(5)去除PBS溶液，加入1mL的无水甲醇，将细胞固定10min；
(6)去除无水甲醇，加入1mL 0.1％结晶紫溶液，染色10min；
(7)去除结晶紫溶液，用PBS(0.01M、pH＝7.4)清洗3次，使背景降低；
(8)晾干后，于扫描仪中扫描成高分辨率图片并保存，结果如图1-B所示：表明C20orf24的过表达能够促进结直肠癌细胞增殖。
5、慢病毒构建稳转细胞系
(1)复苏HEK 293T(购于中国科学院上海生科院细胞资源中心)，以常规传代培养方法进行传代3次后准备用于共转染病毒包装实验；共转染前一天(约24小时)，在六孔板中铺HEK-293T进行传代每个孔中大约有60％左右的细胞量；转染当天，HEK-293T细胞汇合度接近90％；
(2)将质粒pLKO.1-Control、pLKO.1-shC20orf24-#1和pLKO.1-shC20orf24-#2(由权阳生物科技有限公司构建，构建过程可参考：Addgene Plasmid 10878.ProtocolVersion 1.0.December 2006.见网址http://www.addgene.org/protocols/plko/:其中，pLKO.1-Control为不干扰C20orf24的对照组，Control的序列为5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG-3’；pLKO.1-shC20orf24-#1和pLKO.1-shC20orf24-#2为构建的干扰重组质粒：其中，干扰C20orf24的两个干扰序列如下：shC20orf24-#1的序列为：5’-CGTGTTTCCTGGACCGCGATT-3’；shC20orf24-#2的序列为：5’-CGTGGTCCATAGCACAGTATT-3’；酶切位点为AgeI(New England Biolabs(NEB)#R0552S)和EcoRI(NEB#R0101S))分别与包装质粒(pMD2.G及psPAX2，均购自权阳生物科技有限公司)各2ug加入适量的无血清DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中，轻轻混匀，随后加入Lip3000 4μL，轻轻混匀，室温静置15min,得到混合液，然后将混合液分别加入待转染的HEK 293T细胞中，37℃、5％CO2培养箱中孵育，得到病毒液1(pLKO.1-Control、pMD2.G及psPAX2转染HEK 293T)、病毒液2(pLKO.1-shC20orf24-#1、pMD2.G及psPAX2转染HEK 293T)及病毒液3(pLKO.1-shC20orf24-#2、pMD2.G及psPAX2转染HEK 293T)。
(3)转染48h后，移除上清液，在216g速度下离心3min去除细胞碎片；
(4)感染目的细胞HCT116和HT29：病毒感染前一天，分别对待感染目的细胞HCT116和HT29贴壁细胞进行传代，感染当天，HCT116和HT29细胞汇合度达到90％，所用的培养基为DMEM完全培养基；吸取目的细胞培养上清液，用0.45μM的滤器将病毒过滤以除去细胞碎片，然后分别将2mL病毒液1、病毒液2、病毒液3分别加入目的细胞HCT116、HT29中；
(5)抗性筛选：感染两天后换液(2mL DMEM完全培养基)，然后加嘌呤霉素至终浓度为1μg/mL用于结直肠癌HCT116和HT29细胞系的筛选，直至细胞数量无明显变化后撤药，得到细胞株9(pLKO.1-Control感染HCT116)、细胞株10(pLKO.1-Control感染HT29)、细胞株11(pLKO.1-shC20orf24-#1感染HCT116)、细胞株12(pLKO.1-shC20orf24-#1感染HT29)、细胞株13(pLKO.1-Control感染HCT116)、细胞株14(pLKO.1-Control感染HT29)；
(6)蛋白印迹实验检测干扰效果：撤药3天后，收细胞，做蛋白质印迹实验，以确定目的蛋白的表达效率，具体如下：
①本次所检测蛋白裂解液来自细胞株9、细胞株10、细胞株11、细胞株12、细胞株13、细胞株14，每种细胞株取约100万个细胞；
②裂解细胞：分别用预冷的PBS(0.01M、pH＝7.4)洗三遍，加入100μL的RIPA细胞裂解液(碧云天，P0013B)，冰上裂解30min，每隔10min轻轻颠倒混匀一次；4℃、13200rpm离心30min，取上清进行蛋白浓度测定，细胞株9～14的浓度分别为1.6、1.7、1.6、2.0、1.8、1.9ng/μL；
③制样：分别取30μg的蛋白加入20μL 1×蛋白上样缓冲液(碧云天，P0015)，混匀，在沸水浴中煮10min，得到样品；
④制胶：配制12％的分离胶(5mL)：1.5mM Tris-HCl(pH8.8)1.9mL，ddH2O1mL，30％丙烯酰胺2mL，10％SDS(十二烷基硫酸钠)50μL，10％过硫酸胺50μL，TEMED(四甲基乙二胺)2μL(加入后混匀，快速制胶)；配制5％浓缩胶(3mL)：1.5mM Tris-HCl(pH8.8)0.38mL，ddH2O2.1mL，30％丙烯酰胺0.5mL，10％SDS(十二烷基硫酸钠)30μL，10％过硫酸胺30μL，TEMED(四甲基乙二胺)6μL(加入后混匀，快速制胶)；
⑤将上述的样品沸水中煮5min后，冰上放置2min，离心10s使侧壁上的液体回到EP管底部，准备上样；
⑥装好电泳仪(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，加入电泳缓冲液并且上样；
⑦上样完后，先使用80V电压跑30min，再使用120V电压，直至溴酚蓝条带接近末端，结束电泳，裁剪相应大小的PVDF膜；
⑧将PVDF膜用甲醇浸润活化至变色，按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序摆好，接入转膜电源，235mA恒电流冰上转膜90min；
⑨转膜完后，取出PVDF膜，用TBST润洗去除残留的转膜缓冲液，然后用5％的脱脂牛奶室温封闭2h；
⑩封闭完后用TBST润洗去除残留的牛奶，根据蛋白指示带剪膜，加入稀释1:1000的相应的一抗:anti-C20orf24(Biorbyt,Cat#orb155989)，4℃孵育过夜(16h)；回收一抗，用TBST洗膜30min，每隔十分钟换一次液，加入稀释1:4000的相应二抗(HS101-01、HS201-01，全式金公司)，室温孵育2h；回收二抗，用TBST洗膜30min，每隔十分钟换一次液；合理控制曝光时间显影，并用Photoshop裁剪图片，并用ImageJ计算灰度值；结果如图2-A所示：表明干扰C20orf24的重组质粒能在HCT116和HT29细胞中干扰成功。同时，将构建成功的细胞株冻存于-80℃。
6、体内动物实验
选取60只6周龄、雄性裸小鼠(balb/c-nu/nu，购自江苏集萃药康公司)。每种细胞株6只，构建肿瘤生长模型：
(1)实验之前对裸鼠进行麻醉，通过无痛及有痛刺激来评估麻醉程度，确定裸鼠处于麻醉状态；
(2)将细胞株1、3、5、7、9、10、11、12、13、14细胞分别重悬于PBS(0.01M、pH＝7.4)中，每只小鼠用25G针头的微注射器通过皮下注射分别注入约106个细胞，每2天观察瘤的生长情况，结果如图2-B、图6-A所示：敲低C20orf24能够抑制结直肠癌细胞生长增殖；过表达C20orf24能够促进结直肠癌细胞生长增殖，而在C20orf24过表达的基础上表达失活形式的Rab5(S34N)能够抑制C20orf24诱导的增殖，另外C20orf24-DD单独过表达也能够显著抑制细胞增殖；图2-B表明：C20orf24是一个直结肠癌生长相关的生物标记物，具有直结肠癌临床应用价值；图6-A表明：阻断Rab5活性或者引入C20orf24-DD能够显著抑制直结肠癌生长。
7、免疫共沉淀实验
(1)pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24质粒和pEGFP-RAB5A质粒(购于武汉淼灵生物科技公司)转染HEK 293T细胞：选择Lip3000作为转染试剂，实验分为两组：A空白对照组；B实验组，每组都转染1μg pLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24质粒和1μg pEGFP-RAB5A质粒，细胞接种与转染具体步骤如下：
①在转染前一天晚上将细胞用0.25％胰酶消化HEK 293T细胞，3min后用含10％FBS的DMEM终止消化，用血球计数板进行细胞计数，分别取5×105个细胞种在2个小皿上(康宁)，每个皿添加2mLDMEM完全培养基，在37℃培养过夜；
②转染前，每个皿先用1mL无血清DMEM孵育HEK 293T细胞；同时，配制转染体系：取200μL DMEM培养基及3μL Lip3000，放置5min，得到混合液A；取200μL DMEM完全培养基、1μgpLVX-Puro-mCherry-HA-C20orf24质粒和1μg pEGFP-RAB5A质粒，放置5min，得到混合液B；将混合液A和混合液B混合，室温静置20min，得到混合液C；
③分别取200μL混合物C加入每个皿中，混匀，并置于37℃培养，转染后6h后换成新鲜DMEM完全培养基。
(2)裂解细胞：分别用预冷的PBS(0.01M、pH＝7.4)洗三遍转染后的HEK293T细胞，每个皿加入1mLIP细胞裂解液(碧云天，P0013)，冰上裂解30min，每隔10min轻轻颠倒混匀一次；4℃、13200rpm离心30min，取上清；
(3)预洗裂解液：分别用BCA法测浓度(A空白对照组：2.5ng/μL；B实验组：2.3ng/μL)，取1mg总蛋白，加入2.5μg IgG抗体(Cell Signaling Technology,Cat#5415)和30μLProtein A/G珠子(Santa Cruz,Cat#sc-2003)，然后在4℃旋转混合仪中孵育30min；4℃、2500rpm离心5min，取上清；
(4)再次预洗裂解液：分别加30μL Protein A/G珠子，4℃、2500rpm离心5min，取上清；
(5)孵育抗体：向A空白对照组加入2.5μg IgG抗体(Cell Signaling Technology,Cat#5415)，向B实验组加入2.5μg anti-HA(proteintech,Cat#51064-2-AP)，在4℃旋转混合仪中孵育16h；
(6)孵育珠子：分别加入40μL Protein A/G珠子，在4℃旋转混合仪中孵育4h；
(7)去除杂蛋白：分别在4℃、2500rpm离心5min，弃上清；然后用1mL IP细胞裂解液轻轻重悬珠子，4℃、2500rpm离心5min，去上清；
(8)再次去除杂蛋白：分别用1mL IP细胞裂解液轻轻重悬珠子，4℃、2500rpm离心5min，去上清，重复两次；
(9)制样：分别加入20μL 1×蛋白上样缓冲液(碧云天，P0015)重悬珠子，混匀，在沸水浴中煮10min，得到样品；
(10)蛋白免疫印迹：将步骤(9)得到的样品进行蛋白免疫印迹实验，具体如下：
①制胶：配制10％的分离胶(5mL)：1.5mM Tris-HCl(pH8.8)1.3mL，ddH2O1.9mL，30％丙烯酰胺1.7mL，10％SDS(十二烷基硫酸钠)50μL，10％过硫酸胺50μL，TEMED(四甲基乙二胺)2μL(加入后混匀，快速制胶)(本次所检测蛋白C20orf24-mCherry-HA和Rab5-GFP-flag的分子量大小分别约为46和50kD左右，因此选择10％的分离胶)；配制5％浓缩胶(3mL)：1.5mM Tris-HCl(pH8.8)0.38mL，ddH2O2.1mL，30％丙烯酰胺0.5mL，10％SDS(十二烷基硫酸钠)30μL，10％过硫酸胺30μL，TEMED(四甲基乙二胺)6μL(加入后混匀，快速制胶)；
②将步骤(9)得到的样品沸水中煮5min后，冰上放置2min，离心10s使侧壁上的液体回到EP管底部，准备上样；
③装好电泳仪(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，加入电泳缓冲液并且上样；
④先使用80V电压跑30min，再使用120V电压，直至溴酚蓝条带接近末端，结束电泳，裁剪相应大小的PVDF膜；
⑤将PVDF膜用甲醇浸润活化至变色，按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序摆好，接入转膜电源，235mA恒电流冰上转膜90min；
⑥转膜完后，取出PVDF膜，用TBST润洗去除残留的转膜缓冲液，然后用5％的脱脂牛奶室温封闭2h；
⑦封闭完后用TBST润洗去除残留的牛奶，根据蛋白指示带剪膜，加入稀释1:1000的相应的一抗:anti-GFP(Proteintech,Cat#50430-2-AP)和anti-HA(Proteintech,Cat#51064-2-AP)，4℃孵育过夜(16h)；
⑧回收一抗，用TBST洗膜30min，每隔十分钟换一次液，加入稀释1:4000的相应二抗(HS101-01、HS201-01，全式金公司)，室温孵育2h；
⑨回收二抗，用TBST洗膜30min，每隔十分钟换一次液；
⑩合理控制曝光时间显影，并用Photoshop裁剪图片，并用ImageJ计算灰度值。
结果如图3所示：Rab5与C20orf24存在显著的相互作用；表明：C20orf24通过与Rab5的相互作用来调控细胞增殖生长。
8、Rab5蛋白活性检测：通过GST-Rab5 binding domain(R5BD)pull down实验检测，具体如下：
(1)将细胞株1、细胞株2、细胞株3、细胞株4、细胞株5、细胞株6(每种细胞株取100万个细胞)用Western及IP细胞裂解液(碧云天，Cat#P0013)，按照1ml/皿的Western及IP细胞裂解液的量加入到培养皿中，冰上裂解15min后，12000g离心30min，取上清进行蛋白浓度测定，细胞株1、2、3、4、5、6上清蛋白浓度分别为：2.3ng/μL、2.9ng/μL、2.6ng/μL、2.3ng/μL、2.5ng/μL、2.5ng/μL；
(2)取1mg不同处理组的蛋白裂解液分别与纯化好的GST-R5BD珠子(参照文献Golgi phosphoprotein 3promotes glioma progression via inhibiting Rab5-mediated endocytosis and degradation of epidermal growth factor receptor(Zhouetal.Neuro-oncology,2017,19(12):1628-1639.)中第1630页，左栏倒数第二段：Glutathione S-transferase Pulldown部分制备得到)(BeyoGoldTM GST-tagPurification Resin，碧云天，P2253)进行共孵育4℃过夜，用PBS(0.01M、pH＝7.4)进行洗涤3次后，得到样品；
(3)蛋白印迹实验
①制胶：配制12％的分离胶(5mL)：1.5mM Tris-HCl(pH8.8)1.9mL，ddH2O1mL，30％丙烯酰胺2mL，10％SDS(十二烷基硫酸钠)50μL，10％过硫酸胺50μL，TEMED(四甲基乙二胺)2μL(加入后混匀，快速制胶)(本次所检测蛋白Rab5分子量的大小约21kD左右，因此选择12％的分离胶)；配制5％浓缩胶(3mL)：1.5mM Tris-HCl(pH8.8)0.38mL，ddH2O2.1mL，30％丙烯酰胺0.5mL，10％SDS(十二烷基硫酸钠)30μL，10％过硫酸胺30μL，TEMED(四甲基乙二胺)6μL(加入后混匀，快速制胶)；
②将步骤(2)得到的样品沸水中煮5min后，冰上放置2min，离心10s使侧壁上的液体回到EP管底部，准备上样；
③装好电泳仪(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，加入电泳缓冲液并且上样；
④先使用80V电压跑30min，再使用120V电压，直至溴酚蓝条带接近末端，结束电泳，裁剪相应大小的PVDF膜；
⑤将PVDF膜用甲醇浸润活化至变色，按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序摆好，接入转膜电源，235mA恒电流冰上转膜90min；
⑥转膜完后，取出PVDF膜，用TBST润洗去除残留的转膜缓冲液，然后用5％的脱脂牛奶室温封闭2h；
⑦封闭完后用TBST润洗去除残留的牛奶，根据蛋白指示带剪膜，加入稀释1:1000的相应的一抗:anti-Rab5a(Proteintech，Cat#11947-1-AP)，4℃孵育过夜(16h)；
⑧回收一抗，用TBST洗膜30min，每隔十分钟换一次液，加入稀释1:4000的相应二抗(HS101-01、HS201-01，全式金公司)，室温孵育2h；
⑨回收二抗，用TBST洗膜30min，每隔十分钟换一次液；
⑩合理控制曝光时间显影，并用Photoshop裁剪图片，并用ImageJ计算灰度值，结果如图4所示：C20orf24的Rabip domain缺失体能够抑制Rab5的活性；表明：C20orf24-DD能够通过抑制Rab5活性进而抑制细胞增殖，是一个潜在多肽药物有希望用于临床治疗。
9、蛋白印迹实验检测C20orf24及其Rabip domain缺失体对MAPK通路的影响：
(1)本次所检测蛋白裂解液来自细胞株1、细胞株2、细胞株3、细胞株4、细胞株5、细胞株6，每种细胞株取100万个细胞；
(2)裂解细胞：用预冷的PBS(0.01M、pH＝7.4)洗三遍，加入100μL的RIPA细胞裂解液(碧云天，P0013B)，冰上裂解30min，每隔10min轻轻颠倒混匀一次；4℃、13200rpm离心30min，取上清进行蛋白浓度测定；
(3)制样：各取30μg的蛋白加入20μL 1×蛋白上样缓冲液(碧云天，P0015)，混匀，在沸水浴中煮10min，得到样品；
(4)制胶：配制10％的分离胶(5mL)：1.5mM Tris-HCl(pH8.8)1.3mL，ddH2O 1.9mL，30％丙烯酰胺1.7mL，10％SDS(十二烷基硫酸钠)50μL，10％过硫酸胺50μL，TEMED(四甲基乙二胺)3μL(加入后混匀，快速制胶)；配制5％浓缩胶(3mL)：1.5mM Tris-HCl(pH8.8)0.38mL，ddH2O2.1mL，30％丙烯酰胺0.5mL，10％SDS(十二烷基硫酸钠)30μL，10％过硫酸胺30μL，TEMED(四甲基乙二胺)6μL(加入后混匀，快速制胶)；
(5)将上述的样品沸水中煮5min后，冰上放置2min，离心10s使侧壁上的液体回到EP管底部，准备上样；
(6)装好电泳仪(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，加入电泳缓冲液并且上样；
(7)上样完后，先使用80V电压跑30min，再使用120V电压，直至溴酚蓝条带接近末端，结束电泳，裁剪相应大小的PVDF膜；
(8)将PVDF膜用甲醇浸润活化至变色，按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序摆好，接入转膜电源，235mA恒电流冰上转膜90min；
(9)转膜完后，取出PVDF膜，用TBST润洗去除残留的转膜缓冲液，然后用5％的脱脂牛奶室温封闭2h；
(10)封闭完后用TBST润洗去除残留的牛奶，根据蛋白指示带剪膜，加入稀释1:1000的相应的一抗:anti-EGFR(Proteintech,Cat#18986-1-AP)、p-MEK1(CST,Cat#9127)、MEK1/2(CST,Cat#4694)、p-ERK1/2(Abclonal,Cat#AP0472)、ERK1/2(CST,Cat#4696)、anti-Actin(Proteintech,Cat#60008-1-Ig)和anti-HA(Proteintech,Cat#51064-2-AP)，4℃孵育过夜(16h)；
(11)回收一抗，用TBST洗膜30min，每隔十分钟换一次液，加入稀释1:4000的相应二抗(HS101-01、HS201-01，全式金公司)，室温孵育2h；
(12)回收二抗，用TBST洗膜30min，每隔十分钟换一次液；
(13)合理控制曝光时间显影，并用Photoshop裁剪图片，并用ImageJ计算灰度值，结果如图5所示：过表达C20orf24能够促进结直肠癌细胞促进p-MEK1和p-ERK1/2表达增多及EGFR内吞，而C20orf24-DD过表达能够显著抑p-MEK1和p-ERK1/2表达增多及EGFR内吞，从而抑制肿瘤增殖生长。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> C20orf24蛋白缺失突变体及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C20orf24蛋白缺失突变体
<400> 1
Met Ser Gly Gly Arg Arg Lys Glu Glu Pro Pro Gln Pro Gln Leu Ala
1 5 10 15
Asn Gly Ala Leu Lys Val Ser Val Trp Ser Lys Val Leu Arg Ser Asp
20 25 30
Ala Ala Trp Glu Asp Lys Asp Glu Phe Leu Asp Gly Val Leu Tyr Leu
35 40 45
Tyr Phe Ser Asn Tyr Leu Gln Ile Asp Glu Glu Glu Tyr Gly Gly Thr
50 55 60
Trp Glu Leu Thr Lys Glu Gly Phe Met Thr Ser Phe Ala Leu Phe Met
65 70 75 80
Val Ile Trp Ile Ile Phe Tyr Thr Ala Ile His Tyr Asp
85 90
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C20orf24 UP
<400> 2
atgtacccat acgatgttcc agattacgct agcggcgggc ggcgg 45
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C20orf24 DW
<400> 3
cgctctagaa ctagtctcga gtcagtcata atggatggca g 41
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mCherry-HA UP
<400> 4
atttccggtg aattcctcga ggccaccatg gtgagc 36
<210> 5
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mCherry-HA DW
<400> 5
gacgagctgt acaagctcga gactagttct agagcggccg cggatccaat gtacccatac 60
gatgttccag attacgct 78
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatgaatttt tagatggagt cctgtacctc tacttc 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C20orf24-DD PR
<400> 7
atctaaaaat tcatccttat cctcccaggc cgcgtc 36
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S34N PF
<400> 8
gttggcaaaa acagcctagt gcttcgtttt gtgaaa 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S34N PR
<400> 9
ctgggagagt ccgctgttgg caaaaacagc ctagtg 36
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> shC20orf24-#1
<400> 10
cgtgtttcct ggaccgcgat t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> shC20orf24-#2
<400> 11
cgtggtccat agcacagtat t 21
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Control
<400> 12
cctaaggtta agtcgccctc gctcgagcga gggcgactta accttagg 48

Claims (5)

1.一种C20orf24蛋白缺失突变体，其特征在于：所述的C20orf24蛋白缺失突变体为缺失了C20orf24蛋白中第44-79位氨基酸序列的C20orf24蛋白缺失突变体，其氨基酸序列为MSGGRRKEEPPQPQLANGALKVSVWSKVLRSDAAWEDKDEFLDGVLYLYFSNYLQIDEEEYGGTWELTKEGFMTSFALFMVIWIIFYTAIHYD。
2.一种多核苷酸，其特征在于：为以下多核苷酸中的至少一种：
（1）编码权利要求1所述的C20orf24蛋白缺失突变体的多核苷酸；
（2）与（1）中所述多核苷酸互补的多核苷酸。
3.一种载体，其特征在于：包含权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于：包含权利要求3述的载体。
5.权利要求1所述的C20orf24蛋白缺失突变体在制备治疗癌症药物中的应用，其特征在于：所述的癌症为结直肠癌。
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Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6242214B1 (en) * 1998-04-21 2001-06-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human GTPase-associated proteins
CN1618808A (zh) * 2003-11-21 2005-05-25 上海人类基因组研究中心 肝癌相关蛋白及其编码序列和用途
CA2650616A1 (en) * 2006-04-26 2007-11-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hepatitis c virus infection biomarkers
EP1985713A1 (en) * 2007-04-05 2008-10-29 Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg Methods and tools for detecting the presence of colorectal adenocarcinoma cells
EP2169077A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-31 Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg Methods and compositions for diagnosing an adenocarcinoma
EP2199407A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-23 Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg In vitro methods and compositions for the diagnosis and/or treatment of adenocarcinoma
TWI751557B (zh) * 2015-06-19 2022-01-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於免疫治療的新穎胜肽及胜肽組合物與產生用於抗胰臟癌及其他癌症的支架的方法

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