KR20140015207A - 지속형 인슐린 결합체의 액상 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생리활성 펩타이드인 인슐린 (insulin)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제 및 상기 제제의 제조방법에 관한 것으로 다회 사용시 미생물 오염 방지를 목적으로 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 액상 제제는 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없이 인슐린 결합체에 대해 우수한 저장 안정성을 나타낸다.

Description

지속형 인슐린 결합체의 액상 제제 {A liquid formulation of long acting insulin conjugate}
본 발명은 생리활성 펩타이드인 인슐린 (insulin)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제 및 상기 제제의 제조방법에 관한 것이다.
인슐린 (Insulin)은 사람 췌장의 베타세포에서 분비되는 51개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 5,800 달톤(Da)의 펩타이드로서, 체내의 혈당을 조절하는데 매우 중요한 역할을 담당하는 물질이다. 이러한 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않아 혈중 포도당의 농도가 높아지는 대사질환을 당뇨병이라 한다. 인슐린이 제대로 분비되지 않거나 분비된 인슐린이 체내에서 제대로 작용하지 못하여 체내의 혈당이 조절되지 못하고 상승하는 경우를 제 2형 당뇨병이라고 하며, 췌장에서 인슐린을 분비하지 못하여 혈당이 상승하는 경우를 제 1형 당뇨병이라고 한다. 제 2형 당뇨병의 경우 화학물질을 주성분으로 하는 경구용 혈당 강하제를 이용하여 치료를 하며 일부 환자에는 인슐린을 사용하여 치료하기도 한다. 반면 제 1형 당뇨병의 경우에는 인슐린의 투여가 필수적으로 요구된다.
현재 많이 사용되고 있는 인슐린 치료법은 식사 전, 후에 주사를 통하여 인슐린을 투여하는 방법이다. 하지만, 이러한 인슐린 치료법은 하루에 3번씩 지속적으로 사용되어야 하기 때문에 환자들에게 많은 고통과 불편을 야기한다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 다양한 시도가 있어 왔으며, 그 중 하나로 펩타이드 약물의 생체막 투과도를 증가시켜 구강 또는 비강을 통한 흡입으로 펩타이드의 약물을 체내로 전달하는 시도가 있었다. 그러나 이러한 방법은 주사제에 비해 펩타이드의 체내 전달 효율이 현저히 낮으며 따라서 펩타이드 약물의 체내 활성을, 요구되는 조건으로 유지하는데 아직까지는 어려움이 많다.
한편, 과량의 약물을 피하에 투여한 후 흡수가 지연되도록 하는 방법이 있었으며 이를 통하여 하루에 한번 투여로 지속적인 혈중농도를 유지하는 방법이 있었다. 그 중 일부는 의약품 (Lantus, Sanofi-aventis)으로 허가를 받아 현재 환자에게 투여되고 있다. 또 인슐린에 지방산을 수식하여 인슐린 중합체의 결합을 강하게 하며 투여부위 및 혈중의 알부민과 결합하여 지속시간을 늘리는 연구가 진행되었으며 의약품 (Levemir, NovoNordisk)으로 허가를 받았다. 하지만, 이러한 방법은 투여부위에서 통증이 나타나는 부작용이 있으며, 아직도 하루 한번 주사를 통한 투여간격으로 여전히 환자에게 큰 부담이 아닐 수 없다.
한편, 펩타이드 약물이 체내로 흡수된 이후, 펩타이드 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔는데, 이러한 펩타이드 약물의 지속형 제제는 펩타이드 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역 반응을 유발하지 않아야 한다. 이러한 펩타이드 약물의 지속형 제제로는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 용해도가 높은 고분자 물질을 펩타이드 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어왔다.
PEG는 목적 펩타이드의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며, 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 예를 들어, 국제공개특허 WO 2006/076471은 NPR-A에 결합하여 cGMP의 생산을 활성화하여 동맥 내 혈압을 감소시키며 따라서 울혈성 심부전증 (Congestive heart failure) 치료제로 사용되는 B형 나트륨배설증가펩타이드 (B-type natriuretic peptide, BNP)에 PEG를 결합하여 생리 활성을 지속시키는 것에 대해 기술하고 있으며, 미국 등록특허 US 6,924,264에서는 엑센딘-4의 라이신 잔기에 PEG를 결합시켜 생체 내 지속 시간을 증가시키는 방법을 기술하고 있다. 그러나 이러한 방법은 PEG 분자량을 증가시켜 펩타이드 약물의 생체 내 지속시간을 연장할 수 있는 반면, 분자량이 증가할수록 펩타이드 약물의 역가가 낮아지는 단점이 있다.
생리활성 단백질의 생체 내 안정성을 높이는 또 다른 방법으로서, 유전자 재조합에 의해 혈중 안정성이 높은 단백질 유전자와 생리활성 단백질 유전자를 연결한 후, 상기 재조합 유전자로 형질전환된 동물세포 등을 배양하여 융합 단백질을 생산하는 방법이 개발되어 있다. 예를 들어, 단백질의 안정성 증가에 효과가 높은 것으로 알려져 있는 알부민 또는 그 단편을 유전자 재조합에 의해 목적하는 생리활성 단백질에 결합시켜 생산한 융합 단백질이 보고되어 있다 (국제공개특허 WO 93/15199 및 WO 93/15200, 유럽특허 EP 413,622).
국제공개특허 WO 02/46227는 재조합 유전자 기술을 이용한 GLP-1 및 엑센딘-4 또는 그 유사체와 인간 혈청 알부민 또는 면역글로불린 단편(Fc)과의 융합단백질에 대해 기술하고 있으며, 미국등록특허 US 6,756,480는 부갑상선 호르몬(PTH) 및 그 유사체와 Fc 융합단백질에 대해 기술하고 있다. 이러한 방법은 낮은 페길화(pegylation) 수율 문제와 비특이성을 극복할 수 있는 반면에, 혈중반감기 증가효과가 예상보다 획기적이지 못하고 경우에 따라서는 역가가 낮은 문제점을 지니고 있다. 혈중반감기 증가효과를 극대화하기 위하여 다양한 종류의 펩타이드 링커가 사용되기도 하지만 면역 반응을 유발할 수 있는 가능성이 있다. 또한 BNP와 같이 디설파이드 결합 (disulfide bond)을 가지고 있는 펩타이드를 이용할 경우 미스폴딩 (misfolding)의 확률이 높아 적용이 어렵다는 문제점과 천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기가 있는 경우 유전자 재조합의 형태로 생산이 불가능하다는 문제점이 있다.
최근에 활성 감소 최소화와 안정성 증가를 동시에 이룰 수 있는 지속성 단백질 약물 제제로, 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 폴리펩타이드를 결합시켜 제조한 결합체가 대한민국 등록특허 10-0567902 (생체내 지속성이 증가된 생리활성 폴리펩타이드 결합체), 및 대한민국 등록특허 10-0725315 (면역글로불린단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의 제조방법)에 개시되었다.
또한 인슐린의 혈중반감기 증가 및 생체 내 저혈당 증상을 나타내지 않는 방법으로 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 PEG 수식된 인슐린 아날로그를 공유 결합에 의해 부위 선택적으로 상호 연결한 인슐린 결합체가 혈중 반감기 및 저혈당 위험을 획기적으로 개선시키는 효과가 대한민국 공개특허 10-2011-0134210 (면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 유도체 약물 결합체)에 개시되었다. 상기의 방법으로 생리활성 펩타이드로서 인슐린을 적용시켜 지속형 인슐린 결합체를 제조할 수 있는데, 지속형 인슐린 결합체가 포함된 약물을 제품으로 공급하기 위해서는 저장 운송 과정에서 빛, 열, 또는 첨가제 내 불순물에 의해 유도된 열화에 의한 변성, 응집, 흡착 또는 가수분해 등의 물리화학적인 변화를 억제하면서 생체 내 효력을 유지시키는 것이 필수적이다. 지속형 인슐린 결합체는 펩타이드 상의 인슐린에 비해 부피가 커지고, 분자량이 증가하여 펩타이드 상의 인슐린에 비해 안정화하는데 매우 어려움이 있다.
상이한 단백질들은 그들의 화학적 차이점으로 인해, 저장 동안 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있다. 즉, 안정화를 위해 사용되는 물질에 의한 저장기간 연장 효과는 상이한 단백질에 대해서 동등하지 않으며, 이로 인해 저장 안정성을 부여하기 위해 사용되는 안정화제는 목적 단백질의 물리화학적 특성에 따라 적합한 비율, 농도 및 종류가 다양하다. 안정화제들을 병용할 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있으며, 저장하는 동안 저장 단백질의 본질이 변화하거나 농도가 변화하기 때문에 상이한 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 용액 중의 단백질을 안정화하기 위해서는 많은 노력과 주의가 필요하다. 특히, 생체 내 지속성 및 안정성을 높인 지속형 인슐린 결합체의 경우, 생리활성 펩타이드인 인슐린과 면역글로불린 Fc영역이 결합된 형태이므로 분자량 및 부피가 일반적인 인슐린과 확연하게 달라, 단백질을 안정화하기 위한 특별한 조성이 요구된다.
또한, 생리활성 펩타이드인 인슐린과 면역글로불린 Fc영역은 각각 물리 화학적 특성이 다른 펩타이드 또는 단백질이므로, 생리활성 펩타이드인 인슐린과 면역글로불린 Fc영역을 동시에 안정화하여야 한다. 그러나, 상기 설명한 바와 같이, 상이한 펩타이드 또는 단백질들은 그들의 물리 화학적 차이점으로 인해, 저장 동안 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있고, 각각의 펩타이드 또는 단백질에 적합한 안정화제들을 병용하는 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있다. 따라서, 지속형 인슐린 결합체의 경우 생리활성 펩타이드인 인슐린과 면역글로불린 Fc영역을 동시에 안정화하는 안정화제의 조성을 찾는 것에 많은 어려움이 있다.
한편, 최근에는 환자의 편의성을 높인 반복 사용 가능한 단백질 및 펩타이드 제형이 개발되고 있다. 하지만 이 다회 사용 제형은, 반복 투여 후 버리기 전까지 미생물의 오염을 방지하기 위하여 반드시 보존제가 포함되어야 한다. 보존제가 포함된 다회 사용 제형은 단회 사용 제형에 비해 몇 가지 장점이 있다. 예를 들어, 단회 사용 제형의 경우 투여량의 차이에 따라 낭비되는 약물의 양이 많은데, 다회 사용 제형의 경우 버려지는 제품의 양을 줄일 수 있다. 게다가 일정 기간 동안 미생물의 성장의 걱정 없이 여러 번 사용 할 수 있으며, 하나의 용기로 제공할 수 있어 포장을 최소화할 수 있어 경제적이다.
하지만, 보존제의 사용은 단백질의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 보존제를 사용하는 경우 가장 많이 알려진 문제는 침전 형성이다. 단백질 침전은 약물의 효과를 감소시키고 체내 투여시 예기치 않은 면역반응을 초래할 수 있다. 따라서 보존제의 미생물 방지력을 유지하면서 단백질의 안정성에 문제가 되지 않는 보존제의 종류 및 농도의 선택이 중요하다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 지속형 인슐린 결합체를 바이러스 오염의 우려 없이 장기간 동안 보관할 수 있는 지속형 인슐린 결합체의 안정한 액상 제제를 제공하기 위하여 예의 노력한 결과, 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 등장화제를 포함하는 안정화제를 이용함으로써 지속형 인슐린 결합체의 안정성을 증대시켜 경제적이고 안정한 액상 제제를 제조할 수 있음을 확인하였으며, 또한 상기 액상 제제가 추가로 보존제를 포함하는 경우 다회 사용이 가능한 액상 제제를 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 생리활성 펩타이드인 인슐린 (insulin)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 지속형 인슐린 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제에 더하여 보존제를 추가로 포함하는, 다회투여용 지속형 인슐린 결합체 액상 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 액상 제제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 생리활성 펩타이드인 인슐린 (insulin)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인슐린 결합체를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 당뇨병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 생리활성 펩타이드인 인슐린 (insulin)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 지속형 인슐린 결합체 및 알부민-비함유 안정화제에 더하여 보존제를 포함하는, 다회투여용 지속형 인슐린 결합체 액상 제제를 제공한다.
본 발명의 용어 "지속형 인슐린 결합체"는 유도체, 변이체, 전구물질, 그리고 단편 등을 포함하는 생리활성 인슐린과 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 결합체로서, 천연형 인슐린에 비해 생리활성 지속기간이 증가된 특징을 가진 결합체를 의미할 수 있다. 본 발명에서 용어, 지속형 인슐린 결합체는 인슐린이 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 링커 또는 펩타이드 링커를 통하여 연결된 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 용어 "지속형"이란 생리활성 지속기간이 천연형에 비해 증대된 것을 의미하는 것이며, "결합체"란 인슐린과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 형태를 의미한다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체는 효력의 지속성이 천연형 인슐린에 비해 증가한 것을 의미하며, 상기 지속형 인슐린 결합체는 천연형 인슐린의 아미노산이 수식, 치환, 추가 또는 제거된 형태, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 생분해성 중합체가 인슐린에 결합된 결합체, 알부민이나 면역글로불린과 같은 지속성이 뛰어난 단백질이 인슐린에 결합된 결합체, 생체 내 알부민과 결합력을 갖는 지방산이 인슐린에 결합된 결합체 또는 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태의 인슐린을 포함할 수 있으나, 지속형 인슐린 결합체의 종류는 본 발명에 제한을 두지 않는다.
본 발명에서 사용되는 지속형 인슐린 결합체는 합성하여 제조한 인슐린과 면역글로불린 Fc 영역을 결합시켜 제조한다. 이 때 이용되는 결합 방법으로, 인슐린과 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 이용하여 교차 결합시키거나, 재조합기술을 이용하여 인슐린과 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 융합 단백질로 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린"은 체내의 혈당이 높을 때 췌장에서 분비되어 간, 근육, 지방 조직에서 당을 흡수하여 글리코겐으로 저장하며, 지방을 분해하여 에너지원으로 사용되는 것을 억제하여 혈당을 조절하는 기능을 가지는 펩타이드를 의미한다. 상기 펩타이드는 천연형 인슐린, 기초 인슐린(basal insulin), 인슐린 아고니스트(agonist), 전구물질(precursor), 유도체 (derivatives), 단편(fragments) 및 변이체(variants) 등을 포함한다.
본 발명에서 용어, "천연형 인슐린"은 췌장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 세포 내 글루코스 흡수를 촉진하고 지방의 분해를 억제하여 체내의 혈당을 조절하는 역할을 한다. 인슐린은 혈당조절 기능이 없는 프로인슐린(proinsulin) 전구체의 형태에서 프로세싱을 거쳐 혈당조절 기능을 가지는 인슐린이 된다. 인슐린 아미노산 서열은 아래와 같다:
알파 체인:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (서열번호 1)
베타 체인:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly- Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호 2)
본 발명에서 용어, "기초 인슐린(basal insulin)"은 정상적인 하루의 혈중 글루코스 변동을 조절하는 펩타이드로서, 그 예로 래브미어(levemir), 글라긴(glagine) 및 디글루드(deglude) 등이 있다. 본 발명에서 용어, "인슐린 아고니스트"는 인슐린의 구조와 상관없이 인슐린의 생체내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다. 본 발명에서 용어, "인슐린 변이체"는, 인슐린과 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들의 방법의 조합을 통해 제조될 수 있다. 본 발명에서 용어, "인슐린 유도체"는 천연형 인슐린과 비교 시 아미노산 서열에서 최소한 80% 이상 상동성을 보이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태일 수 있고, 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다. 본 발명에서 용어, "인슐린 단편"은 인슐린의 아미노말단 또는 카르복시말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D형 아미노산)도 가능할 수 있다. 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.
인슐린 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고, N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화 (deamination)된 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다. 본 발명에서 사용한 인슐린은 재조합 방법을 통하여 생산될 수 있으며, Solid phase 합성법을 통하여 합성하는 방법으로도 생산 가능하다. 또한, 본 발명에서 사용된 인슐린은 베타 체인의 아미노 말단에 비펩타이드성 중합체가 결합될 수 있다. 이와 같은 비펩타이드성 중합체는 링커로 이용될 수 도 있다. 상기 비펩타이드성 중합체를 링커로 연결함으로서 인슐린의 활성을 유지시키면서, 안전성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 1개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이나 이에 제한되지 않는다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체를 사용하는 경우 캐리어와 유사한 수준의 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체 뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가질 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체인 링커의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 본 발명의 지속형 인슐린 결합체를 제조할 수 있다.
바람직하게는 상기 비펩타이드성 중합체는 인슐린 베타 체인의 N-말단에 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 인슐린은 비펩타이드성 중합체로 개질된 형태일 수 있다.
면역글로불린 단편을 이용한 지속형 인슐린 결합체의 개발 시, 저혈당 증상을 나타내지 않으면서 보다 긴 약물 지속시간을 나타내기 위하여 폴리에틸렌글리콜로 생리활성 폴리펩타이드를 수식할 경우 역가가 줄어드는 현상이 오히려 지속형 인슐린 결합체에 있어서는 특수하게 장점으로 사용되므로, 폴리에틸렌글리콜 수식된 인슐린을 비펩타이드성 중합체를 통하여 면역글로불린 Fc 영역과 결합시킬 수도 있다. 인슐린 개질에 사용할 수 있는 비펩타이드성 중합체의 종류는 상기에서 설명한 바와 같으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 상기 폴리에틸렌글리콜 수식된 인슐린에서 폴리에틸렌글리콜의 수식은, 폴리에틸렌글리콜이 인슐린의 알파 체인 N-말단 또는 베타 체인 특정 라이신 잔기에 선택적으로 결합한 것을 특징으로 한다. 상기 인슐린을 수식하는 폴리에틸렌글리콜은 바람직하게 말단에 알데히드 및 숙신 반응기를 포함하고, 더욱 바람직하게 숙신 반응기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜이다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체의 자세한 제조방법 및 효력은 대한민국 공개특허 10-2011-0134210, 10-2011-0134209, 10-2011-0111267등이 참고문헌으로서 본 발명에 해당된다. 당업자들은 상기의 문헌들에 의해 본 발명에 사용되는 지속형 인슐린 결합체를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단에 모노 페길 화(mono-PEGylation)한 다음, 이를 인슐린의 베타 체인의 1번 페닐알라닌에 수식시켜 지속형 인슐린 결합체를 제조하는 방법을 제공한 바 있다.
본 발명에서 사용되는 인슐린은 캐리어 물질과 비펩타이드성 중합체를 링커로 사용하여 연결된다. 본 발명에 사용가능한 캐리어 물질은 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 트랜스페린 및 PEG로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 면역글로불린 Fc 영역이다.
본 발명의 상기 지속성 인슐린 결합체는 인슐린이 면역글로불린 Fc 영역과 비펩티이드성 링커를 통해 연결된 형태로서, 지속성 및 안정성을 나타낸다. 본 발명에서 면역글로불린 Fc는 면역글로불린 단편과 혼용하여 사용될 수 있다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 달라 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1)CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)과의 조합, 6)중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체 (mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능(effector function)을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 WO 97/34631, 국제특허공개 WO 96/32478 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화 되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체 액상제제는 치료학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 지속형 인슐린 결합체의 농도는 0.1 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖이고, 바람직하게는 10 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖이다. 본 발명의 상기 지속형 인슐린 결합체 액상 제제는 인슐린 결합체가 저농도로 존재할 경우뿐만 아니라 고농도로 존재할 경우에도 결합체를 침전없이 안정적으로 저장할 수 있어, 안정적으로 생체 내로 고농도의 인슐린을 공급할 수 있다.
본 발명의 용어 "안정화제"는 지속형 인슐린 결합체가 안정하게 저장될 수 있도록 하는 물질을 의미하는데, "안정화"는 일정한 시간 동안 특정 저장 조건하에서 활성 성분의 손실이 특정량 미만, 일반적으로 10% 미만임을 의미한다. 보통, 5±3 ℃에서 2년, 25±2 ℃에서 6개월 또는 40±2 ℃에서 1 내지 2주 동안 지속형 인슐린 결합체가 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 92-95% 정도의 잔존율을 유지하는 경우 이러한 제제는 안정한 것으로 이해된다. 지속형 인슐린 결합체와 같은 단백질에 있어서, 저장 안정성은 정확한 투여량을 보장하기 위해서 뿐만 아니라, 지속형 인슐린 결합체에 대한 항원성 형태 물질의 잠재적인 생성을 억제하기 위해서 중요하다. 저장 동안 지속형 인슐린 결합체가 10% 정도의 손실을 나타내는 것은 조성물 내에서 응집체나 단편 등을 야기하여 항원성 화합물로 전환되지 않는 한 실질적인 투여 시 허용할 만한 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 상기 안정화제는 지속형 인슐린 결합체에 안정성을 부여하기 위해 완충용액, 당알코올, 등장화제로서의 염화나트륨, 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하다.
완충용액은 지속형 인슐린 결합체가 안정해지도록 용액 제형의 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시키는 역할을 한다. 완충용액은 알칼리 염(나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 이들의 수소 또는 이수소 염), 나트륨 시트레이트/시트르산 (구연산 나트륨/구연산), 나트륨 아세테이트/아세트산을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 다른 제약 상 허용 가능한 pH 완충제를 포함할 수 있으며, 이들 완충제의 혼합물도 사용될 수 있다. 그러한 완충용액의 바람직한 예로는 아세트산 나트륨 완충용액 (Na-Acetate buffer)이 특히 바람직하다. 아세트산 나트륨 완충용액을 구성하는 아세트산염의 농도는 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 이고, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 50 mM이다. 완충용액의 pH는 바람직하게는 4.0 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 4.0 내지 7.0, 더욱 더 바람직하게는 5.0 내지 7.0이다.
당알코올은 지속형 인슐린 결합체의 안정성을 증대시키는 역할을 하는데, 본 발명에 사용되는 당알코올의 농도는 바람직하게는 전체 용액 대비 1 내지 20%(w/v), 더욱 바람직하게는 2 내지 15%(w/v)이다. 그러한 당알코올의 대표적인 예로는 만니톨, 소르비톨을 들 수 있으며, 바람직한 예로는, 만니톨을 들 수 있다.
등장화제는 지속형 인슐린 결합체를 용액 상에서 체내에 투여할 때 삼투압을 적절하게 유지하는 역할을 하며, 상기 지속형 인슐린 결합체를 용액 상에서 더욱 안정화시키는 부수적인 효과도 나타낸다. 그러한 등장화제의 대표적인 예로는 수용성 무기염을 들 수 있으며, 그 예로 염화나트륨, 황산나트륨, 구연산나트륨을 들 수 있으며, 바람직한 예로는, 염화나트륨을 들 수 있다. 상기 등장화제는 제형에 포함된 성분들의 종류 및 양 등에 따라 각각의 혼합물이 모두 포함된 용액 제형이 등장액이 되도록 적절한 함량으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 등장화제는 1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 이용될 수 있다.
비이온 계면활성제는 단백질 용액의 표면장력을 낮추어 소수성 표면에 단백질이 흡착되거나 응집되는 것을 방지하여 준다. 본 발명에 사용될 수 있는 비이온 계면활성제의 바람직한 예로는 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제 및 플록사머계 비이온 계면활성제 등을 들 수 있고, 이들이 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용 될 수 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제가 더욱 바람직하다. 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제의 예로는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80 등이 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트 20이 바람직하다.
상기 비이온 계면활성제를 액상 제제에 고농도로 사용하는 것은 적절하지 못한데, 고농도의 비이온 계면활성제는 UV-분광법이나 등초점법과 같은 분석법으로 단백질의 농도 측정이나 안정성을 평가할 때에 간섭효과를 유발하여, 단백질의 안정성을 정확하게 평가하기가 어렵기 때문이다. 따라서, 본 발명의 용액 제형에는 상기 비이온 계면활성제가 바람직하게는 0.2%(w/v) 이하의 저농도, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.02%(w/v)로 포함된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 완충용액, 당알코올 및 비이온성 계면활성제 존재 하에서, 등장화제로서의 염화나트륨을 포함시키는 경우 지속형 인슐린 결합체의 저장 안정성을 현저히 증가시키는 것으로 확인되었으며, 특히 10 mM 아세트산나트륨, 10 내지 20 mg/ml 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 및 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하며 pH가 6.0일 경우에 지속형 인슐린 결합체가 매우 높은 안정성을 나타내었다. 또한, 등장성 삼투압을 위하여 10 mM 아세트산나트륨, 1.2 내지 5.9 mg/ml 염화나트륨, 2 내지 5%(w/v) 만니톨, 및 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하며 pH가 6.0일 경우에도 지속형 인슐린 결합체가 매우 높은 안정성을 나타내었다. 이는 완충용액, 당알코올 및 비이온성 계면활성제와 등장화제로서의 염화나트륨의 동시 사용이 시너지 효과를 나타내어 지속형 인슐린 결합체에 특별한 안정성을 부여한다는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 안정화제는 알부민을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 단백질의 안정화제로 이용될 수 있는 인간 혈청 알부민은 인체의 혈액으로부터 제조되므로, 인간 유래의 병원성 바이러스에 의한 오염 가능성이 존재하며, 젤라틴이나 소 혈청 알부민은 질환을 야기하거나, 또는 일부 환자의 경우에는 알러지 반응을 유발할 가능성이 있다. 본 발명의 알부민-비함유 안정화제는 인간 또는 동물 유래의 혈청 알부민 또는 정제된 젤라틴 등의 이종 단백질을 함유하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없다.
또한, 본 발명의 상기 안정화제는 당류, 다가 알코올 또는 중성 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 지속형 인슐린 결합체의 저장 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당류 및 다가 알코올 중 당류의 바람직한 예로는 만노오스, 글루코오스 ,푸코오스 및 크실로오스 등의 단당류와 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스 및 덱스트란 등의 다당류 등을 들 수 있고, 다가 알코올의 바람직한 예로는, 프로필렌글리콜 및 저분자량의 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 저분자량의 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있으며, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 지속형 인슐린 결합체 액상 제제는 상기 설명한 결합체, 완충용액, 등장화제, 당 알코올, 및 비이온 계면활성제 이외에, 다회투여용 제제의 미생물 오염 방지를 목적으로 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 '보존제'란 항균제로서 작용하기 위해 제약 제제에 첨가되는 화합물을 의미하며, 이러한 보존제로는 벤즈에토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로부탄올, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 염화 벤잘코늄, 페닐수은산 질산염, 티메로살, 벤조산 등을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 보존제는 1종 단독으로 사용하거나 2종 이상을 임의로 조합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 액상 제제는 보존제로서 m-크레졸, 페놀, 및 벤질알코올 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 액상 제제에 있어서, 보존제는 0.001 내지 1 %(w/v)의 양으로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 0.5 %(w/v)의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 액상제제에 보존제로서 m-크레졸을 0.27%(w/v) 포함시켜 크레졸이 인슐린 결합체의 안정성에 미치는 영향을 평가한 결과, 결합체의 침전이 일어나지 않고 결합체의 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기한 안정화제에 더하여 보존제를 추가로 포함하는 본 발명의 인슐린 결합체의 액상제제는 다회 투여를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 액상 제제에는 상기 설명한 완충용액, 등장화제, 당알코올, 비이온 계면활성제 및 보존제 이외에, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업계에 공지되어 있는 기타의 성분 내지 물질들이 선택적으로 더 포함될 수도 있다.
지속형 인슐린 결합체에 안정성을 제공하는 본 발명에 따른 알부민-비함유 지속형 인슐린 결합체 액상 제제는 바이러스 감염의 우려가 없을 뿐만 아니라, 간단한 제형으로 우수한 저장 안정성을 나타내어 다른 안정화제나 동결 건조 제제에 비해 경제적인 제공이 가능한 제제이다.
또한, 본 발명의 액상 제제는 천연형에 비해 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 인슐린 결합체를 포함하고 있으므로 통상적인 인슐린 제제에 비해 인체 내에서 단백질 활성을 장기간 유지할 수 있어 효율적인 약물 제제로 이용할 수 있으며, 저농도 뿐만 아니라 고농도의 지속형 인슐린 결합체에 대해서도 우수한 안정성을 제공하는 제제이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 액상 제제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 액상 제제는 지속형 인슐린 결합체를 제조하는 단계, 및 상기 단계에서 제조된 지속형 인슐린 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 통하여 제조할 수 있다. 또한 상기 안정화제에 더하여 보존제를 추가로 혼합함으로써 다회 사용을 위한 안정한 지속형 인슐린 결합체 액상 제제를 제조할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 인슐린 결합체를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 인슐린 결합체는 액상 제제의 형태일 수 있으며, 이는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "당뇨(Diabetes)병"은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환(metabolic disease)을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 혈당을 조절하여 당뇨병을 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 당뇨병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하며, "예방"은 상기 조성물의 투여로 당뇨병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 증세가 호전되거나 이롭게 변경 상기 당뇨병 치료는 당뇨병이 발생할 수 있는 임의의 포유동물에 적용이 가능하며, 그 예로 인간 및 영장류 뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등 가축을 제한 없이 포함하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 어떤 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물들의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강 내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 경구투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체의 액상 제제는 치료학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체를 포함한다. 일반적으로, 그 예로 란투스(Lantus, Insulin glargine; Sanofi Aventis), 인슐린의 치료학적 유효량은 1일 약 0.07 ~ 3.7 mg 정도가 허용 범위이다. 특히, 본 발명의 추가 목적이 가능한 한 수 주일에 한번만 투여한다는 것이기에 인슐린의 1일 최대 허용량은 약 0.5 ~ 25.9mg 정도이다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 지속형 인슐린 결합체를 포함하는 조성물을 당뇨병에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
지속형 인슐린 결합체를 포함하는 본 발명의 조성물은 주1회의 투여로도 혈당을 우수하게 낮추면서 체중 증가의 부작용을 가지고 오지 않는바, 당뇨병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 지속형 인슐린 결합체의 액상 제제는 완충용액, 당알코올, 등장화제, 비이온성 계면활성제를 함유하는 안정화제를 포함하고 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아, 바이러스 감염의 우려가 없고, 인슐린과 면역글로불린 Fc 영역의 결합으로 이루어져 천연형에 비해 분자량이 크고 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 인슐린 결합체에 대해 우수한 저장 안정성을 제공한다. 또한 보존제를 추가로 포함하는 경우 다회 사용이 가능한 안정한 액상 제제를 제공할 수 있다. 특히, 상기 지속형 인슐린 결합체에 우수한 안정화된 액상 제제를 제공한다. 이와 같은 본 발명의 액상 제제는 간단한 제형으로 우수한 저장 안정성을 나타내어 다른 안정화제나 동결 건조 제제에 비해 경제적인 제공이 가능한 제제이다. 또한, 통상적인 인슐린 제제에 비해 인체 내에서 단백질 활성을 장기간 유지할 수 있어 효율적인 약물 제제로 이용할 수 있다.
도 1은 표 7의 조성에 따른 지속형 인슐린 결합체의 40에서 4주간 동안 침전 발생 결과를 육안으로 확인한 도이다. 침전 저해 지속 기간은 보관 후 단백 침전이 발생하지 않은 기간을 의미한다.
도 2는 실시예 1 내지 4에서 확인된 액상 제제(10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20)를 기초하여 고농도 등장화제로서의 20㎎/㎖ 염화나트륨, 고농도 계면활성제로서의 0.2%(w/v) 폴리소르베이트 20의 단독 추가 및 조합에 따른 지속형 인슐린 결합체 액상 제제의 40 ℃ 가혹 안정성시험을 통해 안정성을 분석한 그래프이다. 그 결과, 아세트산나트륨, pH 6.0, 염화나트륨, 만니톨, 폴리소르베이트 20 액상 제제에서 염화나트륨 농도가 20㎎/㎖로 증가된 액상 제제(#2)가 대조군(10 ㎎/㎖ 염화나트륨)에 비해 안정성을 유지하고 있음을 알 수 있다. 하지만, 폴리소르베이트 20 농도가 0.2%(w/v) 되도록 증가한 경우(#1), 보관 3주 후부터 단백침전이 발생하였으며, 고농도 등장화제로서의 20㎎/㎖ 염화나트륨, 고농도 계면활성제로서의 0.2%(w/v) 폴리소르베이트 20을 동시에 포함한 액상 제제(#3)는 보관 1주 후부터 단백침전이 발생하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 지속형 인슐린 결합체의 액상 제제를 위한 안정성 인자 확인
지속형 인슐린 결합체는 혈중 반감기 증가 및 생체 내 저혈당 증상을 나타내지 않는 방법으로 개발된 것으로, 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 인슐린을 공유 결합에 의해 부위 선택적으로 상호 연결시킨 인슐린 결합체가 혈중 반감기 및 저혈당 위험을 획기적으로 줄여준다.
이와 같은 지속형 인슐린 결합체 액상 제제의 안정성을 확인하기 위해 하기 표 1과 같은 조성으로 40℃에서 2주 동안 보관 후, 이온교환 크로마토그래피법 (Ion Exchange Chromatography, IE-HPLC)을 이용해 분석하였다.
이때 pH, 완충용액의 종류 및 농도, 등장화제의 종류, 만니톨 (Mannitol)로 이루어진 당알코올의 농도, 계면활성제의 종류, 폴리소르베이트 20 (Polysorbate 20)으로 이루어진 계면활성제의 농도, 기타 첨가제의 유무, 메티오닌 (Methionine)과 염화나트륨의 병용 첨가 등을 주요 인자로 설정하여 비교하였다.
표 1의 IE-HPLC(%)는 (Area %/Start Area %)로서, 초기 결과 값에 대비한 지속형 인슐린 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 1]
Figure pat00001

[표 2]
Figure pat00002

분석 결과, 상기 표 2와 같이, 지속형 인슐린 결합체에 있어서 아세트산 나트륨으로 이루어진 완충용액, 염화나트륨으로 이루어진 등장화제, 만니톨로 이루어진 당알코올, 폴리소르베이트 20으로 이루어진 계면활성제로 이루어진 액상 제제가 가장 안정하며 이때 pH는 5.6 또는 6.0 모두 안정하였다.
실시예 2: 등장화제 및 계면활성제 농도에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성 평가
상기 실시예 1에서 확인된 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20)를 기초하여 등장화제 및 계면활성제 농도에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성을 비교하였다. 이때 등장화제 및 계면활성제의 농도는 시판제형 및 허가기관에서 권고하는 최대 허용범위를 선정하였다.
하기 표 3과 같은 조성을 각각 지속형 인슐린 결합체의 액상 제제로 사용하여 40℃에서 4주간 보관 후, 이온교환 크로마토그래피법와 크기 배제 크로마토그래피법 (Size Exclusion Chromatography, SE-HPLC)을 이용해 안정성 평가를 하였다.
표 4의 IE-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 (Area% / Start Area%) %로서 초기 결과값에 대비한 지속형 인슐린 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 3]
Figure pat00003

[표 4]
Figure pat00004

N/A: 응집으로 인한 침전으로 데이타 이용 불가
상기 결과에서 보듯이, 실시예 2에서 확인된 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20)에 염화나트륨 농도가 20 ㎎/㎖이 되도록 증가한 경우(#2), 가장 높은 안정성을 나타냈다. 또한 폴리소르베이트 20 농도가 0.2%(w/v) 되도록 증가한 경우(#1), 보관 3주 후부터 단백 침전이 발생하여 보관 4주 후에는 단백침전이 증가하였다 (표 4).
실시예 3: 당알코올 종류에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성 평가
지속형 인슐린 결합체의 저장 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당알코올의 예로는 만노오스, 글루코오스, 푸코오스 및 크실로오스 등의 단당류와 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스 및 덱스트란 등의 다당류를 들 수 있다. 그 중 탈아미드화(deamidation) 감소 효과(J. of Pharmaceutical Sciences, Vol. 94, 2005)가 확인된 수크로오스에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성을 비교하였다. 이때 수크로오스의 농도는 시판제형 및 허가기관에서 권고하는 최대 허용범위를 고려하였다.
하기 표 5와 같은 조성을 각각 지속형 인슐린 결합체의 액상 제제로 사용하여 40에서 4주간 보관 후, 이온교환 크로마토그래피법와 크기 배제 크로마토그래피법을 이용해 안정성 평가를 하였다.
표 6의 IE-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 (Area% / Start Area%) %로서 초기 결과값에 대비한 지속형 인슐린 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 5]
Figure pat00005

[표 6]
Figure pat00006

상기 결과에서 보듯이, 지속형 인슐린 결합체의 저장 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당알코올인 수크로오스를 만니톨 대신 추가할 경우(#1), 대조군 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20)와 유사한 안정성을 확인하였다. 또한 당알코올로서의 수크로오스가 포함된 액상 제제에 염화나트륨 농도가 20 ㎎/㎖ 되도록 증가한 경우(#3), 대조군 액상 제제와 유사한 안정성을 확인하였다. 또한 폴리소르베이트 20 농도가 0.2%(w/v) 되도록 증가한 경우(#2), 그렇지 않은 경우보다 안정성이 저해되는 것을 확인하였으며, 보관 3주 후부터 단백침전이 발생하였다. #2의 경우에 침전을 제거하고 순도 비교를 하였으며 안정성이 다른 제제보다 안정성이 저해되는 것을 확인하였다 (표 6).
실시예 4: pH에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성 평가
완충용액과 염화나트륨, 만니톨, 그리고 폴리소르베이트 20으로 이루어진 액상 제제를 기초하여 다양한 pH 하에서 지속형 인슐린 결합체의 안정성을 비교하였다.
하기 표 7과 같은 조성을 각각 지속형 인슐린 결합체의 액상 제제로 사용하여 40℃에서 4주간 보관 후, 육안관찰을 이용한 단백침전 유무로서 안정성을 비교하였다.
[표 7]
Figure pat00007

도 1의 단백침전 저해 지속기간(주)는 40℃ 보관 후 단백침전이 발생하지 않은 시점을 나타낸다. 상기 결과에서 보듯이, 아세트산나트륨, pH 5.2(#1, #4, #7) 일 때, 40℃ 에서 1주 이내 단백침전이 발생하였으며, 아세트산나트륨, pH 5.6(#2, #5, #8) 일 때, 40℃ 에서 2주 이내 단백침전이 발생하였다. 그러나 아세트산나트륨, pH 6.0(#3, #6, #9) 일 때, 40℃ 에서 3주까지 단백침전이 발생하지 않았으며, 그 중, 아세트산나트륨, pH 6.0, 염화나트륨 농도가 20㎎/㎖가 되도록 증가한 경우(#6) 가장 높은 안정성을 나타냈다 (도 1).
실시예 5: 고농도 등장화제 및 계면활성제 단독 및 조합에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성 평가
상기 실시예 1 내지 4에서 확인된 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20)를 기초하여 고농도 등장화제로서의 20㎎/㎖ 염화나트륨, 고농도 계면활성제로서의 0.2%(w/v) 폴리소르베이트 20의 단독 추가 및 조합에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성을 비교하였다.
하기 표 8과 같은 조성을 각각 지속형 인슐린 결합체의 액상 제제로 사용하여 40℃에서 4주간 보관 후, 이온교환 크로마토그래피법와 크기 배제 크로마토그래피법을 이용해 안정성 평가를 하였다.
표 9의 IE-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 (Area% / Start Area%) %로서 초기 결과값에 대비한 지속형 인슐린 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 8]
Figure pat00008

[표 9]
Figure pat00009

상기 결과에서 보듯이, 대조군 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20)에 염화나트륨 농도가 20㎎/㎖ 되도록 증가한 경우(#2), 가장 높은 안정성을 나타냈다. 또한 폴리소르베이트 20 농도가 0.2%(w/v) 되도록 증가한 경우(#1), 보관 3주 후부터 단백침전이 발생하여 보관 4주 후에는 단백침전이 증가하였다. 또한 고농도 등장화제로서의 20 ㎎/㎖ 염화나트륨, 고농도 계면활성제로서의 0.2%(w/v) 폴리소르베이트 20을 동시에 포함한 액상 제제(#3)는 40℃에서 2주 이내 단백침전이 발생하였다 (표 9 및 도 2).
실시예 6: 저농도 등장화제 및 저농도 당알코올 조합에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성 평가
상기 실시예 1 내지 4에서 확인된 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20)를 기초하여 저농도 등장화제로서의 1.2 내지 5.9 ㎎/㎖ 염화나트륨, 저농도 당알코올로서의 2 내지 5%(w/v) 만니톨의 조합에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성을 비교하였다.
하기 표 10과 같은 조성을 각각 지속형 인슐린 결합체의 액상 제제로 사용하여 25℃에서 4주간 보관 후, 이온교환 크로마토그래피법와 크기 배제 크로마토그래피법을 이용해 안정성 평가를 하였다.
표 11의 IE-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 (Area% / Start Area%) %로서 초기 결과값에 대비한 지속형 인슐린 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 10]
Figure pat00010

[표 11]
Figure pat00011
상기 결과에서 보듯이, 등장화제로서 1.2 내지 5.9 ㎎/㎖ 염화나트륨 및 당 알코올로서 2 내지 5%(w/v) 만니톨을 포함하는 액상 제제는 실시예 1 내지 4에서 확인된 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20)와 견줄만한 안정성을 나타내었다.
실시예 7: 보존제에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성 평가
상기 실시예 1 내지 4에서 확인된 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20) 및 상기 실시예 6에서 확인된 등장성 삼투압을 위한 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 1.2 내지 5.9 ㎎/㎖ 염화나트륨, 2 내지 5%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20)를 기초하여 보존제에 따른 지속형 인슐린 결합체의 안정성을 비교하였다.
하기 표 12과 같은 조성을 각각 지속형 인슐린 결합체의 액상 제제로 사용하여 25℃에서 4주간 보관 후, 이온교환 크로마토그래피법와 크기 배제 크로마토그래피법을 이용해 안정성 평가를 하였다.
표 13의 IE-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 (Area% / Start Area%) %로서 초기 결과값에 대비한 지속형 인슐린 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 12]
Figure pat00012

[표 13]
Figure pat00013

상기 결과에서 보듯이, 실시예 1 내지 4에서 확인된 액상 제제(10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20) 및 실시예 6에서 확인된 등장성 삼투압을 위한 액상 제제(10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 1.2 내지 5.9 ㎎/㎖ 염화나트륨, 2 내지 5%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20)에 보존제로서의 0.27%(w/v) 메타크레졸을 포함한 액상 제제(#1, #3, #5)는 그렇지 않은 경우(대조군, #2, #4)와 견줄만한 안정성을 나타냈다.
상기 결과는 본 발명의 액상제제의 조성에 보존제를 추가로 포함시키더라도 인슐린 결합체의 높은 안정성을 유지시킬 수 있다는 것을 잘 보여주는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (32)

  1. 생리활성 펩타이드인 인슐린 (insulin)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 완충용액이 구연산, 아세트산 또는 인산 완충용액인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인슐린은 천연형 인슐린과 동일한 아미노산 서열을 갖는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인슐린은 천연형 인슐린의 아미노산 치환, 제거 또는 삽입 등에 의해 변이된 인슐린 유도체 또는 천연형 인슐린과 유사한 활성을 나타내는 펩타이드 유사체인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  7. 제5항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  9. 제1항에 있어서, 상기 결합체의 결합 방법이 비펩타이드성 중합체를 이용하거나, 재조합기술을 이용하여 결합된 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  11. 제9항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  12. 제1항에 있어서, 상기 약리학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체의 농도가 10 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  13. 제1항에 있어서, 상기 당알코올이 만니톨, 수크로오스 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 당알코올의 농도가 전체 용액 대비 1%(w/v) 내지 15%(w/v)인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  15. 제1항에 있어서, 상기 완충용액은 아세트산 완충용액인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  16. 제1항에 있어서, 상기 완충용액의 농도가 전체 용액 대비 5 mM 내지 50 mM 인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  17. 제1항에 있어서, 상기 완충용액의 pH 범위가 5 내지 7인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  18. 제1항에 있어서, 상기 등장화제는 염화나트륨 (Sodium chloride), 황산나트륨 (Sodium sulfate) 및 구연산 나트륨 (Sodium citrate)로 이루어진 군에서 선택된 것인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  19. 제1항에 있어서, 상기 등장화제는 염화나트륨인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  20. 제1항에 있어서, 상기 등장화제의 농도가 0.5 mg/ml 내지 20 mg/ml인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  21. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머 (poloxomer)인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 0.001%(w/v) 내지 0.02%(w/v)인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  23. 제1항에 있어서, 상기 안정화제가 당류, 다가알코올 및 아미노산으로 구성되는 군 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  24. 인슐린과 면역글로불린 Fc 영역이 폴리에틸렌 글리콜에 의해 결합된 지속형 인슐린 결합체 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하되, 상기 안정화제가 아세트산 완충용액, 만니톨, 폴리소르베이트 20, 및 염화나트륨을 포함하는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  25. 제24항에 있어서, 상기 안정화제가 10 mM 아세트산나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 10 내지 20 mg/ml 염화나트륨, 및 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하며 pH가 6.0인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  26. 제24항에 있어서, 상기 안정화제가 10 mM 아세트산나트륨, 2 내지 5%(w/v) 만니톨, 1 내지 6 mg/ml 염화나트륨, 및 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하며 pH가 6.0인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  27. 제1항에 있어서, m-크레졸, 페놀, 벤질알코올로 구성되는 군중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 보존제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  28. 제27항에 있어서, 상기 보존제의 농도가 전체 용액 대비 0.001% 내지 1%(w/v) 인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  29. 제27항에 있어서, 상기 보존제가 m-크레졸인 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  30. 제27항에 있어서, 다회 투여용인 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린 결합체 액상 제제.
  31. a) 지속형 인슐린 결합체를 제조하는 단계; 및
    b) a) 단계에서 제조된 지속형 인슐린 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 등장화제로서의 염화나트륨을 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 지속형 인슐린 결합체 액상 제제의 제조 방법.
  32. a) 지속형 인슐린 결합체를 제조하는 단계; 및
    b) a) 단계에서 제조된 지속형 인슐린 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 등장화제로서의 염화나트륨을 포함하는 안정화제 및 보존제와 혼합하는 단계를 포함하는 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항의 지속형 인슐린 결합체 액상 제제의 제조 방법.
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