JP2011042654A - 新規のIgEエピトープの同定 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、IgEに特異的に結合する高親和性抗体によって認識される、IgEのCH3ドメインに由来する新規のペプチドエピトープに関する。これらの新規のペプチドは、被験体においてこれらのペプチドを投与して高親和性抗体を産生させることによる、被験体の能動免疫のため、ならびに被験体の受動免疫のために、非ヒト宿主においてIgEのこれらの領域に特異的に結合する高親和性抗IgE抗体を産生するための、両方に使用され得る。
【選択図】なし
Description
本出願は、PCT出願番号PCT/US04/02892およびPCT/US04/02894(2004年2月2日出願)の優先権を主張する。上記出願の全ては、本明細書において参考として援用される。
アレルギーは、外来の因子(例えば、アレルゲン)に対する過大な免疫応答によって誘導される過敏性状態である。即時(I型)過敏症は、アレルゲンとの接触直後のアレルギー性応答によって特徴付けられ、これは、B細胞を介して媒介され、そして抗原−抗体反応に基づく。遅延性過敏症は、T細胞を介して媒介され、そして細胞免疫の機構に基づく。近年、用語「アレルギー」は、よりI型過敏症と同義になってきている。
したがって、アレルギーの治療のために適用可能な抗体は、感作された肥満細胞および好塩基球に結合したIgEと反応してはいけないが、sIgE+B細胞を認識する能力を保持しているべきである。このようなIgEアイソタイプ特異的抗体は、例えば、非特許文献18)によって、特許文献2において、および数件の米国特許(例えば、特許文献3)において、記載されている。
抗IgE抗体を産生するために使用されるペプチドはまた、アナフィラキシー性抗体を誘導する危険の可能性を被る。能動的ワクチン接種の間の抗IgE抗体の産生は、免疫の間に産生された抗体が、高親和性IgEレセプターに結合したIgEに結合する場合、または他の機構によって、受動的に投与された抗IgE抗体と同様の方法で、ヒスタミン放出を誘発し得る。
本発明は、IgEのCH3ドメインに由来する新規のペプチドエピトープに関する。これらのペプチドエピトープは、IgEに特異的に結合する高親和性抗体によって認識される。これらの新規のペプチドは、哺乳動物においてこれらのペプチドを投与して高親和性抗体を産生することによる、哺乳動物の能動免疫のために使用され得る。このペプチドエピトープはまた、非ヒト宿主において、IgEのこれらの領域に特異的に結合する高親和性抗IgE抗体を産生すること、および得られた抗体を哺乳動物の受動免疫のために使用することに使用され得る。
Asn Pro Arg Gly Val Ser Xaa Tyr Xaa Xaa
Arg Xaa(配列番号72)
エピトープAの1つの例は、以下である:
Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser
Arg Pro(配列番号73)
別の免疫原(エピトープB、図11)は、以下のアミノ酸配列を含む:
Leu Pro Arg Ala Leu Xaa Arg Ser Xaa(配列番号74)
エピトープBの例としては、以下が挙げられる:
Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(配列番号75)
His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg
Ser Thr(配列番号76)
Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr
Lys Thr(配列番号77)
配列番号72または配列番号74のいずれにおいても、Xaaは、任意のアミノ酸であり得る。
本発明は、配列番号72および/または配列番号74を含むペプチドを用いて産生された高親和性抗体の、IgE媒介性疾患もしくはIgE媒介性状態に罹患する哺乳動物への投与に関する。この高親和性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。この抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。このようなIgE媒介性疾患もしくはIgE媒介性状態としては、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、および湿疹が挙げられる。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
(項目1)
以下:Asn Pro Arg Gly Val Ser Xaa Tyr Xaa Xaa Arg Xaa(配列番号72)のアミノ酸配列から実質的に構成される、単離されたペプチド。
(項目2)
前記アミノ酸配列が、Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro(配列番号73)である、項目1に記載のアミノ酸。
(項目3)
以下:Leu Pro Arg Ala Leu Xaa Arg Ser Xaa(配列番号74)のアミノ酸配列から実質的に構成される、単離されたペプチド。
(項目4)
前記アミノ酸配列が、以下:
a)Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(配列番号75);
b)Hi Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(配列番号76);または
c)Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr(配列番号77)
である、項目3に記載のペプチド。
(項目5)
項目1または3に記載のペプチドと、生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、安定剤、または賦形剤とを含む、組成物。
(項目6)
項目5に記載の組成物であって、免疫原性キャリアをさらに含む、組成物。
(項目7)
項目6に記載の組成物であって、前記免疫原性キャリアが、BSA、KLH、破傷風トキソイド、およびジフテリアトキソイドからなる群より選択される、組成物。
(項目8)
項目1〜4のいずれか1項に記載のペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
(項目9)
標識をさらに含む、項目8に記載の抗体。
(項目10)
項目8に記載の抗体であって、該抗体は、以下:
a)キメラ抗体、
b)単鎖抗体、
c)Fabフラグメント、
d)F(ab’)、フラグメント、
e)ヒト抗体、または
f)ヒト化抗体
である、抗体。
(項目11)
項目8に記載の抗体と、受容可能なキャリアとを含む、組成物。
(項目12)
ポリクローナル抗体を調製する方法であって、該方法は、以下:
a)抗体応答を誘発する条件下において、配列番号72または配列番号74のアミノ酸配列から構成されるポリペプチドで、動物を免疫する工程、
b)該動物から抗体を単離する工程、および
c)該単離された抗体を前記ポリペプチドによってスクリーニングし、該スクリーニングによって、配列番号72または配列番号74のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、高親和性に特異的に結合するポリクローナル抗体を同定する工程、
を包含する、方法。
(項目13)
項目12に記載の方法によって生成されるポリクローナル抗体。
(項目14)
項目13に記載のポリクローナル抗体と適切なキャリアとを含む、組成物。
(項目15)
モノクローナル抗体を作製する方法であって、該方法は、以下:
a)抗体応答を誘発する条件下において、配列番号72または配列番号74のアミノ酸配列から実質的に構成されるポリペプチドで、動物を免疫する工程、
b)該動物から抗体産生細胞を単離する工程、
c)該抗体産生細胞と不死化細胞とを融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成する工程、
d)該ハイブリドーマ細胞を培養する工程、および
e)該培養から、配列番号72または配列番号74のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して高親和性に特異的に結合するモノクローナル抗体を単離する工程、
を包含する、方法。
(項目16)
項目15に記載の方法によって生成されるモノクローナル抗体。
(項目17)
項目16に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを含む、組成物。
(項目18)
前記抗体が、Fab発現ライブラリーをスクリーニングすることによって生成される、項目8に記載の抗体。
(項目19)
前記抗体がコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることによって生成される、項目8に記載の抗体。
(項目20)
項目8〜19のいずれか1項に記載の抗体を含む、キット。
(項目21)
哺乳動物においてIgEに対する免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳動物に、応答を誘導するのに十分な量の、項目1〜7のいずれか1項に記載のペプチドまたは組成物を投与する工程を包含する、方法。
(定義)
本出願を通して使用される用語は、当業者にとって通常かつ典型的な意味で解釈されるべきである。しかし、本出願人らは、以下の用語が以下に定義されるような特定の定義を与えられることを所望する。
出発抗体または「親」抗体は、このような抗体を生成するために当該分野で利用可能な技術を用いて調製され得る。これらの技術は、当該分野で周知である。出発抗体を生成するための例示的方法は、以下の節においてより詳細に記載される。これらの記載は、親抗体を作製または選択するための考えられる代替案であり、このような分子が生成され得る方法を決して限定しない。
(標的の調製)
可溶性の標的またはそれらのフラグメントは、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。この抗体は、目的の標的に対して指向する。好ましくは、この標的は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患する哺乳動物へのこの抗体の投与は、哺乳動物に治療的利益をもたらし得る。しかし、抗体は、非ポリペプチド標的に対して指向し得る。標的がポリペプチドである場合、それは、膜貫通分子(例えば、レセプター)またはリガンド(例えば、成長因子)であり得る。本発明の1つの標的は、IgEである。全細胞が抗体を作製するための免疫原として使用され得る。標的は、組み換え的に使用され得るか、または合成法を用いて使用され得る。標的はまた、天然の供給源から単離され得る。
ポリクローナル抗体は、通常、非ヒト哺乳動物において、アジュバントと組み合わせての関連する標的の複数回の皮下(sc)注射または腹腔内(ip)注射によって生成される。免疫応答を誘起し得る多くの因子は当該分野において周知である。
モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を認識する抗体である。これらの均一な特異性は、モノクローナル抗体を、種々の異なる抗原部位を認識する抗体を通常含むポリクローナル抗体よりもずっと有用にしている。モノクローナル抗体は、Kohlerら,Nature,256:495(1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製され得るか、または組み換えDNA法によって作製され得る。
ヒト化は、キメラ抗体を作製するための技術であり、キメラ抗体においては、インタクトなヒト可変ドメインよりもずっとわずかが、対応する非ヒト種由来の配列によって置換されている。ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入(import)」残基と称され、これは代表的に、「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Winterおよび共同研究者(Jonesら,Nature 321:522−525(1986);Riechmanら,Nature 332:323−327(1988);Verhoeyensら,Science 239:1534−1536(1988))の方法に従って、非ヒトCDRまたはヒト抗体中の対応する配列についてのCDR配列で置換することによって行われる(例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと)。本発明において実施される場合、ヒト化抗体は、マウス抗体における類似部位由来の残基によって置換された、いくつかのCDR残基およびいくつかのFR残基を有し得る。
種々の技術が、抗体フラグメントの生成のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して得られた(例えば、Morimotoら,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117(1992)およびBrennanら,Science 229:81(1985))。しかし、これらのフラグメントは、現在、組み換え宿主細胞によって直接的に生成され得る。例えば、抗体フラグメントは、抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、F(ab’)2−SHフラグメントが、E.coliから直接的に回収され得、化学的に結合されてF(ab’)2フラグメントを形成し得る(Carterら,Bio/Technology 10:163−167(1992))。別のアプローチに従うと、F(ab’)2フラグメントは、組み換え宿主細胞培養物から直接的に単離され得る。抗体フラグメントを生成するための他の技術は、当業者に明らかである。別の実施形態において、最適な抗体は、単鎖Fvフラグメントである(scFv)(PCT特許出願 国際公開番号93/16185)。
一旦親抗体が同定され、単離された場合、親抗体の可変領域の1つ以上において、1つ以上のアミノ酸残基が変化され得る。あるいは、または加えて、フレームワーク残基の1つ以上の置換が、親抗体中に導入され得、これらは、抗体の(例えば、ヒトIgEに対する)結合親和性に改善をもたらす。改変するフレームワーク領域の残基の例としては、以下が挙げられる:直接的に標的に非共有結合性に結合するもの(Amitら,Science 233:747−753(1986));CDRの高次構造と相互作用するもの/CDRの高次構造に影響するもの(Chothiaら,J.Mol.Biol.196:901−917(1987));および/またはVL−VH界面に(EP 239 400 B1)関与するもの。特定の実施形態において、このようなフレームワーク領域の残基の1つ以上の改変は、目的の標的に対する抗体の結合親和性の増強をもたらす。
本発明はまた、本明細書において開示されるような抗体改変体をコードする単離された核酸、この核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに上記抗体改変体の生成のための組み換え技術を提供する。抗体改変体の組み換え生成のため、それをコードする核酸が単離され、そしてさらなるクローニング(DNAの増幅)または発現のため、複製可能なベクターに挿入される。抗体改変体をコードするDNAは、容易に単離され、従来の手順を用いて(例えば、この抗体改変体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)配列決定される。
本発明の抗体改変体は、組み換え的に生成され得る。この改変体はまた、異種ポリペプチド(好ましくは、シグナル配列、または成熟タンパク質または成熟ポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチド)と融合された融合ポリペプチドとして発現され得る。好んで選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)配列である。ネイティブ抗体シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、このシグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ippまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列によって置換され得る。あるいは、図1のベクターの場合、選択されたシグナル配列は、遺伝子III由来のウイルスシグナル配列であった。酵母分泌については、ネイティブシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(SaccharomycesおよびKluyveromyces α因子リーダーが挙げられる)もしくは酸性ホスファターゼリーダー、C.albicansグルコアミラーゼリーダー、または、例えば国際公開番号90/13646において記載されるシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー(例えば、単純ヘルペスgDシグナル)が利用可能である。このような前駆領域のためのDNAは、リーディングフレームにおいて、抗体改変体をコードするDNAに連結される。
ベクターは、通常、ベクターが1種以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的に、この配列は、ベクターが宿主の染色体DNAと独立に複製することを可能にする配列であり、そして複製起点または自立的に複製する配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスに関して周知である。プラスミドpBR322由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に対して適切であり、2μプラスミド起点は、酵母に対して適切であり、そして種々のウイルス起点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVもしくはBPV)は、哺乳動物細胞中のベクターに対して有用である。一般的に、複製起点の構成要素は、哺乳動物発現ベクターにとって必要ではない(SV40起点は、初期プロモーターを含むので、代表的に唯一使用され得る)。
ベクターは、選択遺伝子(選択マーカーとも称される)を含み得る。代表的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリン)に対する耐性を与えるか、(b)栄養素要求性欠損を補完するか、または(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする(例えば、Bacillus属にとってのD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子)。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物体によって認識され、かつ抗体核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主とともに使用するために適切なプロモーターとしては、phoAプロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター(例えば、tacプロモーター)が挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、抗体をコードするDNAに作動可能に連結された、シャイン−ダルガーノ(S.D.)配列を含む。
高等真核生物による本発明の抗体をコードするDNAの転写は、多くの場合、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大する。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子から知られている(グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインシュリン)。しかし代表的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側におけるSV40エンハンサー(bp100〜270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関する、Yaniv,Nature 297:17−18(1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体をコードする配列に対して5’位置または3’位置において、ベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターの5’部位に位置する。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、もしくは他の多細胞生物由来の有核細胞)において使用される発現ベクターはまた、転写の終止のためおよびmRNAを安定化するために必要な配列を含み得る。このような配列は、一般的に、真核生物またはウイルスのDNAもしくはcDNAの、5’非翻訳領域から、そしてときには3’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写される、ヌクレオチドセグメントを含む。1つの有用な転写終止構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。例えば、国際公開番号94/11026を参照のこと。
本明細書中に記載のベクターにDNAをクローニングまたは発現させるのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物の細胞である。この目的に適した原核生物としては、グラム陰性生物およびグラム陽性生物(例えば、E.coli、Enterobacter属、エルウィニア属、Klebsiella属、Proteus属、サルモネラ属、Serratia属およびShigella属などの腸内細菌、ならびにバチルス属、シュードモナス属およびストレプトミセス属)の両方が挙げられる。一つの好ましいE.coliクローニング宿主は、E.coli294(ATCC 31,446)であるが、E.coli B、E.coli X1776(ATCC 31,537)およびE.coli W3110(ATCC 27,325)のような他の菌株も適している。これらの例は、限定的ではなく、むしろ例示的である。
組換え技術を使用する場合、抗体改変体は、細胞内で産生され得るか、ペリプラズム空間で産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。抗体改変体が、細胞内で産生される場合、第一の工程として、粒状の破片である、宿主細胞の断片または溶解した断片のいずれかは、例えば、遠心分離または限外濾過により取り除かれ得る。Carterら、Bio/Technology 10:163〜167(1992)は、E.coliのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順を記述する。手短かには、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTAおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で約30分間にわたって溶解する。細胞の破片は、遠心分離によって取り除かれ得る。抗体改変体が、培地中に分泌される場合、そのような発現系由来の上清は、一般的には最初に市販のタンパク質濃縮フィルター(例えば、Amicon限外濾過ユニットまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニット)を使用して濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、前の工程のいずれかに例えば、PMSFのようなプロテアーゼインヒビターが含まれてもよく、外来性の夾雑物の増殖を防止するために抗生物質が含まれてもよい。
ポリペプチドまたは抗体の治療処方物は、凍結乾燥処方物または水溶液として保存するために、所望の程度の精製度を有するポリペプチドを、当該分野で代表的に利用される任意の「薬学的に受容可能な」キャリア、賦形剤または安定化剤(これらは全て「賦形剤」と称される)と混合することにより調製され得る。例えば、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤および他の種々の添加剤である(Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、A.Osol編(1980)を参照のこと)。このような添加剤は、用いられる投薬量および濃度では、レシピエントに対して無毒性でなければならない。
本発明の抗体改変体は、親和性精製因子として使用され得る。このプロセスにおいて、抗体は、当該分野で周知の方法を使用して、固相(例えば、SEPHADEXTM樹脂、またはろ紙)上に固定される。固定された抗体改変体は、精製されるべき標的を含むサンプルと接触され、その後、その支持体は、精製されるべき標的を除いてサンプル中の実質的に全ての物質を取り除く適した溶媒で洗浄される。その支持体は、固定された抗体改変体結合される。最後に、その支持体は、標的を抗体改変体から放出する別の適切な溶媒(例えば、グリシン緩衝液)で洗浄される。
本発明の抗体は、哺乳動物を処置するために使用され得ることが企図される。一実施形態において、この抗体は、例えば、前臨床データを得る目的で、非ヒト哺乳動物に投与される。処置されるべき例示的な非ヒト哺乳動物としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、および前臨床研究が行われる他の哺乳動物が挙げられる。このような哺乳動物は、この抗体を用いて処置されるべき疾患に対する確立された動物モデルであり得るか、または、目的の抗体の毒性を研究するために使用され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、用量増大研究が、哺乳動物に対して行なわれ得る。この抗体またはポリペプチドは、任意の適切な手段で投与され、その手段としては、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、鼻腔内投与が挙げられ、局所的な免疫抑制処置について所望の場合、病巣内投与が挙げられる。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与が挙げられる。さらに、抗体改変体は、パルス注入、特に低下用量の抗体改変体を用いたパルス注入により適切に投与される。好ましくは、この用量は、注射によって与えられ、最も好ましくは、投与が、短期であるか、長期であるかに一部依存して、静脈内注射または皮下注射によって与えられる。
用語「エピトープ」とは、B細胞および/またはT細胞が抗原に対して応答する部位をいう。B細胞エピトープは、連続するアミノ酸またはタンパク質の三次元のフォールディングによって並列する連続しないアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは、代表的に、変性溶媒に曝露されて保持されるのに対して、三次元フォールディングによって形成されるエピトープは、代表的に変性溶媒を用いた処理に対して失われる。エピトープは、代表的に、少なくとも3個、より通常は、少なくとも5個または8〜10個のアミノ酸を、固有の空間コンフォメーションに含む。同一のエピトープを認識する抗体は、ある抗体の、別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示す単純な免疫学的検定において同定され得る。
本発明はまた、薬学的組成物(例えば、配列番号72および/または配列番号74を含む本発明のペプチド免疫源分子、ならびに希釈剤、賦形剤、アジュバントまたはキャリアを含有するワクチン)に関する。本発明は、さらに、本発明の少なくとも一つのペプチドを、そのペプチドに対する免疫応答を誘発し得る部分と共有結合させる工程を包含する、本発明の免疫源の調製のためのプロセスに関する。
(抗IgEマウスMAb TES−C21のヒト化)
マウスmAb TES−C21の重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)の配列を、公開されたデータベースで利用可能なヒト抗体生殖細胞系配列と比較した。上記工程1に記載されるテンプレートを決定する場合、いくつかの基準を用い、これらの基準としては、全長、フレームワーク内の類似したCDR位置、全体の相同性、CDRの大きさなどが挙げられる。これらの基準は全てひとまとめにして、TES−C21MAb重鎖配列とTES−C21MAb軽鎖配列との間の配列アラインメント、ならびに図3Aおよび図3Bに示されるそれぞれのヒトテンプレート配列に示される最適なヒトテンプレートを選択するための結果を提供する。
(VHおよびVLのファージ発現ベクターへのクローニング)
VHおよびVLをハイブリダイゼーション変異誘発により、ファージ発現ベクターにクローニングした。ウリジン化テンプレートを、CJ236 E.coli株(dut「ung」)を、M13ベースのファージで感染させることにより調製した(ファージ発現ベクターTN003)。
lawn)上で増殖させることにより、力価を測った。クローンを、組成を確認するために、配列決定した。
(ライブラリースクリーニングのためのディープウェルでの培養)
(A.ファージライブラリーのプレーティング)
ファージライブラリーを、LB培地に希釈し、プレートあたりの所望のプラーク数を達成した。高力価のファージを、200μLのXL−1B細胞培養物と混合した。3mLのLBの表面の寒天を混合し、LBプレートに注ぎ、室温で10分間そのままにしておいた。そのプレートを、37℃にて、一晩インキュベートした。
100μLのファージ溶出緩衝液(10mM Tris−Cl、pH7.5、10mM
EDTA、100mM NaCl)を滅菌U底96ウェルプレートの各ウェルに添加した。一晩後のライブラリープレート由来の単一のファージプラークを、フィルター処理したピペットチップを用いてウェルに移した。ファージ溶出プレートを、37℃にて1時間インキュベートした。このプレートをインキュベーションに続いて4℃にて保存し得る。
50mLの培養物由来のXL1B細胞を、2×YT培地に、1:100希釈で添加した。その細胞を、A600が0.9〜1.2の間になるまで、シェーカー内で37℃にて増殖させた。
細胞が適切なODに到達したときに、1M IPTG(1:2000)をXL 1B培養物に添加した。IPTGの最終濃度は、0.5mMであった。750μLの細胞培養物を96ウェルのディープウェルプレート(Fisher Scientific)の各ウェルに移した。各ウェルに、25μLの溶出ファージを接種した。このディープウェルプレートをシェーカー(250rpm)内に配置し、37℃にて一晩インキュベートした。
インキュベーション後、このディープウェルプレートを、Beckman JA−5.3プレートローターを使用して、3,250rpmにて20分間遠心した。ELISAのために、各ウェルから50μLの上清を抜き取った。
XL−1を、10μg/mLのテトラサイクリンを含有する2×YT中で、シェーカー内で(250rpm)、37℃にて、A600が0.9〜1.2になるまで増殖させた。IPTGを、0.5mMの最終濃度で添加し、15mLの培養物を50mLの円錐管に、各クローンが特徴付けられるように移した。細胞に、高力価ストック(力価=約1011pfu/mL)由来の10μLのファージを接種し、37℃にて1時間インキュベートした。この細胞を、室温で振盪しながら一晩増殖させた。
この細胞を、4,500rpmでの20分間のIEC遠心分離にて、ペレット化した。培養培地を取り除き、ペレットを、650μLの再懸濁緩衝液(1mMのEDTAおよび500mMのスクロースを含有する、50mM Tris、pH8.0)に再懸濁し、ボルテックスし、その後穏やかに振盪しながら1時間氷上に配置した。細胞の破片を、4℃で、9,000rpmで10分間遠心することにより取り除いた。可溶性Fabを含む上清を、収集し、そして4℃にて保存した。
(フレームワーク改変)
フレームワーク内の上記の潜在的に重要な位置に、12個のマウス/ヒトのゆらぎ残基が存在する。VHの73位は、ヒト化ライブラリーでは、マウス残基スレオニンとして維持されていた。なぜならこの位置は、結合に影響を及ぼすと確定されたからである。しかし、VH73のスレオニンが、ヒト生殖細胞系VHサブグループ1および2の共通のヒト残基であることが示された。
(抗IgEをスクリーニングするための一点ELISAプロトコル)
プレートを、炭酸塩被覆緩衝液中の2μg/mLのヒツジ抗ヒトFdで、4℃で一晩被覆した。被覆溶液を取り除き、そして、そのプレートを、ウェルあたり200μLの3% BSA/PBSで、37℃にて1時間ブロックした。プレートを、PBS/0.1% TWEEN(登録商標)(PBST)で4回洗浄した後、50μL/ウェルのFabサンプル(すなわち、高力価ファージおよびDMBブロックから分泌されたFabもしくはペリプラズム調製物、または15mLの調製物を含む上清)を添加した。プレートを室温で1時間インキュベートし、その後、PBSTで4回洗浄した。0.5% BSA/PBS中に0.015μg/mLで希釈した50μL/ウェルのビオチン化SE44および0.05%のTWEEN(登録商標)を添加した。次いで、プレートを室温で2時間インキュベートし、4×PBSTで洗浄した。0.5%のBSA/PBSおよび0.05%のTWEEN(登録商標)中に1:2000で希釈した50μL/ウェルのストレプトアビジンHRPを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを、6×PBSTで洗浄した。50μL/ウェルのTMB 基質(Sigma)を添加して展開し、次いで、50μL/ウェルの0.2MのH2SO4を添加することにより停止させた。
(ELISA滴定:抗IgE)
プレートを、炭酸塩被覆緩衝液中の0.25μg/mL(精製したFab 0.1μg/ml)のSE44で4℃で一晩被覆した。被覆溶液を取り除き、このプレートを、200μL/ウェルの3%のBSA/PBSで、37℃にて1時間ブロックした。
(可溶性Fabを発現するM13ファージの親和性精製のためのプロトコル)
(A.1日目)
10mg/mLのテトラサイクリンを含有する2つの500mL培養物(2×YT)に、5mLの一晩のストックXL1Bを接種し、37℃にてA600が0.9〜1.2になるまで増殖させた。IPTGを、0.5mMの濃度まで添加した。次いで、細胞培養物を、培養あたり200μLのファージで感染させ、振盪しながら37℃にて1時間インキュベートした。感染後、その細胞を25℃にて一晩振盪しながら増殖させた。
細胞を、250mLの遠心管中で、4℃で、3500×gにて30分間で、ペレット化した。培養培地を吸引し、ペレットを、合計12〜15mLの溶解緩衝液(緩衝液A+プロテアーゼインヒビターの混液)に再懸濁した。
(可溶性レセプターアッセイ)
ELISAに適した96ウェルアッセイプレートを、0.05mLの0.5μg/mL FcεRIα鎖レセプター被覆緩衝液(50mM 炭酸塩/重炭酸塩、pH9.6)で、4〜8℃にて12時間被覆した。このウェルを吸引し、250μLのブロック緩衝液(PBS、1% BSA、pH7.2)を添加し、37℃にて1時間インキュベートした。別個のアッセイプレートにおいて、サンプルおよび参照のTES−C21 MAbを、200μg/mL〜0.001μg/mLまで、アッセイ緩衝液(0.5% BSAおよび0.05% Tween20、PBS、pH7.2)で1:4希釈して滴定し、等量の100ng/mLのビオチン化IgEを添加して、そのプレートを25℃にて、2〜3時間インキュベートした。FcεRI被覆ウェルを、0.05% TWEEN20を含むPBSを用いて三回洗浄し、サンプルウェルから50μLを移し、25℃にて、30分間攪拌しながらインキュベートした。アッセイ緩衝液に1:2000で希釈した1mg/mLのストレプトアビジン−HRPを50μL/ウェルで、30分間攪拌しながらインキュベートし、次いで、そのプレートを既に述べたように洗浄した。50μL/ウェルのTMB基質を添加し、発色させた。等量の0.2M H2SO4を添加することにより、反応を停止させ、450nmにて吸光度を測定した。
(抗体のIgE負荷FcεRIに対する結合)
FcεRIのαサブユニットと結合したヒトIgEに対する抗体の結合を、10μg/mLのヒトIgEと4℃にて30分間プレインキュベートすることによって、決定した。プレートを三回洗浄し、その後、種々の濃度のマウス抗ヒトIgE MAb E−10−10またはヒト化Fab改変体のどちらかと1時間インキュベートした。Fabの結合を、ビオチン標識した抗ヒトFd抗体を用いて、その後SA−HRPにより検出した。マウスMAb E−10−10を、ヤギ抗マウスIg Fc HRP結合Abにより検出した。
(クローン特徴付け)
各候補を、結合親和性についてアッセイし、ポジティブクローンを配列決定した。結合親和性を増加させる、CDR領域における有益な変異を有する抗体改変体をさらに特徴付けした。アッセイには、Biacore分析;IgEのレセプターに対するIgE結合の阻害;およびレセプターが結合したIgEの架橋が含まれる。
(抗IgE抗体の発現および精製ならびにHRP結合)
高親和性MAb候補を生成した。インタクトな抗IgE MAbの生成のために、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をファージベクターテンプレートからPCR増幅し、CMVプロモーターの発現下で、H鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターに別個にサブクローニングした。6個の全長抗体クローンを構築した。これらを図10A〜図10Fに示す。適切な重鎖プラスミドおよび適切な軽鎖プラスミドを、当該分野で周知の技術によるエレクトロポレーションを使用して、マウス骨髄腫細胞株NS0に同時トランスフェクトした。例えば、Liouら、J.Immunol.第143巻、第12号:3967〜75(1989)を参照のこと。抗体を、プロテインAセファロース(Pharmacia)を使用して単一の安定な細胞株上清から精製した。抗体の濃度を、280nmでのスペクトロフォトメーターおよびFCAアッセイ(IDEXX)を使用して決定した。
(ヒトIgEの高親和性結合エピトープのマッピング)
(A.ペプチド合成および抗IgE結合アッセイ)
研究は、IgEが、そのCH3ドメインを介してそのレセプターに結合することを示した。本発明のHA 抗IgE抗体は、非常に効率的にIgEのそのレセプターへの結合をブロックするので、本発明者らは、全長CH3ドメインを含むペプチドを使用してエピトープをマッピングした。第一に、本発明者らは、二つのV5タグ化したペプチドを調製し、その一つは、ヒトIgEの全長定常領域を含み、もう一つは、ヒトIgEのCH2−CH3領域のみを含んでいた。これらの二つのペプチドは、インビトロ転写翻訳によって発現し、HA抗IgE MAb結合を検出するために、ウエスタンブロットアッセイに使用された。CL−2 CMAbおよびCL−5I MAbは両方ともインタクトなヒトIgEに結合し得、両方ともそのペプチドに結合し得る。
IgG1に見出されるアミノ酸とペプチド内のアミノ酸との置換に伴うアラニンスキャニングを、どのアミノ酸が、HA抗IgE MAbのこれらのペプチドへの結合に決定的に関与しているかを決定するために行なった。HA抗IgE MAb結合に重要であることが決定されたアミノ酸を、IgEのε鎖におけるインビトロ変異誘発方法を使用して置換した。上に記載されるCε2領域およびCε3領域をカバーする別のペプチドをまた、この研究に使用した(図13および図14を参照のこと)。
(エピトープBの免疫原性ペプチドを使用するトランスジェニックマウスの能動免疫)
ヒトIgEを構成的に発現するトランスジェニックマウスを使用して、エピトープBのヒト免疫原性ペプチドに対する抗体の能動的な産生を実証した。二つの融合ペプチド(それぞれが、本発明の免疫原性ペプチドであるシステイン残基およびKLHを含む)を化学的に合成した。ペプチド1の配列は、以下:
(KLH−Cys)−Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr
であり、ペプチド2の配列は、以下:
Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr−(Cys−KLH)
であった。
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