KR20070008578A - 신규한 ＩｇＥ 에피토프의 확인 - Google Patents

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댄양 후앙
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Abstract

본 발명은 IgE에 특이적으로 결합하는 높은 친화성 항체에 의해 인식되는 IgE의 CH3 도메인으로부터 유래된 신규한 펩티드 에피토프에 관계한다. 이들 신규한 펩티드는 개체에서 높은 친화성 항체를 발생시키는 개체의 능동 면역화(active immunization) 및 IgE의 이들 영역에 특이적으로 결합하는 비-인간 숙주에서 높은 친화성 항-IgE 항체를 발생시키는 개체의 수동 면역화(passive immunization)에 이용될 수 있다.
IgE 에피토프

Description

신규한 ＩｇＥ 에피토프의 확인{IDENTIFICATION OF NOVEL IgE EPITOPES}
관련 출원
본 출원은 2004년 2월 2일자로 제출된 PCT 출원 PCT/US04/02892와 PCT/US04/02894에 우선권을 주장한다.
알레르기는 외래 물질, 예를 들면, 알레르기원(allergen)에 대한 과대한 면역 반응으로 유도되는 과민성 상태이다. 알레르기원과의 접촉 직후에 알레르기 반응으로 특성화되는 즉시형(1형) 과민반응(immediate hypersensitivity)은 B 세포를 통하여 매개되고 항원-항체 반응에 기초한다. 지연형 과민반응(delayed hypersensitivity)은 T 세포를 통하여 매개되고 세포 면역(cellular immunity) 기전에 기초한다. 최근에, “알레르기”는 I형 과민반응과 동의어로서 거의 간주되고 있다.
즉시형 과민반응은 알레르기원에 노출 직후에 항체 분비 혈장 세포로 분화되는 B 세포에 의한 면역글로불린 클래스 E의 항체(IgE 항체)의 생산에 기초한 반응이다. IgE 유도된 반응은 알레르기원의 신체 침입 부위, 다시 말하면, 점막 표면 및/또는 국소 림프절에서 발생하는 국지적 현상이다. 국지적으로 생산된 IgE는 먼저, 국소 비만 세포(mast cell)를 감작화시킨다, 다시 말하면, IgE 항체는 비만 세 포의 표면에서 Fcε 수용체에 불변 영역으로 결합하고, 이후 “스필 오버(spill over)” IgE는 순환계로 들어가 전신에서 순환하는 호염기구와 조직-고정된 비만 세포 모두에서 수용체에 결합한다. 결합된 IgE가 후속으로 알레르기원과 접촉하게 되면, Fcε 수용체는 세포가 탈과립(degranulation)되고 다수의 아나필락시스 매개물질, 예를 들면, 히스타민, 프로스타글란딘, 류코트리엔 등을 방출하도록 하는 알레르기원의 결합에 의해 가교결합된다. 이들 물질의 방출은 즉시형 과민반응의 전형적인 임상 증상, 다시 말하면, 호흡기 또는 장내에서 평활근의 수축; 작은 혈관의 확장과 물과 혈장 단백질에 대한 이들의 투과성 증가; 예로써 알레르기성 비염, 아토피성 습진, 천식을 유발하는 점액의 분비; 가려움과 통증을 유발하는 피부에서 신경 단부의 자극 원인이 된다. 이에 더하여, 알레르기원과 2차 접촉이후 반응이 강화되는데, 그 이유는 일부 B 세포가 알레르기원과 일차 접촉이후 세포 표면에서 IgE를 발현함으로써 표면 IgE 양성 B 세포(sigE+ B 세포)의 “기억 풀(memory pool)”을 형성하기 때문이다.
IgE에 대한 2가지 주요 수용체가 존재한다: 고 친화성 수용체 FcεRI과 저 친화성 수용체 FcεRII. FcεRI은 비만 세포와 호염기구(basophil)의 표면에서 주로 발현되지만, 낮은 수준의 FcεRI은 인간 랑게르한스 세포(Langerhan's cell), 수상돌기 세포(dendritic cell), 단핵구에서도 발견될 수 있는데, 여기서 이는 IgE 매개된 알레르기원 제시에서 기능한다. 이에 더하여, FcεRI은 인간 호산구(eosinophil)와 혈소판에서 보고되었다(Hasegawa, S. et. al., Hematopoiesis, 1999, 93:2543-2551). FcεRI은 B 세포, T 세포, 또는 호중구(neutrophil)의 표면 에서 발견되지 않는다. 랑게르한스 세포와 피부 수상돌기 세포에서 FcεRI의 발현은 알레르기 개체에서 IgE-결합된 항원 제시에 기능적으로, 생물학적으로 중요하다(Klubal R. et al., J. Invest. Dermatol. 1997, 108(3):336-42).
저 친화성 수용체, FcεRII(CD23)는 머리 구조가 세포 혈장 막으로부터 긴 α-나선 꼬인 줄기로부터 연장되는 3개의 동일한 소단위를 포함하는 레시틴-유사 분자이다(Dierks, A.E. et al., J. Immunol. 1993, 150:2372-2382). IgE에 결합이후, FcεRII는 IgE의 합성 조절에 관여하는 B 세포에서 CD21과 결합한다(Sanon, A. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 1990, 86:333-344, Bonnefoy, J. et al., Eur. Resp. J. 1996, 9:63s-66s). FcεRII는 알레르기원 제시에 관여하는 것으로 오래전에 인지되었다(Sutton and Gould 1993, Nature, 366:421-428). 상피 세포에서 FcεRII에 결합된 IgE는 특이적이고 신속한 알레르기원 제시를 주도한다(Yang, P.P., J. Clin. Invest., 2000, 106:879-886). FcεRII는 B 세포, 호산구, 혈소판, 자연 킬러 세포, T-세포, 소포 수상돌기 세포, 랑게르한스 세포를 비롯한 여러 세포형에 존재한다.
FcεRI 및 FcεRII와 상호작용하는 IgE 분자에서 구조적 부분 역시 확인되었다. 돌연변이유발 연구에서, CH3 도메인이 IgE의 FcεRI(Presta et al., J. Biol. Chem. 1994, 269:26368-26373; Henry A. J. et al., Biochemistry, 1997, 36:15568-15578)과 FcεRII(Sutton and Gould, Nature, 1993, 366: 421-428; Shi, J. et al., Biochemistry, 1997, 36:21 12-2122)와의 상호작용을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 고 친화성 수용체와 저 친화성 수용체 모두에 대한 결합 부위는 2개의 CH3 도메인을 통하여 중심 회전 축을 따라 대칭적으로 위치한다. FcεRI-결합 부위는 CH2 도메인의 접합부(junction) 주변에서 외부 측면으로 CH3 도메인에 위치하는 반면, FcεRII-결합 부위는 CH3의 카르복시 말단에 위치한다.
알레르기 치료의 유망한 개념은 단클론 항체의 이용인데, 이들 항체는 IgE 아이소타입-특이적이고 IgE에 결합할 수 있다. 이런 방식은 IgE 면역 반응을 하향조절함으로써 알레르기 반응의 저해에 기초하는데, IgE 면역 반응은 알레르기 유도에 최초 현상이며, 알레르기 상태의 유지를 제공한다. 다른 항체 종류의 반응이 영향을 받지 않기 때문에, 알레르기 증상에 대한 즉각적인 효과와 장기적인 효과가 달성된다. 인간 호염기구 밀도에 관한 초기 연구에서, 환자 혈장에서 IgE 수준과 호염기구당 FcεRI 수용체의 총수 사이에 상관관계가 확인되었다(Malveaux et al., J. Clin. Invest., 1978, 62:176). 알레르기 개체와 비-알레르기 개체에서 FcεRI 밀도는 호염기구당 104 내지 106개의 수용체인 것으로 나타났다. 이후, 항-IgE로 알레르기 질환의 치료는 순환 IgE의 양을 처리이전 수준의 1%로 감소시키는 것으로 밝혀졌다(MacGlashan et al., J. Immunol., 1997, 158:1438-1445). MacGlashan은 환자 혈청에서 순환하는 유리 IgE에 결합하는 전체 항-IgE 항체로 치료된 환자로부터 얻은 혈청을 분석하였다. 환자에서 순환 IgE의 수준을 낮추면 호염기구의 표면에 존재하는 수용체의 총수가 감소하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 호염기구와 비만 세포의 표면에서 FcεRI 밀도는 순환 IgE 항체의 수준에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 조절되는 것으로 가정되었다.
더욱 최근에, WO 99/62550에서는 FcεRI과 FcεRII IgE 결합 부위에 결합하여 수용체에 IgE 결합을 차단하는 IgE 분자와 단편의 유용성을 기술한다. 하지만, 이들 알레르기 질환의 관리에서 유해한 부작용이 부재하는 효과적인 치료법은 제한적이다. 알레르기 질환을 치료하는 다른 치료 방식은 알레르기 비염과 천식을 치료하는 인간화 항-IgE 항체의 이용이다(Corne, J. et al., J. Clin. Invest.1997, 99:879-887; Racine Poon, A. et al., Clin. Pharmcol. Ther. 1997, 62:675-690; Fahy, J.V. et al., Am. J. Resp. Grit. Care Med. 1997, 155:1824-1834; Boulet, L. P. et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med., 1997, 155:1835-1840; Milgrom, E. et al., N. Engl. J. Med., 1999, 341:1966-1973). 이들 임상 데이터는 IgE의 이의 수용체에 대한 결합의 저해가 알레르기 질환을 치료하는데 효과적인 방식임을 입증한다.
항-알레르기원으로서 적합한 항체는 IgE 생산 혈장 세포로 분화되는 표면 IgE 양성 B 세포와 반응하여 이들 B 세포를 기능적으로 제거하는데 이용될 수 있어야 한다. 하지만, 원칙적으로 IgE에 대한 항체는 Fcε 수용체를 가교 결합시켜 혈청 IgE와 sigE+ B 세포 수준에서 발휘되는 유익한 효과를 길항함으로써 IgE 감작화된 비만 세포로부터 중개물질 방출을 유도할 수도 있다. 항-IgE 치료제를 개발하는 과정에서 잠재적으로 유해한 문제점 중의 하나는 고 친화성 수용체에 이미 결합된 IgE에 치료 항체 결합 및 잠재적인 아나필락시스 반응을 초래하는 히스타민 방출 유인에 의해 유발되는 IgE-가교결합의 가능성이다.
이런 이유로, 알레르기 치료에 이용되는 항체는 감작화된 비만 세포와 호염 기구에 결합된 IgE와 상호작용하지 않으면서 sigE+ B 세포를 인식하는 능력을 유지할 수 있어야 한다. 이런 IgE 아이소타입-특이적 항체는 예로써 Chang et al., Biotechnology 8, 122-126(1990), European Patent No. EP0407392, 여러 U.S. 특허 (가령, U.S. Patent No. 5,449,760)에서 기술한다.
항-IgE 항체를 생산하는데 이용되는 펩티드 역시 아나필락시스 항체를 유도하는 잠재적 위험으로부터 자유롭지 못하다. 면역동안 생산된 항체가 고 친화성 IgE 수용체 또는 다른 구조에 결합된 IgE에 결합한다면, 능동 예방접종(active vaccination)동안 항-IgE 항체의 생산은 수동 투여된 항-IgE 항체와 동일한 방식으로 히스타민 방출을 유인할 수 있다.
따라서, IgE에 특이적으로 결합하지만 고 친화성 수용체에 이미 결합된 IgE에 결합하지 않는 더욱 높은 친화성 비-아나필락시스 항체 및 아나필락시스 항체를 유도하지 않는 능동 면역용 펩티드가 필요하다. 본 발명자들은 비만 세포 또는 호염기구에서 IgE에 결합하지 않으면서 항체의 고 친화성 결합을 제공하는 IgE의 특이적인 에피토프를 확인하였다. 이들 특이적인 에피토프는 수용체에 결합하는 IgE의 영역에만 결합하는 IgE에 대한 항체를 생산하기 위한 특이적인 능동 면역용 펩티드를 생산하는데 이용될 수 있고, 이들 항체가 수용체에 이미 결합된 IgE를 가교결합시키지 않도록 하여 아나필락시스가 발생하지 않도록 담보한다.
본 발명의 요약
본 발명은 IgE의 CH3 도메인으로부터 유래된 신규한 펩티드 에피토프에 관계한다. 이들 펩티드 에피토프는 IgE에 특이적으로 결합하는 고 친화성 항체에 의해 인식된다. 이들 신규한 펩티드는 이들 펩티드를 투여하여 포유동물에서 고 친화성 항체를 생산하는 포유동물의 능동 면역에 이용될 수 있다. 펩티드 에피토프 역시 IgE의 이들 영역에 특이적으로 결합하는 고 친화성 항-IgE 항체를 비-인간 숙주에서 생산하는데 이용될 수 있는데, 이들 생산된 항체는 포유동물의 수동 면역에 이용된다.
본 발명의 한가지 면역원(에피토프 A, 도 11)은 아래의 아미노산 서열을 포함한다:
Asn Pro Arg Gly Val Ser Xaa Tyr Xaa Xaa Arg Xaa(SEQ ID NO. 72).
에피토프 A의 한가지 실례는 아래와 같다:
Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro(SEQ ID NO. 73).
다른 면역원(에피토프 B. 도 11)은 아래의 아미노산 서열을 포함한다:
Leu Pro Arg Ala Leu Xaa Arg Ser Xaa(SEQ ID NO. 74).
에피토프 B의 실례는 아래와 같다:
Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(SEQ ID NO. 75)
His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(SEQ ID NO 76)
Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr(SEQ ID NO 77).
SEQ ID NO: 72 또는 SEQ ID NO: 74에서, Xaa는 임의의 아미노산이다.
이들 펩티드는 면역학적 담체뿐만 아니라 적어도 한가지 펩티드 및 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 안정제 또는 부형제를 함유하는 조성물에 포함될 수 있다. 면역학적 담체는 예로써 BSA, KLH, 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 디프 테리아 톡소이드(diphtheria toxoid)이다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO. 72-77을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포에 관계한다.
또한, 본 발명은 에피토프 A 및/또는 에피토프 B에 특이적으로 결합하는 항체에 관계한다. 또한, 본 발명은 에피토프 A 및/또는 에피토프 B에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법에 관계한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 72 및/또는 SEQ ID NO 74를 포함하는 펩티드의 IgE-매개된 질환이나 이상으로 고생하는 개체에 투여에 관계한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 72 및/또는 SEQ ID NO 74를 포함하는 펩티드를 이용하여 생산된 고 친화성 항체의 IgE-매개된 질환이나 이상으로 고생하는 포유동물에 투여에 관계한다. 고 친화성 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 항체는 다클론 또는 단클론 항체이다. IgE 매개된 질환이나 질병에는 예로써 천식, 아토피성 피부염, 두드러기, 알레르기 비염, 습진 등이 포함된다.
도 1은 항체 클로닝(cloning)과 스크리닝(screening)에 이용되는 파지 벡터의 개요도이다.
도 2는 항체 변이체를 생산하는데 유용한 올리고뉴클레오티드의 개요도이다.
도 3A에서는 뮤린 항-IgE 항체 TES-C21 및 L16과 JK4의 연합된 인간 주형의 경쇄의 비교를 도시한다.
도 3B에서는 TES-C21 및 연합된 인간 주형 DP88과 JH4b의 중쇄의 비교를 도 시한다.
도 4에서는 부모 TES-C21과 비교하여 높은 친화성을 보유하는 골격 잔기 변이체의 표를 제시한다.
도 5A와 B에서는 TES-C21의 부모 Fab 및 음성 대조(5D12)와 비교하여 클론 4, 49, 72, 78, 136에 대한 ELISA 적정 곡선(titration curve)을 도시한다.
도 6에서는 부모 TES-C21 및 음성 대조 항체와 비교하여 클론 2C, 5A, 5I의 저해 검사 결과를 도시한다.
도 7A에서는 IgE에 대하여 더욱 높은 친화성을 유도하는 유익한 돌연변이의 조합을 보유하는 클론의 서열을 도시한다.
도 8A & 8B에서는 클론 136, 1, 2, 4, 8, 13, 15, 21, 3O, 31, 35, 43, 44, 53, 81, 9O, 113에 대한 전체 경쇄 가변 영역의 골격 서열을 도시한다.
도 9A & 9B에서는 35개의 클론에 대한 전체 중쇄 가변 영역의 골격 서열을 도시한다.
도 10 A-F에서는 클론 136, 2C, 5I, 5A, 2B, 1136-2C에 대한 완전 중쇄와 경쇄 서열을 도시한다.
도 11에서는 인간 IgE의 CH3 영역 아미노산 서열을 도시하고 에피토프 "A"와 에피토프 "B"를 강조한다.
도 12에서는 에피토프 B를 확인하는데 이용된 중복 펩티드를 도시한다.
도 13에서는 에피토프 A의 결합 영역에서 중요 잔기의 실체를 도시한다.
도 14에서는 에피토프 B의 결합 영역에서 중요 잔기의 실체를 도시한다.
도 15에서는 변이 펩티드에 MAb 결합의 웨스턴 블랏 분석 결과를 도시한다.
도 16에서는 인간 IgE를 발현하는 유전자도입 동물에서 항-IgE 항체의 생산을 도시한다.
정의
본 명세서에 이용된 용어는 당업자에게 통상적이고 전형적인 의미로서 해석된다. 하지만, 본 출원인은 다음의 용어에 아래와 같은 특정한 정의를 부여한다.
항체 사슬 폴리펩티드 서열과 관련하여 “실질적으로 동일한”은 참고 폴리펩티드 서열에 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 상동성을 보이는 항체 사슬로서 해석된다. 핵산 서열과 관련하여 상기 용어는 참고 핵산 서열에 적어도 85%, 90%, 95% 또는 97% 서열 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열로서 해석된다.
“동일성” 또는 “상동성”은 서열 상동성의 일부로서 임의의 보존성 치환에 대한 고려 없이, 서열을 정렬하고, 전체 서열에 대한 최대 상동성 비율을 달성하기 위하여 필요한 경우 갭(gap)을 도입한 이후 비교되는 상응하는 서열의 잔기와 일치하는 후보 서열에서 아미노산 잔기의 비율을 의미한다. N- 또는 C-말단 신장 및 삽입은 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되지 않는다. 정렬을 위한 방법과 컴퓨터 프로그램은 당분야에 널리 공지되어 있다. 서열 상동성은 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정할 수 있다.
“항체”는 가장 넓은 의미로 이용되고, 구체적으로 단클론 항체(전장 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 다중특이적 항체(가령, 이중특이적 항체)를 포괄한다. 항체(Ab)와 면역글로불린(Ig)은 동일한 구조적 특징을 보유하는 당단백질이다. 항체는 특정 표적에 결합 특이성을 보이는 반면, 면역글로불린은 항체 및 표적 특이성(target specificity)이 결여된 다른 항체-유사 분자를 모두 포함한다. 고유 항체와 면역글로불린은 일반적으로, 2개의 동일한 가벼운(L) 사슬과 2개의 동일한 무거운(H) 사슬로 구성되는 대략 150,000 달톤의 이형사합체 당단백질이다. 각 중쇄는 한 단부에 가변 도메인(VH) 및 다수의 불변 도메인을 보유한다. 각 경쇄는 하나의 한 단부에 가변 도메인(VL) 및 다른 단부에 불변 도메인을 보유한다. “고 친화성” 항체는 적어도 10-10, 바람직하게는 10-12의 결합 친화성을 보유하는 항체를 의미한다.
본 명세서에서, “항-인간 IgE 항체”는 인간 IgE의 고 친화성 수용체, FcεRI에 대한 결합을 저해하거나 실질적으로 감소시키는 방식으로 인간 IgE에 결합하는 항체를 의미한다.
항체의 가변 도메인과 관련하여 “가변”은 항체의 서열에서 가변 도메인의 특정 부분이 상당히 변화되고 특정 표적에 대한 각 특정 항체의 특이적인 결합에 이용된다는 사실을 지칭한다. 하지만, 이런 가변성(variability)은 항체의 가변 도메인 전체에 균등하게 분포하지는 않는다. 이는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 영역(hypervariable region)으로 알려져 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 3개의 분절에 집중된다. 가변 도메인의 더욱 보존된 부분은 골격(FR)이라 한다. 고유 중쇄와 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하고, 거의 β-시트 형태를 취하며, 3개의 CDR에 의해 연결되는데, 이들 CDR은 β-시트를 연결하는 루프(loop)를 형성하고, 일부 경우에 β-시트 구조의 일부분을 형성한다. 각 사슬에서 CDR은 FR 영역에 의해 서로 근접하게 유지되고, 다른 사실을 형성하는 CDR과 함께 항체의 표적 결합 부위의 형성에 기여한다(참조: Kabat et al.). 본 명세서에서, 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링은 달리 명시하지 않는 경우에, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Ad. 1987의 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링 시스템에 따라 수행된다.
“항체 단편”은 전장 항체의 일부분, 일반적으로 표적 결합이나 가변 영역을 의미한다. 항체 단편의 실례는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편이다. 항체의 “기능적 단편 또는 유사체”는 전장 항체와 공통으로 정성적 생물 활성을 보유하는 화합물이다. 가령, 항-IgE 항체의 기능적 단편은 고 친화성 수용체, FcεRI에 결합하는 IgE 면역글로불린 분자의 능력의 예방하거나 실질적으로 감소시키는 방식으로 IgE 면역글로불린에 결합할 수 있는 단편이다. 본 명세서에서, 항체와 관련하여 “기능적 단편”은 Fv, F(ab), F(ab')2 단편을 의미한다. “Fv” 단편은 완전 표적 인식과 결합 부위를 보유하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 단단한 비-공유 결합으로 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인의 이합체(VH-VL 이합체)로 구성된다. 이런 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이합체의 표면에서 표적 결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개의 CDR은 항체에 표적 결합 특이성(target binding specificity)을 공여한다. 하지만, 단일 가변 도메인(또는 표적에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 역시 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만, 표적을 인식하고 여기에 결합하는 능력을 보유한다. “단일-사슬 Fv” 또는 “sFv” 항체 단편은 항체의 VH와 VL 도메인을 포함하는데, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함하는데, 상기 링커는 sFv가 표적 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 한다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인(CH1)을 보유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역(hinge region)으로부터 하나이상의 시스테인을 보유하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇몇 잔기의 부가에 Fab 단편과 구별된다. F(ab') 단편은 F(ab')2 펩신 절단 산물의 힌지 시스테인에서 이황화 결합의 절단에 의해 생산된다. 항체 단편의 추가적인 화학적 커플링은 당업자에게 공지되어 있다.
본 명세서에서, “단클론 항체”는 실질적으로 상동한 항체 집단으로부터 획득된 항체를 의미한다, 다시 말하면, 이런 집단에 포함되는 개별 항체는 소규모로 존재하는 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 표적 부위를 지향한다. 더 나아가, 서로 다른 결정부위(에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인(다클론) 항체 제조물과 대조적으로, 각 단클론 항체는 표적에서 단일 결정부위를 지향한다. 단클론 항체는 특이성 이외에, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양물에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. “단클론”은 항체의 실질적으로 상동한 집단으로부터 획득되는 항체의 특성을 지시하며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 가령, 본 발명에 이용되는 단클론 항체는 널리 공지된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 본 발명에 이용되는 부모 단클론 항체는 Kohler and Milstein, Nature 256, 495(1975)에 최초로 기술된 하이브리도마 방법으로 제조하거나, 또는 재조합 방법으로 제조할 수 있다.
비-인간(가령, 뮤린) 항체의 “인간화” 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 보유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(가령, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 표적-결합 부분서열)이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하는데, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 모든 또는 거의 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR 영역에 상응한다. 인간화 항체는 전형적으로, 선택된 인간 면역글로불린 주형의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분을 또한 포함한다.
“세포”, “세포주”, “세포 배양물”은 자손을 포함한다. 또한, 의도적인 또는 우연한 돌연변이로 인하여, 모든 자손이 DNA 함량에서 정확하게 일치하지는 않는다. 초기 형질전환된 세포에서 선별되는, 동일한 기능 또는 생물학적 특성을 보유하는 변이 자손이 포함된다. 본 발명에 이용되는 “숙주 세포”는 일반적으로, 원핵 또는 진핵 숙주이다.
DNA로 세포 생물체의 “형질전환(transformation)”은 생물체에 도입된 DNA가 비염색체 요소(extrachromosomal element)로서 또는 염색체 통합(chromosomal integration)에 의해 복제 가능함을 의미한다. DNA로 세포 생물체의 “형질감염(transfection)”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되는 지의 여부에 상관없이, 세포 또는 미생물에 의한 DNA, 예를 들면, 발현 벡터의 흡입(taking up)을 의미한다. “형질감염된 숙주 세포”와 “형질전환된 숙주 세포”는 DNA가 도입된 세포를 의미한다. 상기 세포는 “숙주 세포”라고 하고, 원해이나 진핵이다. 전형적인 원핵 숙주 세포는 대장균(E. coli)의 다양한 균주이다. 전형적인 진핵 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포 또는 인간 기원의 세포와 같은 포유동물 세포이다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종 또는 상이한 종으로부터 유래되거나, 또는 일부 외래 DNA와 일부 상동성 DNA를 보유하는 하이브리드 DNA 서열일수 있다.
“벡터”는 적당한 숙주에서 DNA의 발현을 유도할 수 있는 적절한 조절 서열(control sequence)에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 구조체(construct)를 의미한다. 이런 조절 서열에는 전사를 수행하는 유도성 프로모터, 전사를 조절하는 선택적 오퍼레이터 서열, 적절한 mRNA 리보좀 결합 부위를 인코딩하는 서열, 전사와 번역의 종결을 조절하는 서열 등이 포함된다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 잠재적인 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주에 형질전환된 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제하고 기능하거나, 또는 일부 경우에 게놈 자체에 통합된다. 본 명세서에서, “플라스미드”와 “벡터”는 빈번하게 동의어로 이용되는데, 그 이유는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 이용되는 형태이기 때문이다. 하지만, 본 발명에는 등가의 기능을 수행하고 당분야에 공지된 다른 형태의 벡터가 포함된다.
“조절 서열”은 특정 숙주 생물체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 진핵생물에 적합한 조절 서열에는 예로써 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위가 포함된다. 원핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 인핸서(enhancer)를 이용하는 것으로 알려져 있다. 프리서열(presequence) 또는 분비 리더(secretory leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질(preprotein)로서 발현되는 경우에, 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 주는 경우에, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 주는 경우에, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 조장하도록 배치되는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능한 연결”은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에 인접하고 해독 단계(reading phase)에 있음을 의미한다. 하지만, 인핸서는 인접할 필요가 없다.
치료 목적에서 “포유동물”은 인간, 가축, 비-인간 영장류, 동물원, 스포츠 또는 애완 동물을 비롯한 포유동물로서 분류되는 임의의 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 소 등을 의미한다.
폴리펩티드와 관련하여 본 명세서에서 “표식된 에피토프”는 “에피토프 태그(epitope tag)”에 융합된 폴리펩티드를 의미한다. 에피토프 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있지만 폴리펩티드의 활성을 간섭하지 않을 만큼 충분히 짧은 에피토프를 제공할 만큼 충분한 잔기를 보유한다. 적절하게는, 에피토프 태그는 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차-반응하지 않도록 상당히 독특하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 적어도 6개의 아미노산 잔기, 일반적으로 대략 8-50개의 아미노산 잔기(바람직하게는, 대략 9-30개의 잔기)를 보유한다. 실례는 독감 HA 태그 폴리펩티드와 이의 항체 12CA5(Field et al, Mol Cell. Biol. 8: 2159-2165(1988))); c-myc 태그와 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7, 9E10 항체(Even et al., Mol Cell. Biol. 5(12): 3610-3616(1985)); 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex virus) 당단백질 D(gD) 태그와 이의 항체(Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553(1990))이다. 특정 구체예에서, 에피토프 태그는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는, IgG 분자(가령, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프일 수 있다.
본 명세서에서, “라벨”은 분자 또는 단백질, 예를 들면, 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 공액될 수 있는 검출가능 화합물 또는 조성물을 의미한다. 라벨은 자체로써 검출되거나(가령, 방사성동위원소 라벨 또는 형광 라벨), 또는 효소 라벨의 경우에, 검출가능한 기질 화합물이나 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
본 명세서에서, “고체 상”은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 본 발명에 포함되는 고체 상의 실례는 부분적으로 또는 전체적으로 유리로 형성된 고체 상(가령, 제어된 세공 유리), 폴리사카라이드(가령, 아가로즈), 폴리아크릴아마이드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올, 실리콘이다. 특정 구체예에서, 고체 상은 검사 평판의 웰을 포함할 수 있다; 다른 구체예에서, 이는 정제 칼럼(가령, 친화성 크로마토그래피 칼럼)이다.
본 명세서에서, “IgE-매개된 질환”은 면역글로불린 IgE의 과다생산 및/또는 이에 대한 과민반응으로 특성화되는 질환이나 이상을 의미한다. 구체적으로, 여기에는 아나필락시스 과민반응과 아토피성 알레르기와 연관된 이상, 예를 들면, 천식, 알레르기 비염 & 결막염(건초열), 습진, 두드러기, 아토피성 피부염, 음식 알레르기가 포함되는 것으로 해석된다. 예로써 벌에 쏘임, 뱀에 물림, 식품 또는 의약품에 의해 유발되는 아나필락시스 쇼크의 심각한 생리 상태 역시 상기 용어의 범위에 포함된다.
항체의 생산
출발 또는 “부모” 항체는 이런 항체를 생산하기 위한 당분야에 공지된 기술을 이용하여 준비할 수 있다. 출발 항체를 생산하는 전형적인 방법은 아래의 섹션에서 더욱 상세하게 기술한다. 이들 설명은 부모 항체를 제조하거나 준비하기 위한 가능한 대안이며, 이런 분자를 생산하는 방법을 한정하지 않는다.
항체의 결합 친화성은 본 발명의 고 친화성 항체를 생산하기에 앞서 결정한다. 또한, 항체는 예로써 치료제로서 효능을 평가하기 위하여, 다른 생물학적 활성 검사를 수행할 수도 있다. 이들 검사법은 당분야에 공지되어 있고, 항체의 표적과 의도된 용도에 좌우된다.
특정 에피토프에 결합하는 항체(가령, IgE의 고 친화성 수용체에 대한 결합을 차단하는 항체)를 선별하기 위하여, "Antibodies: A Laboratory Manual"(Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988))에 기술된 것과 같은 통상적인 가교-결합 검사를 수행할 수 있다. 대안으로, 에피토프 유전자지도작성(mapping)을 수행하여 항체가 목적 에피토프에 결합하는 지를 결정할 수 있다. 선택적으로, 항체를 생산하는데 이용된 표적의 동족체(homolog)에 대한 항체(동족체가 상이한 종으로부터 유래되는 경우)의 결합 친화성은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 평가할 수 있다. 한 구체예에서, 다른 종은 항체가 전임상 연구에 투여되는 비-인간 포유동물이다. 따라서, 이들 종은 비-인간 영장류, 예를 들면, 붉은털원숭이(rhesus), 키노몰구스(cynomolgus), 비비(baboon), 침팬지(chimpanzee), 머카크(macaque)이다. 다른 구체예에서, 이들 종은 예로써 설치류, 고양이 또는 개다. 부모 항체는 표적에 대하여 부모 항체보다 더욱 높거나 강한 결합 친화성을 보유하는 항체를 생산하기 위하여 본 발명에 따라 변형된다. 항체 특이성(antibody specificity)은 항체와 이의 표적 사이에 형성된 독특한 인터페이스에 기인한다; 표면은 독특한 어울림(fit)을 발생시키기 위하여 서로를 보충한다(Jones, S. & Thornton, J. M.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13-20). 이런 인터페이스를 따라 접촉을 더욱 향상시킴으로써, 결합 파트너의 연합을 조장하는데 요구되는 에너지 대가의 감소로 인하여 전체 친화성이 증가될 수 있다.
항체의 결합 표면은 일반적으로, 코어(core)로부터 연장되는 루프인 6개의 상보성 결정 영역(CDR)으로 구성된다. 이들 CDR은 특정 표적에 결합을 위한 독특한 서열을 보유하는 아미노산으로 구성된다. 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위하여, 이들 아미노산 주변의 환경은 다양한 비-공유 포스(non-covalent force)를 도입하거나 향상시킴으로써 더욱 우호적으로 변해야 하는데, 이들 포스는 상호작용의 에너지를 궁극적으로 감소시켜 더욱 높은 친화성을 결과한다.
반 데르 발스(Van der Waals) 힘은 2개의 전기적으로 중성인 분자 사이에 생성되는 비-공유 상호작용이다(Voet, D. & Voet, J. G.(1990) Biochemistry John Wiley and Sons, NY, NY). 결합은 영구적인 또는 도입된 쌍극자(dipole)로부터 발생되는 정전 상호작용으로부터 두 표면 사이에 생성될 수 있다. 이들 쌍극자는 α-나선의 말단을 따라 또는 극성 아미노산 주변에 존재할 수 있다. 결합 인터페이스를 따라 반 데르 발스 힘의 총계를 증가시키면, 더욱 우호적인 결합이 유도된다.
수소 결합의 도입 역시 항체와 항원 사이에 상호작용의 특이성을 증가시킨다. 수소 결합에 관여하는 통상적인 공여체와 수용체는 질소, 산소, 황 원자인데, 아미노산은 이들 원자로 주로 구성된다(See Voet, et al., supra). 수소 결합은 짧은 거리(일반적으로, 2.7 내지 3.1 Å)만을 가교하는 경향이 있기 때문에, 결합 파트너는 이들 상호작용이 발생할 수 있도록 근접해야 한다. 따라서, 친화성을 향상시킬 수 있는 한가지 방식은 잠재적 공여체와 수용체 분자를 근접 접촉시켜 수소 결합을 확립하는 것이다.
최종적으로, 소수성 상호작용의 향상 역시 두 결합 파트너 사이의 우호적인 에너지를 증가시킨다. 결합 표면에 근접 위치하는 비-극성 잔기는 다른 비-극성 잔기에 의해 둘러싸이게 되고, 따라서 우호적인 환경에 존재하게 된다. 비-극성 측쇄의 매몰(burial)을 충족시킴으로써, 상호작용의 에너지는 강한 결합 인터페이스에 유리하다.
단백질-단백질 인터페이스를 안정화시키는 상호작용은 이들 접촉을 유지하는 에너지 대가를 감소시켜 전체 친화성을 증가시킨다. 결합 인터페이스 근처에 위치하는 개별 아미노산 주변의 환경을 개선함으로써, 더욱 높은 결합 친화성을 결과하는 더욱 우호적인 환경이 유도된다. 이런 이유로, 우호적인 접촉을 도입하고 추가적인 보충을 통하여 인터페이스를 개선함으로써, 항체와 항원 사이의 전체 결합 상호작용이 상당히 향상된다.
적절하게는, 생성된 고 친화성 항체는 표적에 대하여 부모 항체의 결합 친화성보다 적어도 10배, 또는 적어도 20 배, 또는 적어도 500배, 또는 1000 내지 5000배 높은 결합 친화성을 보유한다. 필요하거나 요구되는 결합 친화성에서 향상의 정도는 부모 항체의 최초 결합 친화성에 좌우된다.
일반적으로, 부모 항체로부터 고 친화성 항체를 제조하는 방법은 아래의 단계를 수반한다:
1. 목적 표적에 결합하고 중쇄와 경쇄 가변 도메인을 포함하는 부모 항체를 획득하거나 선별하는 단계. 상기 단계는 전통적인 하이브리도마 기술, 파지-전시 기술, 또는 표적 특이적 항체를 생산하는 임의의 다른 방법에 의해 수행된다.
2. 서열에서 부모 골격, 바람직하게는 인간 주형 서열과 밀접한 골격 서열을 선별하는 단계. 상기 주형은 비교 전장(comparative overall length), CDR의 크기, 골격과 CDR 사이의 접합점에 위치하는 아미노산 잔기, 전체 상동성 등에 기초하여 선택된다. 선택된 주형은 하나 이상의 서열의 혼합물이거나, 또는 컨센서스 주형일 수 있다.
3. 모든 가능한 CDR 위치에서 무작위 아미노산 치환을 수행함으로서 클론 라이브러리를 산출하는 단계. 예로써 CDR에 인접하거나 결합 또는 접힘에 영향을 주는 인간 골격 주형에서 아미노산을 모든 가능한 아미노산으로 무작위 치환하여 골격 치환의 라이브러리를 산출할 수도 있다. 이들 골격 치환은 표적 결합과 항체 접힘에 대한 이들의 잠재적 효과를 평가할 수 있다. 골격에서 아미노산의 치환은 CDR에서 아미노산의 치환과 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성으로 변이체 라이브러리를 산출하는 한가지 방법.
4. 화학식: FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4(1)와 FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4(II)를 포함하고 (3) 단계에서 산출된 중쇄 및/또는 경쇄 변이체를 포함하는 발현 벡터를 작제하는 단계, 여기서 FRL1, FRL2, FRL3, FRL4, FRH1, FRH2, FRH3, FRY는 3 단계에서 선택된 골격 주형 경쇄와 중쇄 서열의 변이체를 나타내고 CDR은 부모 항체 CDR의 변이 CDR을 나타낸다. 이런 경쇄와 중쇄 서열을 보유하는 벡터의 실례는 도 1에 도시한다.
5. 특정 표적에 대한 클론 라이브러리 및 상기 표적에 결합하는 클론에서 향상된 결합 친화성을 스크리닝하는 단계. 부모 분자보다 높은 친화성으로 결합하는 클론을 스크리닝할 수 있다. 최적 고 친화성 후보는 부모 항체와 비교하여 가능한 최대 결합 친화성, 바람직하게는 20배, 100배, 1000배, 또는 5000배 이상의 결합 친화성을 보유한다. 선택된 변이체가 바람직하지 않은 특정 아미노산, 예를 들면, 도입된 당화 부위 또는 잠재적으로 면역원성 부위를 보유하는 경우에, 이들 아미노산은 더욱 유리한 아미노산 잔기로 대체하고 결합 친화성을 재평가한다.
또한, 이런 방법을 이용하여, 인간 골격을 그대로 두면서 CDR 영역만을 무작위 치환함으로써 완전 인간 부모 항체로부터 고 친화성 항체를 산출할 수도 있다.
도 1에 도시된 바와 같은 향상된 고효율 스크리닝 기술과 벡터로 인하여, 당업자는 일정한 CDR 및/또는 골격 영역의 모든 부위에서 포괄적인 치환 라이브러리를 신속하고 효율적으로 스크리닝할 수 있다. 모든 위치에서 모든 아미노산을 동시에 무작위 치환함으로써, 개별 치환에 의해 예상되거나 확인되지 않은 상승효과로 인하여 친화성이 현저하게 증가된 가능한 조합을 스크리닝할 수 있다.
부모 항체 제조
표적 준비
가용성 표적 또는 이의 단편은 항체를 생산하기 위한 면역원으로 이용될 수 있다. 항체는 목적 표적을 지향한다. 적절하게는, 표적은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 질병이나 질환으로 고생하는 포유동물에 항체의 투여는 포유동물에서 치료 이익을 결과할 수 있다. 하지만, 항체는 비-폴리펩티드 표적을 지향할 수도 있다. 표적이 폴리펩티드인 경우, 이는 막통과 분자(가령, 수용체) 또는 성장 인자와 같은 리간드일 수 있다. 본 발명의 한가지 표적은 IgE이다. 전체 세포가 항체를 제조하기 위한 면역원으로 이용될 수 있다. 표적은 재조합 방식으로 생산되거나, 또는 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 표적은 자연 출처로부터 분리될 수도 있다.
본 발명의 항체를 생산하는데 이용되는 항원의 실례는 에피토프 A 및/또는 B를 비롯한 본 발명의 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편이다. 동물을 면역하는데 이용되는 폴리펩티드는 표준 재조합, 화학적 합성, 또는 정제 방법으로 획득될 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 면역원성(immunogenicity)을 증가시키기 위하여, 항원은 담체 단백질에 공액될 수 있다. 통상적으로 이용되는 담체에는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)(KLH), 혈청갑상선글로불린(thyroglobulin), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)(BSA), 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이후, 결합된 펩티드를 이용하여 동물(가령, 생쥐, 쥐, 또는 토끼)을 면역한다. 이런 담체 이외에, 널리 공지된 어쥬번트를 항원과 함께 투여하여 강한 면역 반응의 유도를 촉진할 수 있다.
다클론 항체
다클론 항체는 일반적으로, 어쥬번트와 공동으로 유관한 표적의 피하(se) 또는 복강내(ip) 주입에 의해 비-인간 포유동물에서 생산된다. 면역 반응을 유도할 수 있는 다수의 병원체가 당분야에 널리 공지되어 있다.
동물은 단백질 또는 공액체(각각, 토끼 또는 생쥐의 경우)를 Freund 완전 어쥬번트와 결합시키고 용액을 피내 주입함으로써 표적, 면역원성 공액체 또는 유도체에 대하여 면역한다. 1개월후, 이들 동물은 Freund 불완전 어쥬번트에 담긴 최초량의 1/5 내지 1/10의 펩티드 또는 공액체의 복수 부위에서 피하 주입으로 효능을 촉진한다. 7일 내지 14일후, 이들 동물을 채혈하고, 혈청에서 항체 역가를 검사한다. 동물은 역가 정체기(titer plateau) 때까지 효능을 촉진한다.
선별된 포유동물 항체는 정상적으로, 표적에 대하여 충분히 강한 결합 친화성을 보유한다. 가령, 항체는 대략 1 x 10-8 M의 결합 친화성(Kd) 수치로 인간 항-IgE에 결합한다. 항체 친화성은 포화 결합(saturation binding); 효소-결합된 면역흡착 검사(enzyme-linked immunoabsorbant assay, ELISA); 경쟁 검사(가령, 방사선면역검사(radioimmunoassays))로 결정할 수 있다.
목적 표적에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위하여, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)에 기술된 바와 같은 통상적인 가교-결합 검사(cross-linking assay)를 수행할 수 있다. 대안으로, 예로써 Champe, et al. J. Biol. Chem. 270: 1388-1394(1995)에 기술된 바와 같이 에피토프 유전자지도작성을 수행하여 결합을 결정할 수 있다.
단클론 항체
단클론 항체는 단일 항원 부위를 인식하는 항체이다. 단클론 항체는 균일한 특이성으로 인하여, 일반적으로 다수의 상이한 항원 부위를 인식하는 다클론 항체보다 더욱 유용하다. 단클론 항체는 Kohler and Milstein, Nature 256, 495(1975)에 최초로 기술된 하이브리도마 방법으로 제조하거나, 또는 재조합 방법으로 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 생쥐 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들면, 설치류는 상기한 바와 같이 면역하여 면역화에 이용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안으로, 림프구는 시험관내에서 면역할 수도 있다. 이후, 림프구는 적절한 융합제(fusing agent), 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, pp. 590-103(Academic Press,1986)).
이렇게 준비된 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 부모 골수종 세포의 성장이나 생존을 저해하는 한가지이상의 물질을 가급적 함유하는 적절한 배양 배지에 접종하고 성장시킨다. 가령, 부모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여되면, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로, 하이포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin), 티미딘(thymidine)(HAT 배지), HGPRT-결손 세포의 성장을 예방하는 물질을 함유한다. 선호되는 골수종 세포는 선별된 항체-생산 세포를 효율적으로 융합시키고, 상기 세포에 의한 안정적이고 높은-수준의 항체 생산을 뒷받침하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감하다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종과 생쥐-인간 이형골수종(heteromyeloma) 세포주가 보고되었다(Kozbar, J.: Immunol.133: 3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 이들 클론은 희석 절차를 제한함으로써 서브클론하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: : Principals and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986)). 이런 목적에 적합한 배양 배지가 포함된다. 이들 서브클론에 의해 분비되는 단클론 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면, 단백질 A 세파로즈, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피로 배양 배지로부터 적절히 분리한다.
이들 단클론 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차(가령, 이들 단클론 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 편의하게 분리하고 염기서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이런 DNA의 공급원으로서 기능한다. 일단 분리된 DNA는 발현 벡터에 위치시키고, 상기 발현 벡터는 숙주 세포, 예를 들면, 대장균(E. coli) 세포, NS0 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포에 이전하여 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체의 합성을 달성한다. 또한, DNA는 예로써 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄와 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써(U.S. Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81: 6851(1984)), 또는 면역글로불린 폴리펩티드에 공유 연결함으로써 변형할 수 있다.
인간화 항체
인간화(humanization)는 실질적으로 원형의 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터 유래된 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체를 제조하는 기술이다. 인간화 항체는 비-인간 출처로부터 하나이상의 아미노산 잔기가 여기에 도입된다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 “수입(import)” 잔기로 지칭되는데, 이들 잔기는 전형적으로, “수입(import)” 가변 도메인으로부터 유래된다. 인간화는 본질적으로, 인간 항체에서 상응하는 서열을 비-인간 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 Winter와 그의 동료(Jones et al, Nature 321: 522-525(1986); Riechman et al., Nature 332: 323-327(1988); Verhoeyens et al., Science 239: 1534-1536(1988))의 방법에 따라 수행될 수 있다(참조: U.S. Pat. No. 4,816,567). 본 발명에서, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기와 일부 FR 잔기가 뮤린 항체에서 유사한 부위로부터 유래된 잔기로 치환될 수 있다.
인간화 항체를 제조하는데 이용되는 인간 가변 도메인(경쇄와 중쇄 모두)의 선택은 항원성(antigenicity)을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 “최적 어울림(best fit)” 방법에 따라, 비-인간 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 라이브러리와 비교한다. 이후, 비-인간 부모 항체의 서열과 가장 근접한 인간 서열은 인간화 항체를 위한 인간 골격으로 수용한다(Sims et al., J. Immunol.151: 2296(1993); Chothia et al., J. Mol. Biol.196: 901(1987)). 다른 방법에서는 경쇄 또는 중쇄의 특정 부분군(subgroup)의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 골격을 이용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 동일한 골격이 이용될 수도 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285(1992); Presta et al., J. Immunol.151: 2623(1993)).
항체 단편
항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 통상적으로, 이들 단편은 본래 항체의 단백분해 절단을 통하여 유도된다(참조: Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107- 117(1992); Brennan et al., Science 229: 81(1985)). 하지만, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수도 있다. 가령, 항체 단편은 항체 파지 라이브러리(antibody phage library)로부터 분리할 수 있다. 대안으로, F(ab')2-SH 단편은 대장균(E. coli)으로부터 직접 회수하고 화학적으로 결합시켜 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167(1992)). 다른 방식에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 분리할 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백하다. 다른 구체예에서, 선택되는 항체는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다(PCT 특허 출원 WO 93/16185).
고 친화성 항체의 제조
부모 항체가 확인되고 분리되면, 부모 항체의 하나이상의 가변 영역에서 하나이상의 아미노산 잔기를 변경할 수 있다. 대안으로, 또는 부가적으로, 골격 잔기의 하나이상의 치환이 부모 항체에 도입될 수 있는데, 여기서 이들은 항체, 예를 들면, 인간 IgE에 대한 결합 친화성을 향상시킨다. 변화시키는 골격 영역 잔기의 실례는 표적에 직접적으로 비-공유 결합하는 잔기(Amit et al. Science 233: 747-753(1986)); CDR과 상호작용하거나 CDR의 구조에 영향을 주는 잔기(Chothia et al. J. Mol. Biol.196: 901-917(1987)); 및/또는 VL-VH 인터페이스에 참여하는 잔기(EP 239 400 B1)이다. 특정 구체예에서, 이런 골격 영역 잔기 중에서 하나이상의 변형은 목적 표적에 대한 항체의 결합 친화성의 향상을 결과한다.
항체의 생물학적 특성에서 변화는 (a) 예로써 시트 또는 나선 형태로서 치환 지역에서 폴리펩티드 골격의 구조; (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는데 대한 효과에서 현저하게 차별되는 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 비-보존성 치환은 이들 종류의 한 구성원을 다른 종류의 구성원으로 교체하는 과정을 수반한다.
아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 핵산 분자는 당분야에 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 이들 방법에는 올리고뉴클레오티드-매개된(또는 특정 부위) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 종-의존성 항체의 기존에 제조된 변이체 또는 비-변이체 이형의 카세트 돌연변이유발이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 변이체를 생산하는 적합한 방법은 올리고뉴클레오티드-매개된 합성이다. 특정 구체예에서, 항체 변이체는 단일 초가변 영역 잔기만 치환된다, 예를 들면, 대략 2개 내지 15개의 초가변 영역 치환을 보유한다.
변이체 라이브러리를 산출하는 한가지 방법은 도 2에 도시된 계획에 따른 올리고뉴클레오티드 매개된 합성이다. 전체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에 걸쳐, 각각 대략 100개의 뉴클레오티드로 구성되는 3개의 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있다. 각 올리고뉴클레오티드는 (1) 삼중항(NNK)20에 의해 생성된 60개의 아미노산 스트레치(stretch), 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이고 K는 G 또는 T이다; (2) 다음 올리고, 또는 각 말단에서 벡터 서열과 대략 15-30개의 뉴클레오티드 오버랩을 포함할 수 있다. PCR 반응에서 이들 3개의 올리고뉴클레오티드의 어닐링(annealing)이후, 중합효소는 반대 가닥을 메워 완전 이중 가닥 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열을 생성한다. 삼중항의 총계를 임의의 반복 길이로 조정하고 올리고뉴클레오티드 내에서 이들의 위치를 선택하여 일정한 CDR 또는 골격 영역에서만 아미노산을 치환할 수 있다. (NNK)를 이용함으로써, 인코딩된 변이체의 각 위치에서 총 20개의 아미노산이 가능하다. 5-10개의 아미노산(15-30개의 뉴클레오티드)의 중복 서열은 치환되지 않지만, 이는 골격의 스태킹 영역(stacking region) 내에 포함되도록 선택되거나, 또는 별도의 또는 후속의 합성 과정에서 치환될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 상업적으로도 이용가능하다. 이들 올리고뉴클레오티드로부터 항체 변이체를 생산하는 방법, 예를 들면, PCR 역시 당분야에 널리 공지되어 있다.
서열에서 무작위 위치에서 차별되는 중쇄와 경쇄 변이체 라이브러리는 임의의 발현 벡터, 예를 들면, 박테리오파지, 특히 도 1의 벡터에 구성될 수 있는데, 벡터 각각은 특정 중쇄와 경쇄 변이체를 인코딩하는 DNA를 보유한다.
항체 변이체의 생산이후, 부모 항체와 비교하여 이들 변이체의 생물학적 활성을 결정한다. 상기한 바와 같이, 이는 표적에 대한 변이체의 결합 친화성을 결정하는 과정을 수반한다. 항체 변이체에서 목적 표적에 결합하는 이들의 능력을 신속하게 스크리닝하기 위한 다수의 고효율 방법이 존재한다.
이런 초기 스크리닝으로부터 선별된 하나이상의 항체는 이후, 부모 항체와 비교하여 향상된 결합 친화성을 스크리닝할 수 있다. 결합 친화성을 결정하기 위한 한가지 통상적인 방법은 BIAcoreTM 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 장치(BlAcore, Inc.)를 이용하여 결합(association)과 분리(dissociation) 비율 상수(rate constant)를 평가하는 것이다. 제조업자(BlAcore)의 사용설명서에 따라 표적의 공유 결합을 위하여 바이오센서 칩을 활성화시킨다. 이후, 표적을 희석하고 칩에 주입하여 고정된 물질의 신호(반응 단위(RU))를 획득한다. 신호(RU)가 고정된 물질의 부피에 비례하기 때문에, 이는 매트릭스에서 고정된 표적 밀도의 범위를 나타낸다. 분리 데이터는 일-부위 모형(one-site model)에 적합시켜 koff +/- s.d(치수의 표준 편차)를 획득한다. 각 결합 곡선에 대한 가성-일차 비율 상수(pseudo-first order rate constant)(KS)를 산정하고, 단백질의 농도의 함수로서 좌표에서 위치를 결정하여 kon +/s.e.(적합도(fit)의 표준 오차)를 획득한다. 결합에 대한 평형 분리 상수(equilibrium dissociation constants for binding) KD'S는 koff/kon로서, SPR 치수로부터 산정한다. 평형 분리 상수(equilibrium dissociation constant) KD가 koff에 반비례하기 때문에, 친화성 향상은 결합 비율(kon)이 모든 변이체에서 일정하다는 가정하에 평가할 수 있다.
고 친화성을 보유하는 후보는 선택적으로, 한가지이상의 추가적인 생물 활성 검사를 수행하여 향상된 결합 친화성을 보유하는 항체 변이체가 원하는 치료 특성을 보유하는 지를 확인할 수 있다. 가령, 항-IgE 항체의 경우에, IgE의 수용체에 대한 결합을 차단하고 히스타민의 방출을 저해하는 것들을 스크리닝할 수 있다. 최적 항체 변이체는 부모 항체보다 훨씬 높은 결합 친화성으로 표적에 결합하는 능력을 유지한다.
이렇게 선별된 항체 변이체는 항체의 의도된 용도에 따라, 추가적으로 변형될 수 있다. 이런 변형은 아미노산 서열의 추가적인 변형, 이질성 폴리펩티드에 융합 및/또는 아래에 상술된 바와 같은 공유 변형(covalent modification)을 수반할 수 있다. 가령, 항체 변이체의 적절한 구조를 유지시키는데 관여하지 않는 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환시켜 분자의 산화 안정성을 향상시키고 비정상적 가교 결합을 예방한다. 반대로, 시스테인 결합을 항체에 추가하여 이의 안정성을 향상시킬 수도 있다(특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
벡터
또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체 변이체를 인코딩하는 분리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터와 숙주 세포, 항체 변이체의 생산을 위한 재조합 기술을 제시한다. 항체 변이체의 재조합 생산을 위하여, 이를 인코딩하는 핵산을 분리하고 추가적인 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제 벡터에 삽입한다. 항체 변이체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차(가령, 항체 변이체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여)를 이용하여 편의하게 분리하고 염기서열분석한다.
다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 구성요소에는 일반적으로, 신호 서열, 복제 기점, 하나이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 전사 종결 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
도 1에 도시된 파지 발현 벡터는 통상적으로 이용되는 M13 벡터; 신속한 분비 및 변이체 Fab에서 적절한 결합 특이성과 최소 친화성 기준의 스크리닝을 위한 M13의 자체 유전자 III 바이러스 분비 신호로 구성된다. 상기 벡터는 전체 유전자 III 서열을 이용하지 않기 때문에, 박테리아 세포의 표면에 전시되지 않고, 오히려 Fab가 주변세포질(periplasmic space)으로 분비된다. 대안으로, 이들 Fab는 세포질에서 발현되고 분리될 수 있다. 중쇄와 경쇄는 각각 자체의 바이러스 분비 신호를 보유하지만, 하나의 강한 유도성 프로모터로부터 의존적으로 발현된다.
도 1에 도시된 벡터는 탐지뿐만 아니라 편의한 정제를 위하여 His 태그와 myc 태그를 제공한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이들 Fab는 별개의 프로모터로부터 독립적으로 발현되거나, 또는 분비 신호는 선택된 바이러스 서열일 필요가 없고 선택된 숙주 세포로부터 항체 단편의 분비에 적합한 원핵이나 진핵 신호 서열일 수 있다. 또한, 중쇄와 경쇄는 상이한 벡터에 존재할 수도 있다.
A. 신호 서열 구성요소
본 발명의 항체 변이체는 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 변이체는 또한, 이질성 폴리펩티드와 융합된 융합 폴리펩티드로서 발현될 수도 있는데, 상기 이질성 폴리펩티드는 가급적, 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적인 절단 부위를 보유하는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드이다. 적절하게는, 선별된 이질성 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 가공된다(즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단된다). 고유 항체 신호 서열을 인식하고 가공하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예로써 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase), 페니실리나아제(penicillinase), Ipp, 또는 열-안정성 엔테로톡신 II 리더(heat-stable enterotoxin II 리더)에서 선택되는 원핵 신호 서열로 치환될 수 있다. 또는, 도 1의 벡터의 경우에서, 선택된 신호 서열은 유전자 III으로부터 바이러스 신호 서열이었다. 효모 분비를 위하여, 고유 신호 서열은 예로써 효모 전화효소 리더(yeast invertase leader), α-인자 리더(α-factor leader)(사카로미세스(Saccharomyces)와 클루베로미세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 산 포스파타아제 리더(acid phosphatase leader), 칸디다 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라아제 리더(glucoamylase leader), 또는 예로써 WO 90/13646에 기술된 신호로 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열과 바이러스 분비 리더, 예를 들면, 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다. 이런 전구물질 영역에 대한 DNA는 해독틀(reading frame)에서, 항체 변이체를 인코딩하는 DNA에 결찰된다.
B. 복제 구성요소의 기점
일반적으로, 벡터는 벡터가 하나이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 보유한다. 일반적으로, 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있도록 하고, 복제 기점(origin of replication) 또는 자동적 복제 서열을 보유한다. 이런 서열은 다양한 박테리아, 효모, 바이러스에서 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점(SV4O, 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터에 적합하다. 일반적으로, 복제 구성요소의 기점은 포유동물 발현 벡터에는 필요하지 않다(복제 구성요소가 조기 프로모터(early promoter)를 보유하는 경우에만 SV40 기점이 전형적으로 이용될 수 있다).
C. 선별 유전자 구성요소
벡터는 선별가능 마커(selectable marker)라고 하는 선별 유전자(selection gene)를 보유한다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 공여하는 단백질; (b) 영양요구성 결핍을 보충하는 단백질; 또는 (c) 복합 배지에 결여된 중요 영양분을 제공하는 단백질을 인코딩한다(가령, 바실루스에 대한 D-알라닌 라세미화효소(racemase)를 인코딩하는 유전자).
선별 계획의 한가지 실례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이질성 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 저항성을 공여하는 단백질을 생산하고, 따라서 이런 선별 작업을 극복한다. 이런 우성 선별의 실례는 약물 네오마이신(neomycin), 미코페놀산(mycophenolic acid), 히그로마이신(hygromycin)을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능 마커의 다른 실례는 항체 핵산을 흡입할 수 있는 세포의 확인을 가능하게 하는 마커, 예를 들면, DHFR, 티미딘 키나아제(thymidine kinase), 메탈로티오네인(metallothionein)-I과 II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자(primate metallothionein gene), 아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase), 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase) 등이다.
가령, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 DHFR의 경쟁성 길항물질인 메토트렉세이트(methotrexate)(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체(transformant)를 배양함으로써 먼저 확인한다. 야생형 DHFR이 이용되는 경우에 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다.
대안으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질, 다른 선별가능 마커, 예를 들면, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라아제(APH)를 인코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포(특히, 내생적 DHFR을 보유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시딕 항생제(aminoglycosidic antibiotic), 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418.(U.S. Pat. No. 4,965,199)과 같은 선별가능 마커에 대한 선별제(selection agent)를 함유하는 배지에서 세포 성장으로 선별할 수 있다.
효모에 이용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 Yrp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature 282: 39(1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모 변이 균주, 예를 들면, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다(Jones, Genetics 85: 12(1977)). 효모 숙주 세포 게놈에서 trp1 장애의 존재는 트립토판의 부재하에 성장으로 형질전환을 탐지하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결손 효모 균주(ATCC 20, 622 또는 38, 626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보충된다.
D. 프로모터 구성요소
발현과 클로닝 벡터는 일반적으로, 숙주 생물체에 의해 인식되고 항체 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 보유한다. 원핵 숙주에 이용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마아제와 락토오스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타아제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 하이브리드 프로모터(가령, tac 프로모터) 등이다. 하지만, 다른 공지된 박테리아 프로모터 역시 적합하다. 박테리아 계통에 이용되는 프로모터는 항체를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 Shine-Dalgarno(S.D.) 서열을 보유할 수도 있다.
진핵생물에 대한 프로모터 서열은 공지되어 있다. 거의 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 상류의 대략 25개 내지 30개 염기에 위치한 AT-풍부한 영역을 보유한다. 많은 유전자의 전사의 개시 부위로부터 상류의 70개 내지 80개 염기에서 발견되는 다른 서열은 CNCAAT 영역인데, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에 AATAAA 서열이 존재하는데, 상기 서열은 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 추가를 위한 신호이다. 이들 서열 모두 진핵생물 발현 벡터에 적절히 삽입된다.
효모 숙주에 이용하기 적합한 프로모터 서열의 실례는 3-글리세린인산 키나아제(3-phosphoglycerate kinase) 또는 다른 당분해 효소(glycolytic enzyme), 예를 들면, 에놀라아제(enolase), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase), 헥소키나아제(hexokinase), 피루베이트 디카르복실라아제(pyruvate decarboxylase), 포스포프럭토키나아제(phosphofructokinase), 글루코오스-6-포스페이트 아이소머라아제(glucose-6-phosphate isomerase), 3-글리세린인산 뮤타아제(3-phosphoglycerate mutase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 트리오스포스페이트 아이소머라아제(triosephosphate isomerase), 포스포글루코오스 아이소머라아제(phosphoglucose isomerase), 글루코키나아제(glucokinase)에 대한 프로모터이다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가적인 이점을 보유하는 유도성 프로모터로서 다른 효모 프로모터는 알코올 디하이드로게나아제 2(alcohol dehydrogenase 2), 이소사이토크롬 C(isocytochrome C), 산 포스파타아제(acid phosphatase), 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인(metallothionein), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 말토오스와 갈락토오스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 이용하기 적합한 벡터와 프로모터는 EP 73,657에서 더욱 상술한다. 적절하게는, 효모 인핸서 역시 효모 프로모터와 함께 이용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 항체 전사는 예로써, 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 계두 바이러스(fowlpox virus), 아데노바이러스(가령, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 조류 육종 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalo virus), 레트로바이러스(retrovirus), B형 간염 바이러스(hepatitis-B virus), 가장 바람직하게는 유인원 바이러스 40(Simian virus 40)(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 획득된 프로모터; 이질성 포유동물 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터; 또는 열-쇼크(heat-shock) 프로모터에 의해 조절되는데, 여기서 이들 프로모터는 숙주 세포 시스템에 적합해야 한다.
SV40 바이러스의 조기 프로모터와 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 보유하는 SV40 제한 단편으로서 편의하게 획득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 조기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편의하게 획득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 이용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하는 시스템은 U.S. Pat. No. 4,419,446에서 기술한다. 상기 시스템의 변형은 U.S. Pat. No. 4,601,978에서 기술한다. 대안으로, 인간 β-인터페론 cDNA가 단순 포진 바이러스로부터 획득된 티미딘 키나아제 프로모터의 조절하에 생쥐 세포에서 발현되었다. 대안으로, 라우스 육종 바이러스 장 말단 반복(rous sarcoma virus long terminal repeat)이 프로모터로서 이용될 수 있다.
E. 인핸서 요소 구성요소
본 발명의 항체를 인코딩하는 DNA의 고등 진핵생물에 의한 전사는 빈번하게, 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로서 증가된다. 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아토단백질(α-fetoprotein), 인슐린)로부터 다수의 인핸서 서열이 알려져 있다. 하지만, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터 인핸서가 이용된다. 실례는 복제 기점의 후측에서 SV40 인핸서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후측에서 폴리오마 인핸서, 아데노바이러스 인핸서이다. 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소와 관련하여 Yaniv, Nature 297: 17-18(1982)을 참조한다. 인핸서는 항체-인코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 절단접합될 수 있지만, 가급적 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
F. 전사 종결 구성요소
진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 생물체로부터 핵을 지닌 세포)에 이용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화를 위하여 필요한 서열을 보유할 수도 있다. 이들 서열은 통상적으로 5' 말단으로부터, 때때로 진핵이나 바이러스 DNA 또는 cDNA의 3' 비번역 영역으로부터 획득된다. 이들 영역은 항체를 인코딩하는 mRNA의 비번역 영역에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 분절을 보유한다. 한가지 유용한 전사 종결 구성요소는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다(참조: WO94/11026).
숙주 세포의 선별과 형질전환
본 발명의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현하는데 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 이런 목적에 적합한 원핵생물은 바실루스(Bacillus), 슈도모나스균(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces) 뿐만 아니라 그람-음성과 그람-양성 생물체, 예를 들면, 대장균(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르비니아균속(Erwinia), 클레프시엘라균(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라균(Salmonella), 세라티아속(Serratia), 시겔라(Shigella)와 같은 장내세균(Enterobacteria)이다. 한가지 선호되는 대장균(E. coli) 클로닝 숙주는 대장균(E. coli) 294(ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들면, 대장균(E. coli) B, 대장균(E. coli) X1776(ATCC 31,537), 대장균(E. coli) W3110(ATCC 27,325) 역시 적합하다. 이들은 무-제한적 실례이다.
원핵생물 이외에, 섬유성 진균이나 효모와 같은 진핵 미생물이 항체-인코딩 벡터에 대한 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 저급 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 이용된다. 하지만, 다수의 다른 속, 종, 균주, 예를 들면, 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루베로미세스(Kluyveromyces); 칸디다(Candida); 트리콜데마(Trichoderma); 붉은빵곰팡이(Neurospora crassa); 섬유성 진균, 예를 들면, 빵곰팡이속(Neurospora), 푸른곰팡이(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주(가령, 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans)와 아스페르길루스 니게르(A. niger))가 편의하게 입수가능하고 본 발명에 이용된다.
당화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물체로부터 유래된다. 원칙적으로, 척추동물 또는 무척추동물 배양물로부터 유래되는 지에 상관없이, 임의의 고등 진핵 세포 배양물이 이용될 수 있다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포이다(Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55(1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al. ads. Vol. 8, pp. 277-279(Plenam publishing 1986); Mseda et al., Nature 315, 592-594(1985)). 다수의 배큘로바이러스 균주와 변이체 및 거염벌레(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 숲모기(Aedes)(모기), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)(광대파리), 누에나방(Bombyx mori)과 같은 숙주로부터 상응하는 복제가능 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들면, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체와 누에나방(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능한데, 이들 바이러스는 본 발명에 따라, 특히 거염벌레(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위한 바이러스로서 이용될 수 있다. 게다가, 면화, 옥수수, 감자, 콩, 피튜니아, 토마토, 담배의 식물 세포 배양물 역시 숙주로서 이용될 수 있다.
척추동물 세포의 배양(조직 배양)에 의한 증식은 일상화되었다(참조: Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, eds. (1973)). 유용한 포유동물 숙주 세포주의 실례는 원숭이 신장; 인간 태아 신장 세포주; 베이비 햄스터 신장 세포; 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(1980)); 생쥐 세르톨리 세포(sertoli cell); 인간 경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포; 인간 폐 세포; 인간 간 세포; 생쥐 유방 종양; NS0 세포이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위한 상기한 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하는데 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
본 발명의 항체 변이체를 생산하는데 이용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 구입가능한 배지, 예를 들면, Ham's F10(Sigma), Minimal Essential Medium(MEM, Sigma), RPMI-1640(Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, Sigma)이 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 이에 더하여, Ham et al., Meth. Enzymol. 58. 44(1979); Barnes et al., Anal. Biochem.102: 255(1980); U.S. Pat. No. 4,767,704; 4,657,866; 4,560,655; 5,122,469; 5,712,163; 6,048,728에 기술된 임의의 배지가 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 이용될 수 있다. 이들 배지는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(가령, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(가령, X-염화물, 여기서 X는 나트륨, 칼슘, 마그네슘); 인산염), 완충액(가령, HEPES), 뉴클레오티드(가령, 아데노신과 티미딘), 항생제(가령, GENTAMYCIN.TM. 약물), 미량 원소(일반적으로, 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 글루코오스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 다른 필요 보충물질 역시 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들면, 온도, pH 등은 발현을 위하여 선별된 숙주 세포에서 기존에 이용된 조건과 동일하고, 당업자에게 명백하다.
항체 정제
재조합 기술을 이용하는 경우에, 항체 변이체는 세포내에서 또는 주변세포질에서 생산되거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체 변이체가 세포내에서 생산되는 경우에, 일차 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미립자 잔해를 예로써 원심분리 또는 한외여과로 제거한다. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167(1992)에서는 대장균(E. coli)의 주변세포질로 분비되는 항체를 분리하는 절차를 기술한다. 간단히 말하면, 세포 페이스트(cell paste)를 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 페닐메틸설포닐플루라이드(PMSF)의 존재하에 30분간 해동시킨다. 세포 잔해는 원심분리로 제거할 수 있다. 항체 변이체가 배지로 분비되는 경우, 이들 발현 시스템으로부터 상층액은 일반적으로, 상업적으로 구입가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용하여 먼저 농축된다. 단백분해를 저해하기 위하여 상기한 단계 중에서 임의의 단계에 PMSF와 같은 프로테아제 저해물질이 포함될 수 있고, 우발적인 오염물질의 성장을 예방하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다.
이들 세포로부터 제조된 항체 조성물은 예로써 하이드록시아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화성 크로마토그래피가 정제 기술로서 선호된다. 단백질 A의 친화성 리간드(affinity ligand)로서 적합성(suitability)은 항체 변이체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종류와 아이소타입에 좌우된다. 단백질 A는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄에 기초한 항체를 정제하는데 이용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol Meth. 62: 1 13(1983)). 단백질 G는 모든 생쥐 아이소타입과 인간 IgG3에 권장된다(Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575(1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 빈번하게 아가로즈이지만, 다른 매트릭스도 가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들면, 제어된 세공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로즈에서보다 더욱 신속한 유속(flow rate)과 더욱 짧은 가공 시간(processing time)을 가능하게 한다. 항체 변이체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, Bakerbond ABXTM 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들면, 이온-교환 칼럼(ion-exchange column)에서 분류(fractionation), 에탄올 침전(ethanol precipitation), 역상 HPLC, 실리카에서 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSETM에서 크로마토그래피, 음이온이나 양이온 교환 수지(가령, 폴리아스파라긴산(polyaspartic acid) 칼럼)에서 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 황산암모늄 침전(ammonium sulfate precipitation) 역시 회수되는 항체 변이체에 따라 이용될 수 있다.
임의의 예비 정제 단계이후, 목적하는 항체 변이체 및 오염물질을 함유하는 혼합물은 가급적 낮은 염 농도(가령, 대략 0-0.25M 염)에서 대략 2.5-4.5 pH의 용리 완충액을 이용한 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행할 수 있다.
제약학적 조성물
폴리펩티드 또는 항체의 치료 조성물은 원하는 수준의 순도를 보유하는 폴리펩티드를 당분야에 전형적으로 이용되는 선택적인 “제약학적으로 허용되는”담체, 부형제 또는 안정제(이들 모두 “부형제”라 한다), 예를 들면, 완충제, 안정제, 보존제, 등장제(isotonifier), 비-이온성 계면활성제, 항산화제, 기타 첨가제와 혼합함으로써 보관을 위한 냉동건조 조성물 또는 수용액으로 제조될 수 있다(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed.(1980)). 이들 첨가제는 이용된 용량과 농도에서 수용자에 비-독성이어야 한다.
완충제는 생리 조건에 근사하는 범위에 pH를 유지하는데 도움을 준다. 적절하게는, 이들은 대략 2 mM 내지 50 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에 이용하기 적합한 완충제에는 유기산과 무기산 및 이들의 염, 예를 들면, 구연산염 완충액(가령, 구연산나트륨-구연산이나트륨 혼합물, 구연산-구연산삼나트륨 혼합물, 구연산-구연산나트륨 혼합물 등), 숙신산염 완충액(가령, 숙신산-숙신산나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨 혼합물 등), 주석산염 완충액(가령, 주석산-주석산나트륨 혼합물, 주석산-주석산칼륨 혼합물, 주석산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마르산염 완충액(가령, 푸마르산-푸마르산나트륨 혼합물 등), 푸마르산염 완충액(가령, 푸마르산-푸마르산나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루콘산염 완충액(가령, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살산염 완충액(가령, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락트산염 완충액(가령, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등), 아세트산염 완충액(가령, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등) 등이다. 부가적으로, 인산염 완충액, 히스티딘 완충액, 트리메틸아민 염(가령, Tris) 역시 완충제로서 가능하다.
보존제는 미생물 성장을 지체시키기 위하여 0.2%-1%(w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명에 이용하기 적합한 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레솔, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride), 벤잘코니움 할라이드(benzalconium halide)(가령, 염화물, 브롬화물, 요오드화물), 헥사메소늄 클로라이드(hexamethonium chloride), 메틸이나 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜(catechol), 레조르시놀(resorcinol), 사이클로헥산올, 3-펜탄올 등이다.
“안정제”라고도 불리는 등장제는 본 발명의 액체 조성물의 등장성(isotonicity)을 담보하기 위하여 첨가되는데, 여기에는 다가 당 알코올(polyhydric sugar alcohol), 바람직하게는 3가 또는 더욱 고급 당 알코올, 예를 들면, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 솔비톨, 만니톨 등이 포함된다.
안정제는 증량제에서부터 치료제를 용해시키거나, 또는 변성이나 용기 벽에 부착을 예방하는데 도움을 주는 첨가제까지 기능의 측면에서 넓은 범위의 부형제를 지칭한다. 전형적인 안정제는 다가 당 알코올(앞서 열거됨); 아미노산, 예를 들면, 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-루이신, 2-페닐알라닌, 글루타민산, 트레오닌, 등; 이노시톨(inositol)과 같은 사이클리톨(cyclitol)을 비롯한 유기 당이나 당 알코올, 예를 들면, 락토오스, 트레할로스(trehalose), 스타키오스(stachyose), 만니톨, 솔비톨, 자일리톨, 리비톨(ribitol), 미오이니시톨(myoinisitol), 갈락티톨(galactitol), 글리세롤 등; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황 보유 환원제, 예를 들면, 요소, 글루타티온(glutathione), 치옥트산(thioctic acid), 나트륨 티오글리콜레이트(sodium thioglycolate), 티오글리세롤(thioglycerol), α-모노티오글리세롤(α-monothioglycerol), 나트륨 티오설페이트(sodium thio sulfate); 저분자량 폴리펩티드(즉, <10개 잔기); 단백질, 예를 들면, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈 단당류(polyvinylpyrrolidone monosaccharide)(가령, 자일로스(xylose), 만노스(mannose), 프럭토오스(fructose), 글루코오스; 이당류(disaccharide), 예를 들면, 락토오스, 말토오스, 수크로오스; 삼당류(trisaccacharide), 예를 들면, 라피노오스(raffinose); 다당류(polysaccharide), 예를 들면, 덱스트란(dextran)이다; 안정제는 활성 단백질 중량의 0.1 내지 10,000 중량 비율의 범위로 존재한다.
비-이온성 계면활성제 또는 세정제(“적심제”)는 휘젓기-유도된 응집으로부터 치료 단백질을 보호할 뿐만 아니라 치료제를 안정화시키는데 도움을 주기 위하여 첨가되는데, 이들은 단백질의 변성 없이 조성물이 압박된 전단면(shear surface)에 노출되도록 한다. 적절한 비-이온 계면활성제는 폴리소르베이트(polysorbate)(20, 80 등), 폴리옥사머(polyoxamer)(184, 188 etc.), Pluronic폴리올, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에테르(polyoxyethylene sorbitan monoether)(TWEEN, TWEEN등) 등이다. 비-이온성 계면활성제는 대략 0.05 ㎎/㎖ 내지 1.0 ㎎/㎖, 바람직하게는 대략 0.07 ㎎/㎖ 내지 0.2 ㎎/㎖의 범위에 존재한다.
추가적인 기타 부형제에는 증량제(가령, 전분), 킬레이트화제(가령, EDTA), 항산화제(가령, 아스코르빈산, 메티오닌, 비타민 E), 보조-용제 등이 포함된다. 본 발명의 조성물은 치료되는 특정 징후에 필요한 경우에 한가지이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적인 영향을 주지 않는 보충적 활성을 보유하는 활성 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 가령, 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 적절하게는, 이들 분자는 의도한 목적을 충족하는 효과량의 조합으로 존재한다. 이들 활성 성분은 예로써 액적 형성(coacervation) 기술 또는 계면 중합(interfacial polymerization)으로 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(가령, 리포좀, 알부민 마이크로구체(albumin microsphere), 마이크로에멀젼, 나노입자, 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼(macroemulsion)에서 하이드록시메틸셀룰로오스(hydroxymethylcellulose) 또는 젤라틴-마이크로캡슐과 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 각각 피포될 수도 있다. 이들 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed.(1980)에서 기술한다.
생체내 투여에 이용되는 조성물은 무균이어야 한다. 이는 예로써 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 편의하게 달성된다. 서방 조성물이 제조될 수도 있다. 서방 조성물의 적절한 실례는 항체 변이체를 보유하는 고형 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스인데, 상기 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태를 취한다. 서방 매트릭스의 실례는 폴리에스테르, 하이드로겔(hydrogel)(가령, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(polylactide)(U.S. Pat. No. 3,773,919), L-글루타민산과 에틸-L-글루타민산염의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체(가령, LUPRON DEPOTTM(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프로리드 아세테이트(leuprolide acetate)로 구성되는 주사가능 마이크로구체)), 폴리-D-(-)-3-하이드록시부틸산이다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상의 분자 방출이 가능한 반면, 특정 하이드로겔은 더욱 짧은 기간동안 단백질을 방출한다. 피포된 항체는 장기간동안 체내에 남아있는 동안, 37℃에서 수분에 대한 노출의 결과로써 변성되거나 응집되어 생물학적 활성이 상실되고 면역원성이 변화될 수 있다. 관련된 기전에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 가령, 응집 기전이 티오-이황화 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성으로 확인되면, 설프하이드릴(sulfhydryl) 잔기를 변형하고, 산성 용액으로부터 냉동 건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 이용하고, 특이적인 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화를 달성할 수 있다.
특정 질환이나 이상의 치료에 효과적인 치료 폴리펩티드, 항체 또는 이의 단편의 양은 질환이나 질병의 특성에 좌우되고, 표준 임상 기술로 결정할 수 있다. 가능하면, 먼저 시험관내에서, 이후 임상 검사에 앞서 유용한 동물 모형 시스템에서 본 발명의 제약학적 조성물의 용량-반응 곡선(dose-response curve)을 결정하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 치료 폴리펩티드, 항체 또는 이의 단편의 수용액은 피하 주사로 투여된다. 각 용량은 체중 ㎏당 대략 0.5 ㎍ 내지 50 ㎍, 더욱 바람직하게는 체중 ㎏당 대략 3 ㎍ 내지 30 ㎍이다. 피하 투여를 위한 투약 일정(dosing schedule)은 질병 유형, 질병 심각도, 치료제에 대한 환자의 민감도를 비롯한 다수의 임상 요인(clinical factor)에 따라, 월1회에서부터 매일까지 다양하다.
항체 변이체의 용도
본 발명의 항체 변이체는 친화성 정제 약제로서 이용될 수 있다. 이런 과정에서, 항체는 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여, SEPHADEXTM 수지 또는 필터 페이퍼와 같은 고체상에 고정시킨다. 고정된 항체 변이체는 정제되는 표적을 함유하는 샘플과 접촉시키고, 이후 정제되는 표적을 제외하고 샘플 내에서 거의 모든 물질을 제거하는 적절한 용제로 서포트(support)를 세척하는데, 여기서 상기 표적은 고정된 항체 변이체에 결합하게 된다. 최종적으로, 다른 적절한 용제, 예를 들면, 글리신 완충액으로 서포트를 세척하여 항체 변이체로부터 표적을 분리시킨다.
이들 변이 항체는 예로써, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 목적하는 표적의 발현을 탐지하기 위한 진단 검사에도 이용될 수 있다. 진단 적용을 위하여, 항체 변이체는 전형적으로, 탐지가능 부분으로 표지된다. 형광 변화를 정량하는 기술에 이용가능한 다수의 라벨이 존재한다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전기적으로 여기되고, 이후 측정될 수 있거나(예로써 화학발광분석기를 이용하여) 또는 형광 수용체에 에너지를 공여하는 광을 방출한다. 효소 라벨의 실례는 루시페라제(가령, 개똥벌레 루시페라제와 박테리아 루시페라제; U.S. Pat. No. 4,737,456), 루시페린, 2,3-(디하이드로프탈라진디온)(2,3-dihydrophthalazinedione), 말레이트 디하이드로게나아제(malate dehydrogenase), 우레아제(urease), 과산화효소(가령, 양고추냉이 과산화효소(HRPO)), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제(glucoamylase), 라이소자임, 당질 산화효소(saccharine oxidase)(가령, 글루코오스 산화효소, 갈락토오스 산화효소, 글루코오스-6-포스페이트 디하이로게나아제), 헤테로사이클릭 산화효소(가령, 요산 산화효소(uricase)와 산틴 산화효소), 락토페록시다아제(lactoperoxidase), 마이크로페록시다아제(microperoxidase) 등이다. 효소를 항체에 공액하는 기술은 O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym.(Ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166(1981)에서 기술한다.
때로는, 라벨은 항체 변이체와 간접적으로 공액된다. 이를 달성하기 위한 다양한 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 가령, 항체 변이체는 비오틴으로 공액하고, 상기한 3가지 넓은 기준의 라벨 중에서 임의 하나는 아비딘 등으로 공액할 수 있다. 비오틴은 아비딘에 특이적으로 결합하고, 따라서 라벨은 이런 간접적인 방식으로 항체 변이체와 공액할 수 있다. 대안으로, 라벨과 항체 변이체의 간접적인 공액을 달성하기 위하여, 항체 변이체는 소형 합텐(가령, 디글록신(digloxin))으로 공액되고, 상기한 상이한 유형의 라벨중 하나는 항-합텐 항체 변이체(가령, 항-디글록신 항체)로 공액된다. 따라서, 라벨과 항체 변이체의 간접적인 공액을 달성할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 항체 변이체는 표지할 필요가 없고, 이의 존재는 항체 변이체에 결합하는 표지된 항체를 이용하여 탐지할 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 공지된 검사 방법, 예를 들면, 경쟁적 결합 검사법, 직접과 간접 샌드위치 검사법, 면역침전 검사법에 이용될 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158(CRC Press, Inc. 1987).
경쟁적 결합 검사는 한정된 양의 항체 변이체와의 결합에 대하여 검사 샘플과 경쟁하는 표지된 기준(standard)의 능력에 좌우된다. 검사 샘플에서 표적의 양은 항체에 결합하는 기준의 양에 반비례한다. 결합하는 기준의 양을 용이하게 결정하기 위하여, 항체는 일반적으로, 경쟁 전후에 불용성화된다. 결과적으로, 항체에 결합하는 기준과 검사 샘플은 결합하지 않은 상태의 기준과 검사 샘플로부터 편의하게 분리된다.
샌드위치 검사법은 2가지 항체의 이용을 수반하는데, 이들 각각은 상이한 면역원성 부분, 또는 에피토프, 또는 탐지되는 단백질에 결합할 수 있다. 샌드위치 검사에서, 분석되는 검사 샘플은 고형 서포트에 고정된 제 1 항체에 의해 결합되고, 이후 제 2 항체가 검사 샘플에 결합하여 불수용성 3자 복합체를 형성한다(참조: U.S. Pat. No. 4,376,110). 제 2 항체는 자체적으로, 탐지가능 부분으로 표지되거나(직접 샌드위치 검사법), 또는 탐지가능 부분으로 표지된 항-면역글로불린 항체를 이용하여 측정될 수 있다(간접 샌드위치 검사법). 가령, 샌드위치 검사법의 한가지 유형은 ELISA 검사인데, 이런 경우에 탐지가능 부분은 효소이다.
면역조직화학 검사를 위하여, 종양 샘플은 냉동 또는 동결되거나 파라핀에 포매되고, 예로써 포르말린과 같은 보존제로 고정된다. 항체는 생체내 진단 검사에도 이용될 수 있다. 일반적으로, 항체 변이체는 방사성뉴클레오티드(가령, sup.111 In, sup.99 To, sup.14 C, sup.131 I, sup.3 H, sup.32 P 또는 sup.35 S)로 표지하고, 면역신티그라피(immunoscintigraphy)를 이용하여 종양의 위치를 확인할 수 있다. 가령, 본 발명의 고 친화성 항-IgE 항체는 예로써 천식 환자의 폐에 존재하는 IgE의 양을 탐지하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 항체는 키트, 다시 말하면, 진단 검사를 수행하기 위한 사용설명서와 함께 미리결정된 양으로 반응물의 포장된 조합으로 제공될 수 있다. 항체 변이체가 효소로 표지되는 경우에, 키트는 상기 효소에 의해 요구되는 기질과 보조인자(가령, 탐지가능 발색단(chromophore) 또는 형광단(fluorophore)을 제공하는 기질 전구물질)를 포함한다. 이에 더하여, 다른 첨가제, 예를 들면, 안정제, 완충액(블록 완충액 또는 용해 완충액) 등이 포함될 수 있다. 다양한 반응물의 상대적인 양을 폭넓게 변화시켜 검사의 민감도를 실질적으로 최적화시키는 반응물의 용해 농도(concentration in solution)를 제공할 수 있다. 특히, 부형제를 비롯한 이들 반응물은 일반적으로 냉동 건조된 건성 분말로서 제공되는데, 이는 용해이후 적절한 농도를 보유하는 반응물 용액을 제공한다.
항체의 생체내 이용
본 발명의 항체는 포유동물을 치료하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 예로써 전임상 데이터를 획득하기 위한 목적으로 비-인간 포유동물에 투여된다. 치료되는 전형적인 비-인간 포유동물은 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 전임상 연구가 수행되는 다른 포유동물이다. 이들 포유동물은 본 발명의 항체로 치료되는 질환에 대한 확립된 동물 모델이거나, 또는 목적 항체의 독성을 연구하는데 이용될 수 있다. 이들 각 구체예에서, 용량 증가 연구가 이들 포유동물에서 수행될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 비강내 및 국소 면역억제 치료를 위하여 필요한 경우에, 병소내 투여를 비롯한 임의의 적절한 수단으로 투여된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 이에 더하여, 항체 변이체는 특히 감소하는 용량의 펄스 주입(pulse infusion)으로 적절하게 투여된다. 적절하게는, 투약은 주입, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주입으로 제공되는데, 이는 투여가 단기 또는 장기인 지에 부분적으로 좌우된다.
질환의 예방 또는 치료에서, 항체 또는 폴리펩티드의 적량은 치료되는 질환의 유형, 심각도, 질환의 진전, 항체 변이체가 예방 목적 또는 치료 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전 요법, 환자의 병력과 항체 변이체에 대한 반응, 참여 의사의 판단에 좌우된다. 본 발명의 고 친화성 항-인간 IgE 항체는 한 번에 또는 일련의 치료로 환자에 적절히 투여될 수 있다. 질환의 유형과 심각도에 따라, 대략 0.1 ㎎/㎏ 내지 150 ㎎/㎏(가령, 0.1-20 ㎎/㎏)의 항체가 예로써 1회 이상의 개별 투여, 또는 연속 주입에 의한 환자 투여에서 최초 후보 용량이다. 전형적인 일일 용량은 상기한 요인에 따라, 대략 1 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상일 수 있다. 수일 또는 그 이상동안 반복 투여의 경우, 상태에 따라, 치료는 병징(disease symptom)의 원하는 억제가 달성될 때까지 지속한다. 하지만, 다른 투약 섭생이 유용할 수도 있다. 치료의 진행은 통상적인 기술과 검사에 의해 편의하게 모니터된다. 항-LFA-1 또는 항-lCAM-1 항체에 대한 전형적인 투약 섭생은 WO 94/04188에서 기술한다.
항체 변이체 조성물은 의약품 안전 기준(good medical practice)에 합치되는 방식으로 제조되고 조제되며 투약된다. 이와 관련하여 고려해야 하는 요인에는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 약물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 의료 전문의에게 공지된 다른 요인 등이 포함된다. 투여되는 항체 변이체의 “치료 효과량”은 이들 고려 요인에 의해 결정되고, 질병이나 질환을 예방, 완화 또는 치료하는데 필요한 최소량이다. 선택적으로, 항체 변이체는 문제가 되는 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 현재 이용되고 있는 다른 약물과 공동으로 제조될 수 있다. 이들 다른 약물의 효과량은 조성물에 존재하는 항체의 양, 질환이나 치료의 유형, 상기한 다른 요인에 좌우된다. 일반적으로, 이들은 앞서 기술된 동일한 용량과 투여 경로로 이용되거나, 또는 상기한 용량의 대략 1 내지 99%의 양으로 이용된다.
IgE를 표적으로 인식하는 본 발명의 항체는 “IgE-매개된 질환”을 치료하는데 이용될 수 있다. 여기에는 천식, 알레르기 비염 & 결막염(건초열), 습진, 두드러기, 아토피성 피부염, 음식 알레르기 등이 포함된다. 예로써 벌에 쏘임, 뱀에 물림, 식품 또는 의약품에 의해 유발되는 아나필락시스 쇼크의 심각한 생리 상태 역시 본 발명의 범위에 속한다.
항체 에피토프 유전자지도작성
“에피토프”는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원의 특정 부위를 지칭한다. B-세포 에피토프는 연속 아미노산, 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 병렬된 비-연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로, 변성 용제에 노출이후에도 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로, 변성 용제로 처리이후 상실된다. 전형적으로, 에피토프는 독특한 공간적 형태에서 적어도 3개, 더욱 일반적으로 적어도 5개 또는 8-10개 아미노산을 보유한다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는 항체의 능력을 보여주는 간단한 면역검사로 확인할 수 있다.
본 발명의 고 친화성 항체 IgE에 대한 결합 부위의 에피토프 유전자지도작성은 결합에 대한 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis), IgE의 CH3 도메인의 펩티드 스캔, 결합을 보이는 영역의 알라닌 스캔, IgG1의 상응하는 영역으로부터 아미노산 치환, 부위 직접 돌연변이유발을 수반한다.
IgE의 전체 CH3 도메인의 펩티드 스캔은 73개의 중복 펩티드를 필요로 하였다. 이들 각 펩티드는 본 발명의 표지된 항-IgE 항체에 의한 결합을 수행하여 IgE의 고 친화성 수용체에 대한 결합을 차단하는 IgE의 특정 에피토프를 확인하였다. 펩티드 스캔에서 2개의 펩티드가 IgE에서 잠재적인 항-IgE MAb 접촉 부위로서 확인되었다(에피토프 'A'와 에피토프 'B')(도 11). 에피토프 'A'와 에피토프 'B' 서열이 선형 서열에서 대략 80 아미노산 떨어져 있긴 하지만, 이들은 IgE의 3차원 구조에서 서로 근접하여 위치한다. 이들 둘은 표면 노출되고 IgE의 FcεRI 결합 부위에서 부분적으로 겹쳐지며, 양 펩티드에는 Arg의 양으로 하전된 잔기 및 Pro의 소수성 잔기가 존재한다. 도 12에서는 펩티드 스캔을 이용한 ELISA에 의해 확인된 에피토프 B의 결합 영역을 예시한다.
어떤 아미노산 잔기가 이들 에피토프 내에서 고 친화성 항체의 결합에 중요한 지의 결정은 알라닌 스캐닝(alanine scanning mutagenesis)으로 수행하였다(Cunningham et al., "High-Resolution Epitope Mapping of hGH-Receptor Interactions by Alanine-Scanning Mutagenesis" Science 244:1081-1085). 알라닌은 에피토프 A와 에피토프 B의 각 잔기에서 치환되고, 고 친화성 단클론 항체의 결합이 결정되었다(참조: 하기 실시예 12 및 도 13과 14).
능동과 수동 면역화
또한, 본 발명은 SEQ ID NO 72 및/또는 SEQ ID NO 74를 비롯한 본 발명의 펩티드 면역원 분자 및 희석제, 부형제, 어쥬번트 또는 담체를 함유하는 제약학적 조성물, 예를 들면, 백신에 관계한다. 더 나아가, 본 발명은 본 발명의 면역원의 제조 공정에 관계하는데, 상기 공정은 본 발명의 적어도 한가지 펩티드를 상기 펩티드에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 부분과 공유 결합시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 예로써 알레르기 또는 아토피성 피부염과 같은 IgE-매개된 질환이나 질병의 치료에서 치료 약물로서 이용되는 상기한 면역원성 펩티드에 관계한다.
또한, 본 발명은 IgE-매개된 질환이나 질병, 예를 들면, 알레르기와 아토피성 피부염으로부터 포유동물을 면역하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 치료 효과량의 상기한 면역원성 펩티드를 이런 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 면역원성 펩티드는 비-세포용해 히스타민 방출을 실질적으로 매개할 수 없지만 에피토프 A 및/또는 에피토프 B의 표적 아미노산 서열과의 강한 혈청학적 교차-반응성(serological cross-reactivity)으로 항체를 유도할 수 있다.
최초량의 펩티드(가령, 대략 0.2 ㎎ 내지 5 ㎎)는 예로써 근육내 투여되고, 이후 14일 내지 28일 시점에서 반복(부스터) 투여될 수 있다. 용량은 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강에 상당히 좌우된다. 면역화는 “능동” 또는 “수동”일 수 있다. “능동” 면역화에서, 개체는 본 발명의 면역원성 단백질을 섭취하고, 항-IgE 반응이 개체의 면역계에 의해 능동적으로 유도된다.
“능동 면역화”는 인간에게 이용하기 적합하지만, 다른 포유동물 종, 예를 들면, 개 역시 유사하게 치료될 수 있다. 본 명세서에서 “면역원성 담체”는 숙주 동물에서 면역원성 반응을 독립적으로 유도할 수 있는 물질을 의미하는데, 이들 물질은 폴리펩티드에서 유리 카르복실, 아미노 또는 하이드록실 작용기와 면역원성 담체 물질에서 상응하는 작용기 사이의 펩티드 또는 에스테르 결합의 형성을 통하여 직접적으로, 또는 대안으로 통상적인 이중기능성 연결기를 통한 결합으로, 또는 융합 단백질로서 폴리펩티드에 공유 결합될 수 있다. 이런 면역원성 담체의 실례는 BSA와 같은 알부민; 글로불린(globulin); 혈청 갑상선글로불린(thyroglobulin); 헤모글로불린(hemoglobin); 헤모시아닌(hemocyanin)(특히, 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin)[KLH]); J. Immunol. 111 1973; 260-268, J. Immunol. 122 1979; 302-308, J. Immun. 98 1967; 893-900, a Am. J. Physiol. 199 1960; 575-578에 기술된 바와 같이 회충(ascaris)으로부터 추출된 단백질, 예를 들면, 회충 추출물 또는 이의 정제된 산물; 폴리리신; 폴리글루타민산; 리신-글루타민산 공중합체; 리신이나 오르니틴을 보유하는 공중합체 등이다. 백신은 디프테리아 톡소이드 또는 파상풍 톡소이드를 면역원성 담체 물질로 이용하여 생산되고 있고(Lepow M. L. et al., J. of Infectious Diseases 150 1984; 402-406; Coon Beuvery, E. et al., Infection and Immunity 40 1983; 39-45), 이들 톡소이드 물질은 본 발명에도 이용될 수 있다. 투베르쿨린(tuberculin)의 정제된 단백질 유도체(PPD)는 “능동” 면역화 전략에 이용하기 특히 적합한데, 그 이유는 상기 유도체가 (1) 자체로써 T-세포 반응을 유도하지 않으면서(즉, 이는 실제적으로 “T-세포 합텐”이다) 완전히 가공된 항원처럼 행동하고 T-세포에 의해 인식되며; (2) 연계된 인식 양식(linked recognition mode)에서 가장 강력한 합텐 “담체” 중의 하나로 알려져 있고; (3) 추가적인 검사없이 인간에 이용될 수 있기 때문이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포에 관계한다. 이에 더하여, 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써 능동 면역화를 달성할 수 있다. 이런 요법에 적합한 벡터는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터이다.
“수동” 면역화는 본 발명의 항-IgE 항체를 IgE-매개된 질환이나 질병으로 고생하는 환자에 투여함으로써 달성된다. 이들 항체는 본 발명의 면역원성 펩티드를 비-인간 포유동물에 투여하고, 생성 항-혈청을 수거함으로써 제조할 수 있다. 일정한 기간동안 반복 주입으로 향상된 역가를 달성할 수 있다. 항체를 유도하는데 이용할 수 있는 포유동물의 종에는 특별한 제한이 없다; 일반적으로, 토끼 또는 기니피그를 이용하는 것이 선호되긴 하지만 말, 고양이, 개, 염소, 돼지, 쥐, 소, 양 역시 이용될 수 있다. 항체는 최종 투여이후 1 내지 2주 시점에 면역된 동물로부터 혈액을 수집하고, 혈액을 원심분리하며, 혈액으로부터 혈청을 분리함으로써 수거된다. 단클론 항체는 예로써 인간이나 뮤린 단클론 항체일 수 있다.
개체를 면역할 때, 본 발명의 항체는 예로써 근육내 주입으로 포유동물에 도입할 수 있다. 하지만, 임의 형태의 항체 투여가 이용될 수 있다. 개체에 수용되고 유해한 부작용을 유발하지 않는 임의의 통상적인 액체 또는 고체 운반제(vehicle)가 이용될 수 있다. 생리 pH, 예를 들면, 대략 pH 6.8 내지 7.2, 바람직하게는 대략 pH 7.0에서 인산염-완충액(PBS)은 단독으로, 또는 적절한 어쥬번트, 예를 들면, 수산화알루미늄-기초된 어쥬번트와 함께 운반제로서 이용될 수 있다.
아래의 실시예는 예시를 목적으로 하며, 본 발명을 한정하지 않는다.
실시예 1: 항-IgE 뮤린 MAb TES-C21의 인간화
뮤린 mAb TES-C21의 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)의 서열은 공개 데이터베이스에서 입수가능한 인간 항체 생식세포주 서열과 비교하였다. 전체 길이, 골격 내에서 유사한 CDR 위치, 전체 상동성, CDR 크기 등을 비롯한 여러 기준은 상기 1 단계에 기술된 바와 같이, 주형을 결정하는 경우에 이용된다. 이들 모든 기준은 종합하면, 도 3A와 3B에 도시된 TES-C21 MAb 중쇄와 경쇄 서열 및 개별 인간 주형 서열 사이의 서열 정렬에 보이는 바와 같이 최적 인간 주형을 선택하기 위한 결과를 제공하였다.
이런 경우에, 하나이상의 인간 골격 주형을 이용하여 항체를 설계하였다. VH 사슬에 대하여 선택된 인간 주형은 DP88(aa 잔기 1-95)과 JH4b(aa 잔기 103-113)의 조합이었다(도 3B). VL 사슬에 대하여 선택된 인간 주형은 L16(VK 부분군 III, aa 잔기 1-87)과 JK4(as 잔기 98-107)의 조합이었다(도 3A). 뮤린 서열과 인간 주형 사이의 골격 상동성은 VH의 경우 대략 70% 및 VL의 경우 대략 74%이었다.
주형이 선택되면, 앞서 기술되고 도 2에 도시된 바와 같이 DNA 합성과 중복 PCR로 Fab 라이브러리를 작제하였다. 상기 라이브러리는 각각 선택된 인간 주형, DP88/JH4b와 L16/JK4로 합성된 합성 TES-C21 CDR로 구성되었다. 라이브러리의 복잡성(complexity)은 4096(= 212)이었다. 부분 VH와 VL 서열을 인코딩하는 중복 뉴클레 오티드는 18 내지 21개의 뉴클레오티드 오버랩을 보유하는 대략 63 내지 76개의 뉴클레오티드 범위에서 합성되었다.
VL과 VH 유전자의 PCR 증폭은 골격 영역 FR1에서 특이적인 서열과 리더 서열의 말단에 어닐링된 돌출 서열을 보유하는 비오틴화된 전방 프라이머(Genelll) 및 보존된 불변 영역으로부터 후방 프라이머(CK 또는 CH1)를 이용하여 표준 PCR 조건하에 수행하였다. PCR 산물은 아가로즈 겔 전기영동, 또는 상업적 PCR 정제 키트로 정제하여 통합되지 않은 비오틴화된 프라이머와 비-특이적 PCR을 제거하였다.
PCR 산물의 5'-인산화는 ddH2O에 의해 조정되는 20 ㎕의 전체 체적에서 2 ㎍ PCR 산물, 1 ㎕의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(10 unit/㎕), 2 ㎕의 10x PNK 완충액, 1 ㎕의 1O mM ATP를 이용하여 수행하였다. 37℃에서 45분간 배양 및 65℃에서 10분간 열 변성이후, 반응 체적은 다음 단계를 위하여 ddH2O를 첨가함으로써 200 ㎕로 조정하였다.
100 ㎕의 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드는 200 ㎕ 2x B&W 완충액으로 2회 세척하고 200 ㎕ 2x B&W 완충액으로 2회 세척하였다. 인산화된 PCR 산물은 비드와 혼합하고, 부드럽게 교반하면서 실온(RT)에서 16분간 배양하였다.
비드는 침전시키고 200 ㎕ 2x B&W 완충액으로 2회 세척하였다. 비-비오틴화된 ssDNA(마이너스 가닥)는 부드럽게 교반하면서 실온에서 10분간, 300 ㎕의 새로 제조된 0.15M NaOH로 용리하였다. 두 번째 NaOH 용리가 수율을 약간 증가시킬 수 있다(선택적). 용리액은 원심분리하여 임의의 잔류 비드를 제거하였다.
ssDNA는 1 ㎕ 글리코겐(10 ㎎/㎖), 1/10 볼륨의 3M NaOAc(pH 5.2), 2.5 볼륨의 EtOH를 첨가함으로써 상층액으로부터 침전시켰다. 침전된 ssDNA는 70% EtOH로 세척하고 3분간 냉동 건조시키며 20 ㎕ ddH2O에 용해시켰다. ssDNA는 브롬화에티듐(EtBr) 아가로즈 평판에 DNA 가닥을 배치하거나, 또는 OD260을 측정함으로써 정량하였다.
실시예 2
파지-발현 벡터로 V H 와 V L 의 클로닝
VH와 VL은 혼성화 돌연변이유발로 파지-발현 벡터에 클론하였다. 우리딘화(uridinylation)된 주형은 CJ236 대장균(E. coli) 균주(dut- ung-)를 M13-기초된 파지(파지-발현 벡터 TN003)로 감염시킴으로써 준비하였다. 아래의 구성요소[200 ng의 우리딘화된 파지 벡터(8.49 kb); 92 ng 인산화된 단일-가닥 H 사슬(489개의 염기); 100 ng 인산화된 단일-가닥 L 사슬(525개의 염기); 1 ㎕ 1OX 어닐링 완충액; ddH2O로 체적을 10 ㎕로 조정한다]는 온도를 85℃에서 5분간 유지하고(변성), 이후 55℃로 1시간동안 램핑(ramping)하는 PCR로 어닐링하였다(삽입체 대 벡터의 대략 8-배 몰 비율에서). 이들 샘플은 얼음 위에서 냉각시켰다.
어닐링된 산물에 아래의 구성요소: 1.4 ㎕ 10 X 합성 완충액; 0.5 ㎕ T4 DNA 리가아제(1 unit/㎕); 1 ㎕ T4 DNA 중합효소(1 unit/㎕)를 첨가하고, 이후 얼음 위에서 5분간, 37℃에서 1.5 시간동안 배양하였다. 그 다음, 산물은 에탄올 침전시키 고 10 ㎕의 ddH20 또는 TE에 용해시켰다.
DNA는 1 ㎕ Xbal(1O unit/㎕)로 2시간동안 절단하고, 65℃에서 20분간 열 불활화시켰다. 절단된 DNA는 50 ㎕의 전기-적격(electro-competent) DH1OB 세포에 전기천공(electroporation)으로 형질감염시켰다. 생성된 파지는 37℃에서 하룻밤동안 XL-1 블루 박테리아 론(bacterial lawn)에서 성장시킴으로써 적정하였다. 클론은 염기서열분석하여 조성을 확인하였다.
실시예 3
라이브러리 스크리닝(library Screening)을 위한 딥 웰 배양(deep well culture)
A. 파지 라이브러리 도말
파지 라이브러리는 평판당 원하는 수의 플라크를 달성하기 위하여 LB 배지에 희석하였다. 고 역가 파지는 200 ㎕ XL-1 B 세포 배양액과 혼합하였다. 3 ㎖ LB 상층 아가를 혼합하고 LB 배지에 부어넣고 실온에서 10분간 방치하였다. 평판은 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
B. 파지 용리
100 ㎕의 파지 용리 완충액(10mM Tris-Cl, pH 7.5, 10mM EDTA, 100mM NaCl)을 무균 U-바닥 96 웰 평판의 각 웰에 첨가하였다. 하룻밤 라이브러리 평판으로부터 단일 파지 플라크는 여과된 필터 첨단으로 웰에 이전하였다. 파지 용리 평판은 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 평판은 배양이후 4℃에서 보관하였다.
C. 딥 웰 평판(deep well plate)에서 배양
50 ㎖ 배양액으로부터 XL1B 세포는 1:100 희석도에서 2xYT 배지에 첨가하였다. 세포는 A600이 0.9 내지 1.2가 될 때까지 37℃에서 교반기에서 성장시켰다.
D. 딥 웰 평판에서 파지로 감염
세포가 적당한 OD에 도달하면, 1 M IPTG(1:2000)를 XL1B 배양액에 첨가하였다. IPTG의 최종 농도는 0.5mM이었다. 750 ㎕의 세포 배양액을 96 웰 - 딥 웰 평판(Fisher Scientific)의 각 웰에 이전하였다. 각 웰은 25 ㎕의 용리된 파지로 접종하였다. 딥 웰 평판은 교반기(250rpm)에 위치시키고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
E. ELISA 스크리닝을 위한 상층액 준비
배양이후, 딥 웰 평판은 Beckman JA-5.3 평판 회전자를 이용하여 3,250 rpm에서 20분간 원심분리하였다. ELISA를 위하여 각 웰로부터 50 ㎕의 상층액을 채취하였다.
F. XL-1 세포의 15 ㎖ 액체 배양액의 접종
XL-1은 A600 = 0.9 내지 1.2까지 10 ㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유하는 2xYT에서, 37℃ 교반기(250rpm)에서 성장시켰다. 각 클론을 특성화시키기 위하여, IPTG를 0.5mM의 최종 농도로 첨가하고, 15 ㎖의 배양액을 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 이전하였다. 세포는 고 역가 원액(역가= ~1011 pfu/㎖)로부터 10 ㎕ 파지로 접종하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이들 세포는 교반하면서 실온에서 하룻밤동안 성장시 켰다.
G. 주변세포질(periplasm)으로부터 가용성 Fab의 분리
이들 세포는 IEC 원심분리기에서 4,500 rpm으로 20분간 펠릿으로 뭉쳤다. 배양 배지는 제거하고, 펠릿은 650 ㎕의 재부유 완충액(50mM Tris, 1mM EDTA와 500mM 수크로오스 함유, pH 8.0)에서 재부유시키고, 회전시키고, 부드럽게 교반하면서 1시간동안 얼음 위에 위치시켰다. 세포 잔해는 4℃에서 10분간 9,000 rpm으로 원심분리하여 제거하였다. 가용성 Fab를 함유하는 상층액은 수집하고 4℃에서 보관하였다.
실시예 4
골격 변형
골격 내에서 상기한 잠재적 핵심 위치에서 12개의 뮤린/인간 wobble 잔기가 존재하였다. VH에서 73번 위치는 인간화 라이브러리(humanization library)에서 뮤린 잔기 트레오닌으로 보존되는데, 그 이유는 상기 위치가 결합에 영향을 주는 것으로 확인되었기 때문이다. 하지만, VH 73에서 트레오닌은 인간 생식세포주 VH 부분군 1과 2에서 공통 인간 잔기이다.
TES-C21 서열과 인간 주형 사이에 구별되는 골격 잔기는 상기한 바와 같이 무작위로 치환시키고, 이후 표적 결합에 대한 이들의 잠재적 효과 및 항체 접힘을 평가하엿다. 결합에 영향을 줄 수 있는 잠재적 골격 잔기가 확인되었다. 본 발명의 경우에, 이들은 VH에서 잔기 12, 27, 43, 48, 67, 69 및 VL에서 1, 3, 4, 49, 60, 85이었다(Kabat 진법(number system))(도 4). 이후, 27번과 69번만 VH 영역에서 결합에 현저한 영향을 주는 것으로 밝혀졌다(클론 번호 1136-2C).
이용된 일차 스크린은 배양 배지를 이용한 단일 점 ELISA(SPE)이었다(하기 참조). 일차 스크린은 항체의 표적 분자에 결합하는 클론을 선별하였다. 부모 분자와 동등하거나 이보다 우월한 신호를 제공하는 클론은 차기 스크리닝(screening)을 위하여 선별하였다. 이차 스크리닝에서, 개별 파지는 15 ㎖ 박테리아 배양액에 성장시키고, 주변세포질 제조물은 SPE와 ELISA 적정 검사에 이용하였다. 상기 검사에서 높은 결합력을 유지하는 클론은 더욱 특성화시켰다. 모든 선별된 일차 클론이 처리되면, 상위 10-15% 클론은 염기서열분석하고 서열에 따라 정렬하였다. 각 서열 군으로부터 대표는 서로 비교하고 최고 클론을 선별하였다. 이들 선택된 클론으로부터 서열은 집합시키고 다양한 조합의 효과를 평가하였다.
작제된 라이브러리는 재조합 인간 IgE, SE44에 대한 향상된 결합을 위하여 ELISA 스크린을 수행하였다. 뮤린 TES-C21 Fab보다 높은 결합 친화성을 보유하는 클론은 분리하고 염기서열분석하였다. 클론 ID #4, 49, 72, 76, 136은 더욱 특성화시켰다. 클론 4, 49, 72, 78, 136에 대한 ELISA 적정 곡선은 도 5A와 5B에 도시하는데, 상기 곡선은 이들 클론의 친화성이 부모 TES-C21의 친화성에 유사하다는 것을 암시한다. 이들 클론은 인간 IgE와의 결합에 대하여 뮤린 TES-C21과 경쟁하는데, 이는 결합 에피토프가 인간화 과정동안 변화되지 않는다는 것을 암시한다. 인간화 Fab는 FcεRI-결합된 IgE에 결합하지 않는데, 이는 이들 인간화 항체가 이 가(divalent) IgG로 작제되는 경우에, 수용체를 가교결합시켜 히스타민 방출을 유도할 가능성이 더욱 낮다는 것을 의미한다. 인간화 클론 136은 5개의 뮤린 중쇄 골격 잔기(= 94.3% 인간 VH 골격 상동성)를 유지하는데, 100% 인간 경쇄 골격은 친화성 돌연변이에 의해 선별된다. 인간화 Fab에 의한 FcεRI에 IgE 결합의 저해가 입증되었다(도 6).
실시예 5
항-IgE를 스크리닝하기 위한 단일 점 ELISA 프로토콜
평판은 탄산염 코팅 완충액에 담긴 2 ㎍/㎖ 양 항-인간 Fd로 하룻밤동안 4℃에서 코팅하였다. 코팅 용액은 제거하고, 평판은 37℃에서 1시간동안 200 ㎕/웰 3% BSA/PBS로 차단하였다. 평판을 PBS/0.1% TWEEN(PBST)로 4x 세척한 이후, 50 ㎕/웰 Fab 샘플(즉, 고 역가 파지 및 DMB 블록으로부터 분비된 Fab 또는 주변세포질 prep, 또는 15 ㎖ prep을 함유하는 상층액)을 첨가하였다. 평판은 실온에서 1시간동안 배양하고, 이후 PBST로 4x 세척하였다. 그 다음, 0.5% BSA/PBS와 0.05% TWEEN에서 0.015 ㎍/㎖로 희석된 50 ㎕/웰의 비오틴화된 SE44를 첨가하였다. 이후, 평판은 실온에서 2시간동안 배양하고 PBST로 4x 세척하였다. 0.5% BSA/PBS와 0.05% TWEEN에서 50 ㎕/웰 스트렙타비딘 HRP 1:2000 희석액을 첨가하고, 실온에서 1시간동안 평판을 배양하였다. 평판은 PBST로 6x 세척하였다. 50 ㎕/웰 TMB 기질(sigma)을 첨가하여 진전시키고, 이후 50 ㎕/웰 0.2M H2SO4를 첨가하여 중단시켰다.
실시예 6
ELISA 적정: 항-IgE
평판은 탄산염 코팅 완충액에 담긴 0.25 ㎍/㎖(정제된 Fab의 경우, 0.1 ㎍/㎖) SE44로 하룻밤동안 4℃에서 코팅하였다. 코팅 용액은 제거하고, 평판은 37℃에서 1시간동안 200 ㎕/웰 3% BSA/PBS로 차단하였다.
평판은 PBS/0.1% TWEEN(PBST)로 4x 세척하였다. 50 ㎕/웰 Fab(15 ㎖ 주변세포질 prep으로부터)을 첨가하여 1:2의 희석을 시작하고, 0.5% BSA/PBS와 0.05% TWEEN에서 3배 연속 희석하였다. 평판은 실온에서 2시간동안 배양하였다.
이들 평판은 PBST로 4x 세척하고, 0.5% BSA/PBS와 0.05% TWEEN에서 비오틴-양 항-인간 Fd의 50 ㎕/웰 1:1000(0.8 ㎍/㎖) 희석액을 첨가하였다. 평판은 실온에서 2시간동안 다시 배양하였다.
PBST로 4x 세척한 이후, 평판은 0.5% BSA/PBS와 0.05% TWEEN에서 50 ㎕/웰 뉴트라-아비딘-AP(Neutra-avidin-AP) 1:2000(0.9 ㎍/㎖)을 첨가하고, 실온에서 1시간동안 배양하였다.
이들 평판은 PBST로 4x 세척하였다. 50 ㎕/웰 pNPP 기질을 첨가하여 진전시키고, 이후 50 ㎕/웰 3M NaOH를 첨가하여 중단시켰다. 각 웰의 흡광도는 405nm 또는 41Onm에서 판독하였다.
실시예 7
M13 파지 발현된 가용성 Fab의 친화성 정제를 위한 프로토콜
A. DAY1
10 ㎎/㎖ 테트라사이클린을 함유하는 2개의 500 ㎖ 배양액(2xYT)은 5 ㎖ 하 룻밤 원액 XL1B로 접종하고 37℃에서 A600 = 0.9 내지 1.2로 성장시켰다. IPTG를 0.5mM의 농도로 첨가하였다. 이후, 세포 배양액은 배양액당 200 ㎕ 파지로 감염시키고 교반하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 감염이후, 이들 세포는 교반하면서 25℃에서 하룻밤동안 성장시켰다.
B. DAY2
세포는 250 ㎖ 원심분리기 튜브에서 3500 x g로 4℃에서 30분간 펠릿으로 뭉쳤다. 세포 배지는 흡입하고, 펠릿은 총 12-15 ㎖의 용해 완충액(완충액 A + 프로테아제 저해물질 칵테일)에 재부유시켰다.
완충액 A:(1 ℓ)
50mM NaH2PO4 6.9 g NaH2PO4H2O(또는 6 g NaH2PO4)
300mM NaCl 17.54 g NaCl
10mM 이미다졸 0.68 g 이미다졸(MW 68.08)
NaOH를 이용하여 pH를 8.0으로 조정한다.
용해 완충액:
25 ㎖의 완충액 A를 완전 프로테아제 저해물질 칵테일(Roche, Basel, Switzerland)의 한가지 정제와 혼합한다.
재부유된 세포는 50㎖ 원뿔형 튜브로 이전하고, 혼합물이 작은 방울(용해에 기인함)로서 뭉쳐 이동할 때까지 튜브를 수회 뒤집음으로써 100 ㎕ 100 ㎎/㎖ 라이소자임(Iysozyme)으로 용해시켰다. 세포는 얼음 위에서 초음파처리하고, 이후 10 ㎕ DNase I(대략 1000 unit)를 첨가하고 4℃에서 30분간 부드럽게 흔들었다. 잔해는 50 ㎖ 원심분리기 튜브를 이용하여 4℃에서 30분간 12000 x g로 원심분리하여 펠릿으로 뭉쳤다. 상층액은 새로운 원뿔형 튜브로 이전하고 4℃에서 보관하였다.
제조업자의 프로토콜에 따라 Ni-NT 아가로즈(Qiagen, Valencis, CA)를 이용하여 가용성 Fab를 정제하였다. 용해질(Iysate)은 Ni-NTA와 혼합하고 칼럼에 적하하였다. SDS-PAGE 분석을 위하여 통과물(flow through)을 수집하였다. 칼럼은 20 ㎖ 완충액(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 15mM 이미다졸, NaOH로 pH를 8.0으로 조정한다)으로 세척하고, 이후 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸을 함유하는 20 ㎖ 세척액으로 세척하였다. Fab는 6 x 500 ㎕ 용리 완충액(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 450mM 이미다졸, NaOH로 pH를 8.0으로 조정한다)으로 용리하고 SDS PAGE로 분석하였다. 칼럼 분획물은 4℃에서 보관하였다. 칼럼 분획물은 SDS-PAGE로 분석하고, 최대량의 Fab를 포함하는 분획물은 선별하고 4℃에서 PBS에 투석하였다.
실시예 8
가용성 수용체 검사
ELISA에 적합한 96 웰 검사 평판은 4-8℃에서 12시간동안, 0.05 ㎖ 0.5 ㎍/㎖ FcεRI 알파-사슬 수용체 코팅 완충액(50 mM 탄산염/중탄산염, pH 9.6)으로 코팅하였다. 웰은 흡입하고 250 ㎕ 차단 완충액(PBS, 1% BSA, pH 7.2)을 첨가하며 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 별도의 검사 평판에서, 이들 샘플과 참고 TES-C21 MAb는 검사 완충액(0.5% BSA, 0.05% Tween 20, PBS, pH 7.2)을 이용한 1:4 희석으 로 200 내지 0.001 ㎍/㎖로 적정하고 동등량의 100 ng/㎖ 비오틴화된 IgE를 첨가하며, 평판은 25℃에서 2-3시간동안 배양하였다. FcεRI-코팅된 웰은 PBS와 0.05% TWEEN 20으로 3회 세척하고 샘플 웰로부터 50 ㎕를 이전하며 교반하면서 25℃에서 30분간 배양하였다. 검사 완충액에서 1:2000 희석된 50 ㎕/웰의 1 ㎎/㎖ 스트렙타비딘-HRP는 교반하면서 30분간 배양하고, 이후 상기한 바와 같이 평판을 세척하였다. 50 ㎕/웰의 TMB 기질을 첨가하고 발색시켰다. 동등량의 0.2 M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 9
IgE-적하된 FcεRI에 항체의 결합
FcεRI의 알파-소단위와 결합된 인간 IgE에 항체 결합은 4℃에서 30분간 10 ㎍/㎖ 인간 IgE와 함께 선배양함으로써 결정하였다. 평판은 3회 세척하고, 이후 가변 농도의 뮤린 항-인간 IgE MAb E-10-10 또는 인간화 Fab 변이체와 함께 1시간동안 배양하였다. Fab의 결합은 비오틴 표지된 항-인간 Fd 항체와 SA-HRP로 순차적으로 탐지하였다. 뮤린 MAb E-10-10은 염소 항-뮤린 Ig Fc HRP-공액된 Ab로 탐지하였다.
실시예 10
클론 특성화
각 후보는 결합 친화성을 분석하고, 양성 클론은 염기서열분석하였다. 결합 친화성을 증가시키는 CDR 영역에서 유익한 돌연변이를 보유하는 항체 변이체는 더 욱 특성화시켰다. 검사에는 Biacore 분석; IgE의 수용체에 대한 결합의 저해; 수용체 결합된 IgE의 가교 결합이 포함되었다.
변이체 라이브러리를 만들었다. 향상된 친화성을 보이는 다양한 CDR의 아미노산 서열은 표 1에 제시한다. 도 7에서는 치환의 조합을 보유하는 고 친화성 후보를 도시한다.
Figure 112006062957379-PCT00001
19개의 중쇄 변이체는 도 9에 도시하고, 35개의 경쇄 변이체는 도 8에 도시한다. 3개의 후보는 결합 친화성에 대하여 더욱 특성화시켰는데, 이들은 표 2에 제시한다.
결합 친화성
Mab KD 결합 친화성의 증가(fold)
TES-C21 614±200 pM
MAb 1(CL-5A) 0.158 pM 3886
MAb 2(CL-2C) 1.47±0.5 pM 417
MAb 3(CL-5I) 3.2±2.2 pM 191
실시예 11
항-IgE 항체의 발현과 정제 및 HRP-공액
고 친화성 MAb 항체를 생산하였다. 원형 항-IgE MAb의 생산을 위하여, 중쇄와 경쇄 가변 영역은 파지 벡터 주형으로부터 PCR 증폭하고, CMV 프로모터의 발현하에 H-사슬과 L-사슬 발현 벡터에 개별적으로 서브클론하였다. 6개의 완전 항체 클론을 작제하였다(도 10A-F). 적절한 중쇄와 경쇄 플라스미드는 당분야에 널리 공지된 기술로 전기천공(electroporation)을 이용하여 생쥐 골수종 세포주 NSO에 동시-형질감염시켰다(참조: Liou et al. J Immunol. 143(12):3967-75(1989)). 항체는 단백질 A-세파로즈(Pharmacia)를 이용하여 단일 안정성 세포주 상층액으로부터 정제하였다. 항체의 농도는 280nm에서 분광광도계(spectrophotometer) 및 FCA 검사법(IDEXX)을 이용하여 결정하였다.
정제된 항체는 제조업자의 프로토콜에 따라 과산화효소 공액 키트(Zymed Labs, San Francisco, CA)를 이용하여 양고추냉이 과산화효소(HRP)로 공액하였다. 각 공액된 항-IgE MAb의 역가는 단클론 인간 IgE(SE44)로 코팅된 평판으로 ELISA를 이용하여 결정하였다.
아래의 배양물은 American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas Va. 201 10-2209 USA(ATCC)에 기탁되었다:
하이브리도마 ATCC NO. 수탁일
항-IgE CL-2C PTA-5678 December 3, 2003
항-IgE CL-5A PTA-5679 December 3, 2003
항-IgE CL-51 PTA-5680 December 3, 2003
기탁은 특허절차상 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder)하에 실행되었다. 이는 수탁일로부터 30년간 생존 배양물의 유지를 보증한다. 미생물은 유관한 U.S. 특허 공보의 발행이후 일반 대중에게 배양물 자손의 영구적이고 무제한적인 이용가능성을 보증하는 부다페스트 조약 규정하에 ATCC로부터 입수가능하다. 본 발명의 출원인은 기탁 배양물이 적절한 조건하에 배양되는 과정에서 사멸하거나 상실되거나 파괴되면, 통지를 받은 즉시 동일 배양물의 생존 견본으로 이를 대체한다는데 합의하였다. 기탁된 균주의 이용가능성은 임의의 정부 기관에 의해 이의 특허법에 따라 허가된 권리에 반하여 본 발명을 실시할 수 있는 승낙으로 간주되지 않는다.
상기한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있을 만큼 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 배양물에 국한되지 않는데, 그 이유는 이들 기탁된 구체예가 본 발명의 한 측면을 예시하고, 기능적으로 등가인 임의의 배양물이 본 발명의 범위에 속하기 때문이다. 본 발명에서 물질의 기탁은 본 발명의 명세서가 최적 양식을 비롯한 본 발명의 임의 측면을 실시할 만큼 충분하지 않다거나, 또는 특허청구범위가 본 발명의 명세서가 나타내는 특정 실례로 제한될 수 있음을 인정하는 것으로 간주되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 도시되고 기술된 것들 이외에 본 발명의 다양한 개변이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하고 첨부된 특허청구범위의 범위에 속한다.
실시예 12
인간 IgE의 고 친화성 결합 에피토프의 유전자지도작성
A. 펩티드 합성과 항-IgE 결합 검사
IgE는 CH3 도메인을 통하여 수용체에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 HA 항-IgE 항체는 IgE가 이의 수용체에 결합하는 것을 매우 효과적으로 차단하기 때문에, 전체 CH3 도메인을 포괄하는 펩티드를 이용하여 에피토프의 유전자지도를 작성하였다. 먼저, 2개의 V5-표식된 펩티드를 준비하였는데, 한 펩티드는 인간 IgE의 완전 불변 영역을 포함하고, 다른 펩티드는 인간 IgE의 CH2-CH3 영역만을 포함하였다. 이들 2개의 펩티드는 시험관내 전사-번역으로 발현시키고 웨스턴 블랏 검사(Western blot assay)에 이용하여 HA 항-IgE MAb 결합을 탐지하였다. CL-2C와 CL-5I MAb 모두 원형 인간 IgE 및 이들 펩티드에 결합할 수 있었다.
에피토프의 유전자지도를 더욱 구체적으로 작성하기 위하여, 전체 CH3 도메인을 보유하는 인간 IgE의 아미노산 잔기 141 내지 368을 포함하는 73개의 중복 펩티드를 합성하였다. 각 펩티드는 이전 펩티드의 3' 말단과 3개의 아미노산 오버랩을 보유하는 12개의 아미노산 잔기로 구성되었다. 셀룰로오스 막에서 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 아미노산으로 SPOT 막을 합성하였다. 이들 막은 메탄올에서 깨끗이 씻고, 이후 10분간 TBS(pH 7.5) 3X에서 세척하였다. 차단 용액(TBS에서 5% 우유 또는 3% BSA)에서 하룻밤동안 배양한 이후, 차단 용액에서 희석된 HRP-표지된 항-IgE MAb는 막과 함께 3시간동안 배양하였다. SuperSignal HRP 기질(Pierce)을 이용하여 TBS-TWEEN에서 15분간 3X 세척한 이후, 원하는 시간동안 BioMax MS 필름(Kodak)의 화학발광 노출로 IgE 반응성(IgE reactivity)을 측정하였다.
본 실험으로부터 결과는 HA 항-IgE MAb가 IgE의 CH3 부분에서 2개의 영역에 결합한다는 것을 지시하는데, 이는 아래의 2개의 펩티드 서열로 대표된다: NPRGVSAYLSRP(에피토프 "A")과 HPHLPRALMRST(에피토프 "B")(도 12). 에피토프 A에 대한 결합은 에피토프 B에 대한 결합보다 수배 약하였다.
B. 알라닌 스캔 돌연변이유발
이들 펩티드에서 아미노산의 IgG1에서 발견되는 아미노산으로 치환과 함께 알라닌 스캔을 수행하여 어떤 아미노산이 이들 펩티드에 대한 HA 항-IgE MAb의 결합에 결정적으로 관여하는 지를 결정하였다. HA 항-IgE MAb 결합에 중요한 것으로 확인된 아미노산은 IgE의 ε 사슬에서 시험관내 돌연변이유발 전략을 이용하여 교체하였다. Cε2와 Cε3 영역에 걸쳐있는 기존의 다른 펩티드 역시 본 연구에 이용하였다(도 13과 14).
인간 IgE 아미노산 잔기에 대한 EU 넘버링 전략(numbering scheme)을 이용하였다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 IgE의 전체 Fc 영역 및 CH2-CH3 도메인만을 보유하는 IgE Fc의 절두된 형태를 증폭하였다. DNA 산물은 TOPO 클로닝(Invitrogene, Carlsbad, CA)을 이용하여 pcDNA3 발현 벡터(Invitrogene, Carlsbad, CA)에 직접적으로 클론하였다.
IgE-Fc에서 돌연변이유발은 중복 PCR(Ho et al., 1989)을 이용하여 수행하였다. DNA 산물은 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하고 적절한 제한 효소로 절단하며 pcDNA3 발현 벡터에 서브클론하였다. 각 변이 구조체에서, PCR 증폭된 영역은 DNA의 양 가닥으로부터 디데옥시뉴클레오티드 방법을 이용하여 완전하게 염기서열분석하였다. 재조합 인간 IgE Fc와 이의 변이체는 망상적혈구 용해질 기초된 시험관내 전사와 번역 결합 시스템(Promega, Madison, Wl)을 이용하여 발현시켰다.
상기 시험관내 전사와 번역 결합 시스템(10 ㎕ 반응 혼합물)으로부터 용해질은 SDS-PAGE(12%)를 수행하고, 이후 니트로셀룰로오스 막으로 이전하였다. 막은 Tris-완충액(TBS)에 녹인 5% 건유로 차단하고, 이후 일차 항체, 항-IgE MAb로 염색하였다. 특정 반응성 밴드는 양고추냉이 과산화효소(Jackson Labs, Bar Harbor, Maine)에 공액된 염소 항-인간 IgG Fc를 이용하여 탐지하고, 면역반응성 밴드는 SuperSignal Western blotting 탐지 키트(Pierce)로 가시화시켰다. 항-V5 항체는 이들 펩티드의 C-말단에 도입된 V5 태그를 탐지하는 양성 대조로서 이용하였다. 항-V5 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로, 이들 모든 펩티드가 거의 동등한 수준으로 발현된다는 것을 확인하였다. 흥미롭게도, HA 항-IgE MAb는 에피토프 'A'에서 돌연변이를 보유하는 펩티드에 결합할 수 있지만 에피토프 'B'에서 돌연변이를 보유하는 펩티드에 결합하지 않았는데, 이는 상기 두 번째 부위가 결합에 더욱 중요하다는 것을 암시한다(도 15).
실시예 13
에피토프 B의 면역원성 펩티드를 이용한 유전자도입 생쥐의 활성 면역화
인간 IgE를 구조적으로 발현하는 유전자도입 생쥐를 이용하여 에피토프 B의 인간 면역원성 펩티드에 대한 항체의 활성 생산을 입증하였다. 각각 본 발명의 면역원성 펩티드, 시스테인 잔기, KLH를 포함하는 2가지 융합 펩티드를 화학적으로 합성하였다. 펩티드 1의 서열은 아래와 같다:
(KLH-Cys) - Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr;
펩티드 2의 서열은 아래와 같다:
Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr-(Cys-KLH)
이들 유전자도입 생쥐는 200 ㎕의 PBS(pH 7.4)에서 완전 Freund 어쥬번트(Difco Laboratories, Detroit, MI)에 담긴 20 ㎍의 면역원성 펩티드를 피하 주입하였다. 2주 간격으로, 이들 생쥐는 불완전 Freund 어쥬번트에 담긴 20 ㎍의 펩티드 면역원을 2회 피하 주입하였다. 2주후, 희생 3일전에, 이들 생쥐는 PBS에 담긴 20 ㎍의 동일 면역원을 다시 복강내 주입하였다. 혈청을 수집하고, 에피토프 B에 특이적인 항-IgE 항체의 존재를 검사하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, 상기 펩티드는 이들 유전자도입 생쥐에서 항-IgE 항체를 유도하였다.
당업자는 통상적인 실험을 이용하여, 본 명세서에 기술된 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있다. 이들 등가물은 아래의 특허청구범위에 포섭된다.
SEQUENCE LISTING <110> TANOX, INC. SINGH, Sanjaya HUANG, Danyang FUNG, Sek Chung <120> Identification of Unique, High Affinity IgE Epitopes <130> TNX-1030 <150> PCT/US04/02892 <151> 2004-02-02 <150> PCT/US04/02894 <151> 2004-02-02 <150> US60/444,229 <151> 2003-02-01 <160> 77 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Murine <220> <221> misc_feature <223> TES-C21 LIGHT CHAIN <400> 1 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Asn Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Human <220> <221> misc_feature <223> L16/-JK4 human light chain consensus sequence template <400> 2 Glu 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Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 61 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-2C <400> 61 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 62 <211> 123 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-2C <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Trp Tyr 20 25 30 Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-5I <400> 63 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 64 <211> 123 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-5I <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr 20 25 30 Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-5A <400> 65 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 66 <211> 123 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-5A <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Trp Tyr 20 25 30 Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Glu Pro Gly Thr Glu Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-2B <400> 67 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 68 <211> 123 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-2B <400> 68 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-1136-2C <400> 69 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 70 <211> 123 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-1136-2C <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr 20 25 30 Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 71 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro 1 5 10 15 Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val 20 25 30 Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala 35 40 45 Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg 50 55 60 Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp 65 70 75 80 Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu 85 90 95 Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser 100 105 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 72 Asn Pro Arg Gly Val Ser Xaa Tyr Xaa Xaa Arg Xaa 1 5 10 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE <400> 73 Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro 1 5 10 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 74 Leu Pro Arg Ala Leu Xaa Arg Ser Xaa 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE <400> 75 Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr 1 5 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE <400> 76 His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr 1 5 10 <210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE <400> 77 Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr 1 5 10

Claims (25)

  1. 항-IgE 에피토프로서 이용하기 적합한 분리된 펩티드에 있어서, 아래의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:
    Asn Pro Arg Gly Val Ser Xaa1 Tyr Leu Xaa2 Arg Pro(SEQ ID NO 72),
    여기서, Xaa1은 Ala 또는 Val이고;
    Xaa2는 Ser, Ala 또는 Phe이다.
  2. 제 1항에 있어서, 아미노산 서열은
    Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro(SEQ ID NO 73)인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  3. 항-IgE 에피토프로서 이용하기 적합한 분리된 펩티드에 있어서, 아래의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:
    Leu Pro Arg Ala Leu Xaa1 Arg Ser Xaa2(SEQ ID NO 74),
    여기서 Xaa1은 Met, Ala 또는 Glu이고;
    Xaa2는 Thr, Ala 또는 Ile이다.
  4. 제 3항에 있어서, 아미노산 서열은
    a) Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(SEQ ID NO 75);
    b) His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(SEQ ID NO 76); 또는
    c) Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr(SEQ ID NO 77)인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  5. 제 1항 또는 3항에 있어서, 면역원성 서열에 융합되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  6. 제 5항에 있어서, 면역원성 서열은 BSA, KLH, 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  7. 포유동물에서 IgE에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 제약학적 조성물에 있어서, 활성 성분으로서 제 1항 또는 3항의 펩티드 및 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 안정제 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 면역원성 담체를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 면역원성 담체는 BSA, KLH, 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  10. 제 1항 또는 3항의 펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
  11. 제 10항에 있어서, 항체는 하이브리도마의 항-IgE CL-5A(ATTC No: PTA-5679), 항-IgE CL-2C(ATTC No: PTA-5678) 또는 항-IgE CL-5I(ATTC No: PTA-5680)를 배양함으로써 수득되는 CL-5A, CL-2C 또는 CL-5I인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  12. 제 10항에 있어서, SEQ ID NO 5 내지 13에서 선택되는 적어도 한가지 서열을 보유하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  13. 제 10항에 있어서, SEQ ID NO 14 내지 29에서 선택되는 적어도 한가지 서열을 보유하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  14. 제 10항에 있어서, SEQ ID NO 5 내지 13에서 선택되는 적어도 한가지 서열을 보유하는 경쇄 및 SEQ ID NO 14 내지 29에서 선택되는 적어도 한가지 서열을 보유하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  15. 제 10항에 있어서, SEQ ID NO 5, 8, 13, 15, 18, 26을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  16. 제 10항에 있어서, 항체는
    a) 키메라 항체;
    b) 단일 사슬 항체;
    c) Fab 단편;
    d) F(ab') 단편;
    e) 인간 항체; 또는
    f) 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  17. 제 10항에 있어서, 항체는 Fab 발현 라이브러리(expression library)를 스크리닝함으로써 분리되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  18. 제 10항에 있어서, 항체는 조합 면역글로불린 라이브러리(combinatorial immunoglobulin library)를 스크리닝함으로써 분리되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  19. 제 10항에 있어서, 라벨(label)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항 체.
  20. 제 10항의 항체를 포함하는 키트.
  21. 알레르기, 천식, 알레르기 비염, 아토피성 피부염, 두드러기 또는 습진이 발병했거나 발병할 위험이 높은 포유동물을 치료하는 약물의 제조를 위한 제약학적 조성물에 있어서, 활성 성분으로서 제 10항의 항체 및 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 안정제 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  22. 항체를 제조하는 방법에 있어서,
    a) 항체 반응을 유도하는 조건하에 제 1항 또는 3항의 펩티드로 비-인간 동물을 면역하고;
    b) 비-인간 동물로부터 항체를 분리하고;
    c) 제 1항 내지 4항중 어느 한 항에 따른 펩티드에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하는 항체를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항의 방법으로 수득되는 항체.
  24. 단클론 항체를 제조하는 방법에 있어서,
    a) 항체 반응을 유도하는 조건하에 제 1항 또는 3항의 펩티드로 비-인간 동 물을 면역하고;
    b) 비-인간 동물로부터 항체 생산 세포를 분리하고;
    c) 상기 항체 생산 세포를 영속화 세포와 융합하여 단클론 항체-생산 하이브리도마 세포를 형성하고;
    d) 상기 하이브리도마 세포를 배양하고;
    e) 제 1항 내지 4항중 어느 한 항에 따른 펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 배양액으로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항의 방법으로 수득되는 단클론 항체.
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