CN101883862A - 抗体制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗体制备方法，包括：将含免疫用细胞的组织在含抗原和刺激物的培养液中体外免疫的步骤；筛选所述经免疫的细胞的步骤；及从筛选出的免疫细胞获得抗体的步骤。按照这种抗体制备方法可在短时间内大量制备抗体，继而能够为免疫学检查的普及做贡献。

Description

抗体制备方法
技术领域
本发明涉及抗体制备方法。
背景技术
众所周知，在疾病诊断、治疗方面，弄清生物体防御机能、尤其是其核心免疫机能，正逐渐成为重要课题。例如，在诊断除癌症、糖尿病等生活习惯病以外的其他各种疾病时使用的各种方法中，提出了能像可目视检测与疾病密切相关的标记物的浓度、量的免疫胶体层析法一样可更简便诊断的方法，研究用试剂、诊断用试剂、各种物质监测用试剂、免疫学诊断、治疗领域被进一步扩大，但所述方法中抗体的稳定确保将在今后变得越来越重要。另外，开发出了利用噬菌体展示系统的抗体库制备技术，分离人抗体也成为可能。
另外，制备免疫学测定中必要的单克隆抗体时，首先要向小鼠中注射抗原(免疫)，此步骤需要约3个月。之后提取产生抗体的B细胞群，与骨髓瘤细胞进行细胞融合。通过此步骤构建出可无限增殖的抗体产生细胞(杂交瘤)群。最后从该杂交瘤细胞群中筛选能产生目的抗体的细胞(克隆)，用该细胞进行抗体的大量制备。此克隆步骤中，需要稀释杂交瘤细胞群，使1孔只含1个细胞的状态，从1细胞开始进行培养。使其增殖到可进行抗体性质研究的细胞浓度，再对所得单克隆抗体的性质进行检查。对呈阳性的孔再次进行稀释，进行与上述相同的检查。重复实施该操作几次，便分离得到耐用的杂交瘤细胞。此步骤1个周期需要约2周，也有整体需要3个月以上的情况。上述制备单克隆抗体的方法费时费力，且需要依赖专业人员，制备抗体成本高昂。
这里例举公知文献对抗体制备方法进行具体说明，特开平10-282097号公报中记载了对以佐剂物质、细胞因子的组合为特征的抗原的特异性免疫方法。特开2004-121237号公报中记载了如下制备特异性抗体的方法，其特征是，按照诱导抗体产生应答的方法，将诱导出抗原特异性抗体的产生应答的末梢血淋巴细胞通过EB病毒永生化，分离抗原特异性B细胞，制备产生抗原特异性抗体的B细胞，及进一步培养上述B细胞。特开2006-180708号公报中记载了如下抗体制备方法，其包括：将经标记抗原与靶细胞结合的步骤、分离经标记靶细胞的步骤、制备抗体基因步骤、用表达载体表达抗体基因的步骤。此外，特表2006-516408号公报中记载了经过一系列步骤，由目的抗体制备人源化高亲和力抗体的方法。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种新的抗体制备方法，其比以往费时费力的抗体制备方法用时更短，制备更容易。
本发明基于这些新抗体制备方法，以实现在作为肾癌标记物而被广泛关注的S100A10蛋白免疫学测定、治疗中有效的抗体制备方法为目的。S100A10蛋白如高山达也等，肾癌细胞中S100A10蛋白的特异性表达，肾癌研究会会报，28：9-10，2005中所述，可作为肾癌标记物使用，由于该标记物也可从尿成分中获得，因此在简便诊断肾癌中应用价值很高。
为达成这些目的，本发明提供一种抗体制备方法，包括：将含免疫用细胞的组织在含抗原和刺激物的培养液中体外免疫的步骤；筛选所述经免疫的细胞的步骤；及从筛选出的免疫细胞获得抗体的步骤。
即本发明使用所谓体外免疫法，在添加了特定刺激物的培养液中得到由抗原所致的致敏免疫细胞，能够实现用通常所需时间的几十分之一的时间来制备抗体。
更详细而言，首先，如果异物(抗原)进入体内，则巨噬细胞、树突状细胞将其摄入细胞中。异物在细胞内分解，将分解产物呈递到细胞膜表面。接着幼稚T细胞靠近分解产物，通过幼稚T细胞表面的T细胞受体(TCR)识别抗原，经此过程活化T细胞，成为辅助T细胞(Th2)。
另一方面，B细胞也是通过将侵入体内的异物(抗原)用细胞表面上的B细胞受体(BCR)识别而摄入细胞内。被摄入的抗原被快速分解，分解产物被呈递到II类MHC分子上。此时，被称为CD40的分子也同时在细胞膜表面表达。
通过上述方法可使Th2和抗原呈递B细胞靠近，相互识别，开始活化B细胞及抗体的类别转换。此时，未发现不是用相同抗原活化的分子则发生的现象。
其中，上述情况中的免疫反应虽然在体内实施，但使所述免疫反应在体外发生的方法是所谓的体外免疫法。
本发明为了在体外得到期望的抗体产生细胞而添加刺激物，而将B细胞分化诱导成抗体产生细胞(浆细胞)或记忆B细胞。这里的所谓刺激物只要可与在免疫活性细胞(如B细胞、树突状细胞、T细胞等)的膜表面表达的受体分子相互作用，则无特定限制。在本发明的实施中，尤其作为针对细胞因子受体的刺激物，可举例：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-21；作为针对表面抗原的刺激物可举例：TGF-β(转化生长因子-β)、BAFF(B细胞活化因子)、APRIL(A增值-诱导配体)、CD40配体、CD38配体、BCDF(B细胞分化因子)、BCAF(B细胞活化因子)；作为针对信号转导相关受体的刺激物，可举例：LPS(脂多糖)等。刺激物的使用浓度，虽然随着所免疫细胞的浓度而变化，但是LPS优选10ng/mL～500μg/mL的浓度，特别推荐20～80μg/mL的浓度。另外，LPS以外的物质，一般优选为1ng/mL～50μg/mL的浓度，特别推荐为10ng/mL～40ng/mL的浓度。另外，可为代替这些物质的功能的激动剂抗体。在该诱导分化过程中，特别通过IL-4、IL-5、抗-CD38抗体、抗-CD40抗体刺激来诱导抗体的亲和力成熟及类别转换，成为亲和力更高的抗体。
另外通过利用使用像FACScan这样的基于流式细胞术等的细胞分离装置来对目的细胞染色筛选的方法进行致敏免疫细胞的检测及分离。
作为本发明中使用的筛选及检测免疫细胞用染色剂，并没有特定限制。例如作为染色剂可使用台盼蓝来检测增殖、生存中的B细胞，而其他的，在流式细胞术中使用的用FITC或PE等荧光物质标记的抗原或抗体，特别是检测细胞内钙浓度的Fura-2这样的荧光探针或给细胞内DNA染色的溴化乙锭为代表的DNA染色剂等，只要能够给目的免疫细胞染色，都可适当使用。
而筛选发生类别转换或亲和力成熟的细胞时，可适当使用与上述染色剂同样的染色剂。
检测、筛选被染色细胞的方法，除例如流式细胞仪等细胞分离装置以外，还可适当利用例如血细胞计数器等血细胞计数板、电泳装置、离心装置、磁珠装置、微型电路装置等。
另外，将分离出的细胞与骨髓瘤细胞融合而得到杂交瘤也可，但也不一定非要得到杂交瘤。
此外，本发明构成如下：需从组织上筛选用于得到抗体基因的细胞，并通过体外免疫步骤来筛选免疫细胞，并由这些免疫细胞通过PCR方法形成抗体基因，再将其导入宿主细胞培养表达，进而大量制备抗体，通过该方法，可从组织片得到免疫后的细胞，从而可谋求作业效率的提高。
从该细胞中得到的抗体基因通过PCR(聚合酶链式反应)法扩增，再由大肠杆菌等宿主细胞，优选与经克隆化而获得抗体的步骤组合，可在短时间内制备大量抗体。作为宿主细胞，除大肠杆菌外，可举例：链霉菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、CHO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。
另外，作为表达载体，只要是能在宿主细胞中表达的载体，就没有特定限制。作为表达载体，可举例：源于细菌质粒、源于酵母质粒、染色体、游离基因、源于病毒、源于逆转转病毒的载体等。
如上所述课题以外，本发明人还研究了“即便在体外筛选得到免疫细胞，难道就不能无需作为至筛选的准备的杂交瘤形成步骤而可分离抗体基因”这样的课题。
本发明人得出，在采用体外免疫方法时，可通过添加一定的刺激物来实现向记忆B细胞或浆细胞的分化诱导，及被人为在这个过程中发生的抗体亲和力成熟、类别转换，从而完成本发明。
以前，制备高亲和力抗体主要是，在体内，通过抗原反复免疫，进行向记忆B细胞或浆细胞的分化诱导，并利用被人为在此过程中发生的抗体亲和力成熟、类别转换。从分化诱导出的免疫细胞形成杂交瘤，通过进行筛选来获得高亲和力抗体。另一方面，在体外，构建利用PCR的随机突变导入法等向从杂交瘤或市售的库(library)中得到的抗体基因中导入各种突变的库，再插入嗜菌粒载体，通过淘选法，筛选强抗体。
但是，本发明人认为，即便在特定环境下体外供给特定的刺激物，向记忆B细胞或浆细胞的分化诱导及被人为在此过程中可发生的抗体亲和力成熟、类别转换也可能。而且，由于导入刺激物可使B细胞向记忆B细胞、浆细胞分化诱导，因此体外免疫中的该方法一改以往只有通过脾细胞本身或B细胞和T细胞共培养状态下才能免疫的方法，使得用仅B细胞也能进行免疫，抗原也与以往的体外免疫法一样，与体内免疫相比约1/1000～1/10000少量也可能。
而本发明中使用的刺激物可诱导与亲和力成熟或抗体类别转换相关的蛋白表达，其结果实现了从抗体的IgM向IgG的迅速且确定的类别转换。
重点是，本发明所谓体外免疫法为以下方法，通过在向研磨组织片得到的细胞添加了特定刺激物的培养液中得到进行抗原致敏的免疫细胞，从而可在通常对免疫动物进行免疫所需时间的几十分之一的时间内实现。
在上述本发明的抗体制备方法的实施中，可按已经说明的方法有利实施在体内及体外发生免疫反应的方法。
以下对本发明的体外免疫方法中各种刺激物和各种分化、诱导等的关系进行说明。
本发明中所示抗原可在制备免疫用组织片后立即的一次而充分，也可设置2～3日的间隔而进行多次，没有限制。另外，此时的抗原浓度优选1pmol～1mmol，例如可例示1nmol。
可为达到辅助抗原刺激的目的而添加以LPS为代表的刺激TLR(Toll样受体)的物质。该刺激物添加优选在抗原刺激时进行，添加量优选为10ng/mL～500μg/mL较优，尤其优选20～80μg/mL。
此外，本发明所示作为向记忆B细胞或浆细胞分化诱导及被人为在此过程中发生的抗体亲和力成熟、类别转换的诱导用刺激物只要是上述刺激物则没有特定限制，但特别优选IL-4、IL-5、抗-CD38抗体、抗-CD40抗体。添加浓度为，IL-4、IL-5优选1ng/mL～50μg/mL的浓度，特别优选10ng/mL～40ng/mL；抗-CD38抗体、抗-CD40抗体优选1ng/mL～50μg/mL的浓度，特别优选100ng/mL～10μg/mL。该刺激物的添加优选在抗原刺激时进行。
作为构成本发明中体外进行的免疫用组织片的细胞，除例如上述细胞以外，还可例示例如：源于小鼠、大鼠、豚鼠、兔等免疫动物的器官、组织中得到的细胞，分化调节iPS细胞、ES细胞的免疫活性细胞，分化调节培养细胞株的免疫活性细胞等。
本发明中所用抗原可举例：h(人)S100A10、he(鸡)EL、h(人)Ras、h(人)rap74、h(人)TOPO2B、b(牛)SA、b(牛)酪蛋白等源于小鼠以外的蛋白；源于小鼠的m(小鼠)S100A10、mSA、mMapk1等蛋白；肽(四种：7聚体、10聚体、16聚体、20聚体)等。另外，在本发明的实施中，可使用以前得到抗体时不能使用的小分子化合物(若丹明等荧光物质、FITC)。
本发明根据目的体外导入刺激物，不以T细胞为必要，通过将B细胞向抗体产生细胞分化诱导的步骤，除可利用小分子抗原以外，可得到可获得类别转换所致的优选抗体，亲和力成熟所致的抗体的免疫细胞。
此外，如上所述，用FACScan这样的基于流式细胞术等的细胞分离装置，利用染色筛选目的细胞的方法检测和分离致敏免疫细胞。
此外，得到的免疫细胞的大小与其他细胞相比要大，当进一步时亲和度成熟的情况下，细胞的大小会变得更大，因此，也可根据细胞的大小来进行筛选。另外，作为根据所述细胞大小进行筛选的方法，可适当使用例如：特开2007-175684号公报等中记载的方法。
对在本发明中筛选、检测免疫细胞时使用的染色剂已进行说明。而在筛选发生类别转换、亲和力成熟的细胞时，如上所述，也可适当使用相同的染色剂。
此外，如上所述，本发明构成如下：通过体外免疫步骤将用于得到抗体基因的细胞从组织上筛选免疫细胞，由所述免疫细胞通过PCR法形成抗体基因，将其导入宿主细胞培养表达，从而大量制备抗体，通过该方法可从组织片上获得免疫后的细胞，从而可谋求作业效率的提高。在这里，即使不筛选免疫细胞而分离组织片细胞的基因，也由于用于PCR的引物是抗体基因特异性引物，因此也可获得仅目的基因，和筛选免疫细胞的情况一样，也可采用提取抗体基因的方法。
如上所述，从该细胞得到的抗体基因通过PCR法增幅，并通过大肠杆菌等宿主细胞，优选与经克隆化而得到抗体步骤组合，从而可在短时间内制备大量抗体。能够使用的宿主细胞及表达载体如前所述。
作为在本发明中的抗体筛选方法，可举例：在噬菌体或大肠杆菌、酵母、动物细胞等的表面表达抗体的方法；如使用酵母、大肠杆菌等双杂交法、IVV法、核糖体展示法的呈递DNA或mRNA的方法；利用表面等离子体共振的BIACORE法、ELISA法、蛋白印迹法、通过在磁球上固定抗体或抗原，再通过磁力进行筛选(MACS)的方法等。所述筛选方法只要能够研究蛋白质间相互作用，就没有特定限制。
根据本发明，如可从以下详细说明知道，可在短时间内分离、获得目的免疫细胞，并且，能够根据基因组学等方法制备抗体，从而迅速生产及获得抗体。该免疫细胞特别适合于筛选等。
附图简述
图1A为示制备出的总RNA电泳照片、图1B为其说明图。
图2A为示制备出的cDNA电泳照片、图2B为其说明图。
图3A为示制备出的scFv PCR产物的电泳照片、图3B为其说明图。
图4A为示制备出的大肠杆菌克隆的电泳照片、图4B为其说明图。
图5A为示通过SDS-PAGE法分析纯化的MBP-scFv蛋白质的图、图5B为其说明图。
图6为示抗原与IgG1阳性率的关系的坐标图。
图7为示标记物基因与mRNA表达量的关系的坐标图。
图8为将细胞因子的细胞毒性实验结果作为刺激物与比增殖率的关系的显示的坐标图。
图9A及图9B为分别示刺激物与比增殖率的关系的坐标图。
图10A，图10B，图10C和图10D分别为示测定单独刺激时的Blimp-1表达量、Xbp-1表达量、Bc1-6表达量及AID表达量的结果的坐标图。
图11A及图11B分别为示测定复合刺激、浆细胞分化时的Blimp-1表达量及Xbp-1表达量的结果的坐标图。
图12A及图12B分别为示测定复合刺激、体细胞变异时的Bc1-6表达量及AID表达量的结果的坐标图。
图13为示测定复合刺激、浆细胞分化时的Blimp-1表达量的结果的坐标图。
图14为示测定复合刺激、浆细胞分化时的Xbp-1表达量的结果的坐标图。
图15为示测定复合刺激、体细胞变异时的Bc1-6表达量的结果的坐标图。
图16为示测定复合刺激、体细胞变异时的AID表达量的结果的坐标图。
图17A及图17B分别为示用1nmol抗原及0.1nmol抗原进行免疫时细胞因子浓度的上限及下限的标记物表达量的坐标图。
图18A及图18B分别为将B细胞分化的研究结果以脾细胞中B细胞的比例及脾细胞中浆细胞的比例显示的坐标图。
图19A，图19B，图19C及图19D分别为将B细胞分化的研究结果以B细胞中T1-B细胞的比例、B细胞中T2-B细胞的比例、B细胞中B2细胞的比例及B细胞中活化的B细胞的比例显示的坐标图。
图20A，图20B，图20C及图20D分别为示研究B细胞分化时测定Blimp-1表达量、Xbp-1表达量、Bc1-6表达量及AID表达量的结果的坐标图。
图21示对脾细胞进行免疫操作获得的抗-鸡卵溶菌酶/MBP-scFv的ELISA结果，为检测抗原特异性，使用分别用β-酪蛋白、S100A2、S100A14、鸡卵溶菌酶包被的ELISA板进行比较的坐标图。
图22示对B细胞进行免疫操作获得的抗-鸡卵溶菌酶/MBP-scFv的ELISA结果，为检测抗原特异性，使用分别用β-酪蛋白、S100A2、S100A14、鸡卵溶菌酶包被的ELISA板进行比较的坐标图。
图23示抗-鸡卵溶菌酶/MBP-scFv/EGFP的ELISA结果，EGFP通过G1-接头及G5-接头与scFv融合，并且为检测抗原特异性，使用分别用β-酪蛋白、S100A2、S100A14、鸡卵溶菌酶包被的ELISA板进行比较的坐标图。
图24示抗-β-酪朊吗啡肽7/MBP-scFv、抗-血管紧张素I/MBP-scFv、抗-PTH/MBP-scFv的ELISA结果，并且为检测抗原特异性，使用分别用β-Cas7β-酪朊吗啡肽7(b-Cas7)，血管紧张素I(Ang I)，PTH包被的ELISA板进行比较的坐标图。
图25为示评价抗小鼠蛋白抗体的取得结果的吸光度(mAlbuminELISA)的结果的坐标图。
图26为示评价抗小鼠蛋白抗体的取得结果的阳性克隆出现率(mAlbumin阳性率)的结果的坐标图。
图27为示评价抗小鼠蛋白抗体的取得结果的吸光度(mS100A10ELISA 1nmol抗原)的结果的坐标图。
图28为示评价抗小鼠蛋白抗体的取得结果的吸光度(mS100A10ELISA 1nmol抗原)的结果的坐标图。
图29为示评价抗小鼠蛋白抗体的取得结果的阳性克隆出现率(mS100A10阳性率)的结果的坐标图。
图30为示抗小分子化合物抗体的取得的电泳照片。
实施方式
下面对本发明优选的实施方式进行说明。但值得注意的是，本发明并不限于下述特定的实施方式。
本发明从小鼠、大鼠等免疫用动物摘出器官，并从该器官中分离含有免疫细胞的细胞群，将其在含有刺激物的培养液中用抗原致敏，以得到免疫细胞。
该免疫细胞，采用FACScan等细胞分离装置、或其他根据细胞染色的筛选方法，从淋巴细胞中筛选如产生目的抗体的B细胞。可通过将筛选出的B细胞与骨髓瘤细胞融合使其永生化，形成杂交瘤，经克隆后得到抗体或抗体基因，但形成杂交瘤的步骤并不是必需的。
从筛选出的细胞或杂交瘤细胞中提取基因，通过PCR法获得H链、L链的基因，为了能在大肠杆菌中表达，而将其改变成单链抗体scFv，并使其质粒化后，再在大肠杆菌内表达来获得抗体；关于抗原，并不是特定的，但其中例如S100A10蛋白可用作可在以尿为检体使用的肾癌标记物，因此本发明适于作为制备免疫学诊断肾癌用抗体的方法。
【有关小鼠源人抗体的制备】
本发明中，可对小鼠源人抗体制备步骤进行进一步整合。以下示获得人抗体的步骤例。
1.使用免疫人源化小鼠源脾细胞的方法
有报导将小鼠脾细胞内的抗体基因全部置换为人源基因的免疫人源化小鼠。因为除抗体基因以外全部是小鼠源细胞，因此此次可直接使用体外免疫法进行免疫。通过该方法获得的抗体全部是人抗体。
2.进行抗体人源化的方法
由获得的基因确定抗体的氨基酸序列。将该氨基酸序列与人抗体氨基酸序列库进行比对。尤其要比较高变区(互补决定区)以外的抗体构架部分，从人抗体氨基酸序列库中筛选同源性(同一性)高的序列。向筛选出的构架序列中并入所得抗体基因的高变区，进行人源化。此阶段中抗体为人源化小鼠抗体。
对于全长人抗体，由获得的基因确定抗体的氨基酸序列。将该氨基酸序列与人抗体氨基酸序列库进行比对。比较包含高变区的抗体的全长，从人抗体氨基酸序列库中筛选同源性高的序列。将筛选出的序列在细胞中表达，则得到全长人抗体。将筛选出的序列的高变区通过基因工程学方法进行改变，即使与原序列完全相同，也可作为全长人抗体。
在此，如将本发明略示，则如下各项所述。
(1)抗体制备方法，包括：
●将含免疫用细胞的组织在含抗原和刺激物的培养液中体外免疫的步骤；
●筛选所述经免疫的细胞的步骤；及
●从筛选出的免疫细胞获得抗体的步骤。
(2)(1)的抗体制备方法，还包括以下步骤：
●通过PCR扩增方法，从所述免疫细胞得到扩增抗体基因后，由宿主细胞表达制备抗体或类抗体蛋白。
(3)(1)的抗体制备方法，其中所述组织是免疫用动物。
(4)(1)的抗体制备方法，其中所述筛选出的细胞是发生类别转换或亲和力成熟的细胞。
(5)(1)的抗体制备方法，其中所述经免疫细胞的筛选通过流式细胞术或染色进行。
(6)(1)的抗体制备方法，其中所述刺激物是刺激在免疫活性细胞上表达的细胞因子受体、表面抗原或信号转导相关受体的物质。
(7)(1)的抗体制备方法，其中所述抗原是肽。
(8)(1)的抗体制备方法，其中所述抗原是属于S100家族的蛋白，取得单链抗体scFv(单链可变片段)或抗体IgG1(免疫球蛋白G1)。
(9)(1)的抗体制备方法，其中所述抗原是S100A10蛋白，取得单链抗体scFv(单链可变片段)或抗体IgG1(免疫球蛋白G1)。
(10)(6)的抗体制备方法，其中所述刺激物是下列中的至少一种：
●针对细胞因子受体的刺激物：IL-4或IL-5；
●针对表面抗原的刺激物：抗-CD38抗体或抗-CD40抗体；及
●针对信号转导相关受体的刺激物：LPS(脂多糖)。
(11)(1)的抗体制备方法，其将含免疫用细胞的组织在含刺激物的培养液中体外免疫来制备抗体，所述刺激物是选自下列中1种以上的刺激物：IL-4、IL-5、抗-CD38抗体、抗-CD40抗体及LPS。
(12)(1)的抗体制备方法，其还包括：
●确定筛选出的所述抗体基因氨基酸序列的步骤；及
●将所述氨基酸序列与人抗体氨基酸序列库进行比对，并从所述人抗体氨基酸序列库选出同源性(同一性)高的序列，或经改变调整形成人源化抗体基因的步骤。
实施例
以下通过下述实施例来对本发明进行更具体说明。但这些实施例不旨在限定本发明。
实施例1：
本实施例中，以S100A10蛋白作为抗原例使用，说明了抗体IgG1的制备方法。
提取脾细胞(splenocyte)
肉眼识别小鼠脾脏后，取出，洗净。将两只的脾脏置于网格(mesh)上，用细胞刮刀破碎之后，通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收细胞。接着，将细胞悬浮于3mL ACK裂解缓冲液中后，加入10mLPBS(-)。通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收细胞，悬浮于6mL RPMI1640(-)中。使通过细胞过滤网来去除不溶性脂肪等。
体外免疫
S100A10蛋白抗原用检测试剂盒(Dc蛋白测定试剂盒、BioRad公司制)测定浓度。此时作为标准物使用BSA(Sigma公司制)。已知浓度的S100A10蛋白抗原按规定的量(5μg或20μg)分注，向其中添加100μL 1mg/mL的佐剂N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(每只小鼠50μL)，室温下静置15分钟。向脾细胞中添加配制好的抗原溶液，室温下静置15分钟。再各添加6mL RPMI1640(40％FBS)。并添加刺激物(IL-4(终浓度10ng/mL)、IL-5(终浓度10ng/mL)、抗-CD38抗体(终浓度1μg/mL)、抗-CD40抗体(终浓度1μg/mL)、LPS(终浓度40μg/mL))。将全量铺于10cm皿中。在37℃、CO2、培养箱中培养(4天)。培养结束后，通过离心分离(2000rpm、5分钟、4℃)回收细胞，用0.4％台盼蓝染料(GIBCO公司制)染色细胞，用血细胞计数板(AS ONE公司制)统计免疫后的脾细胞数。当用5μgS100A10抗原免疫时的细胞数为1.33×107细胞，用20μg S100A10抗原免疫时的细胞数为0.71×107细胞。该细胞用培养基B(Clona细胞HY试剂盒、StemCell Technology公司制)洗涤(10mL×3次)，配制成1.00×108细胞/mL。
黑色素瘤细胞的制备
PAI细胞(小鼠源骨髓瘤细胞)用培养基A(Clona细胞HY试剂盒、StemCell Technology公司制)继代培养。用培养基B洗涤细胞(10mL×3次)，用与上述同样的装置进行计数。在细胞融合时，该细胞数优选5×107细胞。
细胞融合
按脾细胞Splenocyte∶黑色素瘤细胞Myeloma＝2∶1混合细胞，通过离心回收。放液(tapping)后，用66.5μL(免疫5μg S100A10抗原时)或35.5μL(免疫20μg S100A10抗原时)PEG(聚乙二醇)溶液(对于1×108细胞的脾细胞为500μL)混合。
离心分离回收后，以665μL(免疫5μg S100A10抗原时)或355μL(免疫20μg S100A10抗原时)(对于1×108细胞的脾细胞为5mL)各添加一滴培养基B。
以665μL(免疫5μg S100A10抗原时)或355μL(免疫20μgS100A10抗原时)(对于1×108细胞的脾细胞为5mL)向其中各添加一滴培养基C(Clona细胞HY试剂盒、StemCell Technology公司制)。取该溶液5.32mL(免疫5μg S100A10抗原时)或2.84mL(免疫20μgS100A10抗原时)(对于1×108细胞的脾细胞为40mL)缓慢添加到培养基C中，于37℃，CO2下用培养箱培养(1天)(于15mL离心管中)。
细胞融合当天将培养基D(Clona细胞HY试剂盒、StemCellTechnology公司制)移到4℃培养箱中进行溶解。确认溶解后，混合好后，回到室温。
克隆
细胞离心回收后，悬浮于1.33mL(免疫5μg S100A10抗原时)或0.71mL(免疫20μg S100A10抗原时)(对于1×108细胞的脾细胞为10mL)培养基C中，之后将其悬浮于11.97mL(免疫5μg S100A10抗原时)或6.39mL(免疫20μg S100A10抗原时)(对于1×108细胞的脾细胞为90mL)培养基D中。于37℃下温育15分钟后，将其铺于10cm皿中。再于37℃、CO2的培养箱中培养(10～14天)。
收获
目视下对细胞集落计数，将其全部移96孔板(well plate)上，加200μL培养基E(Clona细胞HY试剂盒、StemCell Technology公司制)。接着于37℃、CO2的培养箱中培养(4天)。回收上清150μL，通过S100A10ELISA进行确认。
S100A10ELISA板的制备
S100A10抗原用PBS(-)稀释到5μg/mL，各取100μL加入到96孔板(Nunc-Immuno module F8 maxisoap，Nunc公司制)上。将其于4℃下静置1天后，弃去上清，各加入200μL 0.1％BSA/PBS(-)。于室温下静置1个小时后，用PBS(-)洗3次，从而制备S100A10 ELISA板。
S100A10 ELISA
取从上述“收获”中得到的培养上清150μL加入到S100A10ELISA板中，于37℃培养箱中静置1个小时。弃去上清，用PBS(-)清洗3次，加入用PBS(-)稀释5000倍的50μL第二抗体(抗-小鼠IgG1-HRP，Funakoshi公司制)，于37℃培养箱中静置1个小时。弃去上清，用PBS(-)洗3次，加入100μL的TMB溶液，于37℃培养箱中静置10分钟。之后立刻添加100μL 1N HC1(和光纯药公司制)来终止反应。此后，再用酶标仪(550型，BioRad公司制)测定各孔的在450nm下的吸光度。得到结果如表1所示。
表1
Figure GPA00001146430300151
接着，将杂交瘤集落化，其集落大小用肉眼确认。这些集落通过上述方法克隆后，确认此后的增殖。增殖的克隆的培养上清通过S100A10 ELISA确认产生抗S100A10 IgG1抗体的克隆数。根据上述表1中的记录，通过体外免疫法确认能够制备IgG1。此免疫步骤需要约5天，与一般情况(2～3个月)相比，可更快制备出针对S100A10蛋白的IgG1。
实施例2：
本例中，对抗S100A10抗体基因的提取及通过大肠杆菌表达抗体的步骤进行说明。
DNA提取、单链抗体scFv质粒的制备
用Isogen(Nippongene公司制)从1.5×106细胞(cells)免疫后的B细胞或杂交瘤中得到总RNA。其中，也可将通过上述实施例1中说明的体外免疫步骤得到的免疫细胞用于所述步骤。
接着，通过1.2％琼脂糖凝胶(Agarose Gel)电泳进行确认得到。得到的结果如图1A及图1B所示。
以得到的总RNA为模板，以小鼠(mouse)VH基因特异性引物或小鼠VL基因特异性引物，用ReverTra Ace(TOYOBO公司制)试剂合成了单链cDNA。再以制备出的cDNA为模板，用引物-VH正向引物混合物/VH反向引物混合物或VL正向引物混合物/VL反向引物混合物，通过PrimeSTAR HS聚合酶(TaKaRa公司制)进行第一PCR。所用引物序列利用了Antibody Engineering a practicalapproach(pp.210-211)中介绍的引物序列。
之后，通过2％琼脂糖凝胶电泳进行确认得到。得到的结果如图2A及图2B所示。
从电泳后的琼脂糖凝胶上切下目的条带，用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制)提取、纯化VH基因及VL基因。接着用该VH基因及VL基因各10ng，通过PrimeSTAR HS聚合酶(TaKaRa公司制)，在不添加引物的情况下，进行连接PCR反应。之后向连接PCR的样品中加入引物-第二PCR预混物而直接进行PCR扩增。之后，通过2％琼脂糖凝胶电泳进行确认得到。得到的结果如图3A及图3B所示。由这些结果可确认能够得到目的scFv PCR产物。
接着，用限制酶EcoRI及HindIII在37℃下对scFv PCR产物反应1小时而进行分解，从电泳后的琼脂糖凝胶上切下目的条带，用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制)提取、纯化scFv基因。同样，用限制酶EcoRI及HindIII在37℃下对质粒载体pMAL-p2X反应1小时而进行分裂，从电泳后的琼脂糖凝胶上切下目的条带，用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制)提取、纯化质粒载体基因。这些纯化产物按1mol质粒载体基因对6mol scFv基因的比例混合，通过DNA连接试剂盒<Mighty Mix>(TaKaRa公司制)进行连接。取连接溶液20μL与大肠杆菌JM109株的感受态细胞混合来转化大肠杆菌JM109株。将该转化体涂布到含有50μg/mL的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，于37℃培养18小时。
为了筛选携带连接了scFv基因的质粒的大肠杆菌克隆，将通过上述步骤形成的集落通过集落PCR及2％琼脂糖凝胶电泳进行确认得到。得到的结果如图4A及图4B所示。
将按上述方法得到的克隆接种到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，于37℃培养18小时，用QIAprep Miniprep试剂盒(QIAGEN公司制)提取质粒DNA。提取出的质粒的DNA序列用DNA测序仪MegaBASE1000(GE Healthcare公司制)进行确定。此获得抗体基因的步骤耗时3天。
由大肠杆菌表达单链抗体scFv
用序列经确定的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将该转化体涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，于37℃培养18小时。
接着，将按上述方式得到集落接种到5mL含50μg/mL氨苄青霉素的LBG液体培养基中，于30℃培养18小时。之后取该培养液1mL接种到100mL含50μg/mL氨苄青霉素的LBG液体培养基中，于30℃培养。培养过程中每隔1小时在660nm下用分光光度计UV-1200(岛津制作所公司制)测定吸光度。当吸光度达到0.5时，添加IPTG至终浓度达到0.5mM，于23℃下培养20个小时。培养结束后，通过离心分离(6000rpm，20分钟，4℃)回收大肠杆菌。将其用5mL溶液A(20％蔗糖、1mM EDTA、30mM Tris-HCl pH8.0、0.5mM APMSF)溶解，室温下静置10分钟。通过离心分离(6000rpm，20分钟，4℃)回收大肠杆菌，将其用5mL冰冷的溶液B(5mM MgSO4)溶解，并在冰上静置10分钟。之后通过离心分离(6000rpm，20分钟，4℃)回收上清。
此后，使如上所述回收的上清通过直链淀粉树脂柱(10mL，Φ2.5cm×3.3cm)。上清全部通过柱后，用洗涤缓冲液(200mM NaCl，20mM Tris-HCl pH8.0)40mL清洗柱。清洗两次后，用40mL洗脱缓冲液(5mM麦芽糖，200mM NaCl，20mM Tris-HCl pH8.0)将吸附在柱上的MBP(麦芽糖结合蛋白)-scFv蛋白洗脱，纯化。将纯化的MBP-scFv蛋白用SDS-PAGE法分析。得到的结果如图5A及图5B所示。
接着用测定试剂盒(Dc蛋白测定试剂盒、BioRad公司制)测定经纯化的MBP-scFv蛋白的浓度。结果，从50mL培养液中可得到0.345mg的MBP-scFv蛋白。
上述纯化步骤需要3天。本方法从获得抗体基因步骤算起，需要6天，比起一般方法(2～3个月)可更快的制备针对S100A10蛋白的scFv。
其中需知，本发明作为实施例例示了可大量制备抗S100A10抗体的可能性，但并不限于抗S100A10抗体，其他各种抗体也适用。
实施例3：
重复了实施例1中记载的方法。但本实施例中使用S100A1蛋白及S100A10蛋白作为抗原，采用与上述实施例1相同的方法实施体外免疫法，计算了IgG1阳性率。图6示如此得到的结果。从图6可看到，虽然可根据抗原而不同，但均以60％以上的高概率发生向IgG1的类别转换。
本发明在体外(in vitro)免疫过程中，在抗原免疫后添加一次LPS(40μg/mL)、IL-4、IL-5(10ng/mL)、抗-CD38抗体、抗-CD40抗体(1μg/mL)等刺激物，在刺激物存在下培养4天，则可实现实现有效的类别转换。
实施例4：
重复了实施例1中记载的方法。但本实施例是以S100A10蛋白为抗原以与实施例1相同的方法实施体外免疫法，在进行培养的第4天和第7天回收全细胞，并由此提取总RNA。
以600ng的总RNA为模板，使用ReverTra Ace(TOYOBO公司)进行逆转录反应。反应组成随厂商说明，体积为20μL，使用Oligo(dT)20(TOYOBO公司)作为引物。反应条件：42℃20分钟、99℃5分钟、4℃5分钟。以该产物1μL为模板，使用PowerSYBR Green PCR MasterMix(Applied Biosystems公司)进行实时PCR反应。反应条件：95℃10分钟→(95℃15秒、60℃1分钟)进行40个循环。
此外，本实施例所用设备为7500Fast(Applied Biosystems公司)。得到的结果采用内标β激动蛋白进行标准化，绘制成图。结果如图7所示。从图7可看到所有的标记物基因(Bc16、AID、Xbp1、Blimp1)均可使表达量上升，抗体的亲和力、抗体产生细胞的分化、诱导也变更高。这里的Bc16或AID主要是涉及抗体亲和力成熟或类别转换的基因；Xbp1是多功能转录因子，与抗体产生细胞的分化也有关；Blimp1也与Xbp1一样，是B细胞向抗体产生细胞(浆细胞)分化时起作用的因子。
实施例5：
本实施例就细胞因子的细胞毒性试验的实验方法进行说明。
将BALB/c小鼠(4周龄、♀、SPF/VAF)颈椎脱臼处死，肉眼识别小鼠脾脏后，摘出，用70％乙醇洗净。之后再用PBS洗净后，将2只的脾脏置于细胞过滤网上，用细胞刮刀破碎。用4mL PBS(-)清洗3次细胞过滤网，将脾细胞从细胞过滤网上洗脱。通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收细胞。
将细胞悬浮于3mL ACK裂解缓冲液中后，加入10mL PBS(-)去除红细胞，通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收脾细胞。将该脾细胞悬浮于10mL RPMI1640培养基中，使通过细胞过滤网来去除不溶性脂肪。细胞数用血细胞计数板计数，并浓缩至1×107细胞/mL。
将刺激物(IL-4(标准终浓度10ng/mL)、IL-5(标准终浓度10ng/mL)、抗-CD38抗体(标准终浓度1μg/mL)、抗-CD40抗体(标准终浓度1μg/mL)、LPS(标准终浓度40μg/mL))配成达标准终浓度的10000倍。将其用PBS(-)进行10倍梯度稀释。由此配置至10-6～104倍的刺激物稀释系列。取该刺激物1.5μL(1/1000体积)与300μL脾细胞混合，用含40％FBS的RPMI1640培养基将细胞浓度配至2×106细胞/mL，用37℃的CO2培养箱培养4天。
培养后，将100μL细胞溶液分注到96孔板上，用37℃的CO2培养箱温育2小时。之后向其中添加10mL细胞计数试剂盒-8(Dojindo公司制)，再温浴1小时。用酶标仪测定450nm下的吸光度，作为空白，对照测定了650nm下的吸光度。以450nm下的测定值减去650nm下的测定值，即得测定值。用各测定值比上未添加刺激物时的测定值，就得到比增殖率。得到的结果如图8的坐标图所示。作图时由于10-5以下的结果与10-4的结果显示同一值，因此省略。另外，各刺激物在各稀释倍数下的终浓度如表2所示。
表2
  稀释倍数 LPS IL-4 IL-5   抗-CD38抗体   抗-CD40抗体
  10   400μg/mL   100ng/mL   100ng/mL   10μg/mL   10μg/mL
  1   40μg/mL   10ng/mL   10ng/mL   1μg/mL   1μg/mL
  0.1   4μg/mL   1ng/mL   1ng/mL   100ng/mL   100ng/mL
  0.01   400ng/mL   100pg/mL   100pg/mL   10ng/mL   10ng/mL
  稀释倍数 LPS IL-4 IL-5   抗-CD38抗体   抗-CD40抗体
  0.001   40ng/mL   10pg/mL   10pg/mL   1ng/mL   1ng/mL
  0.0001   4ng/mL   1pg/mL   1pg/mL   100pg/mL   100pg/mL
  10-5   400pg/mL   100fg/mL   100fg/mL   10pg/mL   10pg/mL
  10-6   40pg/mL   10fg/mL   10fg/mL   1pg/mL   1pg/mL
  10-7   4pg/mL   1fg/mL   1fg/mL   100fg/mL   100fg/mL
  10-8   400fg/mL   100at/mL   100at/mL   10fg/mL   10fg/mL
  10-9   40fg/mL   10ag/mL   10ag/mL   1fg/mL   1fg/mL
综上所述，细胞因子细胞毒性试验的结果如图8所示。该图以比增殖率为纵坐标，刺激物的稀释倍数为横坐标。图中箭头所示浓度为通常使用的浓度。进行3次独立实验，取平均值作图。
在标准终浓度下并没有观察到细胞毒性。有过LPS，如果使用现在的10倍浓度，就有观察到细胞死亡的情况。但由于也只能下降到与未添加任何刺激物的情况相同的程度，因此得知该浓度也可使用。另外，标准终浓度下，添加任何刺激物都能观察到细胞的增殖，因此认为被最优效免疫。
实施例6：
本实施例中，就研究刺激物组合的实验方法进行说明。
将BALB/c小鼠(4周龄、♀、SPF/VAF)颈椎脱臼处死，肉眼识别小鼠脾脏后，摘出，用70％乙醇洗净。之后再用PBS洗净后，将2只的脾脏置于细胞过滤网上，用细胞刮刀破碎。用4mL PBS(-)清洗3次细胞过滤网，将脾细胞从细胞过滤网上洗脱。通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收细胞。
将细胞悬浮于3mL ACK裂解缓冲液中后，加入10mL PBS(-)去除红细胞，通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收脾细胞。将该脾细胞悬浮于10mL RPMI1640培养基中，使通过细胞过滤网来去除不溶性脂肪。细胞数用血细胞计数板计数，并浓缩至1×107细胞/mL。
将刺激物(IL-4(标准终浓度10ng/mL)、IL-5(标准终浓度10ng/mL)、抗-CD38抗体(标准终浓度1μg/mL)、抗-CD40抗体(标准终浓度1μg/mL)、LPS(标准终浓度40μg/mL))配成达标准终浓度的1000倍。取该刺激物1.5μL(1/1000体积)与300μL脾细胞混合，用含40％FBS的RPMI1640培养基将细胞浓度配至2×106细胞/mL，用37℃的CO2培养箱培养4天。
培养后，将100μL细胞溶液分注到96孔板上，用37℃的CO2培养箱温育2小时。之后向其中添加10mL细胞计数试剂盒-8(Dojindo公司制)，再温育1小时。用酶标仪测定450nm下的吸光度，作为空白对照，测定了650nm下的吸光度。以450nm下的测定值减去650nm下的测定值，即得测定值。用各测定值比上未添加刺激物时的测定值，就得到比增殖率。得到的结果如图9A及图9B所示，其中纵坐标为比增殖率，横坐标为添加的刺激物种类。
回收培养后残留的细胞，用ISOGEN(Nippongene公司制)回收总RNA。用600ng的上述总RNA为模板，使用ReverTra Ace(TOYOBO公司)进行逆转录反应。反应组成随厂商说明，体积为20μL，使用Oligo(dT)20(TOYOBO公司)作为引物。反应条件：42℃20分钟、99℃5分钟、4℃5分钟。以该产物1μL为模板，使用PowerSYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems公司)进行实时PCR反应。反应条件：95℃10分钟→(95℃15秒、60℃1分钟)进行40个循环。此外，本实施例所用设备为7500Fast(AppliedBiosystems公司)。得到的结果采用内标β激动蛋白进行标准化。将此数值再用未添加时的值标准化而绘制成图，结果如图10A～图10D、图11A及图11B、图12A及图12B、图13、图14、图15及图16所示。
从显示研究刺激物组合的结果的一系列图可知，对于细胞增殖而言，抗CD40刺激及LPS刺激有效。但是当LPS与抗CD40共存时却抑制增殖。因此推测是由于进入细胞的刺激过强，诱导细胞凋亡的结果。
另一方面，添加LPS、抗CD38、IL-5中的任一种均能增加浆细胞分化标记物的表达量，说明这些刺激可促进分化。另外，复合添加这些刺激物时，可发现表达量增加了。但由于LPS存在增殖细胞的作用，因此使共存时全体细胞数增加，而作为结果，表达量减少了。此外，添加任意两种时，分化标记物的表达量就会达到几乎饱和，因此得出在现在的浓度下就可充分达到分化刺激的目的。而添加IL4和抗CD40可提高全体细胞数，由此虽然表达量下降了，但是确认可能是添加IL5或抗CD38、LPS而提高了分化标记物的表达量。
再者，添加LPS、抗CD38、IL5中的任一种都可增加体细胞变异标记物的表达量。在细胞基本不增殖的条件(不存在IL4、抗CD40、LPS的条件)下，由于IL5及抗CD38的刺激而体细胞变异标记物的表达量升高，而在细胞增殖的条件下，确认了LPS刺激所致的标记物表达量升高。这提示由LPS可促进抗原非依赖性B细胞的活化、分化。LPS是构成大肠杆菌肽聚糖的脂多糖，其存在的状态意味着生物体处于被微生物感染的状态。从生物体防御观点来看，由于LPS刺激，诱导了B细胞的体细胞变异、活化，使免疫活性细胞具备了制备更适于产生抗体的细胞的功能。
这里所述体外免疫方法是指，首先在原本脾细胞中存在的B细胞中，通过IL4、抗CD40的作用，使产生目的抗体的细胞增殖，通过IL5、抗CD38作用使体细胞变异，成为具有亲和力不同的细胞群。并通过LPS刺激，使不与抗原反应的细胞增殖、产生体细胞变异，成为积累能与抗原反应的变异的系统。
实施例7：
本实施例对细胞因子浓度上限和下限的标记物表达量的实验方法进行说明。
将BALB/c小鼠(4周龄、♀、SPF/VAF)颈椎脱臼处死，肉眼识别小鼠脾脏后，摘出，用70％乙醇洗净。再用PBS洗净后，将2只的脾脏置于细胞过滤网上，用细胞刮刀破碎。用4mL PBS(-)清洗3次细胞过滤网，将脾细胞从细胞过滤网上洗脱。通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收细胞。
将细胞悬浮于3mL ACK裂解缓冲液中后，加入10mL PBS(-)去除红细胞，通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收脾细胞。将该脾细胞悬浮于10mL RPMI1640培养基中，使通过细胞过滤网来去除不溶性脂肪。细胞数用血细胞计数板计数，并浓缩至1×107细胞/mL。
用纯化的hS100A10蛋白作为抗原，取0.1nmol或1nmol免疫1×107细胞的脾细胞。此时，作为佐剂添加50μg的胞壁酰二肽(SIGMA公司)。室温下静置15分钟进行免疫反应。刺激物(IL-4、IL-5、抗CD38抗体、抗CD40抗体、LPS)配置成至下述表3的终浓度。将所述刺激物与经免疫的脾细胞混合，用含40％FBS的RPMI1640培养基将细胞浓度配至2×106细胞/mL，用37℃的CO2培养箱培养4天。
培养后，回收全部细胞，用ISOGEN(Nippongene公司制)回收总RNA。用600ng的上述总RNA为模板，使用ReverTra Ace(TOYOBO公司)进行逆转录反应。反应组成随厂商说明，体积为20μL，使用Oligo(dT)20(TOYOBO公司)作为引物。反应条件：42℃20分钟、99℃5分钟、4℃5分钟。以该产物1μL为模板，使用PowerSYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems公司)进行实时PCR反应。反应条件：95℃10分钟→(95℃15秒、60℃1分钟)进行40个循环。此外，本实施例所用设备为7500Fast(AppliedBiosystems公司)。得到的结果采用内标β激动蛋白进行标准化。将此数值再用未添加时的值标准化而绘制成图，结果如图17A及图17B所示。
表3
  稀释倍数 LPS IL-4 IL-5   抗-CD38抗体   抗-CD40抗体
  未添加   0μg/mL   0ng/mL   0ng/mL   0μg/mL   0μg/mL
  下限浓度 10ng/mL 1pg/mL 1pg/mL 1ng/mL 1ng/mL
  一般浓度 40μg/mL 10ng/mL 10ng/mL 1μg/mL 1μg/mL
  上限浓度 500μg/mL 50ng/mL 50ng/mL 50μg/mL 50μg/mL
显示细胞因子浓度上限、下限的标记物表达量的结果的图17A及图17B中，坐标图的横坐标示所研究标记物基因名，纵坐标示mRNA的表达量。坐标图的纵坐标中的数值减少0.05时，可换算成mRNA表达量成为约2倍。
从图可看到，无论抗原浓度为0.1nmol还是1nmol，用上限及下限的刺激物浓度可得到与未添加时相同或以上的标记物表达量。由此提示，通过在该范围内添加刺激物，经抗原免疫的细胞分化成浆细胞、并在该过程中发生抗体的亲和力成熟及类别转换。
实施例8：
本实施例就B细胞分化研究的实验方法进行说明。
将BALB/c小鼠(4周龄、♀、SPF/VAF)颈椎脱臼处死，肉眼识别小鼠脾脏后，摘出，用70％乙醇洗净。再用PBS洗净后，将2只的脾脏置于细胞过滤网上，用细胞刮刀破碎。用4mL PBS(-)清洗3次细胞过滤网，将脾细胞从细胞过滤网上洗脱。通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收细胞。
将细胞悬浮于3mL ACK裂解缓冲液中后，加入10mL PBS(-)去除红细胞，通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收脾细胞。将该脾细胞悬浮于10mL RPMI1640培养基中，使通过细胞过滤网来去除不溶性脂肪。细胞数用血细胞计数板计数，并浓缩至1×107细胞/mL。
用1nmol纯化的hS100A10蛋白作为抗原，免疫2×107细胞的脾细胞。此时，作为佐剂添加100μg的胞壁酰二肽(SIGMA公司)。室温下静置15分钟进行免疫反应。将刺激物(IL-4、IL-5、抗CD38抗体、抗CD40抗体、LPS)配成达标准终浓度的1000倍。取上述刺激物10μL与经免疫的脾细胞(2mL)混合，用含40％FBS的RPMI1640培养基将细胞浓度配至2×106细胞/mL，用37℃的CO2培养箱培养4天。将只添加抗原的和只添加刺激物的、未添加的同时用作对照。
培养后回收全部细胞，为了使其达到1×108细胞/mL，并悬浮于染色缓冲液(含0.5％BSA，2mM EDTA的PBS(-)缓冲液)中。取20μL该细胞用抗体染色。染色方法如下表4所示。
表4
  靶细胞   抗体  染色方法
B细胞   抗-CD45R-PE(Miltenyi Biotec公司)  添加20μL用染色缓冲液稀释20倍的抗体。将其置于冰箱中静置10分钟，用染色缓冲液洗去未反应的抗体。
浆细胞 抗-多配体蛋白聚糖-1(CosmoBio公司)  添加2μL抗体。冰上静置45分钟，用染色缓冲液洗去未反应的抗体。之后添加2μL用染色缓冲液稀释20倍的抗-IgG(F(ab’)2)、山羊(驴)，PE-Cy5标签抗体作为第二抗体。冰上静置45分钟，用染色缓冲液洗去未反应的抗体。
  靶细胞   抗体  染色方法
T1-B细胞   抗-C1qR(M-20)，小鼠(山羊)(又称抗-CD93)(CosmoBio公司)抗-CD23-FITC(CosmoBio公司)  抗体各添加2μL。冰上静置45分钟，用染色缓冲液洗去未反应的抗体。之后添加2μL用染色缓冲液稀释20倍的抗-IgG(F(ab’)2)、山羊(驴)，PE-Cy5标签抗体作为第二抗体。冰上静置45分钟，用染色缓冲液洗去未反应的抗体。
T2-B细胞   抗-C1qR(M-20)，小鼠(山羊)(又称抗-CD93)(CosmoBio公司)抗-CD23-FITC(CosmoBio公司)  抗体各添加2μL。冰上静置45分钟，用染色缓冲液洗去未反应的抗体。之后添加2μL用染色缓冲液稀释20倍的抗-IgG(F(ab’)2)、山羊(驴)，PE-Cy5标签抗体作为第二抗体。冰上静置45分钟，用染色缓冲液洗去未反应的抗体。
B2细胞   抗-C1qR(M-20)，小鼠(山羊)(又称抗-CD93)(CosmoBio公司)抗-CD23-FITC(CosmoBio公司)  抗体各添加2μL。冰上静置45分钟，用染色缓冲液洗去未反应的抗体。之后添加2μL用染色缓冲液稀释20倍的抗-IgG(F(ab’)2)、山羊(驴)，PE-Cy5标签抗体作为第二抗体。冰上静置45分钟，用染色缓冲液洗去未反应的抗体。
活化的B细胞 抗-BCMA，小鼠(大鼠)(CosmoBio公司)  添加2μg小鼠IgG(SIGMA公司)，室温静置15分钟。向其中添加2μL抗体。冰上静置45分钟，用染色缓冲液洗去未反应的抗体。
将经染色的细胞悬浮于500mL的染色缓冲液中，用FACSCaliber分析。测定各细胞的阳性率，作图。得到的结果如图18A、图18B、图19A～图19D所示。图中以各细胞的阳性率为纵坐标，抗原·有无刺激作为横坐标。
从显示研究B细胞分化的结果的一系列图中证实，通过在体外免疫脾细胞，可活化、增殖B细胞并向浆细胞分化。并且可知道，B细胞的活化、成熟由不是抗原的刺激物引起。在只有抗原的情况下，虽然能证实向浆细胞分化，但并没有证实B细胞的成熟，因此提示，向浆细胞的分化主要由抗原刺激引起。而只添加抗原和只添加刺激物的情况下，都可观察到B细胞的增殖，因此提示是佐剂引起的B细胞的增殖。这也可由佐剂的结构与LPS的末端结构相同且可由LPS观察到细胞增殖中得到提示。
即使在只添加刺激物的情况下，得到的浆细胞比例也上升，因此提示可不依赖抗原地分化。
另外，脾细胞中的B细胞，通过抗原、刺激物的作用，依T1-B细胞→T2-B细胞→B2细胞→活化的B细胞成熟，进而分化成浆细胞。事实上，通过本方法，可使B细胞更成熟，特别是比起B2细胞没有免疫的情况，成熟度大幅提高。
而活化的B细胞的比例几乎不依免疫与否而变化，因此提示从活化的B细胞向浆细胞分化非常迅速地发生。当同时添加抗原和刺激物时，与只添加刺激物的情况相比，B2细胞的比例上升。因此同时添加抗原时会优先活化抗原依赖型B细胞，而抗原非依赖型B细胞的活化减少。也就是说，通过本体外免疫法，可优先分化产生目的抗体的细胞。
实施例9：
本实施例，对研究分化B细胞的标记物表达量的实验方法进行说明。
将BALB/c小鼠(4周龄、♀、SPF/VAF)颈椎脱臼处死，肉眼识别小鼠脾脏后，摘出，用70％乙醇洗净。再用PBS洗净后，将2只的脾脏置于细胞过滤网上，用细胞刮刀破碎。用4mL PBS(-)清洗3次细胞过滤网，将脾细胞从细胞过滤网上洗脱。通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收细胞。
将细胞悬浮于3mL ACK裂解缓冲液中后，加入10mL PBS(-)去除红细胞，通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收脾细胞。将该脾细胞悬浮于10mL RPMI1640培养基中，使通过细胞过滤网来去除不溶性脂肪。细胞数用血细胞计数板计数，并浓缩至1×107细胞/mL。
用1nmol纯化的hS100A10蛋白作为抗原，免疫2×107细胞的脾细胞。此时，作为佐剂添加100μg的胞壁酰二肽(SIGMA公司)。室温下静置15分钟进行免疫反应。将刺激物(IL-4、IL-5、抗CD38抗体、抗CD40抗体、LPS)配成达标准终浓度的1000倍。取上述刺激物10μL与经免疫的脾细胞(2mL)混合，用含40％FBS的RPMI1640培养基将细胞浓度配至2×106细胞/mL，用37℃的CO2培养箱培养4天。将只添加抗原的和只添加刺激物的、未添加的同时用作对照。
培养后，回收全部细胞，用ISOGEN(Nippongene公司制)回收总RNA。用600ng的上述总RNA为模板，使用ReverTra Ace(TOYOBO公司)进行逆转录反应。反应组成随厂商说明，体积为20μL，使用Oligo(dT)20(TOYOBO公司)作为引物。反应条件：42℃20分钟、99℃5分钟、4℃5分钟。以该产物1μL为模板，使用PowerSYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems公司)进行实时PCR反应。反应条件：95℃10分钟→(95℃15秒、60℃1分钟)进行40个循环。此外，本实施例所用设备为7500Fast(AppliedBiosystems公司)。得到的结果，用内标β激动蛋白的数值乘以同时测定的浆细胞或活化的B细胞的比例，就得到由源于各细胞的β激动蛋白的表达量。用源于浆细胞的β激动蛋白表达量标准化Blimp-1及Xbp-1表达量，用源于活化的B细胞的β激动蛋白表达量标准化Bc1-6及AID的表达量。将该值再用未添加的值标准化，绘制成图。所得结果如图20A～图20D所示。
从显示B细胞分化的研究标记物表达量的结果的一系列图可知，与抗体染色结果相同，添加抗原的情况下，向浆细胞分化的标记物Blimp-1或Xbp-1的表达量上升。另外，通过添加刺激物，可使体细胞变异的标记物Bc1-6或AID高表达。因此得知，不仅添加抗原，同时添加刺激物，可容易得到更高亲和力的抗体。
另外，同时添加抗原和刺激物时，比只添加刺激物的情况，体细胞变异标记物的表达量降低，因此提示，共存特定抗原时，可在一定程度上抑制体细胞变异，并有防止由于过度变异引起的活性下降的系统。
而免疫前的脾细胞，分化标记物几乎没有表达，而高表达体细胞变异标记物。这可能是由于常发生通过体细胞变异增加抗体集合(repertoire)反应的原因。
实施例10：
本实施例对ELISA实验方法进行说明。
5mL LB培养基中培养收集菌后，悬浮于1mL PBS中进行超声波破碎，取含有可溶性MBP-scFv的破碎上清级分。
该上清级分用3％BSA/PBS稀释50倍，取50μL进行ELISA分析，得到的结果如图21～图24所示。
图21所示的ELISA法，是依据本体外免疫法，通过ELISA测定免疫模型抗原鸡卵溶菌酶(HEL)构建起来的抗-HEL/MBP-scFv的活性。为了研究抗原特异性，用分别包被β-酪蛋白，S100A2，S100A14、鸡卵溶菌酶的ELISA板进行测定。结果采用本法可得到对鸡卵溶菌酶具有明显特异性的scFv。
图22所示的ELISA法是本体外免疫的改良方法，以MACS替代脾细胞进行分离，对于B细胞免疫了鸡卵溶菌酶。与图21一样，确认构建好的抗-HEL/MBP-scFv的特异性，证实可得到具有明显特异性的scFv。因此，本法可对分离得到的B细胞直接进行有效的免疫操作。
图23所示的ELISA法中根据本体外免疫法能够得到目的scFv的基因序列。用此，可对scFv进一步附加功能。作为一例，制备了在抗-HEL/MBP-scFv的C端融合了作为荧光蛋白之一的EGFP的抗-HEL/MBP-scFv-EGFP。制备scFv与EGFP间通过长度不同的接头(Gly及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)连接的2种。与图21相同，确认构建的MBP-scFv-EGFP的特异性，证实可制备对鸡卵溶菌酶具有特异性，且有荧光的scFv。
作为蛋白以外的模型抗原，按本方法免疫肽。一般的免疫方法中，用像肽这样的小分子量物质缀合到KLH或BSA等蛋白上作为抗原使用，但本方法中，以B细胞为直接目标在体外直接用肽也可进行免疫反应。因此用4种长度不同的肽为模型抗原，直接免疫肽。所用肽如下所示：β-酪朊吗啡肽-7(牛；YPFPGPI，7a.a.)，血管紧张素I(人；DRVYIHPFHL，10a.a.)，甲状旁腺激素；PTH(人；EADKADVNVLYKAKSQ，16a.a.)。用PBS溶解各肽，取10μg免疫。
图24所示的ELISA法，是用ELISA法测定根据本方法构建起的抗-β-酪朊吗啡肽7/MBP-scFv，抗-血管紧张素I/MBP-scFv，抗-PTH/MBP-scFv的活性。为了研究特异性，使用分别包被β-酪朊吗啡肽-7，血管紧张素I、PTH的ELISA板进行测定。结果可证明得到了对各肽有显著特异性的scFv。由于本方法中将肽本身作为抗原添加，说明即使对于短链肽也可得到scFv。
实施例11：
本实施例对抗小鼠(mouse)蛋白抗体的获得实验方法进行说明。
将BALB/c小鼠(4周龄、♀、SPF/VAF)颈椎脱臼处死，肉眼识别小鼠脾脏后，摘出，用70％乙醇洗净。再用PBS洗净后，将2只的脾脏置于细胞过滤网上，用细胞刮刀破碎。用4mL PBS(-)清洗3次细胞过滤网，将脾细胞从细胞过滤网上洗脱。通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收细胞。
将细胞悬浮于3mL ACK裂解缓冲液中后，加入10mL PBS(-)去除红细胞，通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收脾细胞。将该脾细胞悬浮于10mL RPMI1640培养基中，使通过细胞过滤网来去除不溶性脂肪。细胞数用血细胞计数板计数，并浓缩至1×107细胞/mL。
以纯化的hS100A10蛋白及购买的mAlbumin(SIGMA公司)用作抗原。分别用1nmol、10nmol免疫2×107细胞的脾细胞。此时，作为佐剂添加100μg的胞壁酰二肽(SIGMA公司)。室温下静置15分钟进行免疫反应。将刺激物(IL-4、IL-5、抗CD38抗体、抗CD40抗体、LPS)配成达标准终浓度的1000倍。取上述刺激物10μL与经免疫的脾细胞(2mL)混合，用含40％FBS的RPMI1640培养基将细胞浓度配至2×106细胞/mL，用37℃的CO2培养箱培养4天。
培养后，回收全部细胞，用ISOGEN(Nippongene公司制)回收总RNA。用600ng的上述总RNA为模板，使用ReverTra Ace(TOYOBO公司)进行逆转录反应。反应组成随厂商说明，体积为20μL，使用Oligo(dT)20(TOYOBO公司)作为引物。反应条件：42℃20分钟、99℃5分钟、4℃5分钟。以10μL该产物为模板，通过PCR扩增抗体的H链及L链的高变区。PCR中采用PrimeSTAR HS(TaKaRa公司)，反应组成、反应条件随厂商说明。得到的400bp片段通过琼脂糖凝胶电泳(2.0％Seakem GTG琼脂糖(TaKaRa公司)/TAE缓冲液，150V，30分钟)分离，用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)提取纯化。实验方法随厂商说明。以提取的片段各50ng为模板，通过PCR制备800bp的scFv片段。PCR采用PrimeSTARHS(TaKaRa公司)，反应组成、反应条件随厂商说明。得到的800bp片段用限制酶KpnI及HindIII(均为TOYOBO公司制)剪切，亚克隆到pMal-c2E载体(NEB公司)中。
用亚克隆的DNA转化大肠杆菌JM109株，得到的克隆在5mL添加了过夜快速自动诱导系统(Novagen公司)的LB培养基中培养。27℃下培养一整晚，之后从1.5mL培养液中回收菌体，用300μL含1mM AEBSF(SIGMA公司)的BugBuster蛋白提取试剂回收可溶性蛋白。
取5μL回收的可溶性蛋白通过SDS-PAGE法(10％聚丙烯酰胺凝胶，25mA，60分钟)证实MBP-scFv的表达。
此外，通过ELISA验证抗体亲和力。作为ELISA用板，制备了固定了mS100A10或mAlbumin的板。每孔添加1μg蛋白，于4℃下固定一晚。用PBS(-)清洗后，mS100A10板用3％BSA(牛血清白蛋白(和光纯药公司))/PBS(-)，mAlbumin板用1％HEL(鸡蛋白溶菌酶(生化学工业公司))/PBS(-)分别进行封闭。在室温下进行1小时封闭后，用PBS清洗。向如上所述制备的板中添加MBP-scFv抗体样品。添加到mS100A10板的抗体用3％BSA/PBS(-)，添加到mAlbumin板的抗体用1％HEL/PBS(-)分别稀释50倍，室温下静置30分钟。向制备好的板中添加50μL该样品，于37℃下反应1小时。用PBS(-)洗净后，添加50μL用PBS(-)稀释了2000倍的第二抗体(抗-MBP，HRP缀合物(NEB公司))的溶液，于37℃下反应1小时。用PBS(-)洗净后，添加100μL SureBlue Reserve(KPL公司)进行显色。在室温下进行显色反应3分钟，添加100μL 1N HCl(和光纯药公司)以终止显色反应。之后用680型酶标仪(BioRad公司)测定450nm/655nm的吸光度。
用测定值减去空白值，绘制成坐标图。以吸光度为纵坐标，样品编号为横坐标绘图。免疫mAlbumin的克隆将在mAlbumin板上的值为阳性值，在mS100A10板上的值为阴性值。出现差异的克隆特别用星号标出。
此外，阳性值比上阴性值，如果比值为负，且阳性值为正值的克隆记为++、比值示2以上的值的克隆记为+，比值示1～2的值的克隆记为±，示1以下的值的克隆记为-，将各自的阳性率绘图。所得结果如图25～图29所示。
从显示抗小鼠蛋白抗体的取得结果的一系列图可知道，mS100A10能够得到多数抗体。从抗体亲和力分布结果来看，免疫高浓度抗原，得到多数无亲和力的克隆。但高亲和力抗体的阳性率与用低浓度抗原免疫的情况没有大差别，由于体细胞变异的频率上升，因此认为不与抗原反应的克隆增加了。因此使用抗原性低的抗原，尽可能用高浓度的，这样可能得到更符合目的的抗体。
另一方面，得到针对mAlbumin的抗体非常困难。原因为：由于小鼠血液中大量存在，如果比较容易制备出相对应的抗体那么患自身免疫疾病的几率迅速上升。因此，认为应该在从骨髓向脾脏运送免疫活性细胞之前，经筛选排除有可能性的克隆。因此制备针对这些的抗体时，从骨髓得到免疫活性细胞而免疫的方法有可能高效获取抗体。并且，从得到mS100A10抗体的结果来看，通过用比10nmol更高浓度免疫可更高效获取抗体。虽然较差，但也能获得与mAlbumin反应的抗体，因此，也可采用向基因中人为导入突变来获得目的抗体的方法。
两个
实施例12：
本实施例对抗小分子化合物抗体的获得及实验方法进行说明。
将BALB/c小鼠(4周龄、♀、SPF/VAF)颈椎脱臼处死，肉眼识别小鼠脾脏后，摘出，用70％乙醇洗净。再用PBS洗净后，将2只的脾脏置于细胞过滤网上，用细胞刮刀破碎。用4mL PBS(-)清洗3次细胞过滤网，将脾细胞从细胞过滤网上洗脱。通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收细胞。
将细胞悬浮于3mL ACK裂解缓冲液中后，加入10mL PBS(-)去除红细胞，通过离心分离(1300rpm×3分钟，4℃)回收脾细胞。将该脾细胞悬浮于10mL RPMI1640培养基中，使通过细胞过滤网来去除不溶性脂肪。细胞数用血细胞计数板计数，并浓缩至1×107细胞/mL。
以HEL-Cy3蛋白及HEL-ITC用作抗原。分别用Cy3单次反应性染料包(GE Healthcare公司)、FITC(Funakoshi公司)标记HEL(生化学工业公司)。测定标记率，用相当于1nmol小分子化合物，免疫2×107细胞的脾细胞。此时，作为佐剂添加100μg的胞壁酰二肽(SIGMA公司)。室温下静置15分钟进行免疫反应。将刺激物(IL-4、IL-5、抗CD38抗体、抗CD40抗体、LPS)配成达标准终浓度的1000倍。取上述刺激物10μL与经免疫的脾细胞(2mL)混合，用含40％FBS的RPMI1640培养基将细胞浓度配至2×106细胞/mL，用37℃的CO2培养箱培养4天。
培养后，回收全部细胞，用ISOGEN(Nippongene公司制)回收总RNA。用600ng的上述总RNA为模板，使用ReverTra Ace(TOYOBO公司)进行逆转录反应。反应组成随厂商说明，体积为20μL，使用Oligo(dT)20(TOYOBO公司)作为引物。反应条件：42℃20分钟、99℃5分钟、4℃5分钟。以10μL该产物为模板，通过PCR扩增抗体的H链及L链的高变区。PCR中采用PrimeSTAR HS(TaKaRa公司)，反应组成、反应条件随厂商说明。得到的400bp片段通过琼脂糖凝胶电泳(2.0％Seakem GTG Agarose(TaKaRa公司)/TAE缓冲液，150V，30分钟)分离，用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)提取纯化。实验方法随厂商说明。以提取的片段各50ng为模板，通过PCR制备800bp的scFv片段。PCR中采用PrimeSTAR HS(TaKaRa公司)，反应组成、反应条件随厂商说明。得到的800bp片段用限制酶KpnI及HindIII(均为TOYOBO公司制)剪切，亚克隆到pMal-c2E载体(NEB公司)中。
用亚克隆的DNA转化大肠杆菌JM109株，得到的克隆在5mL添加了过夜快速自动诱导系统(Novagen公司)的LB培养基中培养。27℃下培养一整晚，之后从1.5mL培养液中回收菌体，用300μL含1mM AEBSF(SIGMA公司)的BugBuster蛋白提取试剂回收可溶性蛋白。
取5μL回收的可溶性蛋白通过SDS-PAGE法(10％聚丙烯酰胺凝胶，25mA，60分钟)证实MBP-scFv的表达。
图30所示为得到的抗小分子化合物抗体的电泳照片。由Cy3-HEL、FITC-HEL都能够确认目的蛋白(图中箭头部分)的高表达，由此提示能够获得目的抗体。
工业实用性
通过上述说明，根据本发明，可在短时间内大量制备抗体应用于以抗原抗体反应为基础的疾病诊断方法中。不限于疾病诊断，更可扩大到免疫学标记物检测领域。此外，还可在短时间内制备多种抗体应用到以抗原抗体反应为基础的疾病治疗中，因此也促进扩大了抗体医药的领域。
另外，由于可在短时间内大量制备抗体用于检测作为肾癌标记物之一的S100A10蛋白，因此，可降低抗体制造成本，及低成本频繁进行以检测癌症为目的的尿检。

Claims (12)

1.抗体制备方法，包括：
●将含免疫用细胞的组织在含抗原和刺激物的培养液中体外免疫的步骤；
●筛选所述经免疫的细胞的步骤；及
●从筛选出的免疫细胞获得抗体的步骤。
2.权利要求1的抗体制备方法，还包括以下步骤：
●通过PCR扩增，从所述免疫细胞得到扩增抗体基因后，由宿主细胞表达制备抗体或类抗体蛋白。
3.权利要求1的抗体制备方法，其中所述组织是免疫用动物。
4.权利要求1的抗体制备方法，其中所述筛选出的细胞是发生类别转换或亲和力成熟的细胞。
5.权利要求1的抗体制备方法，其中所述经免疫细胞的筛选通过流式细胞术或染色进行。
6.权利要求1的抗体制备方法，其中所述刺激物是刺激在免疫活性细胞上表达的细胞因子受体、表面抗原或信号转导相关受体的物质。
7.权利要求1的抗体制备方法，其中所述抗原是肽。
8.权利要求1的抗体制备方法，其中所述抗原是属于S100家族的蛋白，取得单链抗体scFv(单链可变片段)或抗体IgG1(免疫球蛋白G1)。
9.权利要求1的抗体制备方法，其中所述抗原是S100A10蛋白，取得单链抗体scFv(单链可变片段)或抗体IgG1(免疫球蛋白G1)。
10.权利要求6的抗体制备方法，其中所述刺激物是下列中的至少一种：
●针对细胞因子受体的刺激物：IL-4或IL-5；
●针对表面抗原的刺激物：抗-CD38抗体或抗-CD40抗体；及
●针对信号转导相关受体的刺激物：LPS(脂多糖)。
11.权利要求1的抗体制备方法，其将含免疫用细胞的组织在含刺激物的培养液中体外免疫来制备抗体，所述刺激物是选自下列中1种以上的刺激物：IL-4、IL-5、抗-CD38抗体、抗-CD40抗体及LPS。
12.权利要求1的抗体制备方法，其还包括：
●确定筛选出的所述抗体基因氨基酸序列的步骤；及
●将所述氨基酸序列与人抗体氨基酸序列库进行比对，并从所述人抗体氨基酸序列库选出同源性(同一性)高的序列，或经改变调整形成人源化抗体基因的步骤。
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