CN102639563A - 2型糖尿病的标记蛋白 - Google Patents

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胡格斯·马蒂勒
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雅各布·萨瓦斯特贝利韦尔
托马斯·施奈德
埃莱娜·谢伯科娃
王海燕
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Abstract

本发明提供用于早期检测II型糖尿病的标记蛋白，针对所述标记蛋白的抗体，和它们在用于II型糖尿病的诊断方法和药物开发中的应用。

Description

2型糖尿病的标记蛋白
本发明提供用于早期检测II型糖尿病的诊断标记蛋白，针对所述标记蛋白的抗体和它们在II型糖尿病的诊断方法和药物开发中的应用。
2型糖尿病(Type 2 diabetes)(非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM))是这样的病症，其特征在于在胰岛素抵抗和相对胰岛素缺乏的背景下的高血糖。估计在美国有2360万人(人口的7.8％)患有糖尿病，被诊断的有1790万人，其中90％的是2型。随着1990至2005年间流行率加倍，CDC(疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention))已经将该增长表征为流行性的。
因此，存在对允许早期检测II型糖尿病的诊断标记和方法的需求。
在第一个目的中，本发明涉及用于诊断II型糖尿病或用于确定个体发展II型糖尿病的素因的方法，其包括下述步骤：
测量所述个体的组织样品中嗅介蛋白4(OLFM4)的多肽水平，其中，与代表健康群体的OLFM4多肽水平相比，所述个体的所述样品中OLFM4多肽的降低的水平指示II型糖尿病或发展II型糖尿病的素因(predisposition)。
在一个优选的实施方案中，所述组织是血液，优选血浆。
在第二个目的中，本发明提供鉴别用于治疗II型糖尿病的化合物的方法，其包括下述步骤：
a)将所述化合物施用给患有II型糖尿病的非人动物，
b)测量步骤a)的非人动物的组织样品中OLFM4多肽水平，其中与没有被施用化合物的患有II型糖尿病的非人动物的组织样品中OLFM4多肽水平相比，步骤a)的非人动物的组织样品中改变的OLFM4多肽水平指示用于治疗II型糖尿病的化合物。
在一个优选的实施方案中，所述组织是血液，优选血浆.
在另一个优选的实施方案中，所述非人动物是啮齿动物，优选小鼠或大鼠，更优选DIO小鼠，ob/ob小鼠或ZDF大鼠。
在第三个目的中，本发明涉及OLFM4多肽用于诊断II型糖尿病或用于确定个体发展II型糖尿病的素因的应用。
在一个优选的实施方案中，所述OLFM4多肽是人OLFM4多肽。人OLFM4的氨基酸序列公开于Seq.Id.No.1。
在第四个目的中，本发明提供特异性结合OLFM4多肽的抗体用于诊断II型糖尿病或用于确定个体发展II型糖尿病的素因的应用。
在一个优选的实施方案中，所述抗体结合人OLFM4多肽.
在第五个目的中，本发明涉及用于诊断II型糖尿病或确定个体中发展II型糖尿病的素因的试剂盒，其包含：
a)对OLFM4多肽特异性的抗体，优选本发明的抗体，
b)结合被a)的抗体捕获的OLFM4的标记抗体(labeled antibody)，或结合a)的抗体的标记抗体，和
c)用于进行诊断测定的试剂。
在一个优选的实施方案中，所述对OLFM4多肽特异性的抗体结合人OLFM4多肽。
本发明的方法可用于监测进行糖尿病疗法的患者中II型糖尿病疗法的应答，其通过测量这些患者的组织样品(优选血液样品)中的OLFM4多肽水平来进行。与所述疗法开始时OLFM4多肽水平相比，在治疗过程中的组织样品中显示改变的OLFM4多肽水平的患者对所述糖尿病疗法有应答。
在另一个目的中，本发明涉及针对人OLFM4多肽的单克隆抗体。
在一个优选的实施方案中，所述抗体是这样的抗体，其包含能够从选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系获得的抗体的VH结构域的CDR1-CDR3：OLFM4 2/3(DSM ACC3012)，OLFM4 1/46(DSM ACC3011)，OLFM4 2/1(DSM ACC3013)，OLFM4 2/14(DSM ACC3014)，OLFM4 2/28(DSM ACC3015)和OLFM4 1/23(DSMACC3010)，和能够从选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系获得的抗体的VL结构域的CDR1-CDR3：OLFM42/3(DSM ACC3012)，OLFM4 1/46(DSM ACC3011)，OLFM4 2/1(DSMACC3013)，OLFM4 2/14(DSM ACC3014)，OLFM4 2/28(DSM ACC3015)和OLFM4 1/23(DSM ACC3010)。
在另一个优选的实施方案中，所述抗体是嵌合抗体，其包含能够从选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系获得的抗体的VH结构域和VL结构域：OLFM4 2/3(DSM ACC3012)，OLFM4 1/46(DSM ACC3011)，OLFM4 2/1(DSM ACC3013)，OLFM4 2/14(DSM ACC3014)，OLFM4 2/28(DSMACC3015)和OLFM4 1/23(DSM ACC3010)。
在另一个优选的实施方案中，所述抗体由选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系产生：OLFM4 2/3(DSM ACC3012)，OLFM4 1/46(DSM ACC3011)，OLFM4 2/1(DSM ACC3013)，OLFM4 2/14(DSM ACC3014)，OLFM4 2/28(DSM ACC3015)和OLFM4 1/23(DSM ACC3010)。
用于检测和/或测量生物学样品中的多肽的方法是本领域熟知的，包括但不限于蛋白质印迹，ELISAs或RIAs，或各种蛋白组学技术。可以产生用于检测多肽或肽片段目的的识别OLFM4多肽/其片段的单克隆或多克隆抗体或其肽片段(例如通过用纯化的蛋白免疫兔来产生)，或者可以使用识别所述多肽或肽片段的已知抗体。例如，能够结合变性蛋白的抗体(如多克隆抗体)可用于在蛋白质印迹中检测OLFM4多肽/其片段。用于测量标记的方法的一个实例是ELISA。这种类型的蛋白定量是基于能够捕获特异性抗原的抗体，和能够检测被捕获的抗原的第二抗体。用于制备和使用抗体的方法和上文提及的测定法描述于Harlow，E.和Lane，D.Antibodies：ALaboratory Manual，(抗体：实验室手册)(1988)，Cold Spring HarborLaboratory Press(冷泉港实验室出版社)中。
在另一个目的中，本发明提供检测组织样品中胰腺β-细胞的方法，其包括：
a)提供个体或非人动物的胰腺组织样品，
b)检测a)所述的组织样品中的OLFM4阳性细胞，其中所述OLFM4阳性细胞是β-细胞。
在一个优选的实施方案中，所述OLFM4阳性细胞通过OLFM4特异性的抗体检测，所述抗体优选本发明的抗体。
用于检测人个体或非人动物的组织样品中的β-细胞的方法可用于评估II型糖尿病疗法对胰腺生理学/组织学的作用。例如，在开发用于治疗II型糖尿病的化合物的过程中，本发明的检测β-细胞的方法可用于评估所述化合物是否对胰腺的生理学/组织学有作用，即，该化合物是否能够逆转II型糖尿病动物模型中II型糖尿病对胰腺的一些作用。
在另一个目的中，本发明提供用于检测胰腺组织样品中的β-细胞的试剂盒，其包含：
a)对OLFM4多肽特异性的抗体，优选本发明的抗体，
b)结合a)所述抗体的标记抗体或对OLFM4多肽特异性的标记抗体，和
c)用于进行免疫组织化学测定的试剂。
多肽嗅介蛋白4(Olfactomedin 4，OLFM4)的同义词是hGC-1和GW112。
术语“多肽”用于本文中时是指氨基酸的聚合物，而不是指具体长度。因此，肽、寡肽和肽片段包含于多肽的定义中。
术语“化合物”用于本文中，在关于本发明的测定中描述的“测试化合物”或“药物候选化合物”的背景下使用。因此，这些化合物包括有机或无机化合物，由合成获得或从天然来源获得。这些化合物包括无机或有机化合物如多核苷酸、脂质或激素类似物，其特征在于相对低的分子量。其它生物聚合有机测试化合物包括：包含约2至约40个氨基酸的肽和包含约40至约500个氨基酸的更大的多肽，如抗体或抗体缀合物。
术语“抗体”涵盖各种形式的抗体结构，包括但不限于完整抗体和抗体片段。本发明所述的抗体优选是人源化抗体、嵌合抗体或进一步遗传改造的抗体，只要其保留了本发明所述的特有性质。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双抗体(diabodies)、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体是例如在Houston，J.S.，Methodsin Enzymol.(酶学方法)203(1991)46-96)中描述的抗体。另外，抗体片段包括具有VH结构域特性(即能够与VL结构域组装在一起)的单链多肽，或具有结合ANG-2的VL结构域特性(即能够与VH结构域组装在一起)的单链多肽，所述组装形成功能性抗原结合位点并由此提供所述性质。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时是指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其包含来自一个来源或物种的可变区，即结合区，和获自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，所述抗体通常通过重组DNA技术制备。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的其它优选形式的“嵌合抗体”是其中来自最初抗体的恒定区已经被修饰或改变从而产生本发明的性质的那些抗体，所述性质尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性质。此类嵌合抗体也称为“类型转换抗体”。嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述基因包含编码免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA片段。产生嵌合抗体的方法涉及常规重组DNA，并且基因转染技术是本领域熟知的。参见例如Morrison，S.L.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244。
术语“人抗体”用于本文中时意欲包括具有获自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术水平中熟知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.(当前化学生物学观点)5(2001)368-374)。人抗体也可在这样的转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物能够在免疫后产生人抗体的完整库或选择物，同时没有内源免疫球蛋白产生。在此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列经抗原激发后将导致人抗体的产生(参见例如，Jakobovits，A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等人，Nature(自然)362(1993)255-258；Bruggemann，M.，等人，Year Immunol.(年度免疫学)7(1993)33-40)。人抗体也可在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227(1992)381-388；Marks，J.D.，等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。也可获得Cole等人和Boerner等人的技术用于制备人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症疗法)，Alan R.Liss，p.77(1985)；和Boerner，P.，等人，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如在本发明所述的嵌合和人源化抗体中已经提及的，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区被修饰以产生本发明所述的性质，尤其是关于C1q结合和/或FcR结合的性质，例如通过“类型转换”，即改变或突变Fc部分(例如从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)来产生。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括化学活性表面成组分子如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，以及在某些实施方案中，可具有特定三维结构特性，和/或特定电荷特性。表位是这样的抗原区域，该区域被抗体结合。
“可变结构域”(轻链可变结构域(VL)、重链可变结构域(VH))用于本文中时表示直接涉及抗体与抗原结合的轻链和重链结构域对中的每一个。可变轻链和重链结构域具有相同的一般结构，且每个结构域包括四个构架(FR)区，其序列是普遍保守的，并通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)相连。所述构架区采用β-折叠构象，且CDR可以形成连接所述β-折叠结构的环。每个链中的CDR通过构架区保持其三维结构，且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中起特别重要的作用，且因此提供本发明的另一个目的。
术语“抗体的抗原结合部分”在用于本文中时，指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基以外的那些可变结构域区。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N-末端到C-末端包括结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，和FR4。特别地，重链的CDR3是主要对抗原结合作出贡献的区域并且定义抗体的性质。CDR和FR区根据Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目的蛋白序列)，第5版.Public Health Service(公共卫生局)，National Institutes ofHealth(国立卫生研究所)，贝塞斯达，MD(1991)的标准定义和/或来自“高变环”的那些残基来确定。
单克隆抗体可使用杂交瘤方法(如由Kohler和Milstein，Nature(自然)256：495(1975)描述的那些)制备。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物典型地用免疫剂免疫以诱导淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生特异性结合所述免疫剂的抗体。
许多熟知的用于融合淋巴细胞和永生细胞系的方案中的任何方案都可用于产生本发明的单克隆抗体的目的(参见例如，G.Galfre等人(1977)Nature(自然)266：55052；Gefter等人Somatic Cell Genet.(体细胞遗传学)，上文引用；Lerner，Yale J.Biol.Med.(耶鲁生物学医学杂志)，上文引用；Kenneth，Monoclonal Antibodies(单克隆抗体)，上文引用)。此外，普通技术工作人员将理解此类方法有许多变化，它们也将是有用的。典型地，永生细胞系(例如骨髓瘤细胞系)获自与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，可通过融合来自用本发明的免疫原性制剂免疫的小鼠的淋巴细胞和永生小鼠细胞系来制备鼠杂交瘤。优选的永生细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，其对含有次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感。许多骨髓瘤细胞系中的任何细胞系都可用作根据标准技术的融合配偶体，所述细胞系例如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。这些骨髓瘤系可从ATCC获得。典型地，HAT-敏感的小鼠骨髓瘤细胞使用聚乙二醇(“PEG”)融合小鼠脾细胞。然后使用HAT培养基选择融合产生的杂交瘤细胞，该培养基杀死未融合的和非生产性融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞几天后死去，因为它们未被转化)。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞通过筛选杂交瘤培养物上清中获得结合的抗体来检测，例如使用标准ELISA测定。
抗体可使用重组方法和组成(例如如美国专利号4,816,567中所描述)产生。在一个实施方案中，提供编码本文描述的抗-OLFM4抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供包含此类核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在另一个实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已经被转化了)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制造抗-TMEM27抗体的方法，其中所述方法包括在适合所述抗体表达的条件下培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，并且任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收所述抗体。
对于本发明的抗体的重组产生，将例如如上文所描述的编码抗体的核酸分离并且插入到一个或多个载体中，用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。此类核酸可使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并且测序。
用于克隆或表达编码抗体的载体的适当的宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，尤其是当糖基化和Fc效应子功能不需要的时候。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237，5,789,199，和5,840,523。(也参见Charlton，Methods inMolecular Biology(分子生物学中的方法)，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，pp.245-254，描述了在大肠杆菌(E.coli.)中表达抗体片段)。表达后，抗体可从细菌细胞糊中以可溶性级分分离并且可进一步纯化。
从产生单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆抗体基因的方法是本领域技术人员已知的。例如，可变重链和轻链结构域(VH和VL)的遗传信息可使用聚合酶链反应(PCR)通过免疫球蛋白特异性引物从杂交瘤细胞中扩增(Methods Mol Med.2004；94：447-58)。编码可变重链和轻链结构域(VH和VL)的核酸可然后在适当载体中克隆用于在宿主细胞中表达。
附图简述：
图1A：使用抗体对OLFM4-1/23和OLFM4-2/3通过ELISA检测在10个人血浆样品中的OLFM4多肽，
图1B：使用抗体对OLFM4-2/1和OLFM4-2/28通过ELISA检测在10个人血浆样品中的OLFM4多肽，
图1C：使用抗体对OLFM4-2/28和OLFM4-2/14通过ELISA检测在10个人血浆样品中的OLFM4多肽，
图2A：使用单克隆抗体OLFM4-2/1与10个人血浆样品的免疫沉淀(IP)，
图2B：使用单克隆抗体OLFM4-2/3与10个人血浆样品的免疫沉淀(IP)，
图2C：使用单克隆抗体OLFM4-2/28与10个人血浆样品的免疫沉淀(IP)，
图2D：使用单克隆抗体OLFM4-2/14与10个人血浆样品的免疫沉淀(IP)，
图3A：使用抗体对OLFM4 2/1和OLFM4 2/28通过ELISA检测在选自下述组的人受试者的血浆样品中的OLFM4多肽：健康对照，空腹血糖受损(IFG)，糖耐量减低(IGT)，空腹血糖受损+糖耐量减低(IFG+IGT)，1型糖尿病患者(T1D)和2型糖尿病患者(T2D)，
图3B：使用抗体对OLFM4 2/28和OLFM4 2/14通过ELISA检测在选自下述组的人受试者的血浆样品中的OLFM4多肽：健康对照，空腹血糖受损(IFG)，糖耐量减低(IGT)，和空腹血糖受损+糖耐量减低(IFG+IGT)，1型糖尿病患者(T1D)和2型糖尿病患者(T2D)，
图4A：使用单克隆抗体hOLFM4 1/46的人组织阵列的免疫组织化学(IHC)染色，
图4B和C：使用单克隆抗体hOLFM4 1/46对人胰岛染色(OLFM4：绿色，胰高血糖素：红色，DAPI：蓝色)。
实施例
本发明的单克隆抗人OLFM4抗体
下述五种产生针对人OLFM4的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系已经于2009年10月7日以霍夫曼-拉罗奇有限公司(F.Hoffmann-La Roche Ltd.)的名义保藏于DSMZ-(德国微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH))并且收到下列保藏号：
OLMF4-1/23 ＝DSM ACC3010
OLMF4-1/46 ＝DSM ACC3011
OLMF4-2/3 ＝DSMACC3012
OLMF4-2/1 ＝DSM ACC3013
OLMF4-2/14 ＝DSM ACC3014
OLMF4-2/28 ＝DSM ACC3015
产生针对人OLFM4的小鼠单克隆抗体(小鼠OLFM4 mAbs)
用于产生单克隆抗体的重组人OLFM4融合多肽的氨基酸序列如下给出：
GSGGSVSQLFSNFTGSVDDRGTCQCSVSLPDTTFPVDRVERLEFTAHVLSQKFEKE
LSKVREYVQLISVYEKKLLNLTVRIDIMEKDTISYTELDFELIKVEVKEMEKLVIQL
KESFGGSSEIVDQLEVEIRNMTLLVEKLETLDKNNVLAIRREIVALKTKLKECEASK
DQNTPVVHPPPTPGSCGHGGVVNISKPSVVQLNWRGFSYLYGAWGRDYSPQHPN
KGLYVAPLNTDGRLLEYYRLYNTLDDLLLYINARELRTYGQGSGTAVYNNNMYV
NMYNTGNIARVNLTTNTIAVTQTLPNAAYNNRFSYAVAWQDIDFAVDENGLWVI
YSTEASTGNMVISKLNDTTLQVLNTWYTKQYKPSASNAFMVCGVLYATRTMNTR
TEEIFYYDTNTGKEGKLDIVMHKMQEKVQSINYNPFDQLYVYNDGYLL-
NYDLSVLQKPQHHHHHH(Seq.Id.No.2)
将小鼠用在昆虫细胞中产生的偶联His标签的重组OLFM4 5μg/注射免疫。在第0，13和28天在ImmunEasy佐剂(ALHY-DROGEL 2％+CPG-ODN)中以20μl的体积ip进行免疫。通过从第41天采血，通过ELISA评价动物对重组的OLFM4的免疫应答。在第56天超加强(Superboost)(PBS中的5μg重组OLFM4 iv)2只选择的动物，2天后融合脾细胞与PAI-细胞。通过ELISA针对重组的OLFM4进行杂交瘤筛选以及克隆评价。
ELISA 特异性验证
在ELISA中使用三对本发明的mAbs：
  包被-mAb   检测-mAb
  1   OLFM4-1/23   OLFM4-2/3-生物素
  2   OLFM4-2/1   OLFM4-2/28-生物素
  3   OLFM4-2/28   OLFM4-2/14-生物素
10个对照人血浆的ELISA-结果
测定的结果在图1A-图1C中给出：
Hu 1-Hu 10：对照人血清(血液供体人血浆)
阳性对照(OLFM4)：INS-1 hOLFM4 WT F11
阴性对照(med)：培养基
使用三种不同ELISA测定测试10个人血浆样品给出非常相似的结果。这验证了测定的特异性。这些样品进一步用于通过免疫沉淀(IP)定性验证这些ELISA结果。
通过IP(免疫沉淀(IP)-最终选择的mAb对：血液供体人血浆和INS-1 hOLFM4 WT F11/培养基)定性证实ELISAs
使用在之前ELISA中使用的人血浆样品来进行免疫沉淀(IP)，用于评价通过不同技术是否获得相似结果(参见图2A-D)。ELISA和IP结果之间完全匹配。这非常重要，因为它是使用两种不同技术的结果的定性证实。
在IP实验中使用下述样品和抗体：
样品：
Figure BDA00001677893900111
MWM：分子量标记；对照与ELISA测定中相同。
抗体：
图2A：OLFM4-2/1
图2B：OLFM4-2/3
图2C：OLFM4-2/28
图2D：OLFM4-2/14
IP测定的结果在图2A-D中给出。
在ELISA中的阳性样品(#1-5和#7-10)在IP中也是阳性的。在ELISA中阴性的样品(#6)在IP中也是阴性。将INS-1 OLFM4上清和培养基分别用作阳性和阴性对照。这是通过IP定性确认ELISA结果。
人横断面队列(cross sectional cohort)的ELISA结果：在前驱糖尿病(pre-diabetic)和糖尿病患者(Bratislava队列)中OLFM4显著降低。
图3A+3B
人血浆队列
受试者筛选
满足下述入选标准的来自门诊病人门诊部登记簿的具有T2D代谢风险的大约200受试者：
性别：男性
年龄：40-55岁
BMI：25-32kg/m2
HbAlC≤7.0％
进行口服葡萄糖耐受测试(75g)。排除标准包括以前已知葡萄糖代谢改变，使用已知改变胰岛素分泌或作用的药物，和存在肝或内分泌疾病。在收集血液样品前，使用标准方案评估身高和重量。体重指数(BMI)计算为重量(千克)除以高度(米)的平方。在10-12小时过夜禁食后并且在2小时葡萄糖负荷后，将来自肘前静脉的全血样品(20ml)收集到EDTA试管中。为了获得适当的禁食状态，向参加者提供关于食物种类和它们最后摄入时间的精确说明。通过离心分离的血浆在分析前以1ml的等分试样(10x)存储于-80℃。
在该研究中招募签署知情同意书并且满足合格标准的患者。斯洛伐克科学院(Slovak Academy of Sciences)实验内分泌学研究所(Institute ofExperimental Endocrinology)的伦理委员会(The Ethical committee)批准了所述研究的方案。
诊断
将受试者根据ADA指南2005(Diabetes Care.(糖尿病护理)2005年1月；28增刊1：S37-42)分为4个不同的组：
健康对照：禁食血浆葡萄糖(FPG)＜5.6mmol/l并且正常葡萄糖耐受(NGT)＜7.8mmol/l。
空腹血糖受损(IFG)：IFG定义为FPG值在≥5.6和＜6.9mmol/l之间并且在激发后2小时正常糖耐量(NGT)＜7.8mmol/l。
糖耐量减低(IGT)：IGT定义为负荷后2小时葡萄糖浓度在≥7.8和＜11.1mmol/l之间。
空腹血糖受损和葡萄糖耐受(IFG+IGT)：IGT+IFG定义为FPG值在≥5.6和＜6.9mmol/l之间并且激发后2小时的NGT值在≥7.8和＜11.1mmol/l)之间。
另外，还选择了来自门诊病人门诊部登记簿的一组8名1型糖尿病患者和一组11名2型患者。患有血脂异常的患者用降血脂剂(hypolipidemicagents)(例如他汀类(statins)或贝特类(fibrates))治疗。
糖尿病受试者的总结表
Figure BDA00001677893900131
患有1型糖尿病(T1-DM)，2型糖尿病(T2-DM)，糖耐量减低(IGT)，空腹血糖受损(IFG)，糖耐量减低(IGT)和IFG+IGT的受试者的平均人体测量和实验室特征
在ELISA测定中使用下述OLFM4单克隆抗体对：
图3A：抗体：2/1-2/28
图3B：抗体：2/28-2/14
横断面队列的ELISA结果显示在前驱糖尿病患者(IFG+IGT，IFG和IGT)中OLFM4水平比在健康对照患者中显著更低(图3A和3B)。OLFM4水平在T2DM患者中也更低。有趣的是，OLFM4水平在T1DM患者中更高，尽管不显著(Dunnett’s修正的ANOVA)。T2DM和T1DM组患者均在进行治疗中。
鉴于OLFM4在未治疗的前驱糖尿病患者中显著降低，我们认为OLFM4可用作早期T2D发病的标记。
OLFM4作为胰腺β-细胞的标记
使用单克隆抗体hOLFM4 1/46的人组织阵列(Human Tissue Array)的免疫组织化学(IHC)染色。可靠的(robust)结果显示任何测试的组织中没有特异性染色，而在人胰岛(人胰腺切片)的β-细胞中检测到非常强且特异性的信号。注意在组织微阵列中胰腺切片显示阴性，因为在这种组织微阵列的胰腺点中仅有外分泌组织并且没有胰岛结构存在。
图4A：用单克隆抗体hOLFM4 1/46染色的人组织阵列
图4B和C：用单克隆抗体hOLFM4 1/46染色的人胰岛(OLFM4：绿色，胰高血糖素：红色，DAPI：蓝色)。
材料和方法
ELISA方案
包被：
包被-mAb：PBS中5μg/ml，100μl/孔
→在湿润箱中在4℃过夜
→2x洗涤PBS-吐温
封闭：
B-缓冲液
200μl/孔
→在37℃ 1h
→2x洗涤 PBS-吐温
样品和检测-mAb：
生物素化检测-mAb，在B-缓冲液中1μg/ml：25μl/孔
样品(人血浆)：在B-缓冲液中稀释，从未稀释的血浆开始，以1∶2进行到1∶128(8个浓度)30μl/孔
向平板添加第一个25μl检测-mAb，然后30μl样品
→在湿润箱中在振荡器上4℃过夜
→4x洗涤 PBS-吐温
缀合物：
PIERCE 链霉抗生物素(Streptavidine)-HRPO(No 21126)，1μg/ml，在B-缓冲液中
50μl/孔
→在室温1h
→4x洗涤 PBS-吐温
底物：
3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)，100μl/孔
5min后用0.5M H2SO4，100μl/孔停止反应
在450nm读数
细胞培养
多西环素(doxycline)可诱导大鼠胰岛素瘤INS-1 hOLFM4 WT和INS-1hOLFM4-His稳定细胞系(分别为表达野生型(hOLFM4 WT)和带His标签的(hOLFM4-His)人OLFM4形式)如先前所述(Wang等人2001)进行培养。两种INS-1细胞系均在RPMI 1640+GlutaMAX-1培养基(Invitrogen，卡尔斯巴德，CA)中培养，所述培养基含有10mM Hepes(pH 7.4)，1mM丙酮酸钠，50μM 2-巯基乙醇，10％热灭活胎牛血清(FBS)，青霉素和链霉素。添加五十μg/ml G418硫酸盐(Promega，麦迪逊，WI)和50μg/ml zeosin(Invitrogen)用于生长选择。通过500ng/ml多西环素(Dox)(Sigma)诱导hOLFM4 WT和hOLFM4-His的过表达达96小时。细胞在潮湿的保温箱中在37℃和5％ CO2(下标2)中生长。
免疫沉淀(IP)和免疫印迹(蛋白质印迹，WB)
将60-90％汇合细胞在存在或不存在500ng/ml多西环素情况下在10cm培养皿中培养96小时。将上清(细胞培养基)在无菌条件下收获，在2000rpm离心10分钟，并存储在4℃。将细胞在1X PBS中洗涤两次并用1mL裂解缓冲液裂解。5分钟后，将细胞在1.5mL Eppendorf管中收集并全速离心5分钟。收集上清(全细胞提取物)，等分，在液氮中速冻并存储在-80℃。对于IP，将3mL上清(细胞培养基)与1μg每种mAb混合并在轨道式振荡器上4℃温育48小时。将在1X PBS-吐温(0.05％)中稀释50％的二十五μL蛋白质A Sepaharose CL-4B添加到每个反应中并在RT在轨道式振荡器上温育1小时。将试管通过旋转获得沉淀(spin-down)并且将沉淀用1X PBS-吐温(0.05％)洗涤2次和用1X PBS洗涤1次。将三十五μL的1X LDS-SB/10％ β-ME添加到每个沉淀并且将样品剧烈涡旋(哪个词：被涡旋？)且通过旋转获得沉淀，然后装载于SDS-PAGE胶中。免疫印迹，使用增强的化学发光(Pierce，Rockford，IL，USA)检测，如以前所述(WangH，J Biol Chem(生物化学杂志)2001)进行。
免疫组织化学(IHC)
将福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的切片用于组装玻片。将玻片浸泡在二甲苯(x2)，100％ EtOH，95％ EtOH，80％ EtOH，70％ EtOH，和1XPBS中(各自3分钟)对样品进行顺次脱水。通过将玻片浸泡在1X柠檬酸盐缓冲液中并将它们在微波炉(在850瓦特)煮沸3分钟进行抗原修复。用水淋洗玻片两次后，将细胞用100μL 1X PBS中的0.2％ Triton在RT透性化(permeabilized)10分钟。用1X PBS洗涤3次后，用1X PBS中的2％BSA在RT进行封闭30′至1h。再用1X PBS洗涤三次，然后进行初级Ab温育(在37℃ 1-2小时或在4℃ O/N)。再用1X PBS洗涤三次后，在黑暗中在RT与次级Ab温育1h。再进行三次洗涤并且进行DAPI染色(在黑暗中在RT 5-10分钟)。三次最终洗涤并且组装盖玻片。
将FDA标准人组织微阵列(T8234700，Biochain)用小鼠抗-OLFM4单克隆抗体染色，随后用Alexa 488缀合的驴抗小鼠和Alexa 555驴抗兔次级抗体(Invitrogene)染色。
通过Asterand获得的人胰腺切片与小鼠抗-OLFM4单克隆抗体和兔抗-胰高血糖素多克隆抗体两者共染色，随后用Alexa 488缀合的驴抗小鼠和Alexa 555驴抗兔次级抗体(Invitrogene)染色。
尽管显示和描述了目前本发明的优选实施方案，应当明确理解本发明不限于此，而是可以在后附权利要求书的范围内以其他方式体现和实施。
Figure BDA00001677893900181
Figure BDA00001677893900191
Figure BDA00001677893900201
Figure IDA00001677894900011
Figure IDA00001677894900021

Claims (24)

1.用于诊断II型糖尿病或确定个体发展II型糖尿病的素因的方法，其包括下述步骤：
测量所述个体的组织样品中嗅介蛋白4(OLFM4)多肽水平，其中与代表健康群体的OLFM4多肽水平相比，所述个体的所述样品中降低的OLFM4多肽水平指示II型糖尿病或发展II型糖尿病的素因。
2.权利要求1的方法，其中所述组织是血液，优选血浆。
3.鉴别用于治疗II型糖尿病的化合物的方法，其包括下述步骤：
c)将所述化合物施用给患有II型糖尿病的非人动物，
d)测量步骤a)的非人动物的组织样品中OLFM4多肽水平，其中与没有被施用化合物的患有II型糖尿病的非人动物的组织样品中OLFM4多肽水平相比，步骤a)的非人动物的组织样品中改变的OLFM4多肽水平指示用于治疗II型糖尿病的化合物。
4.权利要求3的方法，其中所述组织是血液，优选血浆。
5.权利要求3或4的方法，其中所述非人动物是啮齿动物，优选小鼠或大鼠。
6.权利要求5的方法，其中所述啮齿动物是ZDF大鼠或ob/ob小鼠。
7.OLFM4多肽用于诊断II型糖尿病或用于确定个体发展II型糖尿病的素因的应用。
8.权利要求7的应用，其中所述OLFM4多肽是人OLFM4多肽。
9.特异性结合OLFM4多肽的抗体用于诊断II型糖尿病或用于确定个体发展II型糖尿病的素因的应用。
10.权利要求9的应用，其中所述抗体结合人OLFM4多肽。
11.用于诊断II型糖尿病或确定个体中发展II型糖尿病的素因的试剂盒，其包含：
d)对OLFM4多肽特异性的抗体，优选权利要求13-16的抗体，
e)结合a)所述抗体的标记抗体，或结合a)的被捕获的OLFM4多肽的标记抗体，和
f)用于进行诊断测定的试剂。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述对OLFM4多肽特异性的抗体结合人OLFM4多肽。
13.针对人OLFM4多肽的单克隆抗体。
14.权利要求13的抗体，其中所述抗体包含能够从选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系获得的抗体的VH结构域的CDR1-CDR3：OLFM4 2/3(DSM ACC3012)，OLFM4 1/46(DSM ACC3011)，OLFM4 2/1(DSMACC3013)，OLFM4 2/14(DSM ACC3014)，OLFM4 2/28(DSM ACC3015)和OLFM4 1/23(DSM ACC3010)，和能够从选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系获得的抗体的VL结构域的CDR1-CDR3：OLFM4 2/3(DSMACC3012)，OLFM4 1/46(DSM ACC3011)，OLFM4 2/1(DSM ACC3013)，OLFM4 2/14(DSM ACC3014)，OLFM4 2/28(DSM ACC3015)和OLFM41/23(DSM ACC3010)。
15.权利要求13或14的抗体，其中所述抗体包含能够从选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系获得的抗体的VH结构域和VL结构域：OLFM42/3(DSM ACC3012)，OLFM4 1/46(DSM ACC3011)，OLFM4 2/1(DSMACC3013)，OLFM4 2/14(DSM ACC3014)，OLFM4 2/28(DSM ACC3015)和OLFM4 1/23(DSM ACC3010)。
16.权利要求13-15的抗体，其中所述抗体由选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系产生：OLFM4 2/3(DSM ACC3012)，OLFM4 1/46(DSMACC3011)，OLFM4 2/1(DSM ACC3013)，OLFM4 2/14(DSM ACC3014)，OLFM4 2/28(DSM ACC3015)和OLFM4 1/23(DSM ACC3010)。
17.选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系：OLFM4 2/3(DSMACC3012)，OLFM4 1/46(DSM ACC3011)，OLFM4 2/1(DSM ACC3013)，OLFM4 2/14(DSM ACC3014)，OLFM4 2/28(DSM ACC3015)和OLFM41/23(DSM ACC3010)。
18.核酸序列，其包含编码能够从选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系获得的抗体的VH结构域的序列：OLFM4 2/3(DSM ACC3012)，OLFM41/46(DSM ACC3011)，OLFM4 2/1(DSM ACC3013)，OLFM4 2/14(DSMACC3014)，OLFM4 2/28(DSM ACC3015)和OLFM4 1/23(DSM ACC3010)。
19.核酸序列，其包含编码能够从选自由以下组成的组的杂交瘤细胞系获得的抗体的VL结构域的序列：OLFM4 2/3(DSM ACC3012)，OLFM41/46(DSM ACC3011)，OLFM4 2/1(DSM ACC3013)，OLFM4 2/14(DSMACC3014)，OLFM4 2/28(DSM ACC3015)和OLFM4 1/23(DSM ACC3010)。
20.OLFM4多肽作为胰腺β-细胞标记的应用。
21.检测组织样品中胰腺β-细胞的方法，其包括：
c)提供个体或非人动物的胰腺组织样品，
d)检测a)所述的组织样品中的OLFM4阳性细胞，其中所述OLFM4阳性细胞是β-细胞。
22.权利要求21的方法，其中所述OLFM4阳性细胞通过OLFM4特异性的抗体检测，所述抗体优选权利要求13-16的抗体。
23.用于检测胰腺组织样品中的β-细胞的试剂盒，其包含：
a)对OLFM4多肽特异性的抗体，优选权利要求13-16的抗体，
b)结合a)所述抗体的标记抗体，和
c)用于进行免疫组织化学测定的试剂。
24.基本上如上文所描述的，特别是参照前述实施例的方法和抗体。
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