JPWO2009072660A1 - 抗体作製方法 - Google Patents
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Abstract
体外で免疫用細胞を含む組織を抗原と刺激物質を含む培養液中で免疫する工程と、前記免疫された細胞を選別する工程と、前記選別された免疫細胞から抗体を得る工程とを含む抗体作製方法。この抗体作製方法によると、抗体を短時間で大量に作製することができ、よって免疫学的検査の普及に寄与することができる。
Description
本発明は抗体作製方法に関する。
周知の通り、生体防御機能のなかでもその中心的な存在である免疫機能の解明は、疾病の診断、治療において、重要な課題となりつつある。例えば、癌、糖尿病等の生活習慣病の他各種疾病の診断に用いられる手法の中で、疾病に深く関わりのあるマーカー物質の濃度、量を目視可能に検出するイムノクロマト法のように、より簡易的診断が可能なものまでも提案されており、研究用試薬、診断用試薬、各種物質モニター用試薬、免疫学的診断、治療の分野はより拡大していくものであるが、当該方法における抗体の安定した確保は、今後より重要になってくることが明らかである。また、ファージディスプレイ系を用いた抗体ライブラリー作製技術が開発され、ヒト抗体単離も可能となっている。
ところで、免疫学的測定に必要なモノクローナル抗体の作製は、まずマウスに抗原を注射（免疫）する工程で約３ヶ月を要する。その後抗体を産生しているＢ細胞群を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合する。この工程によって、無限に増殖することが可能な抗体産生細胞（ハイブリドーマ）群を構築する。最後にこのハイブリドーマ群の中から、目的にあった抗体を産生している細胞を選別（クローニング）し、この細胞を用いて抗体の大量調製を実施する。このクローニング工程では、ハイブリドーマ群を希釈し、１ウェルに１細胞しかいないという状態にして、１細胞から培養を行う。これを抗体の性質が検討できる細胞濃度まで増殖させ、得られるモノクローナル抗体の性質を検査する。この検査で陽性となったウェルを再度希釈し、上記と同様に検査を実施する。この操作を複数回実施し、使用に耐えうるハイブリドーマを分離取得する。この工程１サイクルに約２週間を要し、全体で約３ヶ月以上を要する場合もある。このようにモノクローナル抗体の作製には手間と時間のかかる作業が必要であり、また、これを専門の業者に依頼すると、抗体の作製費用が高額となる。
ここで、公知文献を挙げて抗体作製方法を具体的に説明すると、特開平１０−２８２０９７号公報には、アジュバンド物質、サイトカインの組合せを特徴とする抗原に対する特異的な免疫法が記載されている。特開２００４−１２１２３７号公報には、抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された抹消血リンパ球細胞を、エプスタインバールウィルスにより不死化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離して抗原特異的抗体産生Ｂ細胞を調製し、さらにこのＢ細胞を培養することを特徴とする抗原特異的抗体の製造方法が記載されている。特開２００６−１８０７０８号公報には、標識化抗原をターゲット細胞に結合させる工程と、標識化ターゲット細胞を分離する工程と、抗体遺伝子を調製する工程と、抗体遺伝子を発現ベクターを用いて発現させる工程とを含む抗体作製方法が記載されている。また、特表２００６−５１６４０８号公報には、一連の工程を経て、目的の抗体からヒト化高親和性抗体を作製する方法が記載されている。
ところで、免疫学的測定に必要なモノクローナル抗体の作製は、まずマウスに抗原を注射（免疫）する工程で約３ヶ月を要する。その後抗体を産生しているＢ細胞群を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合する。この工程によって、無限に増殖することが可能な抗体産生細胞（ハイブリドーマ）群を構築する。最後にこのハイブリドーマ群の中から、目的にあった抗体を産生している細胞を選別（クローニング）し、この細胞を用いて抗体の大量調製を実施する。このクローニング工程では、ハイブリドーマ群を希釈し、１ウェルに１細胞しかいないという状態にして、１細胞から培養を行う。これを抗体の性質が検討できる細胞濃度まで増殖させ、得られるモノクローナル抗体の性質を検査する。この検査で陽性となったウェルを再度希釈し、上記と同様に検査を実施する。この操作を複数回実施し、使用に耐えうるハイブリドーマを分離取得する。この工程１サイクルに約２週間を要し、全体で約３ヶ月以上を要する場合もある。このようにモノクローナル抗体の作製には手間と時間のかかる作業が必要であり、また、これを専門の業者に依頼すると、抗体の作製費用が高額となる。
ここで、公知文献を挙げて抗体作製方法を具体的に説明すると、特開平１０−２８２０９７号公報には、アジュバンド物質、サイトカインの組合せを特徴とする抗原に対する特異的な免疫法が記載されている。特開２００４−１２１２３７号公報には、抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された抹消血リンパ球細胞を、エプスタインバールウィルスにより不死化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離して抗原特異的抗体産生Ｂ細胞を調製し、さらにこのＢ細胞を培養することを特徴とする抗原特異的抗体の製造方法が記載されている。特開２００６−１８０７０８号公報には、標識化抗原をターゲット細胞に結合させる工程と、標識化ターゲット細胞を分離する工程と、抗体遺伝子を調製する工程と、抗体遺伝子を発現ベクターを用いて発現させる工程とを含む抗体作製方法が記載されている。また、特表２００６−５１６４０８号公報には、一連の工程を経て、目的の抗体からヒト化高親和性抗体を作製する方法が記載されている。
本発明の目的は、したがって、手間と時間が係る作業が必要な抗体作製をより短時間で、しかも容易に抗体が作製できるような新規な抗体作製方法を提供することにある。
また、本発明は、これらの新規な抗体作製手法に基づき、腎臓癌マーカーとして今般注目されているＳ１００Ａ１０タンパク質の免疫学的測定、治療に有効な抗体作製方法を実現することを目的としている。Ｓ１００Ａ１０タンパク質は、高山達也他、腎細胞癌におけるＳ１００Ａ１０蛋白の特異的発現，腎癌研究会会報，２８：９−１０，２００５等で示されるように、腎臓癌マーカーとしても有用であり、当該マーカーは、尿成分からも得られることから、腎臓癌の簡易的な診断においてその価値が高いからである。
これらの目的を達成するため、本発明は、体外で免疫用細胞を含む組織を抗原と刺激物質を含む培養液中で免疫する工程と、その免疫された細胞を選別する工程と、その選別された免疫細胞から抗体を得る工程とを含む抗体作製方法を提供する。
すなわち、本発明は、いわゆる体外免疫法において、特定の刺激物質を添加した培養液で、抗原による感作免疫細胞を得ることで、通常必要としていた時間の数十分の一の時間で抗体を作製することを実現したものである。
より詳細には、まず、異物（抗原）が体内に入ると、マクロファージや樹状細胞がこれを細胞内に取り込む。異物は、細胞内で分解し、分解産物を細胞膜表面上に提示する。次いで、分解産物にナイーブＴ細胞が近づき、ナイーブＴ細胞表面のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介して抗原を認識する。この過程を経てＴ細胞が活性化され、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）となる。
一方Ｂ細胞も体内に侵入した異物（抗原）を細胞表面上のＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）で認識して細胞内に取り込む。取り込んだ抗原をやはり分解し、分解産物をＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ分子上に提示する。この際に細胞膜表面にＣＤ４０という分子も同時に発現する。
このようにしてできたＴｈ２と抗原提示Ｂ細胞が近づき、互いに認識することでＢ細胞の活性化と抗体のクラススイッチが入る。この際に、同じ抗原で活性化した分子同士でなければかかる現象は発現しない。
なお、上記の場合には免疫反応を生体内で実施しているけれども、この免疫反応を生体外で発生させる方法が、いわゆる体外免疫法である。
本発明は、生体外において、所望の抗体産生細胞を得るために、刺激物質を添加してＢ細胞を抗体産生細胞（プラズマ細胞）又はメモリーＢ細胞へと分化誘導するものである。ここで、刺激物質とは、例えばＢ細胞、樹状細胞、Ｔ細胞などのような免疫担当細胞の膜表面に発現しているレセプター分子と相互作用可能である限り、特に制限はない。本発明の実施には、特にサイトカインレセプターに対する刺激物質として、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、表面抗原に対する刺激物質としてＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）、ＢＡＦＦ（Ｂ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、ＡＰＲＩＬ（Ａ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤ４０ ｌｉｇａｎｄ、ＣＤ３８ ｌｉｇａｎｄ、ＢＣＤＦ（Ｂ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）、ＢＣＡＦ（Ｂ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）、シグナル伝達に関与する受容体に対する刺激物質としてＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）等が例示される。刺激物質の使用濃度は、免疫する細胞濃度に依存して変化するけれども、ＬＰＳは１０ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの濃度が良く、特に２０〜８０μｇ／ｍＬの濃度が推奨される。また、ＬＰＳ以外の物質では、一般に１ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの濃度が良く、特に１０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬの濃度が推奨される。また、これら物質の機能を代替するアゴニスト抗体であっても問題はない。その分化誘導の過程において、特にＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体刺激により、抗体の親和性成熟及びクラススイッチを誘導し、より親和性の高い抗体となすことができる。
さらに、ＦＡＣＳｃａｎのようなフローサイトメトリー等に基づく細胞分離装置を用いて、目的とした細胞を染色して選別する手法を利用した感作免疫細胞の検出及び分離を行う。
本発明における免疫細胞の選別及び検出の際に用いられる染色剤としては、特に限定されものではない。例えば、染色剤としてＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅを用いて増殖・生存しているＢ細胞を検出しているが、その他、フローサイトメトリーの際に用いられるＦＩＴＣやＰＥなどの蛍光物質を標識した抗原や抗体、さらに細胞内のカルシウム濃度を検出するＦｕｒａ−２のような蛍光プローブや細胞内のＤＮＡを染色するエチジウムブロマイドに代表されるＤＮＡ染色剤等、目的とする免疫細胞を染色できるものであれば、適宜使用することができる。
また、クラススイッチやアフィニティマチュレーションの発生した細胞を選別する際も、上記したものと同様の染色剤を適宜使用することができる。
染色された細胞を検出・選別する手法は、例えばフローサイトメトリー等の細胞分離装置の他、例えばヘモサイトメーター等の血球計算盤や、電気泳動デバイス、遠心分離デバイス、磁気ビーズデバイス、マイクロ流路デバイスなどを好適に利用することができる。
また、この分離された細胞と、ミエローマ細胞を融合させて、ハイブリドーマを得ても良いが、ハイブリドーマを得る必要は必ずしもない。
さらに、本発明は、抗体遺伝子を得るための細胞を、組織上から選別すべく、体外免疫工程により、免疫細胞を選別し、その免疫細胞から、抗体遺伝子をＰＣＲ手法を用いて形成し、これを宿主細胞に導入して培養発現し、抗体の大量生産をする構成を取り得るものであり、当該手法によれば、組織片から免疫後の細胞を得るため、作業効率の向上が図れる。
当該細胞から得られる抗体遺伝子をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、更に大腸菌等の宿主細胞により、好ましくはコロニー化させて抗体を得る工程を組み合わせることで、大量の抗体を短時間で作製することが可能となる。宿主細胞としては、大腸菌の他、ストレプトマイセス、枯草菌、酵母、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、等が例示される。
また、発現ベクターとしては、宿主細胞で発現されるものであれば、特に限定されるものではない。発現ベクターとして、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、染色体、エピソーム、ウィルス由来、レトロウィルス由来のベクターなどを例示することができる。
上記したような課題に加えて、本発明者らは、体外で免疫細胞を選別し得たとしても、スクリーニングまでの準備としてのハイブリドーマ形成工程を要することなく抗体遺伝子の分離ができないかという課題にも取り組んだ。
本発明者らは、体外免疫手法を採るに際し、メモリーＢ細胞又はプラズマ細胞へ分化誘導及び、その過程で発生すると考えられる抗体の親和性成熟・クラススイッチを所定の刺激物質の添加により実現できるという知見を得、本発明を完成した。
従来、高親和性抗体の作製は、生体内においては、繰り返し抗原を免疫することにより、メモリーＢ細胞又はプラズマ細胞への分化誘導を行い、その過程で発生すると考えられる抗体の親和性成熟・クラススイッチを利用している。分化誘導した免疫細胞からハイブリドーマを形成し、スクリーニングを行うことで高親和性抗体を得ている。一方、生体外の場合は、ハイブリドーマや市販のライブラリーなどから得た抗体遺伝子にＰＣＲを用いたランダム変異導入法等により様々な変異を導入したライブラリーを構築し、ファージミドベクターへの組み込みを経て、パニング法によって、強い抗体をスクリーニングする方法が主であった。
しかしながら、本発明者らは、生体外で特定の刺激物質を、所定の環境下で、供給することでもメモリーＢ細胞又はプラズマ細胞への分化誘導及び、その過程で発生すると考えられる抗体の親和性成熟・クラススイッチが可能であることを知見したのである。また、刺激物質の導入は、Ｂ細胞をメモリーＢ細胞、プラズマ細胞へ分化誘導することを可能としていることから、体外免疫における当該手法は、従来の脾臓細胞そのものもしくは、Ｂ細胞とＴ細胞の共培養状態でしか免疫ができなかったものを、Ｂ細胞のみであっても免疫可能にし、抗原も従来の体外免疫法同様、生体内での免疫に比べて１／１０００〜１／１００００程度の少量で可能となった。
さらに、本発明において使用する刺激物質は、親和性成熟や抗体のクラススイッチに関係している蛋白質の発現を誘導し、その結果、抗体のＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチを迅速にかつ確実に行わせることも実現した。
要するに、本発明は、いわゆる体外免疫法において、組織片をすり潰す等して得られる細胞に特定の刺激物質を添加した培養液で、抗原による感作を行い免疫細胞を得ることで、通常免疫動物を免疫した場合に必要としていた時間の数十分の一の時間で実現できるようにしたものである。
上記のような本発明による抗体作製方法の実施において、生体内及び生体外において免疫反応を発生させる方法は、すでに説明したような手法によって有利に実施することができる。
本発明における体外免疫手法において、各種の刺激物質と各種の分化、誘導等との関係について以下に説明する。
本発明で示す抗原は、免疫用組織片調製直後の１回で充分であるが、２〜３日の間隔を置いて、複数回行っても制限はない。またその際の抗原濃度は１ｐｍｏｌ〜１ｍｍｏｌが好ましく、例えば１ｎｍｏｌを例示することができる。
抗原刺激を補助する目的でＬＰＳに代表されるＴＬＲ（Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を刺激する物質を添加しても良い。この刺激物質の添加は、抗原刺激の度に行うことが好ましく、添加量は１０ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの濃度が良く、特に２０〜８０μｇ／ｍＬの濃度が良い。
また、本発明で示す、メモリーＢ細胞又はプラズマ細胞へ分化誘導及び、その過程で発生すると考えられる抗体の親和性成熟・クラススイッチの誘導用刺激物質としては、前述の刺激物質であれば特に制限はないが、特にＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体が好ましい。添加濃度は、ＩＬ−４、ＩＬ−５は１ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの濃度が良く、特に１０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬが好ましく、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体は１ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの濃度が良く、特に１００ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬが好ましい。また、この刺激物質の添加は、抗原刺激の度に行うことが好ましい。
本発明における体外で行う免疫用の組織片を構成する細胞としては、例えば、上述したものの他、例えばマウス、ラット、モルモット、ラビットなどのような免疫動物由来の臓器・組織から得た細胞、ｉＰＳ細胞・ＥＳ細胞を分化させて調整した免疫担当細胞、培養細胞株を分化させて調整した免疫担当細胞などを例示することができる。
本発明で用いられる抗原には、例えば、ｈ（ヒト）Ｓ１００Ａ１０、ｈｅ（鶏）ＥＬ、ｈ（ヒト）Ｒａｓ、ｈ（ヒト）ｒａｐ７４，ｈ（ヒト）ＴＯＰＯ２Ｂ、ｂ（ウシ）ＳＡ、ｂ（ウシ）Ｃａｓｅｉｎ等のマウス由来以外の蛋白質、マウス由来のｍ（マウス）Ｓ１００Ａ１０、ｍＳＡ、ｍＭａｐｋ１等の蛋白質、ペプチド（４種類：７ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１６ｍｅｒ、２０ｍｅｒ）などを例示することができる。さらに、本発明の実施では、従来抗体を得るために用いることができない、低分子化合物（ローダミン等の蛍光物質、ＦＩＴＣ）も利用可能となる。
本発明は、体外での目的に応じた刺激物質の導入により、Ｔ細胞を必要とせず、Ｂ細胞を抗体産生細胞に分化誘導する工程により、低分子抗原の利用が可能になるほか、クラススイッチによる好ましい抗体、親和性成熟による抗体が得られる免疫細胞を得ることができる。
さらに、上記したように、ＦＡＣＳｃａｎのようなフローサイトメトリー等に基づく細胞分離装置を用いて、目的とした細胞を染色して選別する手法を利用した感作免疫細胞の検出及び分離を行う。
その他、得られる免疫細胞の大きさは、他の細胞に比べ大きいこと、更に親和度を成熟させた場合、細胞の大きさがより大きくなることもあるため、細胞の大きさによって、選別することも可能である。また、当該細胞の大きさにより、選別する手法としては、例えば特開２００７−１７５６８４号公報等に記載された手法を好適に使用することができる。
本発明における免疫細胞の選別、検出の際に用いられる染色剤は、すでに説明した通りである。また、クラススイッチやアフィニティマチュレーションの発生した細胞を選別する際も、上記したように、同様の染色剤を適宜使用することができる。
さらに、本発明は、上記したように、抗体遺伝子を得るための細胞を、組織上から、体外免疫工程により、免疫細胞を選別し、その免疫細胞から、抗体遺伝子をＰＣＲ法を用いて形成し、これを宿主細胞に導入して培養発現し、抗体の大量生産をする構成を取り得るものであり、当該手法によれば、組織片から免疫後の細胞を得るため、作業効率の向上を図ることができる。ここで、免疫細胞を選別しないで、組織片の細胞の遺伝子を分離したとしても、ＰＣＲに使用するプライマーが抗体遺伝子特異的なものであるため、目的の遺伝子のみを取得することが可能であり、免疫細胞を選別した場合と同様に、抗体遺伝子を抽出する手法を採用することも可能である。
上記したように、当該細胞から得られる抗体遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、さらに大腸菌等の宿主細胞により、好ましくはコロニー化させて抗体を得る工程を組み合わせることで、大量の抗体を短時間で作製可能となすことができる。使用しうる宿主細胞及び発現ベクターは、前記した通りである。
本発明における抗体の選別方法としては、例えば、ファージや大腸菌、酵母、動物細胞等の表面に抗体を表示させる方法、酵母、大腸菌等を用いる２−ハイブリッド法、ＩＶＶ法、リボソームデイスプレイ法のようなＤＮＡやｍＲＮＡに提示させる方法、表面プラズモン共鳴を利用したＢＩＡＣＯＲＥ法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、磁気ビーズに抗体もしくは高原を固定化し、磁力を用いた選別（ＭＡＣＳ）方法等を例示することができる。この選別方法は、タンパク質間相互作用を調べ得る手法であれば、特に限定されるものではない。
本発明によれば、以下の詳細な説明から理解されるように、短時間で、目的とする免疫細胞を分離及び取得することができ、さらには、遺伝子工学的な手法による抗体の作製によって、迅速な抗体の生産及び取得を可能とすることができる。この免疫細胞は、とりわけスクリーニング等に好適である。
また、本発明は、これらの新規な抗体作製手法に基づき、腎臓癌マーカーとして今般注目されているＳ１００Ａ１０タンパク質の免疫学的測定、治療に有効な抗体作製方法を実現することを目的としている。Ｓ１００Ａ１０タンパク質は、高山達也他、腎細胞癌におけるＳ１００Ａ１０蛋白の特異的発現，腎癌研究会会報，２８：９−１０，２００５等で示されるように、腎臓癌マーカーとしても有用であり、当該マーカーは、尿成分からも得られることから、腎臓癌の簡易的な診断においてその価値が高いからである。
これらの目的を達成するため、本発明は、体外で免疫用細胞を含む組織を抗原と刺激物質を含む培養液中で免疫する工程と、その免疫された細胞を選別する工程と、その選別された免疫細胞から抗体を得る工程とを含む抗体作製方法を提供する。
すなわち、本発明は、いわゆる体外免疫法において、特定の刺激物質を添加した培養液で、抗原による感作免疫細胞を得ることで、通常必要としていた時間の数十分の一の時間で抗体を作製することを実現したものである。
より詳細には、まず、異物（抗原）が体内に入ると、マクロファージや樹状細胞がこれを細胞内に取り込む。異物は、細胞内で分解し、分解産物を細胞膜表面上に提示する。次いで、分解産物にナイーブＴ細胞が近づき、ナイーブＴ細胞表面のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介して抗原を認識する。この過程を経てＴ細胞が活性化され、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）となる。
一方Ｂ細胞も体内に侵入した異物（抗原）を細胞表面上のＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）で認識して細胞内に取り込む。取り込んだ抗原をやはり分解し、分解産物をＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ分子上に提示する。この際に細胞膜表面にＣＤ４０という分子も同時に発現する。
このようにしてできたＴｈ２と抗原提示Ｂ細胞が近づき、互いに認識することでＢ細胞の活性化と抗体のクラススイッチが入る。この際に、同じ抗原で活性化した分子同士でなければかかる現象は発現しない。
なお、上記の場合には免疫反応を生体内で実施しているけれども、この免疫反応を生体外で発生させる方法が、いわゆる体外免疫法である。
本発明は、生体外において、所望の抗体産生細胞を得るために、刺激物質を添加してＢ細胞を抗体産生細胞（プラズマ細胞）又はメモリーＢ細胞へと分化誘導するものである。ここで、刺激物質とは、例えばＢ細胞、樹状細胞、Ｔ細胞などのような免疫担当細胞の膜表面に発現しているレセプター分子と相互作用可能である限り、特に制限はない。本発明の実施には、特にサイトカインレセプターに対する刺激物質として、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、表面抗原に対する刺激物質としてＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）、ＢＡＦＦ（Ｂ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、ＡＰＲＩＬ（Ａ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤ４０ ｌｉｇａｎｄ、ＣＤ３８ ｌｉｇａｎｄ、ＢＣＤＦ（Ｂ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）、ＢＣＡＦ（Ｂ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）、シグナル伝達に関与する受容体に対する刺激物質としてＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）等が例示される。刺激物質の使用濃度は、免疫する細胞濃度に依存して変化するけれども、ＬＰＳは１０ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの濃度が良く、特に２０〜８０μｇ／ｍＬの濃度が推奨される。また、ＬＰＳ以外の物質では、一般に１ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの濃度が良く、特に１０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬの濃度が推奨される。また、これら物質の機能を代替するアゴニスト抗体であっても問題はない。その分化誘導の過程において、特にＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体刺激により、抗体の親和性成熟及びクラススイッチを誘導し、より親和性の高い抗体となすことができる。
さらに、ＦＡＣＳｃａｎのようなフローサイトメトリー等に基づく細胞分離装置を用いて、目的とした細胞を染色して選別する手法を利用した感作免疫細胞の検出及び分離を行う。
本発明における免疫細胞の選別及び検出の際に用いられる染色剤としては、特に限定されものではない。例えば、染色剤としてＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅを用いて増殖・生存しているＢ細胞を検出しているが、その他、フローサイトメトリーの際に用いられるＦＩＴＣやＰＥなどの蛍光物質を標識した抗原や抗体、さらに細胞内のカルシウム濃度を検出するＦｕｒａ−２のような蛍光プローブや細胞内のＤＮＡを染色するエチジウムブロマイドに代表されるＤＮＡ染色剤等、目的とする免疫細胞を染色できるものであれば、適宜使用することができる。
また、クラススイッチやアフィニティマチュレーションの発生した細胞を選別する際も、上記したものと同様の染色剤を適宜使用することができる。
染色された細胞を検出・選別する手法は、例えばフローサイトメトリー等の細胞分離装置の他、例えばヘモサイトメーター等の血球計算盤や、電気泳動デバイス、遠心分離デバイス、磁気ビーズデバイス、マイクロ流路デバイスなどを好適に利用することができる。
また、この分離された細胞と、ミエローマ細胞を融合させて、ハイブリドーマを得ても良いが、ハイブリドーマを得る必要は必ずしもない。
さらに、本発明は、抗体遺伝子を得るための細胞を、組織上から選別すべく、体外免疫工程により、免疫細胞を選別し、その免疫細胞から、抗体遺伝子をＰＣＲ手法を用いて形成し、これを宿主細胞に導入して培養発現し、抗体の大量生産をする構成を取り得るものであり、当該手法によれば、組織片から免疫後の細胞を得るため、作業効率の向上が図れる。
当該細胞から得られる抗体遺伝子をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、更に大腸菌等の宿主細胞により、好ましくはコロニー化させて抗体を得る工程を組み合わせることで、大量の抗体を短時間で作製することが可能となる。宿主細胞としては、大腸菌の他、ストレプトマイセス、枯草菌、酵母、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、等が例示される。
また、発現ベクターとしては、宿主細胞で発現されるものであれば、特に限定されるものではない。発現ベクターとして、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、染色体、エピソーム、ウィルス由来、レトロウィルス由来のベクターなどを例示することができる。
上記したような課題に加えて、本発明者らは、体外で免疫細胞を選別し得たとしても、スクリーニングまでの準備としてのハイブリドーマ形成工程を要することなく抗体遺伝子の分離ができないかという課題にも取り組んだ。
本発明者らは、体外免疫手法を採るに際し、メモリーＢ細胞又はプラズマ細胞へ分化誘導及び、その過程で発生すると考えられる抗体の親和性成熟・クラススイッチを所定の刺激物質の添加により実現できるという知見を得、本発明を完成した。
従来、高親和性抗体の作製は、生体内においては、繰り返し抗原を免疫することにより、メモリーＢ細胞又はプラズマ細胞への分化誘導を行い、その過程で発生すると考えられる抗体の親和性成熟・クラススイッチを利用している。分化誘導した免疫細胞からハイブリドーマを形成し、スクリーニングを行うことで高親和性抗体を得ている。一方、生体外の場合は、ハイブリドーマや市販のライブラリーなどから得た抗体遺伝子にＰＣＲを用いたランダム変異導入法等により様々な変異を導入したライブラリーを構築し、ファージミドベクターへの組み込みを経て、パニング法によって、強い抗体をスクリーニングする方法が主であった。
しかしながら、本発明者らは、生体外で特定の刺激物質を、所定の環境下で、供給することでもメモリーＢ細胞又はプラズマ細胞への分化誘導及び、その過程で発生すると考えられる抗体の親和性成熟・クラススイッチが可能であることを知見したのである。また、刺激物質の導入は、Ｂ細胞をメモリーＢ細胞、プラズマ細胞へ分化誘導することを可能としていることから、体外免疫における当該手法は、従来の脾臓細胞そのものもしくは、Ｂ細胞とＴ細胞の共培養状態でしか免疫ができなかったものを、Ｂ細胞のみであっても免疫可能にし、抗原も従来の体外免疫法同様、生体内での免疫に比べて１／１０００〜１／１００００程度の少量で可能となった。
さらに、本発明において使用する刺激物質は、親和性成熟や抗体のクラススイッチに関係している蛋白質の発現を誘導し、その結果、抗体のＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチを迅速にかつ確実に行わせることも実現した。
要するに、本発明は、いわゆる体外免疫法において、組織片をすり潰す等して得られる細胞に特定の刺激物質を添加した培養液で、抗原による感作を行い免疫細胞を得ることで、通常免疫動物を免疫した場合に必要としていた時間の数十分の一の時間で実現できるようにしたものである。
上記のような本発明による抗体作製方法の実施において、生体内及び生体外において免疫反応を発生させる方法は、すでに説明したような手法によって有利に実施することができる。
本発明における体外免疫手法において、各種の刺激物質と各種の分化、誘導等との関係について以下に説明する。
本発明で示す抗原は、免疫用組織片調製直後の１回で充分であるが、２〜３日の間隔を置いて、複数回行っても制限はない。またその際の抗原濃度は１ｐｍｏｌ〜１ｍｍｏｌが好ましく、例えば１ｎｍｏｌを例示することができる。
抗原刺激を補助する目的でＬＰＳに代表されるＴＬＲ（Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を刺激する物質を添加しても良い。この刺激物質の添加は、抗原刺激の度に行うことが好ましく、添加量は１０ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの濃度が良く、特に２０〜８０μｇ／ｍＬの濃度が良い。
また、本発明で示す、メモリーＢ細胞又はプラズマ細胞へ分化誘導及び、その過程で発生すると考えられる抗体の親和性成熟・クラススイッチの誘導用刺激物質としては、前述の刺激物質であれば特に制限はないが、特にＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体が好ましい。添加濃度は、ＩＬ−４、ＩＬ−５は１ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの濃度が良く、特に１０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬが好ましく、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体は１ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの濃度が良く、特に１００ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬが好ましい。また、この刺激物質の添加は、抗原刺激の度に行うことが好ましい。
本発明における体外で行う免疫用の組織片を構成する細胞としては、例えば、上述したものの他、例えばマウス、ラット、モルモット、ラビットなどのような免疫動物由来の臓器・組織から得た細胞、ｉＰＳ細胞・ＥＳ細胞を分化させて調整した免疫担当細胞、培養細胞株を分化させて調整した免疫担当細胞などを例示することができる。
本発明で用いられる抗原には、例えば、ｈ（ヒト）Ｓ１００Ａ１０、ｈｅ（鶏）ＥＬ、ｈ（ヒト）Ｒａｓ、ｈ（ヒト）ｒａｐ７４，ｈ（ヒト）ＴＯＰＯ２Ｂ、ｂ（ウシ）ＳＡ、ｂ（ウシ）Ｃａｓｅｉｎ等のマウス由来以外の蛋白質、マウス由来のｍ（マウス）Ｓ１００Ａ１０、ｍＳＡ、ｍＭａｐｋ１等の蛋白質、ペプチド（４種類：７ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１６ｍｅｒ、２０ｍｅｒ）などを例示することができる。さらに、本発明の実施では、従来抗体を得るために用いることができない、低分子化合物（ローダミン等の蛍光物質、ＦＩＴＣ）も利用可能となる。
本発明は、体外での目的に応じた刺激物質の導入により、Ｔ細胞を必要とせず、Ｂ細胞を抗体産生細胞に分化誘導する工程により、低分子抗原の利用が可能になるほか、クラススイッチによる好ましい抗体、親和性成熟による抗体が得られる免疫細胞を得ることができる。
さらに、上記したように、ＦＡＣＳｃａｎのようなフローサイトメトリー等に基づく細胞分離装置を用いて、目的とした細胞を染色して選別する手法を利用した感作免疫細胞の検出及び分離を行う。
その他、得られる免疫細胞の大きさは、他の細胞に比べ大きいこと、更に親和度を成熟させた場合、細胞の大きさがより大きくなることもあるため、細胞の大きさによって、選別することも可能である。また、当該細胞の大きさにより、選別する手法としては、例えば特開２００７−１７５６８４号公報等に記載された手法を好適に使用することができる。
本発明における免疫細胞の選別、検出の際に用いられる染色剤は、すでに説明した通りである。また、クラススイッチやアフィニティマチュレーションの発生した細胞を選別する際も、上記したように、同様の染色剤を適宜使用することができる。
さらに、本発明は、上記したように、抗体遺伝子を得るための細胞を、組織上から、体外免疫工程により、免疫細胞を選別し、その免疫細胞から、抗体遺伝子をＰＣＲ法を用いて形成し、これを宿主細胞に導入して培養発現し、抗体の大量生産をする構成を取り得るものであり、当該手法によれば、組織片から免疫後の細胞を得るため、作業効率の向上を図ることができる。ここで、免疫細胞を選別しないで、組織片の細胞の遺伝子を分離したとしても、ＰＣＲに使用するプライマーが抗体遺伝子特異的なものであるため、目的の遺伝子のみを取得することが可能であり、免疫細胞を選別した場合と同様に、抗体遺伝子を抽出する手法を採用することも可能である。
上記したように、当該細胞から得られる抗体遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、さらに大腸菌等の宿主細胞により、好ましくはコロニー化させて抗体を得る工程を組み合わせることで、大量の抗体を短時間で作製可能となすことができる。使用しうる宿主細胞及び発現ベクターは、前記した通りである。
本発明における抗体の選別方法としては、例えば、ファージや大腸菌、酵母、動物細胞等の表面に抗体を表示させる方法、酵母、大腸菌等を用いる２−ハイブリッド法、ＩＶＶ法、リボソームデイスプレイ法のようなＤＮＡやｍＲＮＡに提示させる方法、表面プラズモン共鳴を利用したＢＩＡＣＯＲＥ法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、磁気ビーズに抗体もしくは高原を固定化し、磁力を用いた選別（ＭＡＣＳ）方法等を例示することができる。この選別方法は、タンパク質間相互作用を調べ得る手法であれば、特に限定されるものではない。
本発明によれば、以下の詳細な説明から理解されるように、短時間で、目的とする免疫細胞を分離及び取得することができ、さらには、遺伝子工学的な手法による抗体の作製によって、迅速な抗体の生産及び取得を可能とすることができる。この免疫細胞は、とりわけスクリーニング等に好適である。
図１Ａは、調製したＴｏｔａｌ ＲＮＡの電気泳動を示す写真、図１Ｂはその説明図であり、
図２Ａは、調製したｃＤＮＡの電気泳動を示す写真、図２Ｂはその説明図であり、
図３Ａは、調製したｓｃＦｖ ＰＣＲ産物の電気泳動を示す写真、図３Ｂはその説明図であり、
図４Ａは、調製した大腸菌クローンの電気泳動を示す写真、図４Ｂはその説明図であり、
図５Ａは、精製したＭＢＰ−ｓｃＦｖ蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による解析図、図５Ｂはその説明図であり、
図６は、抗原とＩｇＧ１陽性率の関係をプロットしたグラフであり、
図７は、マーカー遺伝子とｍＲＮＡ発現量の関係をプロットしたグラフであり、
図８は、サイトカインの細胞毒性試験の結果を刺激物質と比増殖率の関係としてプロットしたグラフであり、
図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれ、刺激物質と比増殖率の関係をプロットしたグラフであり、
図１０Ａ，図１０Ｂ，図１０Ｃ及び図１０Ｄは、それぞれ、単独刺激時のＢｌｉｍｐ−１発現量、Ｘｂｐ−１発現量、Ｂｃｌ−６発現量及びＡＩＤ発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１１Ａ及び図１１Ｂは、それぞれ、複合刺激、プラズマ細胞分化時のＢｌｉｍｐ−１発現量及びＸｂｐ−１発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１２Ａ及び図１２Ｂは、それぞれ、複合刺激、体細胞変異時のＢｃｌ−６発現量及びＡＩＤ発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１３は、複合刺激、プラズマ細胞分化時のＢｌｉｍｐ−１発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１４は、複合刺激、プラズマ細胞分化時のＸｂｐ−１発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１５は、複合刺激、体細胞変異時のＢｃｌ−６発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１６は、複合刺激、体細胞変異時のＡＩＤ発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１７Ａ及び図１７Ｂは、それぞれ、サイトカイン濃度の上限と下限のマーカー発現量を、抗原１ｎｍｏｌを免疫した場合と抗原０．１ｎｍｏｌを免疫した場合とについてプロットしたグラフであり、
図１８Ａ及び図１８Ｂは、それぞれ、Ｂ細胞の分化の検討の結果を、脾臓細胞中のＢ細胞の割合と脾臓細胞中のプラズマ細胞の割合とについてプロットしたグラフであり、
図１９Ａ，図１９Ｂ，図１９Ｃ及び図１９Ｄは、それぞれ、Ｂ細胞の分化の検討の結果を、Ｂ細胞中のＴ１−Ｂ細胞の割合、Ｂ細胞中のＴ２−Ｂ細胞の割合、Ｂ細胞中のＢ２細胞の割合及びＢ細胞中のＡｃｔｉｖａｔｅｄ−Ｂ細胞の割合についてプロットしたグラフであり、
図２０Ａ，図２０Ｂ，図２０Ｃ及び図２０Ｄは、それぞれ、Ｂ細胞分化の検討時のＢｌｉｍｐ−１発現量、Ｘｂｐ−１発現量、Ｂｃｌ−６発現量及びＡＩＤ発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図２１は、Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅに対して免疫操作を行い取得したａｎｔｉ−Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡ結果を示したものであり、抗原特異性をみるために、β−カゼイン，Ｓ１００Ａ２，Ｓ１００Ａ１４，Ｈｅｎ Ｅｇｇ ＬｙｓｏｚｙｍｅをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて比較したグラフであり、
図２２は、Ｂ細胞に対して免疫操作を行い取得したａｎｔｉ−Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡ結果を示したものであり、抗原特異性をみるために、β−カゼイン，Ｓ１００Ａ２，Ｓ１００Ａ１４，Ｈｅｎ Ｅｇｇ ＬｙｓｏｚｙｍｅをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて比較したグラフであり、
図２３は、ａｎｔｉ−Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ／ＥＧＦＰのＥＬＩＳＡ結果を示したものであり、ＥＧＦＰは，Ｇ１−Ｌｉｎｋｅｒ及びＧ５−Ｌｉｎｋｅｒを介してｓｃＦｖに融合されており、また、抗原特異性をみるために、β−カゼイン，Ｓ１００Ａ２，Ｓ１００Ａ１４，Ｈｅｎ Ｅｇｇ ＬｙｓｏｚｙｍｅをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて比較したグラフであり、
図２４は、ａｎｔｉ−β−Ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ７／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ，ａｎｔｉ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ，ａｎｔｉ−ＰＴＨ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡ結果を示したものであり、抗原特異性をみるために、β−Ｃａｓ７β−Ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ７（ｂ−Ｃａｓ７），Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ（Ａｎｇ Ｉ），ＰＴＨをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて比較したグラフであり、
図２５は、抗マウス蛋白質抗体の取得の結果を吸光度（ｍＡｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ）に関して評価した結果をプロットしたグラフであり、
図２６は、抗マウス蛋白質抗体の取得の結果を陽性クローン出現率（ｍＡｌｂｕｍｉｎ陽性率）に関して評価した結果をプロットしたグラフであり、
図２７は、抗マウス蛋白質抗体の取得の結果を吸光度（ｍＳ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ １ｎｍｏｌの抗原）に関して評価した結果をプロットしたグラフであり、
図２８は、抗マウス蛋白質抗体の取得の結果を吸光度（ｍＳ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ １ｎｍｏｌの抗原）に関して評価した結果をプロットしたグラフであり、
図２９は、抗マウス蛋白質抗体の取得の結果を陽性クローン出現率（ｍＳ１００Ａ１０陽性率）に関して評価した結果をプロットしたグラフであり、そして
図３０は、抗低分子化合物抗体の取得を示す電気泳動の写真である。
図２Ａは、調製したｃＤＮＡの電気泳動を示す写真、図２Ｂはその説明図であり、
図３Ａは、調製したｓｃＦｖ ＰＣＲ産物の電気泳動を示す写真、図３Ｂはその説明図であり、
図４Ａは、調製した大腸菌クローンの電気泳動を示す写真、図４Ｂはその説明図であり、
図５Ａは、精製したＭＢＰ−ｓｃＦｖ蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による解析図、図５Ｂはその説明図であり、
図６は、抗原とＩｇＧ１陽性率の関係をプロットしたグラフであり、
図７は、マーカー遺伝子とｍＲＮＡ発現量の関係をプロットしたグラフであり、
図８は、サイトカインの細胞毒性試験の結果を刺激物質と比増殖率の関係としてプロットしたグラフであり、
図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれ、刺激物質と比増殖率の関係をプロットしたグラフであり、
図１０Ａ，図１０Ｂ，図１０Ｃ及び図１０Ｄは、それぞれ、単独刺激時のＢｌｉｍｐ−１発現量、Ｘｂｐ−１発現量、Ｂｃｌ−６発現量及びＡＩＤ発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１１Ａ及び図１１Ｂは、それぞれ、複合刺激、プラズマ細胞分化時のＢｌｉｍｐ−１発現量及びＸｂｐ−１発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１２Ａ及び図１２Ｂは、それぞれ、複合刺激、体細胞変異時のＢｃｌ−６発現量及びＡＩＤ発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１３は、複合刺激、プラズマ細胞分化時のＢｌｉｍｐ−１発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１４は、複合刺激、プラズマ細胞分化時のＸｂｐ−１発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１５は、複合刺激、体細胞変異時のＢｃｌ−６発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１６は、複合刺激、体細胞変異時のＡＩＤ発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図１７Ａ及び図１７Ｂは、それぞれ、サイトカイン濃度の上限と下限のマーカー発現量を、抗原１ｎｍｏｌを免疫した場合と抗原０．１ｎｍｏｌを免疫した場合とについてプロットしたグラフであり、
図１８Ａ及び図１８Ｂは、それぞれ、Ｂ細胞の分化の検討の結果を、脾臓細胞中のＢ細胞の割合と脾臓細胞中のプラズマ細胞の割合とについてプロットしたグラフであり、
図１９Ａ，図１９Ｂ，図１９Ｃ及び図１９Ｄは、それぞれ、Ｂ細胞の分化の検討の結果を、Ｂ細胞中のＴ１−Ｂ細胞の割合、Ｂ細胞中のＴ２−Ｂ細胞の割合、Ｂ細胞中のＢ２細胞の割合及びＢ細胞中のＡｃｔｉｖａｔｅｄ−Ｂ細胞の割合についてプロットしたグラフであり、
図２０Ａ，図２０Ｂ，図２０Ｃ及び図２０Ｄは、それぞれ、Ｂ細胞分化の検討時のＢｌｉｍｐ−１発現量、Ｘｂｐ−１発現量、Ｂｃｌ−６発現量及びＡＩＤ発現量を測定した結果をプロットしたグラフであり、
図２１は、Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅに対して免疫操作を行い取得したａｎｔｉ−Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡ結果を示したものであり、抗原特異性をみるために、β−カゼイン，Ｓ１００Ａ２，Ｓ１００Ａ１４，Ｈｅｎ Ｅｇｇ ＬｙｓｏｚｙｍｅをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて比較したグラフであり、
図２２は、Ｂ細胞に対して免疫操作を行い取得したａｎｔｉ−Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡ結果を示したものであり、抗原特異性をみるために、β−カゼイン，Ｓ１００Ａ２，Ｓ１００Ａ１４，Ｈｅｎ Ｅｇｇ ＬｙｓｏｚｙｍｅをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて比較したグラフであり、
図２３は、ａｎｔｉ−Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ／ＥＧＦＰのＥＬＩＳＡ結果を示したものであり、ＥＧＦＰは，Ｇ１−Ｌｉｎｋｅｒ及びＧ５−Ｌｉｎｋｅｒを介してｓｃＦｖに融合されており、また、抗原特異性をみるために、β−カゼイン，Ｓ１００Ａ２，Ｓ１００Ａ１４，Ｈｅｎ Ｅｇｇ ＬｙｓｏｚｙｍｅをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて比較したグラフであり、
図２４は、ａｎｔｉ−β−Ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ７／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ，ａｎｔｉ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ，ａｎｔｉ−ＰＴＨ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡ結果を示したものであり、抗原特異性をみるために、β−Ｃａｓ７β−Ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ７（ｂ−Ｃａｓ７），Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ（Ａｎｇ Ｉ），ＰＴＨをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて比較したグラフであり、
図２５は、抗マウス蛋白質抗体の取得の結果を吸光度（ｍＡｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ）に関して評価した結果をプロットしたグラフであり、
図２６は、抗マウス蛋白質抗体の取得の結果を陽性クローン出現率（ｍＡｌｂｕｍｉｎ陽性率）に関して評価した結果をプロットしたグラフであり、
図２７は、抗マウス蛋白質抗体の取得の結果を吸光度（ｍＳ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ １ｎｍｏｌの抗原）に関して評価した結果をプロットしたグラフであり、
図２８は、抗マウス蛋白質抗体の取得の結果を吸光度（ｍＳ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ １ｎｍｏｌの抗原）に関して評価した結果をプロットしたグラフであり、
図２９は、抗マウス蛋白質抗体の取得の結果を陽性クローン出現率（ｍＳ１００Ａ１０陽性率）に関して評価した結果をプロットしたグラフであり、そして
図３０は、抗低分子化合物抗体の取得を示す電気泳動の写真である。
引き続いて、本発明の好ましい実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下に記載する特定の実施の形態によって限定されるものではないことを理解されたい。
本発明は、マウス、ラット等の免疫用動物から臓器を摘出し、当該臓器から免疫細胞を含む細胞群を分離して、これを刺激物質を含む培養液中で抗原による感作を行うことで、免疫細胞を得るものである。
この免疫細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ等の細胞分離装置、又はその他の細胞染色による選別手法を用いて、リンパ球中、例えば目的の抗体を産生するＢ細胞を選別する。選別したＢ細胞をミエローマ細胞との融合により不死化させ、ハイブリドーマを形成させ、クローニング後に抗体や抗体遺伝子を取得することも可能であるが、必ずしもハイブリドーマ形成の工程は必要とはしない。
この選別した細胞若しくはハイブリドーマから、遺伝子を抽出し、ＰＣＲ法によりＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子を取得、大腸菌で発現できるように一本鎖抗体ｓｃＦｖに改変してプラスミド化した後、大腸菌内で発現させて抗体を得るものであれば、抗原については、特定しないが、この中で例えば、Ｓ１００Ａ１０タンパク質が尿を検体として用いることができる腎臓癌マーカーとして使用できることから、本発明は、腎臓癌の免疫学的診断のための抗体の作製方法として、好適である。
〔マウス由来のヒト抗体の作製について〕
本発明では、マウス由来のヒト抗体の作製工程を更に組み合わせても良い。以下にヒト抗体を取得する工程例を示す。
１．免疫ヒト化マウス由来の脾臓細胞を用いる方法
マウスの脾臓細胞内の抗体遺伝子をすべてヒト由来の遺伝子に置き換えた免疫ヒト化マウスが報告されている。これは、抗体遺伝子以外はマウス由来の細胞なので、今回の体外免疫法を直接そのまま使用しての免疫が可能である。この方法で取れてきた抗体はすべてヒト抗体となる。
２．抗体のヒト化を行う方法
取得した遺伝子から、抗体のアミノ酸配列を決定する。このアミノ酸配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーと比較する。超可変領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）以外の抗体のフレーム部分を特に比較し、ホモロジー（相同性）の高い配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーから選択する。選択したフレーム配列に、取得した抗体遺伝子の超可変領域を組み込み、ヒト化する。この段階では抗体はヒト化マウス抗体である。
完全長ヒト抗体は、取得した遺伝子から、抗体のアミノ酸配列を決定する。このアミノ酸配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーと比較する。超可変領域を含む抗体の全長を比較し、ホモロジーの高い配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーから選択する。選択した配列を細胞で発現させれば、完全長ヒト抗体となる。選択した配列の超可変領域を遺伝子工学的手法で改変して元の配列とそっくり同じにしても完全長ヒト抗体とすることもできる。
ここで、本発明を要約して示すと、下記の各項に記載される通りである。
（１）体外で免疫用細胞を含む組織を抗原と刺激物質を含む培養液中で免疫する工程と、
前記免疫された細胞を選別する工程と、
前記選別された免疫細胞から抗体を得る工程とを含む抗体作製方法。
（２）前記免疫細胞から、ＰＣＲ増幅手法により増幅抗体遺伝子を取得した後、宿主細胞により抗体又は抗体に類する蛋白質の発現調製をするステップをさらに含む上記第１項に記載の抗体作製方法。
（３）前記組織が免疫用動物である上記第１項に記載の抗体作製方法。
（４）前記選別された細胞が、クラススイッチ若しくはアフィニティマチュレーションの発生した細胞である上記第１項に記載の抗体作製方法。
（５）前記免疫された細胞の選別が、フローサイトメトリー又は染色による上記第１項に記載の抗体作製方法。
（６）前記刺激物質が、免疫担当細胞上に発現しているサイトカイン受容体、表面抗原又はシグナル伝達に関与する受容体を刺激する物質である上記第１項に記載の抗体作製方法。
（７）前記抗原がペプチドである上記第１項に記載の抗体作製方法。
（８）前記抗原がＳ１００ ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質であり、一本鎖抗体ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）若しくは抗体ＩｇＧ１（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ Ｇ１）を取得する上記第１項に記載の抗体作製方法。
（９）前記抗原がＳ１００Ａ１０タンパク質であり、一本鎖抗体ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）若しくは抗体ＩｇＧ１（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ Ｇ１）を取得する上記第１項に記載の抗体作製方法。
（１０）前記刺激物質が、サイトカイン受容体に対する刺激物質としての、ＩＬ−４又はＩＬ−５、表面抗原に対する刺激物質としての、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体又はａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、及びシグナル伝達に関与する受容体に対する刺激物質としてのＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の少なくとも１つである上記第６項に記載の抗体作製方法。
（１１）体外で免疫用細胞を含む組織と、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体及びＬＰＳからなる群から選ばれた１以上の刺激物質を含む培養液中で免疫して抗体を作製する上記第１項に記載の抗体作製方法。
（１２）選別された前記抗体遺伝子アミノ酸配列を決定する工程と、
このアミノ酸配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーと比較し、ホモロジー（相同性）の高い配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーから選択し又は改変調整してヒト化抗体遺伝子を形成する工程とをさらに含む上記第１項に記載の抗体作製方法。
本発明は、マウス、ラット等の免疫用動物から臓器を摘出し、当該臓器から免疫細胞を含む細胞群を分離して、これを刺激物質を含む培養液中で抗原による感作を行うことで、免疫細胞を得るものである。
この免疫細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ等の細胞分離装置、又はその他の細胞染色による選別手法を用いて、リンパ球中、例えば目的の抗体を産生するＢ細胞を選別する。選別したＢ細胞をミエローマ細胞との融合により不死化させ、ハイブリドーマを形成させ、クローニング後に抗体や抗体遺伝子を取得することも可能であるが、必ずしもハイブリドーマ形成の工程は必要とはしない。
この選別した細胞若しくはハイブリドーマから、遺伝子を抽出し、ＰＣＲ法によりＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子を取得、大腸菌で発現できるように一本鎖抗体ｓｃＦｖに改変してプラスミド化した後、大腸菌内で発現させて抗体を得るものであれば、抗原については、特定しないが、この中で例えば、Ｓ１００Ａ１０タンパク質が尿を検体として用いることができる腎臓癌マーカーとして使用できることから、本発明は、腎臓癌の免疫学的診断のための抗体の作製方法として、好適である。
〔マウス由来のヒト抗体の作製について〕
本発明では、マウス由来のヒト抗体の作製工程を更に組み合わせても良い。以下にヒト抗体を取得する工程例を示す。
１．免疫ヒト化マウス由来の脾臓細胞を用いる方法
マウスの脾臓細胞内の抗体遺伝子をすべてヒト由来の遺伝子に置き換えた免疫ヒト化マウスが報告されている。これは、抗体遺伝子以外はマウス由来の細胞なので、今回の体外免疫法を直接そのまま使用しての免疫が可能である。この方法で取れてきた抗体はすべてヒト抗体となる。
２．抗体のヒト化を行う方法
取得した遺伝子から、抗体のアミノ酸配列を決定する。このアミノ酸配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーと比較する。超可変領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）以外の抗体のフレーム部分を特に比較し、ホモロジー（相同性）の高い配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーから選択する。選択したフレーム配列に、取得した抗体遺伝子の超可変領域を組み込み、ヒト化する。この段階では抗体はヒト化マウス抗体である。
完全長ヒト抗体は、取得した遺伝子から、抗体のアミノ酸配列を決定する。このアミノ酸配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーと比較する。超可変領域を含む抗体の全長を比較し、ホモロジーの高い配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーから選択する。選択した配列を細胞で発現させれば、完全長ヒト抗体となる。選択した配列の超可変領域を遺伝子工学的手法で改変して元の配列とそっくり同じにしても完全長ヒト抗体とすることもできる。
ここで、本発明を要約して示すと、下記の各項に記載される通りである。
（１）体外で免疫用細胞を含む組織を抗原と刺激物質を含む培養液中で免疫する工程と、
前記免疫された細胞を選別する工程と、
前記選別された免疫細胞から抗体を得る工程とを含む抗体作製方法。
（２）前記免疫細胞から、ＰＣＲ増幅手法により増幅抗体遺伝子を取得した後、宿主細胞により抗体又は抗体に類する蛋白質の発現調製をするステップをさらに含む上記第１項に記載の抗体作製方法。
（３）前記組織が免疫用動物である上記第１項に記載の抗体作製方法。
（４）前記選別された細胞が、クラススイッチ若しくはアフィニティマチュレーションの発生した細胞である上記第１項に記載の抗体作製方法。
（５）前記免疫された細胞の選別が、フローサイトメトリー又は染色による上記第１項に記載の抗体作製方法。
（６）前記刺激物質が、免疫担当細胞上に発現しているサイトカイン受容体、表面抗原又はシグナル伝達に関与する受容体を刺激する物質である上記第１項に記載の抗体作製方法。
（７）前記抗原がペプチドである上記第１項に記載の抗体作製方法。
（８）前記抗原がＳ１００ ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質であり、一本鎖抗体ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）若しくは抗体ＩｇＧ１（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ Ｇ１）を取得する上記第１項に記載の抗体作製方法。
（９）前記抗原がＳ１００Ａ１０タンパク質であり、一本鎖抗体ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）若しくは抗体ＩｇＧ１（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ Ｇ１）を取得する上記第１項に記載の抗体作製方法。
（１０）前記刺激物質が、サイトカイン受容体に対する刺激物質としての、ＩＬ−４又はＩＬ−５、表面抗原に対する刺激物質としての、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体又はａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、及びシグナル伝達に関与する受容体に対する刺激物質としてのＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の少なくとも１つである上記第６項に記載の抗体作製方法。
（１１）体外で免疫用細胞を含む組織と、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体及びＬＰＳからなる群から選ばれた１以上の刺激物質を含む培養液中で免疫して抗体を作製する上記第１項に記載の抗体作製方法。
（１２）選別された前記抗体遺伝子アミノ酸配列を決定する工程と、
このアミノ酸配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーと比較し、ホモロジー（相同性）の高い配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーから選択し又は改変調整してヒト化抗体遺伝子を形成する工程とをさらに含む上記第１項に記載の抗体作製方法。
引き続いて、本発明を下記の実施例によりさらに具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
実施例１
本例では、Ｓ１００Ａ１０タンパク質を抗原例として用い、抗体ＩｇＧ１の作製方法について説明する。
脾臓細胞（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）抽出
マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、洗浄した。２匹分の脾臓をメッシュ上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした後、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。次いで、ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えた。遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０（−）６ｍＬに懸濁した。セルストレイナーを通して、不溶性の脂肪等を除去した。
体外免疫
Ｓ１００Ａ１０タンパク質抗原をアッセイキット（Ｄｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ＢｉｏＲａｄ社製）で濃度を測定した。この際のスタンダードとして、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。濃度既知のＳ１００Ａ１０タンパク質抗原を所定の量（５μｇ若しくは２０μｇ）分注し、これにアジュバントＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ（マウス１匹当５０μＬ）で添加し室温で１５分間静置した。脾臓細胞に、調製した抗原溶液を添加し、室温で１５分間静置した。ＲＰＭＩ１６４０（４０％ＦＢＳ）を６ｍＬずつ添加した。刺激物質（ＩＬ−４（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−５（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体（終濃度１μｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体（終濃度１μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（終濃度４０μｇ／ｍＬ））を添加した。１０ｃｍデッシュに全量を播いた。３７℃ ＣＯ２インキュベーターにて培養（４日間）した。培養終了後、細胞を遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）で回収し、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ ０．４％（ＧＩＢＣＯ社製）で細胞を染色し血球計算版（アズワン社製）にて免疫後の脾臓細胞数をカウントした。細胞数は５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合、１．３３ ｘ １０７ｃｅｌｌｓ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合、０．７１ ｘ １０７ｃｅｌｌｓであった。この細胞をＭｅｄｉｕｍ Ｂ（Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ ＨＹキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてウオッシュ洗浄（１０ｍＬ ｘ ３ｔｉｍｅｓ）し、１．００ ｘ １０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。
メラノーマ細胞の調製
ＰＡＩ細胞（マウス由来ミエローマ細胞）をＭｅｄｉｕｍ Ａ（Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ ＨＹキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて、継代培養しておいた。Ｍｅｄｉｕｍ Ｂを用いて細胞をウオッシュ洗浄（１０ｍＬ ｘ ３ｔｉｍｅｓ）し、上記と同じ装置を用いてカウントした。当該細胞数は、細胞融合時に５ ｘ １０７ｃｅｌｌｓが好ましい。
細胞融合
脾臓細胞Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ：メラノーマ細胞Ｍｙｅｌｏｍａ＝２：１にて細胞を混合し、遠心して回収した。タッピングした後、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合６６．５μＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合３５．５μＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して５００μＬ）、で混合した。
遠心分離して回収した後、Ｍｅｄｉｕｍ Ｂを、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合６６５μＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合３５５μＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して５ｍＬ）、で一滴ずつ添加した。
これにＭｅｄｉｕｍ Ｃ（Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ ＨＹキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合６６５μＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合３５５μＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して５ｍＬ）、で一滴ずつ添加した。この溶液を、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合５．３２ｍＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合２．８４ｍＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して４０ｍＬ）、でＭｅｄｉｕｍＣに静かに添加し、３７℃ ＣＯ２インキュベーターにて培養（１日間）（１５ｍＬ遠沈管にて）した。
細胞融合したその日に４℃のインキュベーターにＭｅｄｉｕｍ Ｄ（Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ ＨＹキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を移し、溶解しておいた。溶解確認後、よく混合した後、室温に戻した。
クローニング
細胞を遠心して回収し、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合１．３３ｍＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合０．７１ｍＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して１０ｍＬ）のＭｅｄｉｕｍ Ｃに懸濁し、これを、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合１１．９７ｍＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合６．３９ｍＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して９０ｍＬ）のＭｅｄｉｕｍ Ｄに懸濁した。３７℃で１５分インキュベートした後、１０ｃｍデッシュに撒いた。更に、３７℃ ＣＯ２インキュベーターにて培養（１０〜１４日間）した。
ハーベスト
細胞コロニーを目視下でカウントし、その全てを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ウェルプレート）に移し、２００μＬのＭｅｄｉｕｍ Ｅ（Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ ＨＹキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を加えた。次いで、３７℃ ＣＯ２インキュベーターにて培養（４日間）した。上清を１５０μＬ回収し、Ｓ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡによる確認を行った。
Ｓ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅの調製
Ｓ１００Ａ１０抗原をＰＢＳ（−）にて５μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬずつ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅ Ｆ８ ｍａｘｉｓｏａｐ．Ｎｕｎｃ社製）に添加した。これを４℃で１日間静置した後、上清を捨て、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）を２００μＬずつ添加した。室温で１時間静置した後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、Ｓ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅを調製した。
Ｓ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ
Ｓ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅに上記ハーベストの項で取得した１５０μＬの培養上清を加え、３７℃インキュベーターにて１時間静置した。上清を捨て、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、ＰＢＳ（−）で５０００倍に希釈した二次抗体（ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１−ＨＲＰ、フナコシ社製）を５０μＬ添加し、３７℃インキュベーターにて１時間静置した。上清を捨て、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ溶液を添加し、３７℃インキュベーターにて１０分間静置した。その後直ちに１Ｎ ＨＣｌ（和光純薬社製）を１００μＬ添加し、反応を停止させた。その後、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ５５０，ＢｉｏＲａｄ社製）にて測定した。得られた結果を下記の第１表に示す。
次いで、ハイブリドーマをコロニー化し、そのコロニーの大小を肉眼で確認した。それらのコロニーを上記手法によりクローニングし、その後の増殖を確認した。増殖したクローンの培養上清をＳ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡによって、抗Ｓ１００Ａ１０ ＩｇＧ１抗体を産生しているクローン数を確認した。上記第１表に記載の通り、体外免疫法によって、ＩｇＧ１が作製できることを確認した。免疫工程で要した日数は、約５日と、通常（２〜３ヶ月）に比べ非常に早い時間でＳ１００Ａ１０タンパク質に対するＩｇＧ１が作製できた。
実施例２
本例では、抗Ｓ１００Ａ１０抗体遺伝子の抽出及び大腸菌による抗体の発現工程について説明する。
ＤＮＡ抽出、一本鎖抗体ｓｃＦｖプラスミドの作製
免疫後のＢ細胞やハイブリドーマ１．５ ｘ １０６ｃｅｌｌｓ（セル）より、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを取得した。なお、前記実施例１で説明した体外免疫工程で得られる免疫細胞を当該工程で用いても良い。
次いで、１．２％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ（アガロースゲル）電気泳動により、取得確認を実施した。得られた結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
取得したＴｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして、マウス（ｍｏｕｓｅ）ＶＨ遺伝子特異的プライマー若しくはｍｏｕｓｅ ＶＬ遺伝子特異的プライマーとし、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）試薬を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてプライマーＶＨ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ／ＶＨ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ若しくはＶＬ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ／ＶＬ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）により、１ｓｔ ＰＣＲを実施した。使用したプライマー配列は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ｐｐ．２１０−２１１）に紹介されているものを利用した。
その後、２％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ電気泳動により、取得確認を実施した。得られた結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
電気泳動後のアガロースゲルから目的のバンドを切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を抽出し、精製した。次いで、そのＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子の各１０ｎｇを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）により、プライマーを添加せず、Ｌｉｎｋ ＰＣＲを実施した。その後、Ｌｉｎｋ ＰＣＲのサンプルにプライマー２ｎｄ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｘを加えてそのままＰＣＲ増幅を実施した。その後、２％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ電気泳動により、取得確認を実施した。得られた結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。これらの結果から、目的のｓｃＦｖ ＰＣＲ産物が得られたことが確認できた。
次いで、ｓｃＦｖ ＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩと３７℃で１時間反応させて分解し、電気泳動後のアガロースゲルから目的のバンドを切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｓｃＦｖ遺伝子を抽出し、精製した。同様に、プラスミドベクターｐＭＡＬ−ｐ２Ｘを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩと３７℃で１時間反応させて分解し、電気泳動後のアガロースゲルから目的のバンドを切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドベクター遺伝子を抽出し、精製した。これらの精製物をプラスミドベクター遺伝子１ｍｏｌに対しｓｃＦｖ遺伝子６ｍｏｌの割合で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ〈Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ〉（ＴａＫａＲａ社製）を用いてライゲーションした。ライゲーション溶液２０μＬを大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルと混合し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。この形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１８時間培養した。
ｓｃＦｖ遺伝子の連結したプラスミドを持つ大腸菌クローンをセレクションするため、上記の工程で形成したコロニーをコロニーＰＣＲ法に供し、さらに２％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ電気泳動により、取得確認を実施した。得られた結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。
上記のようにして得たクローンを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地により３７℃で１８時間培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、プラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドのＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーＭｅｇａＢＡＳＥ １０００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて確認した。この抗体遺伝子の取得工程には、３日を要した。
大腸菌による一本鎖抗体ｓｃＦｖの発現
シークエンスを確認したプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。この形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１８時間培養した。
次いで、上記のようにして形成したコロニーを、５ｍＬの５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＧ液体培地により３０℃で１８時間培養した。この培養液１ｍＬを１００ｍＬの５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＧ液体培地により３０℃で培養した。培養１時間ごとに６６０ｎｍの吸光度を分光光度計ＵＶ−１２００（島津製作所社製）にて測定した。吸光度が０．５に達した時点で、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、２３℃で２０時間培養した。培養終了後、遠心分離（６０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により大腸菌菌体を回収した。これをＳｏｌ．Ａ ５ｍＬ（２０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．５ｍＭ ＡＰＭＳＦ）に溶解し、室温で１０分間静置した。遠心分離（６０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により大腸菌菌体を回収し、氷冷したＳｏｌ．Ｂ ５ｍＬ（５ｍＭ ＭｇＳＯ４）に溶解し氷上に１０分間静置した。その後遠心分離（６０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により、上清を回収した。
その後、上記のようにして回収した上清をアミロースレジンカラム（１０ｍＬ、φ２．５ｃｍ ｘ ３．３ｃｍ）に供した。上清が全てカラムを通過した後、ウオッシュ緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）４０ｍＬでカラムを洗浄した。この洗浄を２回実施した後、Ｅｌｕｔｅ緩衝液（５ｍＭ Ｍａｌｔｏｓｅ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）４０ｍＬでカラムに吸着したＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）−ｓｃＦｖ蛋白質を溶出し、精製した。精製したＭＢＰ−ｓｃＦｖ蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により解析した。得られた結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。
また、精製したＭＢＰ−ｓｃＦｖ蛋白質の濃度を、アッセイキット（Ｄｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ＢｉｏＲａｄ社製）で測定した。その結果、５０ｍＬの培養液から０．３４５ｍｇのＭＢＰ−ｓｃＦｖ蛋白質が得られたことがわかった。
ところで、上記の精製工程には３日を要した。本方法は、抗体遺伝子の取得工程から数えれば、６日で終了し、通常の方法（２〜３ヶ月を要する）に比べ非常に早い時間でＳ１００Ａ１０タンパク質に対するｓｃＦｖを作製できたことがわかる。
なお、本発明は、実施例として抗Ｓ１００Ａ１０抗体を大量に生産することを可能とすることを示したが、抗体は抗Ｓ１００Ａ１０抗体に限られるものではなく、その他のさまざまな抗体にも有利に適用可能であることを理解されたい。
実施例３
前記実施例１に記載の手法を反復した。但し、本例の場合、Ｓ１００Ａ１タンパク質及びＳ１０ ０Ａ１０タンパク質を抗原として使用し、前記実施例１と同様の手法で体外免疫法を実施し、ＩｇＧ１陽性率を計算した。図６は、このようにして得られた結果をプロットしたものである。抗原によってバラつきがでるものの、どちらも６０％以上という高い確率でＩｇＧ１へのクラススイッチが発生していることを図６から確認することができる。
本発明では、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での免疫において、ＬＰＳ（４０μｇ／ｍＬ）、ＩＬ−４、ＩＬ−５（１０ｎｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体（１μｇ／ｍＬ）等の刺激物質を抗原免疫後に１回添加し、４日間刺激物質存在下で培養することで有効なクラススイッチが実現可能であることが明らかになった。
実施例４
前記実施例１に記載の手法を反復した。但し、本例の場合、Ｓ１００Ａ１０蛋白質を抗原として前記実施例１と同様の手法で体外免疫法を実施し、培養を行った４日目と７日目に全細胞を回収し、そこからＴｏｔａｌ−ＲＮ Ａを取得した。
Ｔｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇをテンプレートとして、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１μＬをテンプレートとして、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。反応条件は、９５℃１０分→（９５℃ １５秒、６０℃１分）を４０サイクルで行った。
また、本例で使用した機材は、７５００Ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）である。得られた結果を内部標準であるβアクチンで標準化し、グラフ化した。得られた結果を図７に示す。図７から、すべてのマーカー遺伝子（Ｂｃｌ６、ＡＩＤ、Ｘｂｐ１、Ｂｌｉｍｐ１）で発現量の上昇が確認され、抗体の親和性、抗体産生細胞の分化、誘導がより高まることが確認された。ここで、Ｂｃｌ６やＡＩＤは、主に抗体の親和性成熟やクラススイッチに関与する遺伝子であり、Ｘｂｐ１は、多機能転写因子であって、抗体産生細胞への分化にもかかわっているとされ、Ｂｌｉｍｐ１もＸｂｐ１と同様に、Ｂ細胞が抗体産生細胞（プラズマ細胞）へ分化する際に働く因子である。
実施例５
本例では、サイトカインの細胞毒性試験の実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞はＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁し、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
刺激物質（ＩＬ−４（標準の終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−５（標準の終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体（標準の終濃度１μｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体（標準の終濃度１μｇ／ｍＬ）ＬＰＳ（標準の終濃度４０μｇ／ｍＬ））を標準の終濃度の１００００倍にて調製した。これをＰＢＳ（−）を用いて１０倍の段階希釈を行った。これにより、１０−６〜１０４倍までの刺激物質希釈系列を調製した。この刺激物質１．５μＬ（１／１０００容量）と脾臓細胞３００μＬを混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養後、細胞溶液１００μＬを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２時間保温した。そこにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を１０ｍＬ添加し、さらに１時間保温した。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、ブランクとして６５０ｎｍの吸光度を測定した。４５０ｎｍの測定値から６５０ｎｍの測定値を減じ、測定値を得た。それぞれの測定値を刺激物質無添加の場合の測定値で割ることにより、比増殖率を得た。得られた結果を図８のグラフに示す。グラフ化した際に、１０−５以下の結果は１０−４の結果と同一の値を示したため割愛した。また、刺激物質の各希釈倍率での終濃度は、下記の第２表に示す通りである。
上記したように、サイトカインの細胞毒性試験の結果を図８にグラフで示すが、このグラフは、縦軸が比増殖率、横軸が刺激物質の希釈倍率となっている。図中矢印で示した濃度が通常使用している濃度である。実験は３回独立して行い、平均をグラフ化した。
標準の終濃度で細胞毒性は観察されなかった。ＬＰＳに関しては現在の１０倍濃度を使用することで、細胞死が観察される場合があった。しかし刺激物を何も加えなかった場合と同程度までにしか下がっていないことからこの濃度でも使用可能であることが明らかとなった。また、標準の終濃度では、どの刺激物質を加えた場合も細胞の増殖が観察されたので、最も効率よく免疫されると考えられる。
実施例６
本例では、刺激物質組み合わせ検討の実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁させ、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
刺激物質（ＩＬ−４（標準の終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−５（標準の終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体（標準の終濃度１μｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体（標準の終濃度１μｇ／ｍＬ）ＬＰＳ（標準の終濃度４０μｇ／ｍＬ））を標準の終濃度の１０００倍にて調製した。この刺激物質１．５μＬ（１／１０００容量）と脾臓細胞３００μＬを混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養後、細胞溶液１００μＬを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２時間保温した。そこにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を１０ｍＬ添加し、さらに１時間保温した。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、ブランクとして６５０ｎｍの吸光度を測定した。４５０ｎｍの測定値から６５０ｎｍの測定値を減じ、測定値を得た。それぞれの測定値を刺激物質無添加の場合の測定値で割ることにより、比増殖率を得た。得られた結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。なお、グラフの縦軸は比増殖率を示し、横軸は添加した刺激物質の種類を示している。
また、培養後の残りの細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１μＬをテンプレートとして、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。反応条件は、９５℃１０分→（９５℃１５秒、６０℃１分）を４０サイクルで行った。また、本例で使用した機材は、７５００Ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）であった。得られた結果を内部標準であるβアクチンで標準化した。この数値を無添加の場合の値でさらに標準化してグラフ化した。得られた結果を、図１０Ａ〜図１０Ｄ、図１１Ａ及び図１１Ｂ、図１２Ａ及び図１２Ｂ、図１３、図１４、図１５及び図１６に示す。
刺激物質組み合わせ検討の結果を示す一連のグラフから、細胞増殖に関しては、ａｎｔｉＣＤ４０刺激とＬＰＳ刺激が効果的であることが明らかとなった。しかし、その際にＬＰＳとａｎｔｉＣＤ４０が共存する場合には増殖が抑えられることが明らかとなった。これは、細胞に入る刺激が強すぎた結果、アポトーシスが誘導されたことによると思われる。
一方、プラズマ細胞の分化マーカーの発現量は、ＬＰＳ、ａｎｔｉＣＤ３８、ＩＬ５のいずれかを添加した場合に増加しており、これら刺激によって分化が進行することが示唆された。また、これら刺激を複合して添加することで、発現量の増大が確認された。また、ＬＰＳには細胞増殖効果も存在するため、共存させることで全体の細胞数が増加し、結果として発現量が減少するという結果が得られた。また、分化マーカーの発現量がいずれか２種を添加することで、ほぼ飽和していることから、分化刺激は現在の使用濃度で充分目的を達していることが明らかとなった。さらに、ＩＬ４とａｎｔｉＣＤ４０を添加することで、全体の細胞数が上昇するので、結果として発現量は減少しているが、ここにＩＬ５やａｎｔｉＣＤ３８、ＬＰＳを添加することで分化マーカーの発現量を上昇させることが可能であることを確認できた。
さらに、体細胞変異のマーカー発現量は、同様にＬＰＳ、ａｎｔｉＣＤ３８、ＩＬ５のいずれかを添加した場合に増加していた。細胞があまり増殖しない条件（ＩＬ４、ａｎｔｉＣＤ４０、ＬＰＳが存在しない条件）ではＩＬ５とａｎｔｉＣＤ３８刺激によって体細胞変異マーカーの発現量が増大するが、細胞が増殖する条件ではＬＰＳ刺激によるマーカー発現量の増大が確認された。これは、ＬＰＳによって抗原非依存的にＢ細胞の活性化・分化が進行することを示唆している。ＬＰＳは大腸菌のペプチドグリカンを構成するリポ多糖であり、これが共存している状態は、生体内では微生物に感染した状態であることを意味している。生体防御という観点から、ＬＰＳ刺激によって、Ｂ細胞の体細胞変異・活性化を誘導し、より適した抗体を産生する細胞を作りだす働きが免疫担当細胞に備わっていることが考えられる。
今回の体外免疫方法では、まずもともとの脾臓細胞中に存在したＢ細胞のうち、目的の抗体を産生している細胞はＩＬ４、ａｎｔｉＣＤ４０によって増殖し、ＩＬ５、ａｎｔｉＣＤ３８によって体細胞変異をうけ、アフィニティのバリエーションをもった細胞群となることが予想された。また、抗原と反応しない細胞はＬＰＳ刺激によって増殖・体細胞変異をうけ、抗原と反応できるように変異を蓄積していくシステムであることが示唆された。
実施例７
本例では、サイトカイン濃度の上限と下限のマーカー発現量の実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁させ、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
抗原として精製したｈＳ１００Ａ１０蛋白質を用い、０．１ｎｍｏｌもしくは１ｎｍｏｌを用いて、脾臓細胞１ｘ１０７ｃｅｌｌｓを免疫した。この際、アジュバントとしてムラミルジペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を５０μｇ添加した。免疫反応は室温で１５分静置して実施した。刺激物質（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、ＬＰＳ）は下記の第３表の終濃度になるように調製した。この刺激物質と、免疫した脾臓細胞を混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養後、全ての細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１μＬをテンプレートとして、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。反応条件は、９５℃１０分→（９５℃１５秒、６０℃１分）を４０サイクルで行った。また、本例で使用した機材は、７５００Ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）であった。得られた結果を内部標準であるβアクチンで標準化した。この数値を無添加の場合の値でさらに標準化してグラフ化した。得られた結果を図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。
サイトカイン濃度の上限と下限のマーカー発現量の結果を示す図１７Ａ及び図１７Ｂにおいて、グラフの横軸は調べたマーカー遺伝子の名称を示し、縦軸はｍＲＮＡの発現量を示す。グラフの縦軸において、数値が０．０５減少した場合、ｍＲＮＡ発現量が約２倍になったと換算できる。
図から、抗原濃度が０．ｎｍｏｌでも１ｎｍｏｌでも、上限及び下限の刺激物質濃度で、無添加の場合と同等もしくはそれ以上のマーカーの発現を確認することができた。このことから、これらの範囲で刺激物質を添加することで抗原によって免疫された細胞が、形質細胞に分化し、その過程で抗体の親和性成熟やクラススイッチが発生していることが示唆された。
実施例８
本例では、Ｂ細胞の分化の検討の実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁させ、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
抗原として精製したｈＳ１００Ａ１０蛋白質１ｎｍｏｌを用いて、脾臓細胞２ｘ１０７ｃｅｌｌｓを免疫した。この際、アジュバントとしてムラミルジペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を１００μｇ添加した。免疫反応は室温で１５分静置して実施した。刺激物質（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、ＬＰＳ）は標準の終濃度の１０００倍になるように調製した。この刺激物質１０μＬと、免疫した脾臓細胞（２ｍＬ）を混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。コントロールとして、抗原のみ添加したものと刺激物質のみ添加したもの、無添加のものを同時に行った。
培養後、全ての細胞を回収し、１ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、染色バッファー（０．５％ＢＳＡ，２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）バッファー）に懸濁した。この細胞２０μＬを抗体で染色した。染色方法は、下記の第４表に記載の通りである。
染色した細胞を５００ｍＬの染色バッファーに懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒを用いて、解析した。各細胞の陽性率を測定し、グラフ化した。得られた結果を、図１８Ａ、図１８Ｂ、図１９Ａ〜図１９Ｄに示す。グラフは、縦軸が各細胞の陽性率で、横軸に抗原・刺激の有無を示す。
Ｂ細胞の分化の検討の結果を示す一連のグラフから、脾臓細胞を生体外で免疫することによって、Ｂ細胞の活性化・増殖及び、プラズマ細胞への分化を確認した。Ｂ細胞の活性化・成熟は、抗原ではなく刺激物質によって引き起こされていることが明らかとなった。抗原のみの場合は、プラズマ細胞への分化は確認されたが、Ｂ細胞の成熟はあまり確認されなかったことから、プラズマ細胞への分化は主に抗原刺激によって引き起こされていることが示唆された。Ｂ細胞の増殖は抗原のみを添加した場合でも刺激物質のみを添加した場合と同様に確認できたことから、Ｂ細胞の増殖に関してはアジュバントによる効果であることが示唆された。これは、アジュバントの構造がＬＰＳの末端構造と同一であることと、ＬＰＳによって細胞増殖が観察されるという結果からも示唆される。
得られたプラズマ細胞の割合が、刺激物質のみを添加した場合においても上昇していたことから、抗原非依存的に分化し得ることが示唆された。
また、脾臓中のＢ細胞は、抗原や刺激物質によって、Ｔ１−Ｂ細胞→Ｔ２−Ｂ細胞→Ｂ２細胞→Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ細胞と成熟し、プラズマ細胞に分化していく。実際、今回の手法によってＢ細胞がより成熟し、特にＢ２細胞が免疫しない場合に比べて大幅に増加していることが明らかとなった。
また、Ａｃｔｉｂａｔｅｄ−Ｂ細胞の割合が免疫の有無によってほとんど変化がなかったことから、Ａｃｔｉｂａｔｅｄ−Ｂ細胞からプラズマ細胞への分化は非常に迅速に行われていることが示唆された。抗原と刺激物質を共に添加した場合、刺激物質のみ添加した場合と比較して、Ｂ２細胞の割合が上昇していた。このことから、抗原が同時に添加されることによって、抗原依存的なＢ細胞の活性化が優先され、抗原非依存的な活性化が減少することが示唆された。つまり、今回の体外免疫法によって、目的の抗体を産生している細胞を優先的に分化させ得ることが示唆された。
実施例９
本例では、Ｂ細胞分化の検討マーカー発現量の実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁させ、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ ｘ １０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
抗原として精製したｈＳ１００Ａ１０蛋白質１ｎｍｏｌを用いて、脾臓細胞２ｘ１０７ｃｅｌｌｓを免疫した。この際、アジュバントとしてムラミルジペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を１００μｇ添加した。免疫反応は室温で１５分静置して実施した。刺激物質（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、ＬＰＳ）は標準の終濃度の１０００倍になるように調製した。この刺激物質１０μＬと、免疫した脾臓細胞（２ｍＬ）を混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。コントロールとして、抗原のみ添加したものと刺激物質のみ添加したもの、無添加のものを同時に行った。
培養後、全ての細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１μＬをテンプレートとして、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。反応条件は、９５℃１０分→（９５℃１５秒、６０℃１分）を４０サイクルで行った。また、本例で使用した機材は、７５００Ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）であった。得られた結果を内部標準であるβアクチンの数値を、同時に測定したＰｌａｓｍａ細胞もしくはＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ細胞の割合とかけあわせることでそれぞれの細胞由来のβアクチンの発現量を得た。このＰｌａｓｍａ細胞由来のβアクチンの発現量でＢｌｉｍｐ−１及びＸｂｐ−１の発現量を、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ細胞由来のβアクチンの発現量でＢｃｌ−６及びＡＩＤの発現量をそれぞれ標準化した。この値を、無添加の場合でさらに標準化し、グラフ化した。得られた結果を図２０Ａ〜図２０Ｄに示す。
Ｂ細胞分化の検討マーカー発現量の結果を示す一連のグラフからわかるように、抗体染色の結果と同様に、抗原を添加した場合にプラズマ細胞への分化マーカーであるＢｌｉｍｐ−１やＸｂｐ−１の発現量が上昇していた。また、体細胞変異のマーカーであるＢｃｌ−６やＡＩＤは、刺激物質を添加することによって高発現となることが明らかとなった。これにより、抗原のみでなく、刺激物質を加えることで、より高親和性の抗体が得やすくなる可能性があることが確認された。
さらに、抗原と刺激物質を共に加えた場合に、刺激物質のみを加えた場合よりも体細胞変異マーカーの発現量が減少していることから、特定の抗原が共存することで、体細胞変異をある程度抑制し、変異が入りすぎることによる活性の低下を防ぐシステムがあることが示唆された。
また、免疫前の脾臓細胞では、分化マーカーはほとんど発現していないが、体細胞変異マーカーは高い発現量を示した。これは、体細胞変異によって抗体のレパートリーを増やす反応を常に行っているためであると考えられる。
実施例１０
本例では、ＥＬＩＳＡ実験方法について説明する。
５ｍｌ ＬＢ培地で培養し集菌した後，１ｍｌのＰＢＳに懸濁して超音波破砕を行い，可溶性のＭＢＰ−ｓｃＦｖを含む破砕上清画分を採取した。
この上清画分を３％ ＢＳＡ／ＰＢＳで５０倍に希釈し、この５０μｌをＥＬＩＳＡ法に用いた。得られた結果を図２１〜図２４に示す。
図２１に示すＥＬＩＳＡ法では、本体外免疫法に則り、モデル抗原として、Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＨＥＬ）を免疫し構築したａｎｔｉ−ＨＥＬ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖの活性をＥＬＩＳＡにより測定した。抗原特異性を調べるために、β−Ｃａｓｅｉｎ，Ｓ１００Ａ２，Ｓ１００Ａ１４，Ｈｅｎ Ｅｇｇ ＬｙｓｏｚｙｍｅをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて測定を行った。この結果、本法を用いることでＨｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅに対して明らかに特異性のあるｓｃＦｖが得られていることが確認された。
図２２に示すＥＬＩＳＡ法では、本体外免疫法の変法として、Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅに代えて、ＭＡＣＳを用いて分離した、Ｂ細胞に対してＨｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅを免疫した。図２１と同様にして、構築したａｎｔｉ−ＨＥＬ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖの特異性を確認したところ、十分な特異性を持つｓｃＦｖが得られていることが確認された。このことから、本法では、分離されたＢ細胞に対しても、直接的に有効な免疫操作が可能であることが示された。
図２３に示すＥＬＩＳＡ法では、本体外免疫法で目的のｓｃＦｖの遺伝子配列が得られる。これを利用することで、ｓｃＦｖにさらに機能を付け加えることも可能である。その一例として、ａｎｔｉ−ＨＥＬ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖのＣ末端に蛍光蛋白質の１つであるＥＧＦＰを融合させた、ａｎｔｉ−ＨＥＬ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ−ＥＧＦＰを作製した。ｓｃＦｖとＥＧＦＰの間は，ＧｌｙおよびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙといった長さの異なるリンカーを介したものを２種類作製した。図２１と同様にして、構築したＭＢＰ−ｓｃＦｖ−ＥＧＦＰの特異性を確認したところ、Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅに対して特異性を持ち、且つ、蛍光を有するｓｃＦｖの作製が可能であることが確認された。
蛋白質以外のモデル抗原として、本法に則りペプチドを免疫した。一般の免疫方法では、ペプチドの様な低分子量のものは、ＫＬＨやＢＳＡ等の蛋白質にコンジュゲートしたものを抗原として用いるが、本法では、体外においてＢ細胞を直接標的にすることから、ペプチドそのものでも免疫反応が生じると考えられる。そこで、長さの異なる４種類のペプチドをモデル抗原として用い、ペプチドを直接免疫した。用いたペプチドは、次の通りである：β−ｃｏｓｏｍｏｒｐｈｉｎ−７（Ｂｏｖｉｎｅ；ＹＰＦＰＧＰＩ，７ ａ．ａ．），Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ（Ｈｕｍａｎ；ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ，１０ ａ．ａ．），Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ；ＰＴＨ（Ｈｕｍａｎ；ＥＡＤＫＡＤＶＮＶＬＹＫＡＫＳＱ，１６ ａ．ａ．）。各ペプチドをＰＢＳに溶かし、１０μｇを免疫した。
図２４に示すＥＬＩＳＡ法では、本法に則り構築したａｎｔｉ−β−Ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ７／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ，ａｎｔｉ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ，ａｎｔｉ−ＰＴＨ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖの活性をＥＬＩＳＡにより測定した。特異性を調べるために、β−Ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ−７，Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ，ＰＴＨをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて測定を行った。この結果、各ペプチドに対して有意に特異性を持つｓｃＦｖが得られることが確認された。本法では、ペプチドそのものを抗原として添加するだけで、短いペプチドに対してもｓｃＦｖの取得が可能であることが示された。
実施例１１
本例では、抗ｍｏｕｓｅ（マウス）蛋白質抗体の取得実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁させ、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
抗原として精製したｈＳ１００Ａ１０蛋白質及び、購入したｍＡｌｂｕｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ社）を用いた。それぞれ１ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌを用いて、脾臓細胞２ｘ１０７ｃｅｌｌｓを免疫した。この際、アジュバントとしてムラミルジペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を１００μｇ添加した。免疫反応は室温で１５分静置して実施した。刺激物質（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、ＬＰＳ）は標準の終濃度の１０００倍になるように調製した。この刺激物質１０μＬと、免疫した脾臓細胞（２ｍＬ）を混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養後、全ての細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１０μＬをテンプレートとして、ＰＣＲによって抗体のＨ鎖及びＬ鎖の超可変領域を増幅した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（ＴａＫａＲａ社）を用い、反応組成・反応条件はメーカープロトコールに従った。得られた４００ｂｐのフラグメントをアガロースゲル電気泳動（２．０％ Ｓｅａｋｅｍ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）／ＴＡＥバッファー、１５０Ｖ ３０ｍｉｎ）によって分離し、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出精製した。実験方法は、メーカープロトコールに従った。抽出したフラグメント各５０ｎｇをテンプレートとして、ＰＣＲによって８００ｂｐのｓｃＦｖフラグメントを調製した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（ＴａＫａＲａ社）を用い、反応組成・反応条件はメーカープロトコールに従った。得られた８００ｂｐのフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（共にＴＯＹＯＢＯ社製）で切断し、ｐＭａｌ−ｃ２Ｅベクター（ＮＥＢ社）にサブクローニングした。
サブクローニングしたＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたクローンをＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を添加したＬＢ培地５ｍＬで培養した。２７℃で一晩培養した後、１．５ｍＬの培養液から菌体を回収し、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ３００μＬで可溶性蛋白質を回収した。
回収した可溶性蛋白質５μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１０％ ポリアクリルアミドゲル、２５ｍＡ ６０ｍｉｎ）でＭＢＰ−ｓｃＦｖの発現を確認した。
また、ＥＬＩＳＡ法を用いて、抗体のアフィニティを検証した。ＥＬＩＳＡ用のプレートとして、ｍＳ１００Ａ１０もしくはｍＡｌｂｕｍｉｎを固定化したプレートを調製した。１ウェル当たり、１μｇの蛋白質を添加し、４℃で一晩固定化した。ＰＢＳ（−）で洗浄後、ｍＳ１００Ａ１０ ｐｌａｔｅは３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン（和光純薬社））／ＰＢＳ（−）で、ｍＡｌｂｕｍｉｎ ｐｌａｔｅは１％ ＨＥＬ（ニワトリ卵白リゾチーム（生化学工業社））／ＰＢＳ（−）で、それぞれブロッキングを行った。室温で１時間ブロッキングを行った後、ＰＢＳで洗浄した。このように調製したプレートに、ＭＢＰ−ｓｃＦｖ抗体サンプルを添加した。抗体はｍＳ１００Ａ１０ ｐｌａｔｅに添加するものは３％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）で、ｍＡｌｂｕｍｉｎ ｐｌａｔｅに添加するものは１％ ＨＥＬ／ＰＢＳ（−）で、それぞれ５０倍に希釈し、室温で３０分間静置した。このサンプル５０μＬを調製したプレートに添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、２次抗体（ａｎｔｉ−ＭＢＰ，ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＮＥＢ社））をＰＢＳ（−）で２０００倍に希釈した溶液を５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＫＰＬ社）を１００μＬ添加して、発色させた。発色反応は室温で３分間行い、反応を停止するために１Ｎ ＨＣｌ（和光純薬社）を１００μＬ添加した。その後、マイクロプレートリーダーモデル６８０（ＢｉｏＲａｄ社）で４５０ｎｍ／６５５ｎｍの吸光度を測定した。
測定値から、ブランクの値を差し引き、グラフ化した。グラフの縦軸には吸光度を、横軸にはサンプルＮｏを記載した。ｍＡｌｂｕｍｉｎを免疫したクローンはｍＡｌｂｕｍｉｎｐｌａｔｅでの値をポジティブ値、ｍＳ１００Ａ１０ ｐｌａｔｅでの値をネガティブ値とした。特に差の見られたクローンには星印を加えた。
また、ポジティブ値をネガティブ値で割り、マイナスの値を示し、かつポジティブ値が正の値を示したクローンを＋＋、２以上の値を示したクローンを＋、１〜２の値を示したクローンを±、１以下の値を示したクローンを−と定義し、それぞれの陽性率をグラフ化した。このようにして得られた結果を図２５〜図２９に示す。
抗ｍｏｕｓｅ蛋白質抗体の取得結果を示す一連のグラフから理解されるように、ｍＳ１００Ａ１０に関しては、多数の抗体を取得することができた。抗体のアフィニティ分布を調べた結果、高濃度の抗原を免疫することで、アフィニティのないクローンが多数得られた。しかしながら、高アフィニティの抗体の陽性率は低濃度の抗原で免疫した場合と大差ないことから、体細胞変異の頻度が上昇したため、抗原に反応できなくなったクローンが増加したと考えられる。このことから、抗原性の低い抗原を使用する場合は、なるべく高濃度に使用することで、より目的に即した抗体を得られる可能性が示唆された。
一方、ｍＡｌｂｕｍｉｎに対する抗体は、非常の取得困難であることが明らかとなった。この原因として、マウスの血液中に多量に存在しているので、これに対する抗体を作成しやすいと自己免疫疾患になる確率が急上昇する。このため、骨髄から脾臓に免疫担当細胞が運ばれる前にセレクションを受けて可能性のあるクローンを排除していることが考えられる。よって、これらに対する抗体を作製する場合には、骨髄から免疫担当細胞を取得して免疫する方が効率よく抗体を取得できる可能性がある。さらに、ｍＳ１００Ａ１０抗体を取得した結果から、１０ｎｍｏｌよりも濃い濃度で免疫することで効率よく抗体を取得できる可能性が示唆された。また、弱いながらも、ｍＡｌｂｕｍｉｎに反応する抗体が取得できているため、遺伝子に人為的に変異を導入することで、目的の抗体を取得する手法も採用することができる。
実施例１２
本例では、抗低分子化合物抗体の取得及び実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞はＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁し、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
抗原としてＨＥＬ−Ｃｙ３蛋白質及びＨＥＬ−ＩＴＣを用いた。それぞれＣｙ３ Ｍｏｎｏ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ Ｐａｃｋ（ＧＥヘルスケア社）、ＦＩＴＣ（フナコシ社）を用いてＨＥＬ（生化学工業社）をラベル化した。ラベル化率を測定し、低分子化合物１ｎｍｏｌ相当を用いて、脾臓細胞２ｘ１０７ｃｅｌｌｓを免疫した。この際、アジュバントとしてムラミルジペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を１００μｇ添加した。免疫反応は室温で１５分静置して実施した。刺激物質（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、ＬＰＳ）は標準の終濃度の１０００倍になるように調製した。この刺激物質１０μＬと、免疫した脾臓細胞（２ｍＬ）を混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養後、全ての細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１０μＬをテンプレートとして、ＰＣＲによって抗体のＨ鎖及びＬ鎖の超可変領域を増幅した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（ＴａＫａＲａ社）を用い、反応組成・反応条件はメーカープロトコールに従った。得られた４００ｂｐのフラグメントをアガロースゲル電気泳動（２．０％ Ｓｅａｋｅｍ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）／ＴＡＥバッファー、１５０Ｖ ３０ｍｉｎ）によって分離し、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出精製した。実験方法は、メーカープロトコールに従った。抽出したフラグメント各５０ｎｇをテンプレートとして、ＰＣＲによって８００ｂｐのｓｃＦｖフラグメントを調製した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（ＴａＫａＲａ社）を用い、反応組成・反応条件はメーカープロトコールに従った。得られた８００ｂｐのフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（共にＴＯＹＯＢＯ社製）で切断し、ｐＭａｌ−ｃ２Ｅベクター（ＮＥＢ社）にサブクローニングした。
サブクローニングしたＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたクローンをＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を添加したＬＢ培地５ｍＬで培養した。２７℃で一晩培養したのち、１．５ｍＬの培養液から菌体を回収し、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ３００μＬで可溶性蛋白質を回収した。
回収した可溶性蛋白質５μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１０％ ポリアクリルアミドゲル、２５ｍＡ ６０ｍｉｎ）でＭＢＰ−ｓｃＦｖの発現を確認した。
図３０は、抗低分子化合物抗体の取得を示す電気泳動写真を示したものである。Ｃｙ３−ＨＥＬ、ＦＩＴＣ−ＨＥＬともに、目的の蛋白質（図中の矢印部分）の高発現を確認できた。このことから、目的の抗体を取得できたことが示唆された。
実施例１
本例では、Ｓ１００Ａ１０タンパク質を抗原例として用い、抗体ＩｇＧ１の作製方法について説明する。
脾臓細胞（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）抽出
マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、洗浄した。２匹分の脾臓をメッシュ上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした後、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。次いで、ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えた。遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０（−）６ｍＬに懸濁した。セルストレイナーを通して、不溶性の脂肪等を除去した。
体外免疫
Ｓ１００Ａ１０タンパク質抗原をアッセイキット（Ｄｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ＢｉｏＲａｄ社製）で濃度を測定した。この際のスタンダードとして、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。濃度既知のＳ１００Ａ１０タンパク質抗原を所定の量（５μｇ若しくは２０μｇ）分注し、これにアジュバントＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ（マウス１匹当５０μＬ）で添加し室温で１５分間静置した。脾臓細胞に、調製した抗原溶液を添加し、室温で１５分間静置した。ＲＰＭＩ１６４０（４０％ＦＢＳ）を６ｍＬずつ添加した。刺激物質（ＩＬ−４（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−５（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体（終濃度１μｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体（終濃度１μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（終濃度４０μｇ／ｍＬ））を添加した。１０ｃｍデッシュに全量を播いた。３７℃ ＣＯ２インキュベーターにて培養（４日間）した。培養終了後、細胞を遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）で回収し、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ ０．４％（ＧＩＢＣＯ社製）で細胞を染色し血球計算版（アズワン社製）にて免疫後の脾臓細胞数をカウントした。細胞数は５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合、１．３３ ｘ １０７ｃｅｌｌｓ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合、０．７１ ｘ １０７ｃｅｌｌｓであった。この細胞をＭｅｄｉｕｍ Ｂ（Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ ＨＹキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてウオッシュ洗浄（１０ｍＬ ｘ ３ｔｉｍｅｓ）し、１．００ ｘ １０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。
メラノーマ細胞の調製
ＰＡＩ細胞（マウス由来ミエローマ細胞）をＭｅｄｉｕｍ Ａ（Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ ＨＹキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて、継代培養しておいた。Ｍｅｄｉｕｍ Ｂを用いて細胞をウオッシュ洗浄（１０ｍＬ ｘ ３ｔｉｍｅｓ）し、上記と同じ装置を用いてカウントした。当該細胞数は、細胞融合時に５ ｘ １０７ｃｅｌｌｓが好ましい。
細胞融合
脾臓細胞Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ：メラノーマ細胞Ｍｙｅｌｏｍａ＝２：１にて細胞を混合し、遠心して回収した。タッピングした後、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合６６．５μＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合３５．５μＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して５００μＬ）、で混合した。
遠心分離して回収した後、Ｍｅｄｉｕｍ Ｂを、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合６６５μＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合３５５μＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して５ｍＬ）、で一滴ずつ添加した。
これにＭｅｄｉｕｍ Ｃ（Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ ＨＹキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合６６５μＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合３５５μＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して５ｍＬ）、で一滴ずつ添加した。この溶液を、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合５．３２ｍＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合２．８４ｍＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して４０ｍＬ）、でＭｅｄｉｕｍＣに静かに添加し、３７℃ ＣＯ２インキュベーターにて培養（１日間）（１５ｍＬ遠沈管にて）した。
細胞融合したその日に４℃のインキュベーターにＭｅｄｉｕｍ Ｄ（Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ ＨＹキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を移し、溶解しておいた。溶解確認後、よく混合した後、室温に戻した。
クローニング
細胞を遠心して回収し、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合１．３３ｍＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合０．７１ｍＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して１０ｍＬ）のＭｅｄｉｕｍ Ｃに懸濁し、これを、５μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合１１．９７ｍＬ、２０μｇのＳ１００Ａ１０抗原を免疫した場合６．３９ｍＬ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ １ ｘ １０８ｃｅｌｌｓに対して９０ｍＬ）のＭｅｄｉｕｍ Ｄに懸濁した。３７℃で１５分インキュベートした後、１０ｃｍデッシュに撒いた。更に、３７℃ ＣＯ２インキュベーターにて培養（１０〜１４日間）した。
ハーベスト
細胞コロニーを目視下でカウントし、その全てを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ウェルプレート）に移し、２００μＬのＭｅｄｉｕｍ Ｅ（Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ ＨＹキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を加えた。次いで、３７℃ ＣＯ２インキュベーターにて培養（４日間）した。上清を１５０μＬ回収し、Ｓ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡによる確認を行った。
Ｓ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅの調製
Ｓ１００Ａ１０抗原をＰＢＳ（−）にて５μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬずつ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅ Ｆ８ ｍａｘｉｓｏａｐ．Ｎｕｎｃ社製）に添加した。これを４℃で１日間静置した後、上清を捨て、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）を２００μＬずつ添加した。室温で１時間静置した後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、Ｓ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅを調製した。
Ｓ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ
Ｓ１００Ａ１０ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅに上記ハーベストの項で取得した１５０μＬの培養上清を加え、３７℃インキュベーターにて１時間静置した。上清を捨て、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、ＰＢＳ（−）で５０００倍に希釈した二次抗体（ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１−ＨＲＰ、フナコシ社製）を５０μＬ添加し、３７℃インキュベーターにて１時間静置した。上清を捨て、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ溶液を添加し、３７℃インキュベーターにて１０分間静置した。その後直ちに１Ｎ ＨＣｌ（和光純薬社製）を１００μＬ添加し、反応を停止させた。その後、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ５５０，ＢｉｏＲａｄ社製）にて測定した。得られた結果を下記の第１表に示す。
実施例２
本例では、抗Ｓ１００Ａ１０抗体遺伝子の抽出及び大腸菌による抗体の発現工程について説明する。
ＤＮＡ抽出、一本鎖抗体ｓｃＦｖプラスミドの作製
免疫後のＢ細胞やハイブリドーマ１．５ ｘ １０６ｃｅｌｌｓ（セル）より、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを取得した。なお、前記実施例１で説明した体外免疫工程で得られる免疫細胞を当該工程で用いても良い。
次いで、１．２％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ（アガロースゲル）電気泳動により、取得確認を実施した。得られた結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
取得したＴｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして、マウス（ｍｏｕｓｅ）ＶＨ遺伝子特異的プライマー若しくはｍｏｕｓｅ ＶＬ遺伝子特異的プライマーとし、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）試薬を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてプライマーＶＨ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ／ＶＨ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ若しくはＶＬ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ／ＶＬ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）により、１ｓｔ ＰＣＲを実施した。使用したプライマー配列は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ｐｐ．２１０−２１１）に紹介されているものを利用した。
その後、２％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ電気泳動により、取得確認を実施した。得られた結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
電気泳動後のアガロースゲルから目的のバンドを切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を抽出し、精製した。次いで、そのＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子の各１０ｎｇを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）により、プライマーを添加せず、Ｌｉｎｋ ＰＣＲを実施した。その後、Ｌｉｎｋ ＰＣＲのサンプルにプライマー２ｎｄ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｘを加えてそのままＰＣＲ増幅を実施した。その後、２％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ電気泳動により、取得確認を実施した。得られた結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。これらの結果から、目的のｓｃＦｖ ＰＣＲ産物が得られたことが確認できた。
次いで、ｓｃＦｖ ＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩと３７℃で１時間反応させて分解し、電気泳動後のアガロースゲルから目的のバンドを切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｓｃＦｖ遺伝子を抽出し、精製した。同様に、プラスミドベクターｐＭＡＬ−ｐ２Ｘを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩと３７℃で１時間反応させて分解し、電気泳動後のアガロースゲルから目的のバンドを切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドベクター遺伝子を抽出し、精製した。これらの精製物をプラスミドベクター遺伝子１ｍｏｌに対しｓｃＦｖ遺伝子６ｍｏｌの割合で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ〈Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ〉（ＴａＫａＲａ社製）を用いてライゲーションした。ライゲーション溶液２０μＬを大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルと混合し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。この形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１８時間培養した。
ｓｃＦｖ遺伝子の連結したプラスミドを持つ大腸菌クローンをセレクションするため、上記の工程で形成したコロニーをコロニーＰＣＲ法に供し、さらに２％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ電気泳動により、取得確認を実施した。得られた結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。
上記のようにして得たクローンを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地により３７℃で１８時間培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、プラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドのＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーＭｅｇａＢＡＳＥ １０００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて確認した。この抗体遺伝子の取得工程には、３日を要した。
大腸菌による一本鎖抗体ｓｃＦｖの発現
シークエンスを確認したプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。この形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１８時間培養した。
次いで、上記のようにして形成したコロニーを、５ｍＬの５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＧ液体培地により３０℃で１８時間培養した。この培養液１ｍＬを１００ｍＬの５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＧ液体培地により３０℃で培養した。培養１時間ごとに６６０ｎｍの吸光度を分光光度計ＵＶ−１２００（島津製作所社製）にて測定した。吸光度が０．５に達した時点で、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、２３℃で２０時間培養した。培養終了後、遠心分離（６０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により大腸菌菌体を回収した。これをＳｏｌ．Ａ ５ｍＬ（２０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．５ｍＭ ＡＰＭＳＦ）に溶解し、室温で１０分間静置した。遠心分離（６０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により大腸菌菌体を回収し、氷冷したＳｏｌ．Ｂ ５ｍＬ（５ｍＭ ＭｇＳＯ４）に溶解し氷上に１０分間静置した。その後遠心分離（６０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により、上清を回収した。
その後、上記のようにして回収した上清をアミロースレジンカラム（１０ｍＬ、φ２．５ｃｍ ｘ ３．３ｃｍ）に供した。上清が全てカラムを通過した後、ウオッシュ緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）４０ｍＬでカラムを洗浄した。この洗浄を２回実施した後、Ｅｌｕｔｅ緩衝液（５ｍＭ Ｍａｌｔｏｓｅ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）４０ｍＬでカラムに吸着したＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）−ｓｃＦｖ蛋白質を溶出し、精製した。精製したＭＢＰ−ｓｃＦｖ蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により解析した。得られた結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。
また、精製したＭＢＰ−ｓｃＦｖ蛋白質の濃度を、アッセイキット（Ｄｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ＢｉｏＲａｄ社製）で測定した。その結果、５０ｍＬの培養液から０．３４５ｍｇのＭＢＰ−ｓｃＦｖ蛋白質が得られたことがわかった。
ところで、上記の精製工程には３日を要した。本方法は、抗体遺伝子の取得工程から数えれば、６日で終了し、通常の方法（２〜３ヶ月を要する）に比べ非常に早い時間でＳ１００Ａ１０タンパク質に対するｓｃＦｖを作製できたことがわかる。
なお、本発明は、実施例として抗Ｓ１００Ａ１０抗体を大量に生産することを可能とすることを示したが、抗体は抗Ｓ１００Ａ１０抗体に限られるものではなく、その他のさまざまな抗体にも有利に適用可能であることを理解されたい。
実施例３
前記実施例１に記載の手法を反復した。但し、本例の場合、Ｓ１００Ａ１タンパク質及びＳ１０ ０Ａ１０タンパク質を抗原として使用し、前記実施例１と同様の手法で体外免疫法を実施し、ＩｇＧ１陽性率を計算した。図６は、このようにして得られた結果をプロットしたものである。抗原によってバラつきがでるものの、どちらも６０％以上という高い確率でＩｇＧ１へのクラススイッチが発生していることを図６から確認することができる。
本発明では、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での免疫において、ＬＰＳ（４０μｇ／ｍＬ）、ＩＬ−４、ＩＬ−５（１０ｎｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体（１μｇ／ｍＬ）等の刺激物質を抗原免疫後に１回添加し、４日間刺激物質存在下で培養することで有効なクラススイッチが実現可能であることが明らかになった。
実施例４
前記実施例１に記載の手法を反復した。但し、本例の場合、Ｓ１００Ａ１０蛋白質を抗原として前記実施例１と同様の手法で体外免疫法を実施し、培養を行った４日目と７日目に全細胞を回収し、そこからＴｏｔａｌ−ＲＮ Ａを取得した。
Ｔｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇをテンプレートとして、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１μＬをテンプレートとして、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。反応条件は、９５℃１０分→（９５℃ １５秒、６０℃１分）を４０サイクルで行った。
また、本例で使用した機材は、７５００Ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）である。得られた結果を内部標準であるβアクチンで標準化し、グラフ化した。得られた結果を図７に示す。図７から、すべてのマーカー遺伝子（Ｂｃｌ６、ＡＩＤ、Ｘｂｐ１、Ｂｌｉｍｐ１）で発現量の上昇が確認され、抗体の親和性、抗体産生細胞の分化、誘導がより高まることが確認された。ここで、Ｂｃｌ６やＡＩＤは、主に抗体の親和性成熟やクラススイッチに関与する遺伝子であり、Ｘｂｐ１は、多機能転写因子であって、抗体産生細胞への分化にもかかわっているとされ、Ｂｌｉｍｐ１もＸｂｐ１と同様に、Ｂ細胞が抗体産生細胞（プラズマ細胞）へ分化する際に働く因子である。
実施例５
本例では、サイトカインの細胞毒性試験の実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞はＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁し、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
刺激物質（ＩＬ−４（標準の終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−５（標準の終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体（標準の終濃度１μｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体（標準の終濃度１μｇ／ｍＬ）ＬＰＳ（標準の終濃度４０μｇ／ｍＬ））を標準の終濃度の１００００倍にて調製した。これをＰＢＳ（−）を用いて１０倍の段階希釈を行った。これにより、１０−６〜１０４倍までの刺激物質希釈系列を調製した。この刺激物質１．５μＬ（１／１０００容量）と脾臓細胞３００μＬを混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養後、細胞溶液１００μＬを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２時間保温した。そこにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を１０ｍＬ添加し、さらに１時間保温した。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、ブランクとして６５０ｎｍの吸光度を測定した。４５０ｎｍの測定値から６５０ｎｍの測定値を減じ、測定値を得た。それぞれの測定値を刺激物質無添加の場合の測定値で割ることにより、比増殖率を得た。得られた結果を図８のグラフに示す。グラフ化した際に、１０−５以下の結果は１０−４の結果と同一の値を示したため割愛した。また、刺激物質の各希釈倍率での終濃度は、下記の第２表に示す通りである。
標準の終濃度で細胞毒性は観察されなかった。ＬＰＳに関しては現在の１０倍濃度を使用することで、細胞死が観察される場合があった。しかし刺激物を何も加えなかった場合と同程度までにしか下がっていないことからこの濃度でも使用可能であることが明らかとなった。また、標準の終濃度では、どの刺激物質を加えた場合も細胞の増殖が観察されたので、最も効率よく免疫されると考えられる。
実施例６
本例では、刺激物質組み合わせ検討の実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁させ、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
刺激物質（ＩＬ−４（標準の終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−５（標準の終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体（標準の終濃度１μｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体（標準の終濃度１μｇ／ｍＬ）ＬＰＳ（標準の終濃度４０μｇ／ｍＬ））を標準の終濃度の１０００倍にて調製した。この刺激物質１．５μＬ（１／１０００容量）と脾臓細胞３００μＬを混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養後、細胞溶液１００μＬを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２時間保温した。そこにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を１０ｍＬ添加し、さらに１時間保温した。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、ブランクとして６５０ｎｍの吸光度を測定した。４５０ｎｍの測定値から６５０ｎｍの測定値を減じ、測定値を得た。それぞれの測定値を刺激物質無添加の場合の測定値で割ることにより、比増殖率を得た。得られた結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。なお、グラフの縦軸は比増殖率を示し、横軸は添加した刺激物質の種類を示している。
また、培養後の残りの細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１μＬをテンプレートとして、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。反応条件は、９５℃１０分→（９５℃１５秒、６０℃１分）を４０サイクルで行った。また、本例で使用した機材は、７５００Ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）であった。得られた結果を内部標準であるβアクチンで標準化した。この数値を無添加の場合の値でさらに標準化してグラフ化した。得られた結果を、図１０Ａ〜図１０Ｄ、図１１Ａ及び図１１Ｂ、図１２Ａ及び図１２Ｂ、図１３、図１４、図１５及び図１６に示す。
刺激物質組み合わせ検討の結果を示す一連のグラフから、細胞増殖に関しては、ａｎｔｉＣＤ４０刺激とＬＰＳ刺激が効果的であることが明らかとなった。しかし、その際にＬＰＳとａｎｔｉＣＤ４０が共存する場合には増殖が抑えられることが明らかとなった。これは、細胞に入る刺激が強すぎた結果、アポトーシスが誘導されたことによると思われる。
一方、プラズマ細胞の分化マーカーの発現量は、ＬＰＳ、ａｎｔｉＣＤ３８、ＩＬ５のいずれかを添加した場合に増加しており、これら刺激によって分化が進行することが示唆された。また、これら刺激を複合して添加することで、発現量の増大が確認された。また、ＬＰＳには細胞増殖効果も存在するため、共存させることで全体の細胞数が増加し、結果として発現量が減少するという結果が得られた。また、分化マーカーの発現量がいずれか２種を添加することで、ほぼ飽和していることから、分化刺激は現在の使用濃度で充分目的を達していることが明らかとなった。さらに、ＩＬ４とａｎｔｉＣＤ４０を添加することで、全体の細胞数が上昇するので、結果として発現量は減少しているが、ここにＩＬ５やａｎｔｉＣＤ３８、ＬＰＳを添加することで分化マーカーの発現量を上昇させることが可能であることを確認できた。
さらに、体細胞変異のマーカー発現量は、同様にＬＰＳ、ａｎｔｉＣＤ３８、ＩＬ５のいずれかを添加した場合に増加していた。細胞があまり増殖しない条件（ＩＬ４、ａｎｔｉＣＤ４０、ＬＰＳが存在しない条件）ではＩＬ５とａｎｔｉＣＤ３８刺激によって体細胞変異マーカーの発現量が増大するが、細胞が増殖する条件ではＬＰＳ刺激によるマーカー発現量の増大が確認された。これは、ＬＰＳによって抗原非依存的にＢ細胞の活性化・分化が進行することを示唆している。ＬＰＳは大腸菌のペプチドグリカンを構成するリポ多糖であり、これが共存している状態は、生体内では微生物に感染した状態であることを意味している。生体防御という観点から、ＬＰＳ刺激によって、Ｂ細胞の体細胞変異・活性化を誘導し、より適した抗体を産生する細胞を作りだす働きが免疫担当細胞に備わっていることが考えられる。
今回の体外免疫方法では、まずもともとの脾臓細胞中に存在したＢ細胞のうち、目的の抗体を産生している細胞はＩＬ４、ａｎｔｉＣＤ４０によって増殖し、ＩＬ５、ａｎｔｉＣＤ３８によって体細胞変異をうけ、アフィニティのバリエーションをもった細胞群となることが予想された。また、抗原と反応しない細胞はＬＰＳ刺激によって増殖・体細胞変異をうけ、抗原と反応できるように変異を蓄積していくシステムであることが示唆された。
実施例７
本例では、サイトカイン濃度の上限と下限のマーカー発現量の実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁させ、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
抗原として精製したｈＳ１００Ａ１０蛋白質を用い、０．１ｎｍｏｌもしくは１ｎｍｏｌを用いて、脾臓細胞１ｘ１０７ｃｅｌｌｓを免疫した。この際、アジュバントとしてムラミルジペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を５０μｇ添加した。免疫反応は室温で１５分静置して実施した。刺激物質（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、ＬＰＳ）は下記の第３表の終濃度になるように調製した。この刺激物質と、免疫した脾臓細胞を混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養後、全ての細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１μＬをテンプレートとして、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。反応条件は、９５℃１０分→（９５℃１５秒、６０℃１分）を４０サイクルで行った。また、本例で使用した機材は、７５００Ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）であった。得られた結果を内部標準であるβアクチンで標準化した。この数値を無添加の場合の値でさらに標準化してグラフ化した。得られた結果を図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。
図から、抗原濃度が０．ｎｍｏｌでも１ｎｍｏｌでも、上限及び下限の刺激物質濃度で、無添加の場合と同等もしくはそれ以上のマーカーの発現を確認することができた。このことから、これらの範囲で刺激物質を添加することで抗原によって免疫された細胞が、形質細胞に分化し、その過程で抗体の親和性成熟やクラススイッチが発生していることが示唆された。
実施例８
本例では、Ｂ細胞の分化の検討の実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁させ、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
抗原として精製したｈＳ１００Ａ１０蛋白質１ｎｍｏｌを用いて、脾臓細胞２ｘ１０７ｃｅｌｌｓを免疫した。この際、アジュバントとしてムラミルジペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を１００μｇ添加した。免疫反応は室温で１５分静置して実施した。刺激物質（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、ＬＰＳ）は標準の終濃度の１０００倍になるように調製した。この刺激物質１０μＬと、免疫した脾臓細胞（２ｍＬ）を混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。コントロールとして、抗原のみ添加したものと刺激物質のみ添加したもの、無添加のものを同時に行った。
培養後、全ての細胞を回収し、１ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、染色バッファー（０．５％ＢＳＡ，２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）バッファー）に懸濁した。この細胞２０μＬを抗体で染色した。染色方法は、下記の第４表に記載の通りである。
Ｂ細胞の分化の検討の結果を示す一連のグラフから、脾臓細胞を生体外で免疫することによって、Ｂ細胞の活性化・増殖及び、プラズマ細胞への分化を確認した。Ｂ細胞の活性化・成熟は、抗原ではなく刺激物質によって引き起こされていることが明らかとなった。抗原のみの場合は、プラズマ細胞への分化は確認されたが、Ｂ細胞の成熟はあまり確認されなかったことから、プラズマ細胞への分化は主に抗原刺激によって引き起こされていることが示唆された。Ｂ細胞の増殖は抗原のみを添加した場合でも刺激物質のみを添加した場合と同様に確認できたことから、Ｂ細胞の増殖に関してはアジュバントによる効果であることが示唆された。これは、アジュバントの構造がＬＰＳの末端構造と同一であることと、ＬＰＳによって細胞増殖が観察されるという結果からも示唆される。
得られたプラズマ細胞の割合が、刺激物質のみを添加した場合においても上昇していたことから、抗原非依存的に分化し得ることが示唆された。
また、脾臓中のＢ細胞は、抗原や刺激物質によって、Ｔ１−Ｂ細胞→Ｔ２−Ｂ細胞→Ｂ２細胞→Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ細胞と成熟し、プラズマ細胞に分化していく。実際、今回の手法によってＢ細胞がより成熟し、特にＢ２細胞が免疫しない場合に比べて大幅に増加していることが明らかとなった。
また、Ａｃｔｉｂａｔｅｄ−Ｂ細胞の割合が免疫の有無によってほとんど変化がなかったことから、Ａｃｔｉｂａｔｅｄ−Ｂ細胞からプラズマ細胞への分化は非常に迅速に行われていることが示唆された。抗原と刺激物質を共に添加した場合、刺激物質のみ添加した場合と比較して、Ｂ２細胞の割合が上昇していた。このことから、抗原が同時に添加されることによって、抗原依存的なＢ細胞の活性化が優先され、抗原非依存的な活性化が減少することが示唆された。つまり、今回の体外免疫法によって、目的の抗体を産生している細胞を優先的に分化させ得ることが示唆された。
実施例９
本例では、Ｂ細胞分化の検討マーカー発現量の実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁させ、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ ｘ １０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
抗原として精製したｈＳ１００Ａ１０蛋白質１ｎｍｏｌを用いて、脾臓細胞２ｘ１０７ｃｅｌｌｓを免疫した。この際、アジュバントとしてムラミルジペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を１００μｇ添加した。免疫反応は室温で１５分静置して実施した。刺激物質（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、ＬＰＳ）は標準の終濃度の１０００倍になるように調製した。この刺激物質１０μＬと、免疫した脾臓細胞（２ｍＬ）を混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。コントロールとして、抗原のみ添加したものと刺激物質のみ添加したもの、無添加のものを同時に行った。
培養後、全ての細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１μＬをテンプレートとして、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。反応条件は、９５℃１０分→（９５℃１５秒、６０℃１分）を４０サイクルで行った。また、本例で使用した機材は、７５００Ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）であった。得られた結果を内部標準であるβアクチンの数値を、同時に測定したＰｌａｓｍａ細胞もしくはＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ細胞の割合とかけあわせることでそれぞれの細胞由来のβアクチンの発現量を得た。このＰｌａｓｍａ細胞由来のβアクチンの発現量でＢｌｉｍｐ−１及びＸｂｐ−１の発現量を、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ細胞由来のβアクチンの発現量でＢｃｌ−６及びＡＩＤの発現量をそれぞれ標準化した。この値を、無添加の場合でさらに標準化し、グラフ化した。得られた結果を図２０Ａ〜図２０Ｄに示す。
Ｂ細胞分化の検討マーカー発現量の結果を示す一連のグラフからわかるように、抗体染色の結果と同様に、抗原を添加した場合にプラズマ細胞への分化マーカーであるＢｌｉｍｐ−１やＸｂｐ−１の発現量が上昇していた。また、体細胞変異のマーカーであるＢｃｌ−６やＡＩＤは、刺激物質を添加することによって高発現となることが明らかとなった。これにより、抗原のみでなく、刺激物質を加えることで、より高親和性の抗体が得やすくなる可能性があることが確認された。
さらに、抗原と刺激物質を共に加えた場合に、刺激物質のみを加えた場合よりも体細胞変異マーカーの発現量が減少していることから、特定の抗原が共存することで、体細胞変異をある程度抑制し、変異が入りすぎることによる活性の低下を防ぐシステムがあることが示唆された。
また、免疫前の脾臓細胞では、分化マーカーはほとんど発現していないが、体細胞変異マーカーは高い発現量を示した。これは、体細胞変異によって抗体のレパートリーを増やす反応を常に行っているためであると考えられる。
実施例１０
本例では、ＥＬＩＳＡ実験方法について説明する。
５ｍｌ ＬＢ培地で培養し集菌した後，１ｍｌのＰＢＳに懸濁して超音波破砕を行い，可溶性のＭＢＰ−ｓｃＦｖを含む破砕上清画分を採取した。
この上清画分を３％ ＢＳＡ／ＰＢＳで５０倍に希釈し、この５０μｌをＥＬＩＳＡ法に用いた。得られた結果を図２１〜図２４に示す。
図２１に示すＥＬＩＳＡ法では、本体外免疫法に則り、モデル抗原として、Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＨＥＬ）を免疫し構築したａｎｔｉ−ＨＥＬ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖの活性をＥＬＩＳＡにより測定した。抗原特異性を調べるために、β−Ｃａｓｅｉｎ，Ｓ１００Ａ２，Ｓ１００Ａ１４，Ｈｅｎ Ｅｇｇ ＬｙｓｏｚｙｍｅをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて測定を行った。この結果、本法を用いることでＨｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅに対して明らかに特異性のあるｓｃＦｖが得られていることが確認された。
図２２に示すＥＬＩＳＡ法では、本体外免疫法の変法として、Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅに代えて、ＭＡＣＳを用いて分離した、Ｂ細胞に対してＨｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅを免疫した。図２１と同様にして、構築したａｎｔｉ−ＨＥＬ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖの特異性を確認したところ、十分な特異性を持つｓｃＦｖが得られていることが確認された。このことから、本法では、分離されたＢ細胞に対しても、直接的に有効な免疫操作が可能であることが示された。
図２３に示すＥＬＩＳＡ法では、本体外免疫法で目的のｓｃＦｖの遺伝子配列が得られる。これを利用することで、ｓｃＦｖにさらに機能を付け加えることも可能である。その一例として、ａｎｔｉ−ＨＥＬ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖのＣ末端に蛍光蛋白質の１つであるＥＧＦＰを融合させた、ａｎｔｉ−ＨＥＬ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ−ＥＧＦＰを作製した。ｓｃＦｖとＥＧＦＰの間は，ＧｌｙおよびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙといった長さの異なるリンカーを介したものを２種類作製した。図２１と同様にして、構築したＭＢＰ−ｓｃＦｖ−ＥＧＦＰの特異性を確認したところ、Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅに対して特異性を持ち、且つ、蛍光を有するｓｃＦｖの作製が可能であることが確認された。
蛋白質以外のモデル抗原として、本法に則りペプチドを免疫した。一般の免疫方法では、ペプチドの様な低分子量のものは、ＫＬＨやＢＳＡ等の蛋白質にコンジュゲートしたものを抗原として用いるが、本法では、体外においてＢ細胞を直接標的にすることから、ペプチドそのものでも免疫反応が生じると考えられる。そこで、長さの異なる４種類のペプチドをモデル抗原として用い、ペプチドを直接免疫した。用いたペプチドは、次の通りである：β−ｃｏｓｏｍｏｒｐｈｉｎ−７（Ｂｏｖｉｎｅ；ＹＰＦＰＧＰＩ，７ ａ．ａ．），Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ（Ｈｕｍａｎ；ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ，１０ ａ．ａ．），Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ；ＰＴＨ（Ｈｕｍａｎ；ＥＡＤＫＡＤＶＮＶＬＹＫＡＫＳＱ，１６ ａ．ａ．）。各ペプチドをＰＢＳに溶かし、１０μｇを免疫した。
図２４に示すＥＬＩＳＡ法では、本法に則り構築したａｎｔｉ−β−Ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ７／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ，ａｎｔｉ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖ，ａｎｔｉ−ＰＴＨ／ＭＢＰ−ｓｃＦｖの活性をＥＬＩＳＡにより測定した。特異性を調べるために、β−Ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ−７，Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ，ＰＴＨをそれぞれコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて測定を行った。この結果、各ペプチドに対して有意に特異性を持つｓｃＦｖが得られることが確認された。本法では、ペプチドそのものを抗原として添加するだけで、短いペプチドに対してもｓｃＦｖの取得が可能であることが示された。
実施例１１
本例では、抗ｍｏｕｓｅ（マウス）蛋白質抗体の取得実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁させ、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
抗原として精製したｈＳ１００Ａ１０蛋白質及び、購入したｍＡｌｂｕｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ社）を用いた。それぞれ１ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌを用いて、脾臓細胞２ｘ１０７ｃｅｌｌｓを免疫した。この際、アジュバントとしてムラミルジペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を１００μｇ添加した。免疫反応は室温で１５分静置して実施した。刺激物質（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、ＬＰＳ）は標準の終濃度の１０００倍になるように調製した。この刺激物質１０μＬと、免疫した脾臓細胞（２ｍＬ）を混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養後、全ての細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１０μＬをテンプレートとして、ＰＣＲによって抗体のＨ鎖及びＬ鎖の超可変領域を増幅した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（ＴａＫａＲａ社）を用い、反応組成・反応条件はメーカープロトコールに従った。得られた４００ｂｐのフラグメントをアガロースゲル電気泳動（２．０％ Ｓｅａｋｅｍ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）／ＴＡＥバッファー、１５０Ｖ ３０ｍｉｎ）によって分離し、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出精製した。実験方法は、メーカープロトコールに従った。抽出したフラグメント各５０ｎｇをテンプレートとして、ＰＣＲによって８００ｂｐのｓｃＦｖフラグメントを調製した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（ＴａＫａＲａ社）を用い、反応組成・反応条件はメーカープロトコールに従った。得られた８００ｂｐのフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（共にＴＯＹＯＢＯ社製）で切断し、ｐＭａｌ−ｃ２Ｅベクター（ＮＥＢ社）にサブクローニングした。
サブクローニングしたＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたクローンをＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を添加したＬＢ培地５ｍＬで培養した。２７℃で一晩培養した後、１．５ｍＬの培養液から菌体を回収し、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ３００μＬで可溶性蛋白質を回収した。
回収した可溶性蛋白質５μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１０％ ポリアクリルアミドゲル、２５ｍＡ ６０ｍｉｎ）でＭＢＰ−ｓｃＦｖの発現を確認した。
また、ＥＬＩＳＡ法を用いて、抗体のアフィニティを検証した。ＥＬＩＳＡ用のプレートとして、ｍＳ１００Ａ１０もしくはｍＡｌｂｕｍｉｎを固定化したプレートを調製した。１ウェル当たり、１μｇの蛋白質を添加し、４℃で一晩固定化した。ＰＢＳ（−）で洗浄後、ｍＳ１００Ａ１０ ｐｌａｔｅは３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン（和光純薬社））／ＰＢＳ（−）で、ｍＡｌｂｕｍｉｎ ｐｌａｔｅは１％ ＨＥＬ（ニワトリ卵白リゾチーム（生化学工業社））／ＰＢＳ（−）で、それぞれブロッキングを行った。室温で１時間ブロッキングを行った後、ＰＢＳで洗浄した。このように調製したプレートに、ＭＢＰ−ｓｃＦｖ抗体サンプルを添加した。抗体はｍＳ１００Ａ１０ ｐｌａｔｅに添加するものは３％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）で、ｍＡｌｂｕｍｉｎ ｐｌａｔｅに添加するものは１％ ＨＥＬ／ＰＢＳ（−）で、それぞれ５０倍に希釈し、室温で３０分間静置した。このサンプル５０μＬを調製したプレートに添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、２次抗体（ａｎｔｉ−ＭＢＰ，ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＮＥＢ社））をＰＢＳ（−）で２０００倍に希釈した溶液を５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＫＰＬ社）を１００μＬ添加して、発色させた。発色反応は室温で３分間行い、反応を停止するために１Ｎ ＨＣｌ（和光純薬社）を１００μＬ添加した。その後、マイクロプレートリーダーモデル６８０（ＢｉｏＲａｄ社）で４５０ｎｍ／６５５ｎｍの吸光度を測定した。
測定値から、ブランクの値を差し引き、グラフ化した。グラフの縦軸には吸光度を、横軸にはサンプルＮｏを記載した。ｍＡｌｂｕｍｉｎを免疫したクローンはｍＡｌｂｕｍｉｎｐｌａｔｅでの値をポジティブ値、ｍＳ１００Ａ１０ ｐｌａｔｅでの値をネガティブ値とした。特に差の見られたクローンには星印を加えた。
また、ポジティブ値をネガティブ値で割り、マイナスの値を示し、かつポジティブ値が正の値を示したクローンを＋＋、２以上の値を示したクローンを＋、１〜２の値を示したクローンを±、１以下の値を示したクローンを−と定義し、それぞれの陽性率をグラフ化した。このようにして得られた結果を図２５〜図２９に示す。
抗ｍｏｕｓｅ蛋白質抗体の取得結果を示す一連のグラフから理解されるように、ｍＳ１００Ａ１０に関しては、多数の抗体を取得することができた。抗体のアフィニティ分布を調べた結果、高濃度の抗原を免疫することで、アフィニティのないクローンが多数得られた。しかしながら、高アフィニティの抗体の陽性率は低濃度の抗原で免疫した場合と大差ないことから、体細胞変異の頻度が上昇したため、抗原に反応できなくなったクローンが増加したと考えられる。このことから、抗原性の低い抗原を使用する場合は、なるべく高濃度に使用することで、より目的に即した抗体を得られる可能性が示唆された。
一方、ｍＡｌｂｕｍｉｎに対する抗体は、非常の取得困難であることが明らかとなった。この原因として、マウスの血液中に多量に存在しているので、これに対する抗体を作成しやすいと自己免疫疾患になる確率が急上昇する。このため、骨髄から脾臓に免疫担当細胞が運ばれる前にセレクションを受けて可能性のあるクローンを排除していることが考えられる。よって、これらに対する抗体を作製する場合には、骨髄から免疫担当細胞を取得して免疫する方が効率よく抗体を取得できる可能性がある。さらに、ｍＳ１００Ａ１０抗体を取得した結果から、１０ｎｍｏｌよりも濃い濃度で免疫することで効率よく抗体を取得できる可能性が示唆された。また、弱いながらも、ｍＡｌｂｕｍｉｎに反応する抗体が取得できているため、遺伝子に人為的に変異を導入することで、目的の抗体を取得する手法も採用することができる。
実施例１２
本例では、抗低分子化合物抗体の取得及び実験方法について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、♀、ＳＰＦ／ＶＡＦ）を頸椎脱臼にて殺し、マウスの脾臓を肉眼で確認した後、摘出し、７０％エタノールで洗浄した。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、２匹分の脾臓をセルストレイナー上に乗せ、セルスクレイパーにてすりつぶした。セルストレーナーを４ｍＬのＰＢＳ（−）で３回洗浄することで脾臓細胞をセルストレイナーから溶出させた。これを遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）し、細胞を回収した。
ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬに細胞を懸濁した後、１０ｍＬ ＰＢＳ（−）を加えることで赤血球を除去し、遠心分離（１３００ｒｐｍ ｘ ３ｍｉｎ，４℃）して脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞はＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁し、セルストレイナーを通すことにより、不溶性の脂肪等を除去した。細胞数を血球計算版を用いて計測し、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように濃縮した。
抗原としてＨＥＬ−Ｃｙ３蛋白質及びＨＥＬ−ＩＴＣを用いた。それぞれＣｙ３ Ｍｏｎｏ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ Ｐａｃｋ（ＧＥヘルスケア社）、ＦＩＴＣ（フナコシ社）を用いてＨＥＬ（生化学工業社）をラベル化した。ラベル化率を測定し、低分子化合物１ｎｍｏｌ相当を用いて、脾臓細胞２ｘ１０７ｃｅｌｌｓを免疫した。この際、アジュバントとしてムラミルジペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を１００μｇ添加した。免疫反応は室温で１５分静置して実施した。刺激物質（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、ＬＰＳ）は標準の終濃度の１０００倍になるように調製した。この刺激物質１０μＬと、免疫した脾臓細胞（２ｍＬ）を混合し、４０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養後、全ての細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡ６００ｎｇを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて逆転写反応を実施した。反応組成は、メーカープロトコールに従い２０μＬの容量で、プライマーとして、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた。反応条件は、４２℃２０分、９９℃５分、４℃５分で実施した。この産物１０μＬをテンプレートとして、ＰＣＲによって抗体のＨ鎖及びＬ鎖の超可変領域を増幅した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（ＴａＫａＲａ社）を用い、反応組成・反応条件はメーカープロトコールに従った。得られた４００ｂｐのフラグメントをアガロースゲル電気泳動（２．０％ Ｓｅａｋｅｍ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）／ＴＡＥバッファー、１５０Ｖ ３０ｍｉｎ）によって分離し、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出精製した。実験方法は、メーカープロトコールに従った。抽出したフラグメント各５０ｎｇをテンプレートとして、ＰＣＲによって８００ｂｐのｓｃＦｖフラグメントを調製した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（ＴａＫａＲａ社）を用い、反応組成・反応条件はメーカープロトコールに従った。得られた８００ｂｐのフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（共にＴＯＹＯＢＯ社製）で切断し、ｐＭａｌ−ｃ２Ｅベクター（ＮＥＢ社）にサブクローニングした。
サブクローニングしたＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたクローンをＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を添加したＬＢ培地５ｍＬで培養した。２７℃で一晩培養したのち、１．５ｍＬの培養液から菌体を回収し、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ３００μＬで可溶性蛋白質を回収した。
回収した可溶性蛋白質５μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１０％ ポリアクリルアミドゲル、２５ｍＡ ６０ｍｉｎ）でＭＢＰ−ｓｃＦｖの発現を確認した。
図３０は、抗低分子化合物抗体の取得を示す電気泳動写真を示したものである。Ｃｙ３−ＨＥＬ、ＦＩＴＣ−ＨＥＬともに、目的の蛋白質（図中の矢印部分）の高発現を確認できた。このことから、目的の抗体を取得できたことが示唆された。
以上に説明したように、本発明によれば、抗原抗体反応に基づいた疾病の診断における抗体の作製を短期間に大量に行えることから、疾病診断に限らず、免疫学的マーカー検査分野の拡大を促進することができる。また、抗原抗体反応に基づいた疾病の治療に利用する抗体を短期間に多種類取得できることから、抗体医薬分野の拡大を促進することができる。
さらには、腎臓癌マーカーの１つであるＳ１００Ａ１０タンパク質の検出を可能とする抗体の作製を短期間に大量に行えることから、抗体の製造コストが下がり、癌検診を目的とした尿検査を頻繁に低コストでできるようになる。
さらには、腎臓癌マーカーの１つであるＳ１００Ａ１０タンパク質の検出を可能とする抗体の作製を短期間に大量に行えることから、抗体の製造コストが下がり、癌検診を目的とした尿検査を頻繁に低コストでできるようになる。
Claims (12)
- 体外で免疫用細胞を含む組織を抗原と刺激物質を含む培養液中で免疫する工程と、
前記免疫された細胞を選別する工程と、
前記選別された免疫細胞から抗体を得る工程とを含む抗体作製方法。 - 前記免疫細胞から、ＰＣＲ増幅手法により増幅抗体遺伝子を取得した後、宿主細胞により抗体又は抗体に類する蛋白質の発現調製をするステップをさらに含む請求項１に記載の抗体作製方法。
- 前記組織が免疫用動物である請求項１に記載の抗体作製方法。
- 前記選別された細胞が、クラススイッチ若しくはアフィニティマチュレーションの発生した細胞である請求項１に記載の抗体作製方法。
- 前記免疫された細胞の選別が、フローサイトメトリー又は染色による請求項１に記載の抗体作製方法。
- 前記刺激物質が、免疫担当細胞上に発現しているサイトカイン受容体、表面抗原又はシグナル伝達に関与する受容体を刺激する物質である請求項１に記載の抗体作製方法。
- 前記抗原がペプチドである請求項１に記載の抗体作製方法。
- 前記抗原がＳ１００ ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質であり、一本鎖抗体ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）若しくは抗体ＩｇＧ１（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ Ｇ１）を取得する請求項１に記載の抗体作製方法。
- 前記抗原がＳ１００Ａ１０タンパク質であり、一本鎖抗体ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）若しくは抗体ＩｇＧ１（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ Ｇ１）を取得する請求項１に記載の抗体作製方法。
- 前記刺激物質が、サイトカイン受容体に対する刺激物質としての、ＩＬ−４又はＩＬ−５、表面抗原に対する刺激物質としての、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体又はａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体、及びシグナル伝達に関与する受容体に対する刺激物質としてのＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の少なくとも１つである請求項６に記載の抗体作製方法。
- 体外で免疫用細胞を含む組織と、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ａｎｔｉ−ＣＤ３８抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ４０抗体及びＬＰＳからなる群から選ばれた１以上の刺激物質を含む培養液中で免疫して抗体を作製する請求項１に記載の抗体作製方法。
- 選別された前記抗体遺伝子アミノ酸配列を決定する工程と、
このアミノ酸配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーと比較し、ホモロジー（相同性）の高い配列をヒト抗体のアミノ酸配列ライブラリーから選択し又は改変調整してヒト化抗体遺伝子を形成する工程とをさらに含む請求項１に記載の抗体作製方法。
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