JP2023507740A - Psmaに結合する抗原結合ドメイン - Google Patents
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Abstract
本開示は、抗原前立腺特異的膜抗原(PSMA)に結合する抗原結合ドメイン、およびそのような抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)に関する。本発明者らは、改善された特性を有する新しいPSMA結合ドメインを同定し、特徴付けた。抗原結合ドメインは、例えば、以下のいずれかを含み得る:(a)以下から選択される重鎖可変領域(VH)、および軽鎖可変領域(VL):(i)VH-配列番号7、VL-配列番号8、(ii)VH-配列番号15、VL-配列番号16、(iii)VH-配列番号23、VL-配列番号24、および(iv)VH-配列番号31、VL-配列番号32、または(b)以下から選択されるドメイン抗体可変領域:(i)配列番号36、(ii)配列番号40、(iii)配列番号44、(iv)配列番号48、および(v)配列番号52。
Description
発明の分野
本発明は、抗原前立腺特異的膜抗原(PSMA)に結合する抗原結合ドメインに関する。本発明はまた、そのような抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)に関する。PSMAに結合するCARを発現する細胞は、前立腺癌、腎臓癌、乳癌および結腸癌を含む固形腫瘍などの癌性疾患の処置に有用である。
本発明は、抗原前立腺特異的膜抗原(PSMA)に結合する抗原結合ドメインに関する。本発明はまた、そのような抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)に関する。PSMAに結合するCARを発現する細胞は、前立腺癌、腎臓癌、乳癌および結腸癌を含む固形腫瘍などの癌性疾患の処置に有用である。
発明の背景
前立腺癌
前立腺癌は、男性において最も頻繁に診断される癌型であり、癌関連死の第2の主因であると推定されている。根治的前立腺切除術は依然として最も一般的な処置選択肢の1つであり、放射線療法または化学療法と組み合わせてもよい。
前立腺癌
前立腺癌は、男性において最も頻繁に診断される癌型であり、癌関連死の第2の主因であると推定されている。根治的前立腺切除術は依然として最も一般的な処置選択肢の1つであり、放射線療法または化学療法と組み合わせてもよい。
キメラ抗原受容体(CAR)
キメラ抗原受容体は、抗体の特異性をT細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。それらの通常の形態は、T細胞の生存シグナルおよび活性化シグナルを伝達する化合物エンドドメインに全て接続された、アミノ末端を認識する抗原、スペーサー、膜貫通ドメインを有するI型膜貫通ドメインタンパク質の形態である(図1aを参照のこと)。
キメラ抗原受容体は、抗体の特異性をT細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。それらの通常の形態は、T細胞の生存シグナルおよび活性化シグナルを伝達する化合物エンドドメインに全て接続された、アミノ末端を認識する抗原、スペーサー、膜貫通ドメインを有するI型膜貫通ドメインタンパク質の形態である(図1aを参照のこと)。
これらの分子の最も一般的な形態は、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント(scFv)の融合物である。そのような分子は、その標的のscFvによる認識に応答してT細胞の活性化をもたらす。T細胞がそのようなCARを発現する場合、T細胞は、標的抗原を発現する標的細胞を認識して死滅させる。腫瘍関連抗原に対していくつかのCARが開発されており、そのようなCAR発現T細胞を使用する養子移入アプローチは、様々な癌の処置のために現在臨床試験中である。
前立腺特異的膜抗原(PSMA)
前立腺癌を処置するための免疫療法アプローチの1つの標的は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII(GCPII)、N-アセチル-L-アスパルチル-L-グルタミン酸ペプチダーゼI(NAALADase I)またはNAAGペプチダーゼとしても知られる前立腺特異的膜抗原(PSMA)である。PSMAは、N-アセチルアスパルチルグルタメート(NAAG)のグルタメートおよびN-アセチルアスパルタートへの加水分解を触媒する84kDaのクラスII膜貫通亜鉛金属酵素である。タンパク質は主に細胞外であり、小さな細胞内領域のみを有する。
前立腺癌を処置するための免疫療法アプローチの1つの標的は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII(GCPII)、N-アセチル-L-アスパルチル-L-グルタミン酸ペプチダーゼI(NAALADase I)またはNAAGペプチダーゼとしても知られる前立腺特異的膜抗原(PSMA)である。PSMAは、N-アセチルアスパルチルグルタメート(NAAG)のグルタメートおよびN-アセチルアスパルタートへの加水分解を触媒する84kDaのクラスII膜貫通亜鉛金属酵素である。タンパク質は主に細胞外であり、小さな細胞内領域のみを有する。
PSMAは前立腺で高度に発現され、全原発性前立腺癌の90%超で過剰発現される。健康な組織でのPSMA発現は最小限である。したがって、PSMAは、前立腺癌の診断および処置のための標的としての有用性を示している。さらに、PSMAは、腎臓癌、乳癌および結腸癌における標的としての潜在的有用性を有する。
J591モノクローナル抗体に基づく抗原結合ドメインを含む抗PSMA CARは、以前に記載されている(Kloss CC.ら、Mol Ther.2018 7月5日;26(7):1855-1866。)。
本発明者らは、改善された特性を有する代替PSMA標的化CARを作製しようと努めた。
本発明者らは、改善された特性を有する代替PSMA標的化CARを作製しようと努めた。
Kloss CC.ら、Mol Ther.2018 7月5日;26(7):1855-1866
発明の態様の要旨
本発明者らは、改善された特性を有する新しいPSMA結合ドメインを同定し、特徴付けた。
本発明者らは、改善された特性を有する新しいPSMA結合ドメインを同定し、特徴付けた。
したがって、第1の態様では、本発明は、前立腺特異的膜抗原に結合し、以下のいずれかを含む抗原結合ドメインを提供する:
(a)相補性決定領域(CDR):以下から選択されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を有する重鎖可変領域(VH):ならびにCDR:LCDR1、LCDR2およびLCDR3を有する軽鎖可変領域(VL):
(i)HCDR1-配列番号1、HCDR2-配列番号2、HCDR3-配列番号3、LCDR1-配列番号4、LCDR2-配列番号5、LCDR3-配列番号6、
(ii)HCDR1-配列番号9、HCDR2-配列番号10、HCDR3-配列番号11、LCDR1-配列番号12、LCDR2-配列番号13、LCDR3-配列番号14、
(iii)HCDR1-配列番号17、HCDR2-配列番号18、HCDR3-配列番号19、LCDR1-配列番号20、LCDR2-配列番号21、LCDR3-配列番号22、
(iv)HCDR1-配列番号25、HCDR2-配列番号26、HCDR3-配列番号27、LCDR1-配列番号28、LCDR2-配列番号29、LCDR3-配列番号30、または
(b)相補性決定領域(CDR):以下から選択されるVHHCDR1、VHHCDR2およびVHHCDR3を有するドメイン抗体可変領域:
(i)VHHCDR1-配列番号33、VHHCDR2-配列番号34、VHHCDR3-配列番号35、
(ii)VHHCDR1-配列番号37、VHHCDR2-配列番号38、VHHCDR3-配列番号39、
(iii)VHHCDR1-配列番号41、VHHCDR2-配列番号42、VHHCDR3-配列番号43、
(iv)VHHCDR1-配列番号45、VHHCDR2-配列番号46、VHHCDR3-配列番号47、および
(v)VHHCDR1-配列番号49、VHHCDR2-配列番号50、VHHCDR3-配列番号51。
(a)相補性決定領域(CDR):以下から選択されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を有する重鎖可変領域(VH):ならびにCDR:LCDR1、LCDR2およびLCDR3を有する軽鎖可変領域(VL):
(i)HCDR1-配列番号1、HCDR2-配列番号2、HCDR3-配列番号3、LCDR1-配列番号4、LCDR2-配列番号5、LCDR3-配列番号6、
(ii)HCDR1-配列番号9、HCDR2-配列番号10、HCDR3-配列番号11、LCDR1-配列番号12、LCDR2-配列番号13、LCDR3-配列番号14、
(iii)HCDR1-配列番号17、HCDR2-配列番号18、HCDR3-配列番号19、LCDR1-配列番号20、LCDR2-配列番号21、LCDR3-配列番号22、
(iv)HCDR1-配列番号25、HCDR2-配列番号26、HCDR3-配列番号27、LCDR1-配列番号28、LCDR2-配列番号29、LCDR3-配列番号30、または
(b)相補性決定領域(CDR):以下から選択されるVHHCDR1、VHHCDR2およびVHHCDR3を有するドメイン抗体可変領域:
(i)VHHCDR1-配列番号33、VHHCDR2-配列番号34、VHHCDR3-配列番号35、
(ii)VHHCDR1-配列番号37、VHHCDR2-配列番号38、VHHCDR3-配列番号39、
(iii)VHHCDR1-配列番号41、VHHCDR2-配列番号42、VHHCDR3-配列番号43、
(iv)VHHCDR1-配列番号45、VHHCDR2-配列番号46、VHHCDR3-配列番号47、および
(v)VHHCDR1-配列番号49、VHHCDR2-配列番号50、VHHCDR3-配列番号51。
抗原結合ドメインは、例えば、以下のいずれかを含み得る:
(a)以下から選択される重鎖可変領域(VH)、および軽鎖可変領域(VL):
(i)VH-配列番号7、VL-配列番号8、
(ii)VH-配列番号15、VL-配列番号16、
(iii)VH-配列番号23、VL-配列番号24、および
(iv)VH-配列番号31、VL-配列番号32、または
(b)以下から選択されるドメイン抗体可変領域:
(i)配列番号36、
(ii)配列番号40、
(iii)配列番号44、
(iv)配列番号48、および
(v)配列番号52。
(a)以下から選択される重鎖可変領域(VH)、および軽鎖可変領域(VL):
(i)VH-配列番号7、VL-配列番号8、
(ii)VH-配列番号15、VL-配列番号16、
(iii)VH-配列番号23、VL-配列番号24、および
(iv)VH-配列番号31、VL-配列番号32、または
(b)以下から選択されるドメイン抗体可変領域:
(i)配列番号36、
(ii)配列番号40、
(iii)配列番号44、
(iv)配列番号48、および
(v)配列番号52。
第2の態様において、本発明は、本発明の第1の態様の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。
第3の態様では、本発明は、本発明の第1の態様による抗原結合ドメインまたは本発明の第2の態様によるCARをコードする核酸配列を提供する。
第4の態様において、本発明は、本発明の第3の態様に記載の核酸配列と自殺遺伝子をコードする核酸配列とを含む核酸構築物を提供する。
第5の態様において、本発明は、本発明の第3の態様に記載の核酸配列または本発明の第4の態様に記載の核酸構築物を含むベクターを提供する。
第6の態様では、本発明は、本発明の第2の態様によるCARを発現する細胞を提供する。
第7の態様において、本発明は、本発明の第6の態様による細胞を作製する方法であって、本発明の第2の態様によるCARをコードする核酸配列をエクスビボで細胞に導入する工程を含む方法を提供する。
第8の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と共に、本発明の第6の態様による複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。
第9の態様では、本発明は、本発明の第6の態様に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、癌を処置する方法を提供する。
第10の態様では、本発明は、癌の処置に使用するための本発明の第6の態様による細胞を提供する。
第11の態様では、本発明は、癌を処置するための薬物の製造における本発明の第6の態様による細胞の使用を提供する。
詳細な記載
抗原結合ドメイン
本発明の抗原結合ドメインは、標的抗原PSMAに特異的に結合する抗体ベースの結合ドメインである。
抗原結合ドメイン
本発明の抗原結合ドメインは、標的抗原PSMAに特異的に結合する抗体ベースの結合ドメインである。
IgG分子などの抗体の抗原結合ドメインは、2つの可変ドメインで構成され、1つは重鎖(VH)に由来し、1つは軽鎖(VL)に由来する。本発明の抗原結合ドメインのいくつかは、VHドメインとVLドメインの両方を含む。
VHドメインおよびVLドメインを含む本発明の抗原結合ドメインは、例えば、一本鎖可変フラグメント(scFv)またはFabフォーマットであり得る。本発明のCARは、図3a(Fab)および図3c(scFv)に例示されるように、例えばscFvまたはFabベースの抗原結合ドメインを含み得る。
抗原結合ドメインは、相補性決定領域(CDR):以下から選択されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を有する重鎖可変領域(VH)、ならびにCDR:LCDR1、LCDR2およびLCDR3を有する軽鎖可変領域(VL)を含み得る:
(i)HCDR1-配列番号1、HCDR2-配列番号2、HCDR3-配列番号3、LCDR1-配列番号4、LCDR2-配列番号5、LCDR3-配列番号6、
(ii)HCDR1-配列番号9、HCDR2-配列番号10、HCDR3-配列番号11、LCDR1-配列番号12、LCDR2-配列番号13、LCDR3-配列番号14、
(iii)HCDR1-配列番号17、HCDR2-配列番号18、HCDR3-配列番号19、LCDR1-配列番号20、LCDR2-配列番号21、LCDR3-配列番号22、および
(iv)HCDR1-配列番号25、HCDR2-配列番号26、HCDR3-配列番号27、LCDR1-配列番号28、LCDR2-配列番号29、LCDR3-配列番号30、または
(i)HCDR1-配列番号1、HCDR2-配列番号2、HCDR3-配列番号3、LCDR1-配列番号4、LCDR2-配列番号5、LCDR3-配列番号6、
(ii)HCDR1-配列番号9、HCDR2-配列番号10、HCDR3-配列番号11、LCDR1-配列番号12、LCDR2-配列番号13、LCDR3-配列番号14、
(iii)HCDR1-配列番号17、HCDR2-配列番号18、HCDR3-配列番号19、LCDR1-配列番号20、LCDR2-配列番号21、LCDR3-配列番号22、および
(iv)HCDR1-配列番号25、HCDR2-配列番号26、HCDR3-配列番号27、LCDR1-配列番号28、LCDR2-配列番号29、LCDR3-配列番号30、または
配列中のCDRの位置は、異なるナンバリングスキーム、例えばKabatおよびIMGTによって決定され得る。本出願では、特に明記しない限り、Kabatナンバリングシステムが使用される。
抗原結合ドメインは、
(i)VH-配列番号7、VL-配列番号8、
(ii)VH-配列番号15、VL-配列番号16、
(iii)VH-配列番号23、VL-配列番号24、および
(iv)VH-配列番号31、VL-配列番号32の対のVH/VLドメインのうちの1つを含み得る。
(i)VH-配列番号7、VL-配列番号8、
(ii)VH-配列番号15、VL-配列番号16、
(iii)VH-配列番号23、VL-配列番号24、および
(iv)VH-配列番号31、VL-配列番号32の対のVH/VLドメインのうちの1つを含み得る。
あるいは、本発明の抗原結合ドメインは、単一の可変ドメインを含み得る。
ナノボディとしても知られる単一ドメイン抗体(sdAb)は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。
第1の単一ドメイン抗体を、ラクダ科動物に見られる重鎖抗体から操作した。これらはVHHフラグメントと呼ばれる。軟骨魚類はまた、重鎖抗体(IgNAR、「免疫グロブリン新規抗原受容体」)を有し、そこからVNARフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。単一ドメイン抗体に関するほとんどの研究は、現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖に由来するナノボディも、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。
本発明の抗原結合ドメインは、相補性決定領域(CDR):以下から選択されるVHHCDR1、VHHCDR2およびVHHCDR3を有するドメイン抗体可変領域を含み得る:
VHHCDR1-配列番号33、VHHCDR2-配列番号34、VHHCDR3-配列番号35、
(ii)VHHCDR1-配列番号37、VHHCDR2-配列番号38、VHHCDR3-配列番号39、
(iii)VHHCDR1-配列番号41、VHHCDR2-配列番号42、VHHCDR3-配列番号43、
(iv)VHHCDR1-配列番号45、VHHCDR2-配列番号46、VHHCDR3-配列番号47、および
(v)VHHCDR1-配列番号49、VHHCDR2-配列番号50、VHHCDR3-配列番号51。
VHHCDR1-配列番号33、VHHCDR2-配列番号34、VHHCDR3-配列番号35、
(ii)VHHCDR1-配列番号37、VHHCDR2-配列番号38、VHHCDR3-配列番号39、
(iii)VHHCDR1-配列番号41、VHHCDR2-配列番号42、VHHCDR3-配列番号43、
(iv)VHHCDR1-配列番号45、VHHCDR2-配列番号46、VHHCDR3-配列番号47、および
(v)VHHCDR1-配列番号49、VHHCDR2-配列番号50、VHHCDR3-配列番号51。
抗原結合ドメインは、例えば、以下から選択されるドメイン抗体可変領域を含み得る:
(i)配列番号36、
(ii)配列番号40、
(iii)配列番号44、
(iv)配列番号48、および
(v)配列番号52。
(i)配列番号36、
(ii)配列番号40、
(iii)配列番号44、
(iv)配列番号48、および
(v)配列番号52。
本発明者らは、本発明の抗原結合ドメインが酸性pHで改善された安定性を有することを見出した(実施例7参照)。腫瘍微小環境は酸性であるため、これらの抗原結合ドメインは、固形癌の処置において有益な特性を有することが提案されている。
キメラ抗原受容体(CARS)
古典的なキメラ抗原受容体(CAR)は、細胞外抗原認識ドメイン(結合剤)を細胞内シグナル伝達ドメイン(エンドドメイン)に接続するキメラI型膜貫通タンパク質である。結合剤は、典型的には、モノクローナル抗体(mAb)に由来する一本鎖可変フラグメント(scFv)であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことができる。結合剤を膜から単離し、適切な配向を可能にするために、スペーサードメインが通常必要である。使用される共通のスペーサードメインはIgG1のFcである。
よりコンパクトなスペーサーは、抗原に応じて、例えばCD8αからの柄、さらにはIgG1ヒンジのみで十分であり得る。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
古典的なキメラ抗原受容体(CAR)は、細胞外抗原認識ドメイン(結合剤)を細胞内シグナル伝達ドメイン(エンドドメイン)に接続するキメラI型膜貫通タンパク質である。結合剤は、典型的には、モノクローナル抗体(mAb)に由来する一本鎖可変フラグメント(scFv)であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことができる。結合剤を膜から単離し、適切な配向を可能にするために、スペーサードメインが通常必要である。使用される共通のスペーサードメインはIgG1のFcである。
よりコンパクトなスペーサーは、抗原に応じて、例えばCD8αからの柄、さらにはIgG1ヒンジのみで十分であり得る。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
初期のCAR設計は、FcεR1またはCD3ζのγ鎖のいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。その結果、これらの第一世代受容体は免疫学的シグナル1を伝達し、これは、同族標的細胞のT細胞死滅を誘発するのに十分であったが、増殖して生存するためにT細胞を完全に活性化することができなかった。この制限を克服するために、化合物エンドドメインが構築されている。T細胞共刺激分子の細胞内部分とCD3ζの細胞内部分との融合は、抗原認識後に同時に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを伝達することができる第二世代受容体をもたらす。最も一般的に使用される共刺激ドメインはCD28の共刺激ドメインである。
これは、最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル2を供給し、T細胞増殖を誘発する。生存シグナルを伝達する密接に関連するOX40および41BBなどのTNF受容体ファミリーのエンドドメインを含むいくつかの受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有する、さらにより強力な第三世代CARがここに記載されている(図1)。
これは、最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル2を供給し、T細胞増殖を誘発する。生存シグナルを伝達する密接に関連するOX40および41BBなどのTNF受容体ファミリーのエンドドメインを含むいくつかの受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有する、さらにより強力な第三世代CARがここに記載されている(図1)。
CARが標的抗原に結合すると、これは、CARが発現するT細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。したがって、CARは、T細胞の特異性および細胞傷害性を、標的抗原を発現する腫瘍細胞に向ける。
したがって、CARは、典型的には、(i)抗原結合ドメイン、(ii)スペーサー、(iii)膜貫通ドメイン、および(iii)シグナル伝達ドメインを含むかまたはそれと会合する細胞内ドメインを含む。
CARは、以下の一般構造を有し得る。
抗原結合ドメイン-スペーサードメイン-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン(エンドドメイン)。
CAR抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するキメラ受容体の部分である。古典的CARでは、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント(scFv)を含む(図3cを参照のこと)。CARはまた、ドメイン抗体(dAb)またはVHH抗原結合ドメインを用いて産生されている(図3bを参照のこと)。
抗原結合ドメインは、抗原を認識するキメラ受容体の部分である。古典的CARでは、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント(scFv)を含む(図3cを参照のこと)。CARはまた、ドメイン抗体(dAb)またはVHH抗原結合ドメインを用いて産生されている(図3bを参照のこと)。
CARは、抗体のFabフラグメントを含み得る(図3aを参照のこと)。FabCARは、抗体様軽鎖可変領域(VL)および定常領域(CL)を有する2つの鎖を含む。重鎖可変領域(VH)および定常領域(CH)を有するものである。一方の鎖はまた、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。CLとCHとの間の会合は、受容体の集合を引き起こす。
Fab CARの2つの鎖は、一般構造:
VH-CH-スペーサー-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン、および
VL-CL
または
VL-CL-スペーサー-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン、および
VH-CH
を有し得る。
VH-CH-スペーサー-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン、および
VL-CL
または
VL-CL-スペーサー-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン、および
VH-CH
を有し得る。
本明細書中に記載されるFab型キメラ受容体の場合、抗原結合ドメインは、1つのポリペプチド鎖からのVHおよび別のポリペプチド鎖からのVLから構成される。
ポリペプチド鎖は、VH/VLドメインとCH/CLドメインとの間にリンカーを含み得る。リンカーは柔軟であってよく、VH/VLドメインをCH/CLドメインから空間的に分離するのに役立ち得る。
あるいは、CARは、抗体の一本鎖可変フラグメント(scFv)フラグメントを含み得る(図3cを参照のこと)。これらの「古典的」CARにおいて、VHドメインおよびVLドメインは、分子中でどちらの配向にあってもよく、一般構造:
VH-VL-スペーサー-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン、または
VL-VH-スペーサー-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン
を与える。
VH-VL-スペーサー-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン、または
VL-VH-スペーサー-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン
を与える。
ポリペプチド鎖は、VH/VLの対形成および抗原結合部位の形成を可能にするのに十分な柔軟性を提供するために、VHドメインとVLドメインとの間にリンカーを含み得る。
あるいは、CARは、ドメイン抗体(dAb)型抗原結合ドメインを含み得る(図3b)。そのようなCARは、一般構造:
dAb-スペーサー-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン
を有し得る。
dAb-スペーサー-膜貫通ドメイン-細胞内シグナル伝達ドメイン
を有し得る。
スペーサー
CARは一般に、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのスペーサー配列またはヒンジ領域を含む。柔軟なスペーサーは、抗原結合ドメインが結合を促進するために異なる方向に配向することを可能にする。
CARは一般に、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのスペーサー配列またはヒンジ領域を含む。柔軟なスペーサーは、抗原結合ドメインが結合を促進するために異なる方向に配向することを可能にする。
スペーサーは、天然起源分子の全部もしくは一部、例えば、CD8、CD4もしくはCD28の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来し得る。特に、スペーサーは、ヒトCD8アルファ鎖、FcγRIIIα受容体またはIgG1に由来し得る。
スペーサーは、天然起源のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、または完全に合成された配列であってもよい。スペーサーは、最大300個のアミノ酸、例えば10~100個のアミノ酸および/または25~50個のアミノ酸を含み得る。
スペーサーは、天然起源のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、または完全に合成された配列であってもよい。スペーサーは、最大300個のアミノ酸、例えば10~100個のアミノ酸および/または25~50個のアミノ酸を含み得る。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがるキメラ受容体の部分である。膜貫通ドメインは、膜中で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを使用して、キメラ受容体の膜貫通部分を供給することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの存在およびスパンは、当業者によって、TMHMMアルゴリズム(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)を使用して決定することができる。あるいは、人工的に設計されたTMドメインを使用してもよい。
膜貫通ドメインは、膜にまたがるキメラ受容体の部分である。膜貫通ドメインは、膜中で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを使用して、キメラ受容体の膜貫通部分を供給することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの存在およびスパンは、当業者によって、TMHMMアルゴリズム(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)を使用して決定することができる。あるいは、人工的に設計されたTMドメインを使用してもよい。
エンドドメイン
エンドドメインは、キメラ受容体のシグナル伝達部分である。それは、キメラ受容体の細胞内ドメインの一部であり得るか、またはそれと会合し得る。抗原認識後、受容体クラスター、ネイティブCD45およびCD148がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、3つのITAMを含有するCD3-ゼータの成分である。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをT細胞に伝達する。CD3-ゼータは、完全に適格な活性化シグナルを提供し得ず、さらなる共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。共刺激シグナルは、T細胞の増殖および生存を促進する。共刺激シグナルには2つの主なタイプ:Igファミリーに属するもの(CD28、ICOS)およびTNFファミリーに属するもの(OX40、41BB、CD27、GITR等)がある。例えば、キメラCD28およびOX40は、増殖/生存シグナルを伝達するためにCD3-ゼータと共に使用することができるか、または3つ全てを一緒に使用することができる。
エンドドメインは、キメラ受容体のシグナル伝達部分である。それは、キメラ受容体の細胞内ドメインの一部であり得るか、またはそれと会合し得る。抗原認識後、受容体クラスター、ネイティブCD45およびCD148がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、3つのITAMを含有するCD3-ゼータの成分である。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをT細胞に伝達する。CD3-ゼータは、完全に適格な活性化シグナルを提供し得ず、さらなる共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。共刺激シグナルは、T細胞の増殖および生存を促進する。共刺激シグナルには2つの主なタイプ:Igファミリーに属するもの(CD28、ICOS)およびTNFファミリーに属するもの(OX40、41BB、CD27、GITR等)がある。例えば、キメラCD28およびOX40は、増殖/生存シグナルを伝達するためにCD3-ゼータと共に使用することができるか、または3つ全てを一緒に使用することができる。
エンドドメインは、
(i)ITAM含有エンドドメイン、例えばCD3ζ由来のエンドドメイン、および/または
(ii)共刺激ドメイン、例えばCD28またはICOS由来のエンドドメイン、および/または
(iii)生存シグナルを伝達するドメイン、例えば、OX-40、4-1BB、CD27またはGITRなどのTNF受容体ファミリーエンドドメイン
を含み得る。
(i)ITAM含有エンドドメイン、例えばCD3ζ由来のエンドドメイン、および/または
(ii)共刺激ドメイン、例えばCD28またはICOS由来のエンドドメイン、および/または
(iii)生存シグナルを伝達するドメイン、例えば、OX-40、4-1BB、CD27またはGITRなどのTNF受容体ファミリーエンドドメイン
を含み得る。
抗原認識部分がシグナル伝達部分とは別の分子上にあるいくつかの系が記載されており、例えば国際公開第015/150771号、国際公開第2016/124930号および国際公開第2016/030691号に記載されているものがある。
したがって、本発明のキメラ受容体は、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合成分を含み得る。それは、シグナル伝達ドメインを含む別個の細胞内シグナル伝達成分と相互作用することができる。本発明のベクターは、そのような抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分を含むキメラ受容体シグナル伝達系を発現し得る。
したがって、本発明のキメラ受容体は、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合成分を含み得る。それは、シグナル伝達ドメインを含む別個の細胞内シグナル伝達成分と相互作用することができる。本発明のベクターは、そのような抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分を含むキメラ受容体シグナル伝達系を発現し得る。
キメラ受容体は、細胞内で発現される場合に、新生タンパク質が小胞体に向けられ、続いて細胞表面に向けられて発現されるように、シグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあり得る。
前立腺特異的膜抗原(PSMA)
前立腺特異的膜抗原は、N-アセチルアスパルチルグルタメート(NAAG)のグルタメートおよびN-アセチルアスパルタート(NAA)への加水分解を触媒するクラスII膜糖タンパク質である。これは、ヒトにおいてFOLH1遺伝子によってコードされる亜鉛金属酵素である。
前立腺特異的膜抗原は、N-アセチルアスパルチルグルタメート(NAAG)のグルタメートおよびN-アセチルアスパルタート(NAA)への加水分解を触媒するクラスII膜糖タンパク質である。これは、ヒトにおいてFOLH1遺伝子によってコードされる亜鉛金属酵素である。
ヒトPSMAのアミノ酸配列は、受託番号Q04609(https://www.uniprot.org/uniprot/Q04609)でUniprotから入手可能である。この750アミノ酸配列では、細胞質ドメインは残基1~19である。II型膜タンパク質のシグナルアンカーは残基20~43である。細胞外ドメインは残基44~750である。
細胞外ドメインは、プロテアーゼ、頂端およびC末端ドメインからなる(図2を参照のこと)。
細胞外ドメインは、プロテアーゼ、頂端およびC末端ドメインからなる(図2を参照のこと)。
核酸配列
本発明はまた、本発明の抗原結合ドメインまたはCARをコードする核酸配列を提供する。
本発明はまた、本発明の抗原結合ドメインまたはCARをコードする核酸配列を提供する。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、互いに同義であることを意図している。
多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることが当業者によって理解されるであろう。さらに、当業者は、日常的な技術を使用して、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映し得ることを理解されたい。
本発明による核酸は、DNAまたはRNAを含み得る。それらは一本鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、それらの中に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾は、当技術分野で公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の3’および/または5’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書に記載の使用の目的のために、ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得ることを理解されたい。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。
ヌクレオチド配列に関する「バリアント」、「ホモログ」または「誘導体」という用語は、配列からのまたは配列への1つ(またはそれを超える)核酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失または付加を含む。
核酸配列は、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。
核酸構築物
本発明はまた、本発明のFab型CARをコードする核酸構築物を提供する。
本発明はまた、本発明のFab型CARをコードする核酸構築物を提供する。
FabCARをコードする核酸構築物(図3A)は、以下の構造を有し得る。
VH-CH-スペーサーTM-エンド-coexpr-VL-CLまたは
VL-CL-スペーサーTM-エンド-coexpr-VH-CH
(式中、
VHは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり、
CHは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり、
スペーサーは、スペーサーをコードする核酸であり、
TMは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
エンドは、エンドドメインをコードする核酸配列であり、
coexprは、第1および第2のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり、
VLは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり、および
CLは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である。)
VH-CH-スペーサーTM-エンド-coexpr-VL-CLまたは
VL-CL-スペーサーTM-エンド-coexpr-VH-CH
(式中、
VHは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり、
CHは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり、
スペーサーは、スペーサーをコードする核酸であり、
TMは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
エンドは、エンドドメインをコードする核酸配列であり、
coexprは、第1および第2のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり、
VLは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり、および
CLは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である。)
上記の両方の構造について、2つのポリペプチドをコードする核酸配列は、構築物中のいずれの順序であってもよい。
上記の構造において、「coexpr」は、別々の実体として2つのポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列である。これは、核酸構築物が切断部位によって連結された両方のポリペプチドを産生するように、切断部位をコードする配列であり得る。切断部位は自己切断性であってよく、ポリペプチドが産生される場合に、いかなる外部切断活性も必要とせずに個々のペプチドに直ちに切断される。
切断部位は、2つのポリペプチドが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。
「切断」という用語は、便宜上本明細書で使用されるが、切断部位は、古典的な切断以外の機構によってペプチドを個々の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス(FMDV)2A自己切断ペプチド(以下を参照のこと)については、「切断」活性:宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳効果を説明するための様々なモデルが提案されている(Donnellyら(2001)J.Gen.Virol.82:1027-1041)。そのような「切断」の正確な機構は、切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列の間に位置するとき、タンパク質を別個の実体として発現させる限り、本発明の目的にとって重要ではない。
切断部位は、例えば、フリン切断部位、タバコエッチウイルス(TEV)切断部位であり得るか、または自己切断ペプチドをコードし得る。
「自己切断性ペプチド」とは、タンパク質および自己切断性ペプチドを含むポリペプチドが産生されると、いかなる外部切断活性も必要とせずに直ちに「切断」されるか、または別個の独立した第1および第2のポリペプチドに分離されるように機能するペプチドを指す。
自己切断性ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルスからの2A自己切断性ペプチドであり得る。アプトウイルスおよびカルジオウイルスの一次2A/2B切断は、それ自体のC末端で2A「切断」によって媒介される。口蹄疫ウイルス(FMDV)およびウマ鼻炎Aウイルスなどのアポトウイルスでは、2A領域は約18個のアミノ酸の短いセクションであり、タンパク質2BのN末端残基(保存されたプロリン残基)と共に、それ自体のC末端で「切断」を媒介することができる自律的要素を表す(上記のDonellyら(2001))。
「2A様」配列は、アプトまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、C型ロタウイルス、ならびにトリパノソーマ種および細菌配列内の反復配列で見出されている(上記のDonnellyら(2001))。
切断部位は、配列番号161(RAEGRGSLLTCGDVEENPGP)として示される2A様配列を含み得る。
本発明はまた、本発明のCARをコードする1またはそれを超える核酸配列を、自殺遺伝子などの別の分子をコードする核酸配列と共に含む核酸構築物を提供する。
自殺遺伝子は、許容できない毒性に直面して、養子移入された細胞、例えばT細胞の選択的破壊を可能にする遺伝的にコードされた機構である。
自殺遺伝子は、国際公開第2013/153391号に記載されている、その文献の配列番号4として示されている配列を有する「RQR8」、または国際公開第2016/135470号に記載されている「Rapcasp9」であり得る。
ベクター
本発明はまた、本発明による抗原結合ドメインまたはキメラ抗原受容体をコードする1またはそれを超える核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。そのようなベクターは、抗原結合ドメインまたはキメラ抗原受容体を発現するように、核酸配列を宿主細胞に導入するために使用され得る。
本発明はまた、本発明による抗原結合ドメインまたはキメラ抗原受容体をコードする1またはそれを超える核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。そのようなベクターは、抗原結合ドメインまたはキメラ抗原受容体を発現するように、核酸配列を宿主細胞に導入するために使用され得る。
ベクターは、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンベースのベクターもしくは合成mRNAであり得る。
ベクターは、T細胞またはNK細胞などの細胞をトランスフェクトまたは形質導入することが可能であり得る。
細胞
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体を含む細胞を提供する。
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体を含む細胞を提供する。
細胞は、本発明の核酸配列、核酸構築物またはベクターを含み得る。
細胞は、T細胞またはNK細胞などの細胞溶解性免疫細胞であり得る。
T細胞またはTリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。それらは、細胞表面上のT細胞受容体(TCR)の存在によって、B細胞およびナチュラルキラー細胞(NK細胞)などの他のリンパ球と区別することができる。以下に要約するように、様々なタイプのT細胞が存在する。
ヘルパーTヘルパー細胞(TH細胞)は、B細胞の形質細胞およびメモリーB細胞への成熟、ならびに細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的過程において他の白血球を支援する。TH細胞は、その表面にCD4を発現する。TH細胞は、抗原提示細胞(APC)の表面上のMHCクラスII分子によってペプチド抗原と共に提示されると活性化される。これらの細胞は、異なる種類の免疫応答を促進するために異なるサイトカインを分泌するTH1、TH2、TH3、TH17、Th9またはTFHを含むいくつかのサブタイプのうちの1つに分化することができる。
細胞溶解性T細胞(TC細胞またはCTL)は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。CTLは、その表面にCD8を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するMHCクラスIに関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。制御性T細胞によって分泌されるIL-10、アデノシンおよび他の分子を介して、CD8+細胞は、アネルギー状態に不活性化されることがあり、これにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患が予防される。
メモリーT細胞は、感染が消散した後に長期間持続する抗原特異的T細胞のサブセットである。それらは、それらの同族抗原に再曝露されるとすぐに多数のエフェクターT細胞に拡大し、したがって免疫系に過去の感染に対する「メモリー」を提供する。メモリーT細胞は、3つのサブタイプ:セントラルメモリーT細胞(TCM細胞)および2つのタイプのエフェクターメモリーT細胞(TEM細胞およびTEMRA細胞)を含む。メモリー細胞は、CD4+またはCD8+のいずれかであり得る。メモリーT細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質CD45ROを発現する。
以前はサプレッサーT細胞として知られていた制御性T細胞(Treg細胞)は、免疫寛容の維持にとって極めて重要である。それらの主な役割は、免疫反応の終わりに向かってT細胞性免疫を遮断し、胸腺における陰性選択の過程を脱した自己反応性T細胞を抑制することである。
CD4+Treg細胞の2つの主要なクラス、すなわち天然起源Treg細胞および適応Treg細胞が記載されている。
天然起源Treg細胞(CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞としても知られる)は、胸腺で生じ、発達中のT細胞と、TSLPで活性化された骨髄系(CD11c+)樹状細胞および形質細胞様(CD123+)樹状細胞の両方との間の相互作用に関連している。天然起源Treg細胞は、FoxP3と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のT細胞と区別することができる。
FOXP3遺伝子の変異は、制御性T細胞の発達を妨げ、致命的な自己免疫疾患IPEXを引き起こす可能性がある。
FOXP3遺伝子の変異は、制御性T細胞の発達を妨げ、致命的な自己免疫疾患IPEXを引き起こす可能性がある。
適応Treg細胞(Tr1細胞またはTh3細胞としても知られる)は、正常な免疫応答の間に生じ得る。
細胞は、ナチュラルキラー細胞(またはNK細胞)であり得る。NK細胞は、自然免疫系の一部を形成する。NK細胞は、MHC非依存的な様式でウイルス感染細胞からの自然シグナルに対する迅速な応答を提供する
NK細胞(自然リンパ系細胞の群に属する)は、大顆粒リンパ球(LGL)として定義され、Bリンパ球およびTリンパ球を生成する共通リンパ球前駆体から分化した第3の種類の細胞を構成する。NK細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、その後、循環に入ることが知られている。
本発明の細胞は、上記の細胞型のいずれかであり得る。
本発明の第1の態様による細胞は、患者自身の末梢血(第一者)から、またはドナー末梢血(第二者)からの造血幹細胞移植の状況で、または非血縁ドナー(第三者)からの末梢血のいずれかからエクスビボで作製され得る。
あるいは、本発明の第1の態様による細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のT細胞またはNK細胞へのエクスビボ分化に由来し得る。あるいは、その溶解機能を保持し、治療薬として作用し得る不死化T細胞株が使用され得る。
全てのこれらの実施形態において、キメラポリペプチド発現細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、DNAまたはRNAによるトランスフェクションを含む多くの手段のうちの1つによって、キメラポリペプチドをコードするDNAまたはRNAを導入することによって作製される。
本発明の細胞は、対象からのエクスビボ細胞であり得る。細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)試料からであり得る。細胞は、本発明の第1の態様のキメラポリペプチドを提供する分子をコードする核酸で形質導入される前に、例えば抗CD3モノクローナル抗体で処理することによって、活性化および/または増殖され得る。
本発明の細胞は、
(i)対象または上に列挙した他の供給源からの細胞含有試料の単離、および
(ii)キメラポリペプチドをコードする1またはそれを超える核酸配列での細胞の形質導入またはトランスフェクション
によって、作製され得る。
(i)対象または上に列挙した他の供給源からの細胞含有試料の単離、および
(ii)キメラポリペプチドをコードする1またはそれを超える核酸配列での細胞の形質導入またはトランスフェクション
によって、作製され得る。
次いで、細胞を、例えば抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択される精製によって得ることができる。
医薬組成物
本発明はまた、本発明による複数の細胞を含有する医薬組成物に関する。
本発明はまた、本発明による複数の細胞を含有する医薬組成物に関する。
医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでもよい。医薬組成物は、必要に応じて、1またはそれを超えるさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび/または化合物を含み得る。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。
処置方法
本発明は、疾患を処置および/または予防する方法であって、本発明の細胞を(例えば、上記の医薬組成物中で)対象に投与する工程を含む方法を提供する。
本発明は、疾患を処置および/または予防する方法であって、本発明の細胞を(例えば、上記の医薬組成物中で)対象に投与する工程を含む方法を提供する。
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書では、細胞は、疾患に関連する少なくとも1つの症候を軽減、低減もしくは改善するために、および/または疾患の進行を減速、低減もしくは遮断するために、既存の疾患または症状を有する対象に投与され得る。
疾患を予防する方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書では、そのような細胞は、疾患の原因を予防もしくは損なうため、または疾患に関連する少なくとも1つの症候の発生を軽減もしくは予防するために、疾患にまだ罹患していないおよび/または疾患の任意の症候を示していない対象に投与され得る。対象は、疾患の素因を有するか、または疾患を発症するリスクがあると考えられ得る。
本方法は、
(i)細胞含有試料を単離する工程、
(ii)本発明によって提供される核酸配列またはベクターをそのような細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程、
(iii)(ii)からの細胞を対象に投与する工程、
に関与し得る。
(i)細胞含有試料を単離する工程、
(ii)本発明によって提供される核酸配列またはベクターをそのような細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程、
(iii)(ii)からの細胞を対象に投与する工程、
に関与し得る。
細胞含有試料は、例えば上記のように、対象または他の供給源から単離され得る。細胞は、対象自身の末梢血(第一者)から、またはドナー末梢血(第二者)からの造血幹細胞移植の状況で、または非血縁ドナー(第三者)からの末梢血から単離され得る。
本発明は、疾患の処置および/または予防における使用のための本発明のCAR発現細胞を提供する。
本発明はまた、疾患を処置および/または予防するための薬物の製造における本発明のCAR発現細胞の使用に関する。
本発明の方法によって処置および/または予防される疾患は、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(腎細胞)、白血病、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、および甲状腺癌などの癌性疾患であり得る。
特に、疾患は前立腺癌であり得る。
本発明の細胞は、癌細胞などの標的細胞を死滅させることができる場合がある。標的細胞は、標的細胞の近傍における腫瘍分泌リガンドまたはケモカインリガンドの存在を特徴とし得る。標的細胞は、標的細胞表面での腫瘍関連抗原(TAA)の発現と共に可溶性リガンドの存在を特徴とし得る。
本発明の細胞および医薬組成物は、上記疾患の処置および/または予防に使用するためのものであり得る。
ここで、本発明を実施例によってさらに説明するが、これらは当業者が本発明を実施するのを助けるのに役立つことを意図しており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。
実施例1-PSMA結合剤の生成
免疫化後にラットファージディスプレイライブラリーを作製し、ビーズ上に固定化された社内組換えヒトPSMAに対してパニングした。特異的ファージの濃縮を示した後、ファージELISAアッセイを使用してライブラリーをスクリーニングし、単離されたクローンを配列決定した。さらなる分析のためにマウスIgG2A Fcベクターにクローニングする前に陽性選択を確認するためにクローンの結合を再評価した。
免疫化後にラットファージディスプレイライブラリーを作製し、ビーズ上に固定化された社内組換えヒトPSMAに対してパニングした。特異的ファージの濃縮を示した後、ファージELISAアッセイを使用してライブラリーをスクリーニングし、単離されたクローンを配列決定した。さらなる分析のためにマウスIgG2A Fcベクターにクローニングする前に陽性選択を確認するためにクローンの結合を再評価した。
材料および方法
Strep2タグ付きPSMAの作製
StrepIIタグ付きPSMA(MP27034)を社内で作製し、標準プロトコルに従って30mLのHEK293F細胞にトランスフェクトした。4日後、培養上清を回収し、0.22μmフィルターで滅菌した後、アリコートし、4℃で保存した。
Strep2タグ付きPSMAの作製
StrepIIタグ付きPSMA(MP27034)を社内で作製し、標準プロトコルに従って30mLのHEK293F細胞にトランスフェクトした。4日後、培養上清を回収し、0.22μmフィルターで滅菌した後、アリコートし、4℃で保存した。
組換えPSMAおよびFACS分析プロトコル(QC)のビーズベースの捕捉
25μlのMagstrepビーズ(IBA)を保存バイアルから取り出した。ビーズを1mLのPBS.T(0.05% Tween(登録商標))×3で洗浄し、洗浄間で磁気分離した。1.5mLのMP27034上清(PSMAは定量されなかった)を、撹拌しながら室温で30分間ビーズとインキュベートした。ビーズを、各洗浄後に磁石を介して分離する1mL(x3)のPBS.Tで洗浄した。ビーズを、QC実験における陰性選択/対照のために25μlの非コンジュゲートビーズと一緒に室温で30分間、1mLの1% BSA PBS中でブロッキングした。各洗浄後に磁石を介して分離する1mL(x3)のPBS.Tでビーズを洗浄する。撹拌しながら室温で10分間、1/1000希釈の抗PSMA Alexaflour 488(Abcam ab187570)で染色する。結合のフロー確認を、Milteni MACSquantのコンジュゲートビーズを使用して行った。
25μlのMagstrepビーズ(IBA)を保存バイアルから取り出した。ビーズを1mLのPBS.T(0.05% Tween(登録商標))×3で洗浄し、洗浄間で磁気分離した。1.5mLのMP27034上清(PSMAは定量されなかった)を、撹拌しながら室温で30分間ビーズとインキュベートした。ビーズを、各洗浄後に磁石を介して分離する1mL(x3)のPBS.Tで洗浄した。ビーズを、QC実験における陰性選択/対照のために25μlの非コンジュゲートビーズと一緒に室温で30分間、1mLの1% BSA PBS中でブロッキングした。各洗浄後に磁石を介して分離する1mL(x3)のPBS.Tでビーズを洗浄する。撹拌しながら室温で10分間、1/1000希釈の抗PSMA Alexaflour 488(Abcam ab187570)で染色する。結合のフロー確認を、Milteni MACSquantのコンジュゲートビーズを使用して行った。
ファージパニング
一過性トランスフェクトHEK293T細胞(RJ)からの上清中のPSMA St2(27034)を、上記のように(染色なしで)ビーズにコンジュゲートした。IBA 2型および3型strep-tactinビーズの両方をKingFisher Flexにおけるパニングのために使用した。非特異的結合ファージを撹拌しながら室温で30分間除去するために、ファージライブラリーの100倍の表示(1×1010個のファージ/ml)をBSAコンジュゲートビーズと共にインキュベートした。ビーズを磁気的に分離し、ファージ含有上清をPSMAコンジュゲートビーズに直接移した。
一過性トランスフェクトHEK293T細胞(RJ)からの上清中のPSMA St2(27034)を、上記のように(染色なしで)ビーズにコンジュゲートした。IBA 2型および3型strep-tactinビーズの両方をKingFisher Flexにおけるパニングのために使用した。非特異的結合ファージを撹拌しながら室温で30分間除去するために、ファージライブラリーの100倍の表示(1×1010個のファージ/ml)をBSAコンジュゲートビーズと共にインキュベートした。ビーズを磁気的に分離し、ファージ含有上清をPSMAコンジュゲートビーズに直接移した。
PBS.T 0.05%での3分×5サイクルの洗浄を利用して、「ファージディスプレイプロトコル2」を使用して、パニング工程および洗浄工程をKingfisher Flexで行った。PSMA St2コンジュゲートビーズからの溶出は、PBS中500μlの2×Biotin溶液を用いて20分間行った。
次いで、ファージを滴定し、標準プロトコルに従って増幅した。簡単に述べると、溶出したファージを対数期TG1細胞(5ml)に再感染させ、Amp/Gluc寒天プレート上に播種することによって増幅した。ファージ数および濃縮を確立するために、滴定を行った。数ラウンドのファージパニングおよび増幅を使用して結合剤を生成した。
モノクローナルファージ発現ELISA
標準的なファージELISAプロトコルを使用した。簡単に説明すると、個々の細菌コロニーを拾い、2TY Gluc/Amp培地中で37℃で0.5のOD600nmまで培養した後、ヘルパーファージ(M13KO7)の添加によるファージ発現の誘導を40分間の重複感染のために行い、アンピシリンおよびカナマイシン(それぞれ100μg/mlおよび70μg/ml)を補充した2TY中に再懸濁し、撹拌しながら30℃で一晩培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清をELISAのスクリーニングおよびフローサイトメトリーに直接使用した。
標準的なファージELISAプロトコルを使用した。簡単に説明すると、個々の細菌コロニーを拾い、2TY Gluc/Amp培地中で37℃で0.5のOD600nmまで培養した後、ヘルパーファージ(M13KO7)の添加によるファージ発現の誘導を40分間の重複感染のために行い、アンピシリンおよびカナマイシン(それぞれ100μg/mlおよび70μg/ml)を補充した2TY中に再懸濁し、撹拌しながら30℃で一晩培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清をELISAのスクリーニングおよびフローサイトメトリーに直接使用した。
ELISA
全てのインキュベーションを撹拌しながら室温で1時間行い、洗浄は0.05% PBS.tweenで3回行った。PSMAを1μg/ml(50μl)でnunc 96ウェルプレートに播種し、室温で1時間インキュベートし、プレートを洗浄し、2%ミルクで1時間ブロッキングし、上清を添加する前に再び洗浄した。検出抗体は抗M13-HRPコンジュゲートであり、プレートをTMB基質で展開した後、450nmで読み取った。
全てのインキュベーションを撹拌しながら室温で1時間行い、洗浄は0.05% PBS.tweenで3回行った。PSMAを1μg/ml(50μl)でnunc 96ウェルプレートに播種し、室温で1時間インキュベートし、プレートを洗浄し、2%ミルクで1時間ブロッキングし、上清を添加する前に再び洗浄した。検出抗体は抗M13-HRPコンジュゲートであり、プレートをTMB基質で展開した後、450nmで読み取った。
このELISAプロトコルからの逸脱には、必要に応じて抗c-Myc HRPまたは抗Flag-HRPを使用するscFv検出が含まれる。
結果
パニング開始前のPSMAバッチQC
パニングを開始する前に、一過性の293トランスフェクションからPSMAのバッチを作製した。このQCは、ビオチンを使用して、PSMA ST2が3型ビーズにうまく結合し、そこから溶出することができることを示した。したがって、3型ビーズを、以下のビーズベースのパニング戦略の全てに使用した。
パニング開始前のPSMAバッチQC
パニングを開始する前に、一過性の293トランスフェクションからPSMAのバッチを作製した。このQCは、ビオチンを使用して、PSMA ST2が3型ビーズにうまく結合し、そこから溶出することができることを示した。したがって、3型ビーズを、以下のビーズベースのパニング戦略の全てに使用した。
パニング濃縮は、2回のpan後にファージ力価について陽性結果を示したので、特異的抗体についてスクリーニングするために単一コロニーを選択した。
モノクローナル選択(ファージ沈殿後)によるM13ファージ発現からの繰り返されたELISAの結果は、シグナルが複製可能であり、バックグラウンドタンパク質への結合と比較して有意であることを示した。
図4は、組換えタンパク質ELISAアッセイでの初期スクリーニング(n=3)後の複製物におけるクローンファージおよびscFv培養物のELISAアッセイ
概要
同じ動物からのハイブリドーマ生成を使用するさらなる配列と共に、このファージディスプレイキャンペーンから結合剤の選択を生成した。
同じ動物からのハイブリドーマ生成を使用するさらなる配列と共に、このファージディスプレイキャンペーンから結合剤の選択を生成した。
7A12ヒト化
インシリコのヒト化および抗体モデリング
BioLuminateソフトウェア(Schrodinger)を使用して、インシリコのモデリングおよびCDR移植によって7A12ヒト化を行った。
インシリコのヒト化および抗体モデリング
BioLuminateソフトウェア(Schrodinger)を使用して、インシリコのモデリングおよびCDR移植によって7A12ヒト化を行った。
インシリコ免疫原性分析
目的:MHCI結合およびMHCI免疫原性特性(Nielsenら、2003 Protein Sci.12,1007-1017;Buiら、2005 Immunogenetics 57,304-314;Peters&Sette 2005 BMC Bioinformatics 6,132;Karosieneら、2012 Immunogenetics 64,177-186;Zhangetら、2009 Bioinformatics 25,1293-1299)についてIEDBツール(https://www.iedb.org/)を使用して、新たに設計されたヒト化構築物のT細胞エピトープを予測すること。さらに、T20スコア分析器(https://dm.lakepharma.com/bioinformatics/)を用いて、移植されたフレームワークの人間性を予測する(Gaoら、2013、BMC Biotechnol.13,55)。
目的:MHCI結合およびMHCI免疫原性特性(Nielsenら、2003 Protein Sci.12,1007-1017;Buiら、2005 Immunogenetics 57,304-314;Peters&Sette 2005 BMC Bioinformatics 6,132;Karosieneら、2012 Immunogenetics 64,177-186;Zhangetら、2009 Bioinformatics 25,1293-1299)についてIEDBツール(https://www.iedb.org/)を使用して、新たに設計されたヒト化構築物のT細胞エピトープを予測すること。さらに、T20スコア分析器(https://dm.lakepharma.com/bioinformatics/)を用いて、移植されたフレームワークの人間性を予測する(Gaoら、2013、BMC Biotechnol.13,55)。
IEDB
このツールは、MHCIに対する結合親和性について抗体配列に由来するペプチドの分析を可能にする。全てのペプチド長(8~14)を使用して、ヒトHLA対立遺伝子A*02:01に対するプロテアソーム切断/TAP輸送/MHCクラスI複合予測因子(http://tools.iedb.org/processing/)によって、移植された抗体フレームワークの配列を分析する。274nMの特異的カットオフを適用して、結合ペプチドを分化させる(Paul,S.ら、2013 J.Immunol.191,5831-5839)。
このツールは、MHCIに対する結合親和性について抗体配列に由来するペプチドの分析を可能にする。全てのペプチド長(8~14)を使用して、ヒトHLA対立遺伝子A*02:01に対するプロテアソーム切断/TAP輸送/MHCクラスI複合予測因子(http://tools.iedb.org/processing/)によって、移植された抗体フレームワークの配列を分析する。274nMの特異的カットオフを適用して、結合ペプチドを分化させる(Paul,S.ら、2013 J.Immunol.191,5831-5839)。
IEDB MHC-I免疫原性
次いで、274nm未満のIC50を有する全てのペプチドをクラスI免疫原性ツール(http://tools.iedb.org/immunogenicity/)で分析して、免疫原性スコア(陽性値は免疫原性を示す)を決定した(Calisら、2013 PLoS Comput.Biol.9,e1003266)。
次いで、274nm未満のIC50を有する全てのペプチドをクラスI免疫原性ツール(http://tools.iedb.org/immunogenicity/)で分析して、免疫原性スコア(陽性値は免疫原性を示す)を決定した(Calisら、2013 PLoS Comput.Biol.9,e1003266)。
効率的なCTL応答(Sette,A.ら、1994J.Immunol.Baltim.153,5586-5592)には50nmの親和性閾値が必要であるので、MHC-Iに対して50nmまたはそれ未満の親和性を有する全てのペプチドは、潜在的に免疫原性であると考えられる。
T20スコア
T20スコア分析器は、抗体可変配列(Gaoら、2013、BMC Biotechnol.13,55)からモノクローナル抗体のヒトらしさスコアを計算するために使用される。移植された抗体フレームワークの配列は、T20スコア分析器(https://dm.lakepharma.com/bioinformatics/)によって分析される。80またはそれを超えるスコアがヒト配列に関連付けられる。
T20スコア分析器は、抗体可変配列(Gaoら、2013、BMC Biotechnol.13,55)からモノクローナル抗体のヒトらしさスコアを計算するために使用される。移植された抗体フレームワークの配列は、T20スコア分析器(https://dm.lakepharma.com/bioinformatics/)によって分析される。80またはそれを超えるスコアがヒト配列に関連付けられる。
実施例2-抗PSMA単一ドメイン抗体の生成
固定化抗原と細胞ベースのファージディスプレイパニングとの組み合わせを使用して、免疫化ラマのファージディスプレイライブラリーからPSMAに特異性を有する単一ドメイン抗体(dAb)を単離した。
固定化抗原と細胞ベースのファージディスプレイパニングとの組み合わせを使用して、免疫化ラマのファージディスプレイライブラリーからPSMAに特異性を有する単一ドメイン抗体(dAb)を単離した。
形質導入された内因性PSMA発現細胞への細胞結合の確認をフローサイトメトリーによって確認する前に、組換えタンパク質に対してスクリーニングアッセイを最初に行った。
SPR分析(Biacore)は、IHC染色において、抗体がnM範囲の親和性で結合し、選択された抗体がPSMA(ヒトおよびアカゲザル)に結合することを示した。
材料および方法
免疫およびライブラリーの調製
組換えHisタグ付きPSMAによるタンパク質免疫化の前に(42日目および63日目)免疫応答をプライミングするために、皮下注射(0日目および21日目)を介して、2匹のラマ(9240、9241)をpCMV-PSMAで遺伝子免疫化した。末梢血リンパ球(PBL)を、一次免疫の70日後に採取した150mlの血液試料から単離した。RNAを、RNeasy maxiキット(Qiagen)を使用してPBLから単離した。オリゴ-dTプライミングおよびSuperscript III逆転写酵素を使用して、各ラマからcDNAを合成した。cDNAをコードするdAbを、特異的プライマーを使用してPCRによって増幅し、400bpフラグメントの存在を確実にするために分析し、精製した(Zymoclean)。得られたクリーンなPCR産物を制限酵素消化(PST1およびNOT1)によって切断し、M13ファージベクターウイルスコートタンパク質(pRL144)に連結した。TG1大腸菌に複数の電気穿孔を行い、アンピシリン寒天プレート上で選択を行った後、試料をプールし、凍結した。
免疫およびライブラリーの調製
組換えHisタグ付きPSMAによるタンパク質免疫化の前に(42日目および63日目)免疫応答をプライミングするために、皮下注射(0日目および21日目)を介して、2匹のラマ(9240、9241)をpCMV-PSMAで遺伝子免疫化した。末梢血リンパ球(PBL)を、一次免疫の70日後に採取した150mlの血液試料から単離した。RNAを、RNeasy maxiキット(Qiagen)を使用してPBLから単離した。オリゴ-dTプライミングおよびSuperscript III逆転写酵素を使用して、各ラマからcDNAを合成した。cDNAをコードするdAbを、特異的プライマーを使用してPCRによって増幅し、400bpフラグメントの存在を確実にするために分析し、精製した(Zymoclean)。得られたクリーンなPCR産物を制限酵素消化(PST1およびNOT1)によって切断し、M13ファージベクターウイルスコートタンパク質(pRL144)に連結した。TG1大腸菌に複数の電気穿孔を行い、アンピシリン寒天プレート上で選択を行った後、試料をプールし、凍結した。
タンパク質コートとして発現される抗体を有するファージをTG1大腸菌から増幅した。簡潔には、TG1細胞を、グルコース(2%)/アンピシリン(1μg/ml)を補充した2TY培地に接種し、M13KO7ヘルパーファージを添加する前に、0.5のOD600nmまで撹拌しながら37℃で培養した。40分後、細胞を、カナマイシンおよびアンピシリン(70/100μg/ml)を補充した2YT培地に再懸濁し、撹拌しながら30℃で一晩インキュベートした。PEGベースの沈殿を使用してファージを精製し、TG1大腸菌に滴定してPFU/mlを決定した。
ファージディスプレイパニング
組換えタンパク質
組換えPSMAを1μg/mlで4℃で一晩Nunc免疫チューブに固定化した後、2%ミルクPBS溶液でブロッキングした。ファージを2%ミルクPBS(2ml)中で1時間ブロッキングした後、PSMA被覆免疫チューブに添加した。室温で1時間後、チューブ洗浄物を、PBS 0.05% Tween20を使用する3×1分のインキュベーションで15回洗浄した。
再加温トリプシン(2ml)をチューブに添加し、37℃で10~15分間インキュベートすることによって、特異的ファージの溶出を行った。溶出したファージを対数期TG1細胞(5ml)に再感染させ、Amp/Gluc寒天プレート上に播種することによって増幅した。ファージ数および濃縮を確立するために、滴定を行った。
組換えタンパク質
組換えPSMAを1μg/mlで4℃で一晩Nunc免疫チューブに固定化した後、2%ミルクPBS溶液でブロッキングした。ファージを2%ミルクPBS(2ml)中で1時間ブロッキングした後、PSMA被覆免疫チューブに添加した。室温で1時間後、チューブ洗浄物を、PBS 0.05% Tween20を使用する3×1分のインキュベーションで15回洗浄した。
再加温トリプシン(2ml)をチューブに添加し、37℃で10~15分間インキュベートすることによって、特異的ファージの溶出を行った。溶出したファージを対数期TG1細胞(5ml)に再感染させ、Amp/Gluc寒天プレート上に播種することによって増幅した。ファージ数および濃縮を確立するために、滴定を行った。
細胞ベースのパニング
細胞ベースのパニングを使用して、細胞表面に示されるようにPSMAに対する特異性を有する結合剤を濃縮および単離した。PSMAを安定に形質導入されたSupT1細胞および形質導入されていないSupT1細胞を培養し、ライブラリーあたり合計5×106個の細胞を回収し、4mlの氷冷ミルク/PBS 2%に再懸濁し、氷上で保持した。遠心分離(400×g/5分/4℃)およびファージ溶液中のSupT1 NT細胞の再懸濁の前に、組換えタンパク質上のpan1からのファージ(2×1011 PFU/ml)を2ml PBS/乳2%中で1時間ブロッキングした。ファージおよびSupT1 NT細胞を、非特異的結合剤を除去するために4℃で1時間、端から端まで回転させながらインキュベートし、その後、この過程をSupT1-PSMA細胞で繰り返した。37℃のトリプシンEDTAとのインキュベーション(10分)、ならびにファージ滴定および上記のような大腸菌TG1細胞への増幅の前に、洗浄は、連続遠心分離およびPBS 0.05% Tween 20(pH5調整)中での再懸濁によって実施した。
細胞ベースのパニングを使用して、細胞表面に示されるようにPSMAに対する特異性を有する結合剤を濃縮および単離した。PSMAを安定に形質導入されたSupT1細胞および形質導入されていないSupT1細胞を培養し、ライブラリーあたり合計5×106個の細胞を回収し、4mlの氷冷ミルク/PBS 2%に再懸濁し、氷上で保持した。遠心分離(400×g/5分/4℃)およびファージ溶液中のSupT1 NT細胞の再懸濁の前に、組換えタンパク質上のpan1からのファージ(2×1011 PFU/ml)を2ml PBS/乳2%中で1時間ブロッキングした。ファージおよびSupT1 NT細胞を、非特異的結合剤を除去するために4℃で1時間、端から端まで回転させながらインキュベートし、その後、この過程をSupT1-PSMA細胞で繰り返した。37℃のトリプシンEDTAとのインキュベーション(10分)、ならびにファージ滴定および上記のような大腸菌TG1細胞への増幅の前に、洗浄は、連続遠心分離およびPBS 0.05% Tween 20(pH5調整)中での再懸濁によって実施した。
スクリーニング
個々の細菌コロニーを拾い、IPTG(1 mM)の添加によるdAb発現の誘導および30℃での一晩の培養前に、37℃で2TY Gluc/Amp培地中で0.5のOD600nmまで培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清をELISAのスクリーニングおよびフローサイトメトリーに直接使用した。
個々の細菌コロニーを拾い、IPTG(1 mM)の添加によるdAb発現の誘導および30℃での一晩の培養前に、37℃で2TY Gluc/Amp培地中で0.5のOD600nmまで培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清をELISAのスクリーニングおよびフローサイトメトリーに直接使用した。
ELISA
全てのインキュベーションを撹拌しながら室温で1時間行い、洗浄はPBS 0.05% Tween 20で3回行った。
PSMAをNunc 96ウェルプレートに1μg/ml(50μl)で播種し、室温で1時間インキュベートし、プレートを洗浄し、2%ミルクで1時間ブロッキングし、上清を添加する前に再び洗浄した。検出抗体は抗C Myc-HRPコンジュゲートであり、プレートをTMB基質で展開した後、450nmで読み取った。
全てのインキュベーションを撹拌しながら室温で1時間行い、洗浄はPBS 0.05% Tween 20で3回行った。
PSMAをNunc 96ウェルプレートに1μg/ml(50μl)で播種し、室温で1時間インキュベートし、プレートを洗浄し、2%ミルクで1時間ブロッキングし、上清を添加する前に再び洗浄した。検出抗体は抗C Myc-HRPコンジュゲートであり、プレートをTMB基質で展開した後、450nmで読み取った。
フローサイトメトリー
ヒトPSMAを高レベルまたは低レベルで発現する形質導入されたまたは形質導入されていないSupT1細胞を、腫瘍細胞株LnCAP、PC3および22RV1と共に、様々なフローサイトメトリー実験において染色した。簡潔には、細胞を、マウスFcまたはC-Mycタグのいずれかでタグ付けされたスクリーニング抗体とインキュベートした後、PBS.T 0.05%および適切な二次抗体(抗C Myc PEおよび抗マウスFc AF647)で洗浄した。使用したフローサイトメーターは、Miltenyi MACSquant(図5)およびIntelliCyt(図6)であった。
ヒトPSMAを高レベルまたは低レベルで発現する形質導入されたまたは形質導入されていないSupT1細胞を、腫瘍細胞株LnCAP、PC3および22RV1と共に、様々なフローサイトメトリー実験において染色した。簡潔には、細胞を、マウスFcまたはC-Mycタグのいずれかでタグ付けされたスクリーニング抗体とインキュベートした後、PBS.T 0.05%および適切な二次抗体(抗C Myc PEおよび抗マウスFc AF647)で洗浄した。使用したフローサイトメーターは、Miltenyi MACSquant(図5)およびIntelliCyt(図6)であった。
結果
抗体レパートリーの調査を可能にするために、2つのDNAおよびタンパク質免疫化ラマから2つのファージディスプレイライブラリーを構築した。特定のクローンの初期の高濃縮を示す組換えヒトPSMA(Acro Biosystems)に対してパニングを行った(図5(A))。スクリーニング後、細胞膜結合PSMA特異性を生成するために、これらのライブラリーを両方とも、PSMAを発現するSupT1細胞に対してパニングした。細胞パニングしたライブラリーは、組換えタンパク質パニングからのものと同様の濃縮力価をもたらした(図5(B))。
抗体レパートリーの調査を可能にするために、2つのDNAおよびタンパク質免疫化ラマから2つのファージディスプレイライブラリーを構築した。特定のクローンの初期の高濃縮を示す組換えヒトPSMA(Acro Biosystems)に対してパニングを行った(図5(A))。スクリーニング後、細胞膜結合PSMA特異性を生成するために、これらのライブラリーを両方とも、PSMAを発現するSupT1細胞に対してパニングした。細胞パニングしたライブラリーは、組換えタンパク質パニングからのものと同様の濃縮力価をもたらした(図5(B))。
初期パニング濃縮の評価後、TG1コロニーを発現するモノクローナルファージを滴定プレートから選択し、培養し、IPTG添加およびグルコース飢餓によってdAb発現を誘導した。ELISA分析により、陽性クローンおよびバックグラウンド結合剤の混合物が示された(図6)。陽性クローンを選択し、配列決定し、滴定アッセイで組換えPSMAに対してさらにスクリーニングした(データは示さず)。選択された結合剤をフローサイトメトリーに進めたところ、ラマ2からのクローンB8およびG7は、高発現PSMAクローンに対して最も高い親和性および特異性を有することが示された(図7および図8)。
初期スクリーニングによって示された細胞パニングされたファージのライブラリー内のdAbの濃縮レパートリーは、Next gen Sequence analysis(NGS)による同様の配列のさらなるスクリーニングを保証するのに十分重要であった。ラマ1および2を両方ともNGS(PacBio)によって分析し、配列を、確認された細胞結合剤について高親和性の単離された配列との類似性について評価した。36個のさらなる結合剤のセットを、G Block遺伝子合成(IDT technologies)によって作製した。これらをマウスIgG2A-Fcフォーマットにクローニングし、HEK293細胞から発現させた後、形質導入および内因性発現を含む様々な細胞型に対してスクリーニングした(図9)。
特定の目的の2つの結合剤をNGS配列(クローン2および25)から単離した。形質導入された細胞またはヒト腫瘍試料およびアカゲザル試料に対して免疫組織化学を実施して、共局在化のインビボのモデルバリデーションおよびIHC分析の可能性を確立した(図10)。
結果は、B8およびG7クローン(49110および49112)はPSMA陽性細胞株に結合したが、それらは金標準対照よりも劣っているか、またはアカゲザルのPSMA形質導入細胞株に結合しなかったことを示した。このデータに基づいて、さらなる分析のために選択された2つの候補は、NGS選択からのクローン2および25である。
実施例3-抗PSMA VHH抗体の生物物理学的特徴づけ
方法
抗PSMAクローンを、一過性トランスフェクションによってexpi-CHO細胞において発現させた。トランスフェクトCHO細胞からの上清を、タンパク質A親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。HiTrap MabSelect SuRE 1mlカラムを5カラム体積のPBS pH7.4で平衡化した。
Akta(商標)Pureシステムを使用して1mL/分の流速で上清をカラムに適用した。上清を適用した後、カラムを20カラム体積のPBSで洗浄した。次いで、試料を3mlのIgG溶出緩衝液(Pierce-21004)を用いて1mL/分でカラムから溶出し、2つのHiTrap 5ml脱塩カラムに直接ロードし、予めPBS中で平衡化し、フラクションコレクタ装置を使用して96ウェルプレート上に収集した。
方法
抗PSMAクローンを、一過性トランスフェクションによってexpi-CHO細胞において発現させた。トランスフェクトCHO細胞からの上清を、タンパク質A親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。HiTrap MabSelect SuRE 1mlカラムを5カラム体積のPBS pH7.4で平衡化した。
Akta(商標)Pureシステムを使用して1mL/分の流速で上清をカラムに適用した。上清を適用した後、カラムを20カラム体積のPBSで洗浄した。次いで、試料を3mlのIgG溶出緩衝液(Pierce-21004)を用いて1mL/分でカラムから溶出し、2つのHiTrap 5ml脱塩カラムに直接ロードし、予めPBS中で平衡化し、フラクションコレクタ装置を使用して96ウェルプレート上に収集した。
タンパク質を含有する画分をプールし、SDS-PAGEで分析した。材料をアリコートに分割し、-80℃で保存した。
サイズ排除クロマトグラフィー
20μlの精製組換え抗体を、Akta PureシステムのSuperdex 200 increase 5/150 GLカラムにロードした。簡単に説明すると、カラムを1.5カラム体積のPBSで0.3ml/分で平衡化した。試料を直接ループ注入によって0.3ml/分でロードし、1.5カラム容量にわたってPBS中で実行した。溶出タンパク質をOD280nmで検出した。VHH-Fc構築物は、2mlで溶出すると予想された。
20μlの精製組換え抗体を、Akta PureシステムのSuperdex 200 increase 5/150 GLカラムにロードした。簡単に説明すると、カラムを1.5カラム体積のPBSで0.3ml/分で平衡化した。試料を直接ループ注入によって0.3ml/分でロードし、1.5カラム容量にわたってPBS中で実行した。溶出タンパク質をOD280nmで検出した。VHH-Fc構築物は、2mlで溶出すると予想された。
熱安定性
試料を1mg/mlに正規化し、標準的なガラス毛細管(Nanotemper)にロードした。熱安定性は、Nanotemper Prometheus NT.48装置で20℃~95℃まで1℃/分の線形温度増分によって決定した。データを350nm/330nm比の一次導関数として分析した。
試料を1mg/mlに正規化し、標準的なガラス毛細管(Nanotemper)にロードした。熱安定性は、Nanotemper Prometheus NT.48装置で20℃~95℃まで1℃/分の線形温度増分によって決定した。データを350nm/330nm比の一次導関数として分析した。
表面プラズモン共鳴
可溶性PSMAに対する速度論的親和性を、Biacore T200装置を使用して決定した。組換え精製抗体を、100RUを目標として、10μl/分で60秒間、タンパク質Aチップ#7に捕捉した。HBS-P+緩衝液中で透析した組換えPSMA-His(sino biologicals)を、1μMから10ポイントの1:2段階希釈で分析物として使用し、30μl/分で150秒間流し、解離時間は300秒であった。二重参照減算を適用した。1:1のLangmuirモデルを適合させたSensogram。
可溶性PSMAに対する速度論的親和性を、Biacore T200装置を使用して決定した。組換え精製抗体を、100RUを目標として、10μl/分で60秒間、タンパク質Aチップ#7に捕捉した。HBS-P+緩衝液中で透析した組換えPSMA-His(sino biologicals)を、1μMから10ポイントの1:2段階希釈で分析物として使用し、30μl/分で150秒間流し、解離時間は300秒であった。二重参照減算を適用した。1:1のLangmuirモデルを適合させたSensogram。
抗PSMA抗体J591(UPenn)を参照として使用した。
結果
抗体を、ExpiCHOにおいてVHH-Fcフォーマットで一過性に発現させ、タンパク質A親和性クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質純度をSDS-PAGEによって評価し、分子分散をサイズ排除クロマトグラフィーによって測定した。抗体は、低い凝集傾向を示した。
熱安定性をDSFによって評価し、試験した両方の抗体について57℃を超える融解温度を示した。
抗体を、ExpiCHOにおいてVHH-Fcフォーマットで一過性に発現させ、タンパク質A親和性クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質純度をSDS-PAGEによって評価し、分子分散をサイズ排除クロマトグラフィーによって測定した。抗体は、低い凝集傾向を示した。
熱安定性をDSFによって評価し、試験した両方の抗体について57℃を超える融解温度を示した。
実施例4-抗PSMA CARの構築物
CARをコードする核酸構築物のパネルを以下のように作製する。
fmc63_BBz:SFGmR.RQR8-2A-FMC63-CD8STK-TyrpTM-41BBz
mu7A12_BBz:SFGmR.RQR8-2A-aPSMA_mu7A12_CD8STK-TyrpTM-41BBz
hu7A12_BBz:SFGmR.RQR8-2A-aPSMA_hu7A12_CD8STK-TyrpTM-41BBz
hu7A12_28z:SFGmR.RQR8-2A-aPSMA_hu7A12_CD8STK-TyrpTM-41BBz
J591_BBz:SFGmR.RQR8-2A-aPSMA_hu7A12_CD8STK-TyrpTM-41BBz
SFGmRは、ベクター骨格であり、
RQR8は、国際公開第2013/153391号に記載されている自殺遺伝子RQR8であり、
2Aは、RQR8およびCARポリペプチドの同時発現を可能にする2A自己切断ペプチドファミリーのメンバーであり
CD8 STKはCD8柄スペーサーであり、
Tryp(商標)は、Tryp-1に由来する膜貫通ドメインであり、
41BBzは、CD3ゼータおよび4-1BBからのエンドドメインを含む第二世代エンドドメインである。
CARをコードする核酸構築物のパネルを以下のように作製する。
fmc63_BBz:SFGmR.RQR8-2A-FMC63-CD8STK-TyrpTM-41BBz
mu7A12_BBz:SFGmR.RQR8-2A-aPSMA_mu7A12_CD8STK-TyrpTM-41BBz
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SFGmRは、ベクター骨格であり、
RQR8は、国際公開第2013/153391号に記載されている自殺遺伝子RQR8であり、
2Aは、RQR8およびCARポリペプチドの同時発現を可能にする2A自己切断ペプチドファミリーのメンバーであり
CD8 STKはCD8柄スペーサーであり、
Tryp(商標)は、Tryp-1に由来する膜貫通ドメインであり、
41BBzは、CD3ゼータおよび4-1BBからのエンドドメインを含む第二世代エンドドメインである。
実施例5-FACベースの死滅アッセイ(FBK)
CAR-T細胞が標的細胞を死滅させる能力を、FACSベースの死滅アッセイを使用して調べた。ヒトPSMA抗原(SupT1-PSMA)を発現するように操作されたSupT1細胞を標的細胞として使用した。非操作SupT1細胞(SupT1-NT)を陰性対照として使用した。T細胞を標的細胞と1:1、1:4および1:8のエフェクター対標的比で共培養した。FBKを24時間のインキュベーション後にアッセイし、細胞蛍光測定分析によって分析した。
CAR-T細胞が標的細胞を死滅させる能力を、FACSベースの死滅アッセイを使用して調べた。ヒトPSMA抗原(SupT1-PSMA)を発現するように操作されたSupT1細胞を標的細胞として使用した。非操作SupT1細胞(SupT1-NT)を陰性対照として使用した。T細胞を標的細胞と1:1、1:4および1:8のエフェクター対標的比で共培養した。FBKを24時間のインキュベーション後にアッセイし、細胞蛍光測定分析によって分析した。
実施例6-サイトカイン放出
CAR T細胞によるIL-2およびIFNγの分泌を、実施例5に記載される共培養物から24時間で上清を回収することによって測定した。
IL-2およびIFNγの産生をELISAによって検出した。
CAR T細胞によるIL-2およびIFNγの分泌を、実施例5に記載される共培養物から24時間で上清を回収することによって測定した。
IL-2およびIFNγの産生をELISAによって検出した。
方法論
細胞株
SupT1細胞株(NTおよびPSMA+)を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1% GlutaMAXを補充したRPMI-1640培地中で培養した。T細胞を末梢血単核細胞(PBMC)から単離し、10% FBS、1% GlutaMAXおよび100U/mL IL-2を補充したRPMI-1640培地中で維持した。
細胞株
SupT1細胞株(NTおよびPSMA+)を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1% GlutaMAXを補充したRPMI-1640培地中で培養した。T細胞を末梢血単核細胞(PBMC)から単離し、10% FBS、1% GlutaMAXおよび100U/mL IL-2を補充したRPMI-1640培地中で維持した。
形質導入
レトロウイルスを、GeneJuiceを使用してHEK293T細胞を、RDFプラスミド(RD114エンベロープ)、gag/polプラスミドおよびCARプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって作製した。レトロウイルスのウイルス上清を48および72時間で回収した。T細胞を、T175 TC処理されたTC処理フラスコにおいて0.5μg/mLの抗CD3および抗CD28抗体を使用して刺激し、100U/mLのIL-2中で維持した。
非TC処理6ウェルプレートをRetronectinでコーティングし、T細胞形質導入の前に4℃で24時間インキュベートした。1×106細胞/mlの濃度で1mlの活性化T細胞を添加する前に3mlのウイルス上清を播種し、次いで100U/mLのIL-2を添加し、室温で40分間1000xgで遠心分離し、37℃および5% CO2で2-3日間インキュベートした。
レトロウイルスを、GeneJuiceを使用してHEK293T細胞を、RDFプラスミド(RD114エンベロープ)、gag/polプラスミドおよびCARプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって作製した。レトロウイルスのウイルス上清を48および72時間で回収した。T細胞を、T175 TC処理されたTC処理フラスコにおいて0.5μg/mLの抗CD3および抗CD28抗体を使用して刺激し、100U/mLのIL-2中で維持した。
非TC処理6ウェルプレートをRetronectinでコーティングし、T細胞形質導入の前に4℃で24時間インキュベートした。1×106細胞/mlの濃度で1mlの活性化T細胞を添加する前に3mlのウイルス上清を播種し、次いで100U/mLのIL-2を添加し、室温で40分間1000xgで遠心分離し、37℃および5% CO2で2-3日間インキュベートした。
NK細胞およびNKT細胞の欠乏
EasySep(商標)ヒトCD56陽性選択キットを使用してCD56欠乏を行った。
EasySep(商標)ヒトCD56陽性選択キットを使用してCD56欠乏を行った。
細胞傷害性アッセイ
CAR T細胞を、TC処理された96ウェルプレートで1:1、1:4または1:8のエフェクター対標的比(E:T比)でSupT1-NTおよびSupT1-PSMAと共培養した(標的細胞は、条件あたり5万細胞の一定濃度である)。エフェクターT細胞および標的細胞を分化させるために抗CD3-PeCy7およびQben10-APCで染色することによって、共培養の24時間後に読み出しを行い、7-AAD死細胞染色を使用して死細胞を除外した。フローサイトメトリーによって細胞傷害性読み取り値にアクセスした。
CAR T細胞を、TC処理された96ウェルプレートで1:1、1:4または1:8のエフェクター対標的比(E:T比)でSupT1-NTおよびSupT1-PSMAと共培養した(標的細胞は、条件あたり5万細胞の一定濃度である)。エフェクターT細胞および標的細胞を分化させるために抗CD3-PeCy7およびQben10-APCで染色することによって、共培養の24時間後に読み出しを行い、7-AAD死細胞染色を使用して死細胞を除外した。フローサイトメトリーによって細胞傷害性読み取り値にアクセスした。
サイトカインELISA
ヒトIL-2 ELISA MAX(商標)DeluxeおよびヒトIFN-γELISA MAX(商標)Deluxeキットを使用して、細胞傷害性アッセイから採取した共培養上清に分泌されたサイトカインのレベルにアクセスした。
ヒトIL-2 ELISA MAX(商標)DeluxeおよびヒトIFN-γELISA MAX(商標)Deluxeキットを使用して、細胞傷害性アッセイから採取した共培養上清に分泌されたサイトカインのレベルにアクセスした。
実施例7-pHスカウト
異なるレベルのpHでの結合剤の安定性および親和性速度論を調査した。
異なるレベルのpHでの結合剤の安定性および親和性速度論を調査した。
方法論
表面プラズモン共鳴
Biacore T200装置を使用して、異なるpHでの可溶性PSMAに対する速度論的親和性を決定した。組換え精製抗体をタンパク質Aチップ#6に捕捉し、緩衝HBS-P+を用いて必要なpH(pH7.4、pH7、pH6.5およびpH6)を10μl/分で60秒間予備平衡化し、100RUを目標とした。HBS-P+緩衝液中で透析し、必要なpHに調整した組換えPSMA-His(sino biologicals)を、1μMから10ポイントの1:2段階希釈で分析物として使用し、30μl/分で150秒間流し、解離時間を300秒とした。二重参照減算を適用した。1:1のLangmuirモデルを適合させたSensogram。
表面プラズモン共鳴
Biacore T200装置を使用して、異なるpHでの可溶性PSMAに対する速度論的親和性を決定した。組換え精製抗体をタンパク質Aチップ#6に捕捉し、緩衝HBS-P+を用いて必要なpH(pH7.4、pH7、pH6.5およびpH6)を10μl/分で60秒間予備平衡化し、100RUを目標とした。HBS-P+緩衝液中で透析し、必要なpHに調整した組換えPSMA-His(sino biologicals)を、1μMから10ポイントの1:2段階希釈で分析物として使用し、30μl/分で150秒間流し、解離時間を300秒とした。二重参照減算を適用した。1:1のLangmuirモデルを適合させたSensogram。
熱安定性
試料を、必要なpH(pH7.4、pH7、pH6.5およびpH6)に緩衝したPBS中で1mg/mlに正規化し、標準的なガラス毛細管(Nanotemper)にロードした。熱安定性は、Nanotemper Prometheus NT.48装置で20℃~95℃まで1℃/分の線形温度増分によって決定した。データを350nm/330nm比の一次導関数として分析した。
試料を、必要なpH(pH7.4、pH7、pH6.5およびpH6)に緩衝したPBS中で1mg/mlに正規化し、標準的なガラス毛細管(Nanotemper)にロードした。熱安定性は、Nanotemper Prometheus NT.48装置で20℃~95℃まで1℃/分の線形温度増分によって決定した。データを350nm/330nm比の一次導関数として分析した。
結果
試験した全ての抗体は、より低いpHで標的タンパク質に対する増加した親和性を示した。ヒト化されたクローン7A12および7A12は、pH条件の変化によってほとんど影響されないより高い熱安定性を示した。これらの結果は、J591と比較して、クローン7A12の生理学的および腫瘍特異的pH微小環境でより安定な結合剤の結論を支持する(表4)。
試験した全ての抗体は、より低いpHで標的タンパク質に対する増加した親和性を示した。ヒト化されたクローン7A12および7A12は、pH条件の変化によってほとんど影響されないより高い熱安定性を示した。これらの結果は、J591と比較して、クローン7A12の生理学的および腫瘍特異的pH微小環境でより安定な結合剤の結論を支持する(表4)。
上記の明細書で言及された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
Claims (12)
- 前立腺特異的膜抗原(PSMA)に結合する抗原結合ドメインであって、
(a)相補性決定領域(CDR):以下から選択されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を有する重鎖可変領域(VH)、ならびにCDR:LCDR1、LCDR2およびLCDR3を有する軽鎖可変領域(VL):
(i)HCDR1-配列番号1、HCDR2-配列番号2、HCDR3-配列番号3、LCDR1-配列番号4、LCDR2-配列番号5、LCDR3-配列番号6、
(ii)HCDR1-配列番号9、HCDR2-配列番号10、HCDR3-配列番号11、LCDR1-配列番号12、LCDR2-配列番号13、LCDR3-配列番号14、
(iii)HCDR1-配列番号17、HCDR2-配列番号18、HCDR3-配列番号19、LCDR1-配列番号20、LCDR2-配列番号21、LCDR3-配列番号22、
(iv)HCDR1-配列番号25、HCDR2-配列番号26、HCDR3-配列番号27、LCDR1-配列番号28、LCDR2-配列番号29、LCDR3-配列番号30、
(v)HCDR1-配列番号33、HCDR2-配列番号34、HCDR3-配列番号35、LCDR1-配列番号36、LCDR2-配列番号37、LCDR3-配列番号38、
(vi)HCDR1-配列番号41、HCDR2-配列番号42、HCDR3-配列番号43、LCDR1-配列番号44、LCDR2-配列番号45、LCDR3-配列番号46、および
(vii)HCDR1-配列番号49、HCDR2-配列番号50、HCDR3-配列番号51、LCDR1-配列番号52、LCDR2-配列番号53、LCDR3-配列番号54、または
(b)以下から選択される相補性決定領域(CDR):VHHCDR1、VHHCDR2およびVHHCDR3を有するドメイン抗体可変領域、
(i)VHHCDR1-配列番号57、VHHCDR2-配列番号58、VHHCDR3-配列番号59、
(ii)VHHCDR1-配列番号61、VHHCDR2-配列番号62、VHHCDR3-配列番号63、
(iii)VHHCDR1-配列番号65、VHHCDR2-配列番号66、VHHCDR3-配列番号67、
(iv)VHHCDR1-配列番号69、VHHCDR2-配列番号70、VHHCDR3-配列番号71、および
(v)VHHCDR1-配列番号73、VHHCDR2-配列番号74、VHHCDR3-配列番号75、のいずれかを含む抗原結合ドメイン。 - (a)以下から選択される重鎖可変領域(VH)、および軽鎖可変領域(VL):
(i)VH-配列番号7、VL-配列番号8、
(ii)VH-配列番号15、VL-配列番号16、
(iii)VH-配列番号23、VL-配列番号24、
(iv)VH-配列番号31、VL-配列番号32、
(v)VH-配列番号39、VL-配列番号40、
(vi)VH-配列番号47、VL-配列番号48、および
(vii)VH-配列番号55、VL-配列番号56、または
(b)以下から選択されるドメイン抗体可変領域:
(i)配列番号60、
(ii)配列番号64、
(iii)配列番号68、
(iv)配列番号72、および
(v)配列番号76
のいずれかを含む、請求項1に記載の抗原結合ドメイン。 - 請求項1または2に記載の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)。
- 請求項1もしくは2に記載の抗原結合ドメインまたは請求項3に記載のCARをコードする核酸配列。
- 請求項4に記載の核酸配列と、自殺遺伝子をコードする核酸配列とを含む核酸構築物。
- 請求項4に記載の核酸配列または請求項5に記載の核酸構築物を含むベクター。
- 請求項3に記載のCARを発現する細胞。
- 請求項3に記載のCARをコードする核酸配列をエクスビボで細胞に導入する工程を含む、請求項7に記載の細胞を作製する方法。
- 薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と共に、請求項7に記載の複数の細胞を含む医薬組成物。
- 請求項7に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、癌を処置する方法。
- 癌の処置に使用するための、請求項7に記載の細胞。
- 癌を処置するための薬物の製造における請求項7に記載の細胞の使用。
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