JPH04504727A - 網膜芽腫を含む遺伝子産物に対して高度に特異的な精製抗体および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 網膜芽腫を含む遺伝子産物に対して高度に特異的な精製抗体および方法 本特許出願は、Ｘｕ、　Ｂｅｎｅｄｉｃｔおよびｎｕによって“網膜芽腫を含む 遺伝子産物に対して高度に特異的な抗体および方法”と題された、アメリカ合衆 国出願番号３３８．２８９．１９８９年４月１４日出願、の一部継続出願である 。

本発明の由来 本明細書に記載する発明は、連邦準備銀行準備金を用いてなされたものであり、 アメリカ合衆国政府によって、あるいはアメリカ合衆国政府のために、政府の目 的で、製品化もしくは使用されることがあり、そのための、あるいはそれについ ての特許権使用料は一切支払われない。

本発明の背景 ヒト中に通常存在する遺伝物質の欠如は、腫瘍の発生と関連づけられできた。網 膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子のヒトにおける欠如は、小児の最も一般的な目の腫瘍であ る網膜芽腫の発生と関連づけられてきた。Ｂｅｎｅｄｉｃｔ、　Ｗ、　Ｆ　“劣 性のヒトのガンの感受性遺伝子（網膜芽腫およびウィルム遺伝子座）　”　Ａｄ 、Ｖｉｒ、０ｎｃ１．、Ｖｏｌ、　７、Ｋｌｅｉｎ編、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ 　１９８７゜Ｒｂ遺伝子の欠如は、骨肉腫、線維肉腫および他の軟組織肉腫の発 生とも関連づけられてきたし、また小細胞肺ガンおよび乳ガンのような他の腫瘍 の発生もしくは進行と関連づけられてきた。

Ｒｂ遺伝子の存在は腫瘍の発生を阻害するので、Ｒｂ遺伝子は“抑圧”あるいは “調節”遺伝子と見なされている。Ｍｕｒｐｈｒｅｅ、　Ａ、　Ｌ。

およびＢｅｎｅｄｉｃｔ、　Ｗ、　Ｆ、“網膜芽腫：ヒト腫瘍遺伝子への手掛か り”、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２２３、ｐｐ、　１０２８−１０３３　（１ ９８４）。通常、遺伝子は細胞レベルで、あるタンパク質を生産するためのコー ド配列を含んでいる。

遺伝子の欠如は、その遺伝子を活性化する適切な刺激物を細胞に移入したときに 、その遺伝子によってコードされるタンパク質の欠如によって示されるであろう 。Ｒｂ遺伝子のような抑圧遺伝子の場合には、その遺伝子の存在あるいは欠如を 、Ｒｂ遺伝子産物、即ちＲｂ遺伝子の発現によって生産されるタンパク質、によ って検出することは、極めて重要な診断手段であり、また治療選択および遺伝カ ウンセリングに有効である。　Ｒｂ遺伝子（Ｒｂ感受性遺伝子としても知られて いる）は染色体１３、領域１３ｑ１４上に存在する。

ヒトＲｂ遺伝子ｃＤＮＡ配列は発表されている。“網膜芽腫遺伝子プローブを用 いた腫瘍中の網膜芽腫遺伝子欠陥の検出法および網膜芽腫の素因の検出法”、Ｆ ｕｎｇ、Ｔ’　Ａｎｇ、　ＭｕｐｈｒｅｅおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ、国際公開番 号Ｗ０８８１０９３８７．１９８８年１２月１日公開（国際出願番号ＰＣＴ／　 ＵＳ８８／　０１８０９）　：　Ｌｅｅ、　Ｗ、　Ｈ，、Ｓｈｅｗ、　Ｊ、　Ｙ 、　、　Ｈｏｎｇ、　Ｆ、　Ｄ、　、　５ｅ窒凵B Ｔ、　Ｗ、　、　Ｄｏｎｏｓｏ、　Ｌ、　Ａ、、Ｙｏｕｎｇ、　Ｌ、　Ｊ、、Ｂ ｏｏｋｓｔｅｉｎ、　Ｒ，、Ｌｅｅ、　Ｅ、　Ｙ、　１１．g網 膜芽腫感受性遺伝子は、ＤＮＡ結合能を持つ核リンタンパク質をコードする”　 、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、　３２９、ｐｐ、　６４２−６４．５　（１９８７） 。Ｆｒ１ｅｎｄ、　Ｓ、　Ｈ，。

Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、　Ｊ、　Ｍ、、Ｇｅｒｂｅｒ、　Ｍ、　ＲＸｆａｎｇ、　Ｘ 、　Ｆ、　Ｂｏｇｅｎｍａｎｎ、　Ｅ、、Ｌｉ、　Ｆ、　ＰA、 Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、“網膜芽腫および間葉の腫瘍中のＤ　Ｎ　、Ａ配 列の欠失ｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、　Ｓ、　Ａ、、Ｖｏｌ、　８４ 、ｐｐ、９０５９−９０６３　（１９８７）。

あるＲｂ遺伝子ＤＮＡ配列の存在を同定する遺伝子プローブが開発されている。

詳細な研究によって、ある患者たちでは染色体１３の１つの対立遺伝子あるいは 両対立遺伝子中でＲｂ遺伝子が欠如していることが、この遺伝子の劣性の性質と 共に報告されている。ＲｂｃＤＮＡ配列にしたがえば、９２８アミノ酸のタンパ ク質産物が予期される。しかし天然のＲｂタンパク質は利用不能であり、また通 常細胞から得たＲｂタンパク質に対して特異的な抗体も、まだ最終的な確証がな い。

いくつかの抗原がヒトＲｂ遺伝子産物に対する抗体をもたらすことが、予備的に 確認されている。Ｌｅｅ等、“網膜芽腫感受性遺伝子は、ＤＮＡ結合能を持つ核 リンタンパク質をコードする”、３２９　Ｎａｔｕｒｅ　６４２−６４５゜Ｙｏ ｋｏｔａ等、“肺の小細胞ガン腫における網膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子の変更した発 現”　、３０ｎｃｏｇｅｎｅ　４７１−４７５゜しかし、免疫組織化学的染色標 識と共に用いた場合、既知のＲｂ陽性細胞を既知のＲｂ陰性細胞と区別できるこ とが立証された抗体はなかった。

この調節もしくは抑圧遺伝子（Ｒｂ遺伝子）産物に対して高度に特異的な抗体の 開発は、機能的な正常Ｒｂタンパク質合成を特徴づけ、また異常（短縮された） Ｒｂタンパク質の存在を同定するために用いることができる。高特異的抗体によ る短縮されたＲｈタンパク質の同定は、出生前の、もしくは出生後の診断に利用 できる。

本発明の要約 ヒト網膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子産物中のエピトープに相当するポリペプチド抗原の 特徴づけは、合成ポリペプチドの調製を伴って行った。この合成ポリペプチドは 単独で、もしくは組み合わされて、Ｒｂ遺伝子産物に対して特異的なＩｇＧ抗体 を含む抗血清を生産する。

好適な合成抗原ポリペプチドは、Ｒｂタンパク質に対して高度に特異的な単一特 異的１ｇＧを生産する。この方法は、既知あるいは推定のアミノ酸配列をもつ他 のタンパク質のエピトープおよび相当するポリペプチド抗原を同定するのに有効 である。

ｃＤＮＡ配列をもつＲｂ遺伝子は知られている。発現されるヒトＲ，ｂタンパク 質アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列と考えられている最も長い読み取り枠 は、“バックグラウンド”断片と名付けられて公表されている。Ｌｅｅ、　Ｗ、 　Ｈ，、Ｓｈｅｗ、　Ｊ、　Ｙ、、口ｏｎｇ、　Ｆ、　Ｄ、、５ｅｒｙ、　ＴＶ 、　、　Ｄｏｎｏｓｏ、　Ｌ、　Ａ、、ＹｏｕｎｇルＪ、、Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ 、　Ｒ，、Ｌｅｅ、Ｅ、Ｙ、Ｔ１．　”網膜芽腫感受性遺伝子は、ＤＮＡ結合能 を持つ核リンタンパク質をコードする”　、ＮａｔｕｒｅＳＶｏｌ、３２９、ｐ ｐ、６４２−６４５　（１９８７）。Ｆｒ１ｅｎｄ、　Ｓ、　Ｈ，、Ｈｏｒｏｖ ｉ　ｔｚ、　Ｊ、　Ｍ、、Ｇｅｒｂｅｒ、　Ｍ、　Ｒ，、ｆａｎｇ、　Ｘ、　Ｆ 、　Ｂｏｇｅｎｍａｎｎ、　ＥＳＬｉ、　Ｆ、　ＰA、Ｗ ｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、“網膜芽腫および間葉の腫瘍中のＤＮＡ配列の欠失 変型に利用できる天然のＲｂタンパク質はなかった。Ｒｂタンパク質はを椎動物 種間で保存されているのではないかと考えられている。

Ｌｅｅ、　ｆ、　Ｈ，、Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ、　Ｒ，、Ｈｏｎｇ、　Ｆ、、Ｙｏ ｕｎｇ、　Ｌ、　Ｊ、、Ｓｈｅｗ、　Ｊ、　Ｙ、、Ｌｅｅ。

Ｙ、　１１．　Ｐ、“ヒト網膜芽腫感受性遺伝子・クローニング、同定および配 列”　、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２３５、ｐｐ、　１３９４−１３９９　（ １９８７）。この保存性が低い免疫原性に寄与しているのかも知れない。したが って、本発明のポリペプチド抗原は、利用可能な天然のＲｂタンパク質（天然の 状態でこのタンパク質に対して免疫化するのは困難と思われる）を用いずに開発 された。

ポリペプチド配列は以下の文献に記述された推定のＲｂタンパク質アミノ酸配列 から選択する　Ｌｅｅ、　Ｗ、　Ｈ，、Ｓｈｅｗ、　Ｊ、　Ｙ、、Ｂａｎｇ、　 Ｆ、　Ｄ、、５ｅｒｙ、　Ｔ、Ｗ、、Ｄｏｎｏｓｏ、　Ｌ、　Ａ、、Ｙｏｕｎｇ ル、Ｊ３、Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ、　Ｒ，、Ｌｅｅ、　Ｅ、　Ｙ、　）ｌ。

“網膜芽腫感受性遺伝子は、ＤＮＡ結合能を持つ核リンタンパク質をコードする ”　、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、、３２９、ｐｐ、　６４２−６４５　（１９８ ７）　：　Ｆｒ１ｅｎｄ、　Ｓ。

ＨＸＨｏｒｏｗｉｔｚ、　Ｊ、　ＭＳＧｅｒｂｅｒ、　Ｍ、　Ｒ，、Ｗａｎｇ、 Ｘ、Ｆ、Ｂｏｇｅｎｍａｎｎ、ＥＳＬｉ、Ｆ。

Ｐ、　、　Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、　“網膜芽腫および間葉の腫瘍中のＤ ＮＡ配列の欠失変異、そのコードされるタンパク質および配列の構造”、困。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、Ｖｏｌ、　８４、ｐｐ 、９０５９−９０６３　（１９８７）、これらは太明細書の一部を構成する。ま た、Ｆｕｎｇ、　Ｔ’　Ａｎｇ、　ＭｕｒｐｈｒｅｅおよびＢｅｎｅｄｉｃｔに よって“網膜芽腫遺伝子プローブを用いた腫瘍中の網膜芽腫欠陥の検出法および 網膜芽腫の素因の検出法”と題された同時継続特許出願、アメリカ合衆国出願番 号３１２．７７７、国際公開番号ＷＯ３８１０９３８７，１９８８年１２月１日 公開（国際公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１８０９）は、ＲｂｃＤＮＡ配列を含 んでいる。ポリペプチド抗原の選択は、低溶解度と高親水性を組み合わせて持つ アミノ酸配列のための類のない規準にもとづいて行った。

ポリペプチド配列の低溶解度規準は、抗原応答には高い溶解度が好ましいという 一般に認められている原理に反する。アミノ酸配列の溶解性を親水性と釣り合わ せることは、Ｒｈ遺伝子産物に対する合成抗原を同定するための成功した方法と なった。この方法は、低溶解度および高親水性を持つ目的の配列中の１０あるい はそれ以上のアミノ酸を選択する。

ポリペプチドの低溶解度は、等級Ｉおよび等級ＩＩのアミノ酸の数が等級ＩＩＩ のアミノ酸数より多いか、もしくは同数で、好ましくは、等級■のアミノ酸数が 等級ＩＩＩのアミノ酸数より多いか、もしくは同数であるような、Ｒｂタンパク 質のアミノ酸配列から選択された少なくとも１０アミノ酸の配列を意味する。等 級Ｉのアミノ酸は水に不溶性、等級ＩＩのアミノ酸は微溶性であり、等級ＩＩＩ のアミノ酸は可溶性である。（表１参照）。

本明細書の一部を構成する、Ｈｏｐｐ、　Ｔ、　Ｐ、およびＷｏｏｄｓ、　Ｋ、 　Ｒ，、“り示のために、親水性値を決定した。（表２参照）。Ｈｏｐｐおよび ＷｏｏｄＳが付与した個々のアミノ酸親水性値を平均して計真したこのポリペプ チドの親水性値は０７５より大きい。本発明の合成ポリペプチド抗原は、低い溶 解性と高い親水性を共にその配列を構成するアミノ酸中に含まなければならない ので、“順応性”と定義する。この合成ポリペプチドは担体タンパク質と共に、 もしくは担体タンパク質なしで用いることができる。

このＲｂ抗原配列同定法を、少なくとも６つの合成抗原ポリペプチドを同定する ために用だ。６つのポリペプチドのうち１つの好適なアミノ酸配列が、Ｒｂタン パク質に対する高特異的抗体の生産に優れた性質を持つことが示された。もう１ つの態様は、担体タンパク質を結合できる末端に加えられた結合アミノ酸を伴っ た順応性ポリペプチドを含んでいる。結合アミノ酸は、システィン、チロシン、 リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。他の合成ポリペプチド抗原 は、本発明の選択法を用いて同定され得る。　選択された合成ポリペプチド抗原 を用いてウサギを免疫化して、抗血清を調製した。いくつかの場合では、抗原を 担体タンパク質に共役させなかった。得られた抗血清を硫酸アンモニウムで沈殿 させ、最初の操作で脱塩し、次いてＤＥＡＥクロマトグラフィーで分離してＩｇ Ｇ分画を得た。特異的抗ＲｂＩｇＧを、２．１−２．２の低ｐＨ領域でペプチド −ＣＮＢｒ−セファロースカラムから分離した。本発明の技術を用いて調製した 純粋な高親和性抗Ｒｂ抗体は、Ｒｂタンパク質を免疫沈降させる。本発明によっ て生産した抗体を、正常なＲｂタンパク質の明確な免疫沈降、およびウェスタン プロット様式を同定するために用いた。この抗体は、細胞レベル、もしくは細胞 下レベルでＲｂタンパク質を検出するために使用できる。

この高度に特異的な抗体を、Ｒｂ遺伝子産物を検出するための標識と結合させた 。この高特異的抗体を用いる免疫組織化学的染色法は、既知のＲｈ陽性細胞中で は陽性を、また既知のＲｂ陰性細胞中では陰性を示した。この染色法を、インヒ ポ組織分析と組織培養に用いた。本発明の高特異的抗体は、細胞周期中のＲｂタ ンパク質の細胞下の位置について有益な情報を提供した。

Ｒｂ遺伝子の欠失、改変もしくは変異が種々の腫瘍に関連しているので、Ｒｂタ ンパク質の存在あるいは欠如を検出するための高特異的抗体の生産はスクリーニ ング技術として価値がある。さらにある抗ＲｂＩｇＧが、両Ｒｂ対立遺伝子から のＲｂ遺伝子産物が完全には欠如していない場合のＲｂ遺伝子異常の診断手段と して使用可能な、免疫沈降およびウェスタンプロット法で、異常Ｒｂタンパク質 をも検出することがわかった。

この異常Ｒｂタンパク質の検出は、構成細胞中のタンパク質レベルでのあるガン の素因の試験を可能にする。この高特異的抗ＲｂＩｇＧは、一般に精製抗体を用 いる種々の診断法に使用できる。生検組織試料は、免疫組織化学およびウェスタ ンプロットの両者に用いることができる。これらの技術は、ｍＲＮＡとｃＤＮＡ プローブのハイブリット形成法とは対照的に、より実用的で歓迎すべき診断手段 である。

図面の簡単な説明 図１は、正常ヒトＲｈタンパク質の推定アミノ酸配列およびエピトープ位置であ る。

図２は、ヒトＲｂ遺伝子のケノム構造である。ＨｉｎｄｌＩＩ部位は垂直の線で 示されている。個々のエクソンは黒い四角で表されている。括弧は大きさのはっ きりしないイントロン制限断片を表している。５ａｌＩ部位（Ｓ）を示しである 。またエクソンは、ＲｂｃＤＮＡ地図上の位置と関連させて示されている。

図３ａ、３ｂ、３ｃおよび３ｄは、推定Ｒｂタンパク質の親水性分析図である。

図４は、正常ヒト線維芽細胞Ｒｂ遺伝子産物の免疫沈降およびウェスタンプロッ ト法の図式的な説明を示す。

図５は、構成細胞および腫瘍細胞中のある短縮されたＲｂタンパク質の免疫沈降 の図式的説明である。

図６は、Ｒｂ陰性およびＲｂ陽性培養細胞の染色結果写真である。

図７は、ミオヘムエリトリンタンパク質の親水性分析図であり、既知および予想 エピトープを明示しである。

発明の詳細な説明 本発明のポリペプチド選択法は、Ｒｂ遺伝子の報告されたｃＤＮＡ配列、および Ｒｂ遺伝子ｃＤＮＡの最長読み取り枠から推定した９２８アミノ酸配列を利用し た。ヒトＲｂ遺伝子の推定アミノ酸配列を図１に示す。

本発明に利用したＲｂタンパク質アミノ酸配列および全ｃＤＮＡ配列は以下の文 献に報告された：　Ｌｅｅ、　Ｗ、　Ｈ，、Ｓｈｅｗ、　Ｊ、　Ｙ、、Ｈｏｎｇ 、　Ｆ、　Ｄ、、５ｅｒｙ、　Ｔ、　Ｗ、、Ｄｏｎｏｓｏル、Ａｏ、Ｙｏｕｎｇ 、　Ｌ、　Ｊ、、Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ、　Ｒ，、Ｌｅｅ、　Ｅ、　Ｙ、　Ｈ。

“網膜芽腫感受性遺伝子は、ＤＮＡ結合能を持つ核リンタンパク質をコードする ”　Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、　３２９、ｐｐ、　６４２−６４５　（１９８７） 。Ｆｒ１ｅｎｄ、　Ｓ、　Ｈ，、）１ｏｒｏｙｉｔｚ、　Ｊ、　Ｍ、、Ｇｅｒｂ ｅｒ、　Ｍ、　Ｒ，、ｆａｎｇ、　Ｘ、　Ｆ、　Ｂｏｇｅｎｍａｎｎ、　Ｅ、　 、　Ｌｉ、ＦA　Ｐ、、 Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、“網膜芽腫および間葉の腫瘍中のＤＮＡ配列の欠 失変位　そのコードされるタンパク質および配列の構造”、Ｐｒｏｃ、　、　Ｎ ａの診断におけるヒトＤＮＡ”　、Ｍａｓｓ、Ｅｙｅ　＆　Ｅａｒ　Ｉｎｆｉｒ ｍａｒｙ、　ＥＰ−＾２−０２５９、０３１　；　Ｆｕｎｇ、　Ｔ’　Ａｎｇ、 　ＭｕｒｐｈｒｅｅおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ、”網膜芽腫遺伝子プローブを用い た腫瘍中の網膜芽腫欠陥の検出法および網膜芽腫の素因の検出法“、アメリカ合 衆国出願番号３１２．７７７　、国際公開番号ＩＦ０８ｇ１０９３８７．１９８ ８年１２月１日公開（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１８０９）、これらは 本明細書の一部を構成する。参考のために図式的なＲｂ遺伝子地図を、２７のエ クソンの位置を表す図２に示す。

エピトープの同定法はＲｂタンパク質の全アミノ酸配列を用い、少なくとも１０ アミノ酸の連続した配列について、その溶解度と親水性を評価する。そのポリペ プチドは低い溶解度と高い親水性を合わせ持たなければならず、したがって“順 応性”と定義した。親水性アミノ酸は天然のタンパク質の表面に、よりさらされ やすいと考えられる。親水性ペプチドは伝統的に好まれており、ペプチド−担体 タンパク質結合反応のために、より溶けやすい。したがって高い溶解度は、抗原 ポリペプチドを選択する場合の利点であると考えられた。しかし本発明の方法と 抗原は、高親水性と共に低溶解度規準を用いる。

本発明に使用する個々のアミノ酸の溶解性を下記の表１に示す。

ｈｒ ａ１ 本発明の合成ポリペプチドは、本明細書に定義するような低い溶解性をもたなけ ればならない。溶解性にもとづいてアミノ酸を表１に示した３つの種類にわける 　等級■−不溶性、溶解度＜　Ｉｇ／１００ｍ１Ｈ２０、等級ＩＩ−微溶性、溶 解度＝１−５ｇ／１００ｍＬ　Ｈ２Ｏ、等級ｌｌｌ−可溶性、溶解度＞　５ｇ／ 　１００ｍ１　Ｈ２Ｏ。低溶解度は、その配列中の各アミノ酸の溶解度等級を利 用して、配列中の等級Ｉ（不溶性）および等級ＩＩ（微溶性）のアミノ酸数が等 級ＩＩＩ　（可溶性）のアミノ酸数より大きいか、もしくは同数、好ましくは、 その配列中の等級Ｉのアミノ酸数が等級ＩＩＩのアミノ酸数より大きいかもしく は同数であるような、１０アミノ酸より大きい配列を選択することによって特徴 づけられる。

望ましい低溶解度特性のための配列分析に加えて、その配列の親水性決定も行う 。本発明の目的のために、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓの親水性値を、“タンパク 質抗原決定基のアミノ酸配列からの予想”、叩ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、Ｖｏｌ、　７８、ｐｐ、　３８２４−３８２８　（１９８１）に記述 されているように用いる。アミノ酸配列の平均親水性は０，７５より太き（な（ ではならない。

本発明に使用する種々のアミノ酸の親水性値を下の表２に示す。

順応性ポリペプチドの概念は、ｃＤＮＡ配列が知られている場合、他の遺伝子産 物にも応用てきる。Ｒｂ遺伝子は、抗原を選択し対応する抗体を生産するための 本方法の一例である。

少な（とも１０アミノ酸のペプチドを本発明の方法を用いて同定する。１０アミ ノ酸配列のどちらの末端にでも、最初のペプチド配列を保つ対称的、もしくは非 対称的様式で、そのタンノ々り質配列に対応するアミノ酸を付加して、このペプ チドを延長することができる。

図３（図３ａ、３ｂ、３ｃおよび３ｄからなる）はＲｂタンパク質の親水性分析 図である。少なくとも６つの、Ｒｂ−８、Ｒｂ−９、Ｒｂ−１１、Ｒｂ−１２、 Ｒｂ−１５およびＲｂ−１６と名付だ立証されたＲｂ抗原が本発明の方法によっ て選択され、図３中でＲｂ遺伝子のエクソンの相対的配置の上に黒線で示されて いる。参照番号Ｒｂ−１０および点線で示したポリペプチドを、本発明の順応性 規準に反して調製した。Ｒｂ−１０の平均親水性は０　、８６　（＞０．７５） であるが、Ｒｂ−１０の不溶性、微溶性および可溶性アミノ酸残基の比は１：５ ：１４であり、等級■および等級ＩＩのアミノ酸数が等級ＩＩＩのアミノ酸数よ りも小さい。Ｒｂ−１０は極めて溶は易（、空気中で潮解性を示す。このポリペ プチドを担体タンパク質と共に、もしくは担体タンパク質なしで免疫化に使用し た。その抗血清を本発明の同じ多段階精製操作で加工した後、Ｒｂ−１０抗体を 用いた免疫沈降あるいは免疫ウェスタンプロット法でＲｂタンパク質は検出され なかった。

好ましい抗原はＲｂ−１２である。またＲｂ−１２配列とのアミノ酸相同性が少 なくとも８０％保たれているＲｂ−１２類似物も抗原として好ましい。他のペプ チドは、８０％アミノ酸相同性をもつ同様の様式で変更することができる。

次の表３は、図２に挙げたＲｂ抗原の完全な配列を含んでいる。

これらの抗原が高特異的抗Ｒｂ抗体を生産することが期待される。

表 Ｒｂタンパク質抗原ペプチド Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ ｈ−１６ 表３に含まれる好ましい抗原はＲｂ−１２である。本発明の方法は、表３に特に 挙げたものに加えて、他の合成ポリペプチド抗原を決定するために用いることが できる。

高濃度の各ペプチドを担体タンパク質に共役させずにウサギに注入した。ペプチ ド抗体は、第３あるいは第４追加免疫後に、しばしば高い力価で存在した。これ らのペプチドは、担体タンパク質に共役させて、高特異的抗体を生産することも できる。

上述のＲｂ抗原アミノ酸配列以外にも、純粋な高特異的抗Ｒｂ抗体を得るための 効率を減じることなくその配列に改良を加えることができる。追加するアミノ酸 を、担体タンパク質との共役のために、その配列の末端に加えることができる。

例えば、アミン末端システィンをＲｂ−１２に加え、キーホールリムペット（Ｋ ｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬｌ’［）に共役させて免疫化 に使用した。精製された高親和性単−特異的抗Ｒｂ抗体が得られた。

記述した操作を、高特異的抗Ｒｂ抗体を生産するために用いた。

次に、この抗体を免疫沈降、ウェスタンプロットおよび他の過程に使用した。本 明細書で報告する結果は、典型的な実験法の改良点を明示して記述した操作の結 果である。しかし本明細書に報告した、当業者が習慣的に行い得る方法以外にも 、他の方法もしくは他の改良法によって、これらの抗体を生産することができる 。

抗Ｒｂ抗体ＩｇＧを生産する操作は、担体タンパク質と共に、もしくは担体タン パク質なしで用いるペプチド（単数あるいは複数）の同定から始まる。（表３お よび考察を参照のこと）。完全フロインドアジュバント中のペプチドＩＱｍｇを 最初に筋肉内注射して、ウサギを免疫化する。２週間毎に、不完全フロインドア ジュバント中のペプチド５−１０ｍｇの追加免疫を行う。

このウサギ抗血清は、第３あるいは第４追加免疫後にしばしば高い力価で存在す る。このウサギ血清免疫グロブリンを硫酸アンモニウムで沈殿させた（典型的に は４５％硫酸アンモニウム、４８Ｃで約１２時間）。沈殿後、粗免疫グロブリン ペレットをＰＢＳに再懸濁させた。

この粗免疫グロブリン溶液を透析法で脱塩した。約４８時間にわたって、ｐＨ６ ，３の１７．５ｍＭリン酸緩衝液を３回交換した。次いで、このウサギＩｇＧを イオン交換クロマトグラフィーで単離した。ＤＥＡＥセファセルをｐＨ６，３の １７．５ｍＭリン酸緩衝液で前平衡させた。ＩｇＧ分画はｐＨ６，３の１７．５ ｍＭリン酸緩衝液で溶出した。

次に、このＩｇＧ分画をアフィニティークロマトグラフィーに供した。ｌＮ　Ｎ ａＯＨを添加して、ｐＨを７．２−７．４に調節した。

０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ勾配３．５−２．２）を用いてｐＨ２，２−２４ の低ｐＨ領域で、ペプチドＣＮＢｒ−セファロースカラムから純粋な抗ＲＢＩｇ Ｇを溶出させた。典型的には、０．１Ｍグリシンを使った抗体の免疫アフィニテ ィー精製法に用いられる最低ｐＨはｐＨ２，５である。本発明の精製方法は類が ない。０．１Ｍグリシンのかわりに高濃度の塩を使用すれば、溶出のｐＨ領域が 移動するであろう。ＩｇＧを４℃で約１２時間循環させて免疫吸着体に吸着させ るのが好ましい操作法である。この免疫吸着体は、適切なＲｂペプチドと共役さ せたＣＮＢｒ活性化セファロース（ファルマシア）である。次いで、ｐＨ勾配３ ．６から２．２の０．１Ｍグリシンを用いてカラムから抗体を溶出させ、２．４ −２．２の低ｐＨ領域て抗Ｒｂ抗体を回収した。この純粋な高親和性ＩｇＧは、 洗浄度を増したときにＲｂタンパク質を免疫沈降させた。

免疫沈降のために、この方法で生成した免疫複合体を、使用直前に調製したプロ ティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズ（シグマ）懸濁液上に集めた。２％プ ロティンＡ−セファロース溶液を作るために、プロティンＡ−セファ０−スＣｌ −４ＢヒーズをＰＢＳに懸濁させ、４℃で１時間振盪した。微量遠心機中で、こ のビーズを４℃で５分間８．０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットをＰＢＳで 洗浄し、５分間振盪し、次いで４℃で５分間、微量遠心機中で８，００Ｑｒｐｍ で回転させた。この洗浄および遠心分離過程を３回から５回繰り返した。この操 作の最後の遠心分離後、ペレットを再懸濁緩衝液１ｍｌに再懸濁させて、２％溶 液を得た。再懸濁緩衝液試料１０ｍ１はＰＢ９５ｍｌ、１０％ＮａＮ３５０μｌ 、ＢＳ、Ａ（ラン血清アルブミン）０．４ｇおよび５ｍｌの２００ｍＭ　ＮａＣ １゜２０ｍＭｈリス塩酸ｐＨ７，４および０８４％ＮＰ−４０界面活性剤を含ん でいる。この緩衝液を０．４５μｍフィルターを通して濾過した。このプロティ ンＡ−セファロースビーズ懸濁液は調製後直ちに、もしくは２４時間以内に使用 できる。

Ｒｂタンパク質の存在を試験する細胞培養を、１０％ＦＣ５を含むＤＭＥＭのよ うな組織培養培地もしくは他の組織培養培地中で生長させた。典型的なＲｂ遺伝 子産物様式同定に用いる細胞は、指数増殖期のものであるべきである。本明細書 のために、１−２Ｘ１０６細胞を用いてこの過程を記述する。細胞を、＝ｍｅ　 ｔ　ＭＥＭ　１０％透析ＦＣ３培地のようなメチオニンの欠如した培地中で１時 間から１．５時間飢餓状態にした。［３５３］−メチオニン２５０μｃｉ／１． ３ｍｌ培地を、６０ｍｍ培養皿中の細胞に３時間から４時間加えた。この細胞を ＰＢＳで１回洗浄した。６０ｍＭＮａＣ１゜３ＱｍＭ　トリス塩酸ｐＨ７，４， ０，２％ＮＰ−４０．．．０．５％デオキシコール酸ナトリウムおよび０゜１％ ＳＤＳの溶解緩衝液を調製した。この溶解緩衝液を使用する直前に、０．０５ｍ ｇ／ｍｌのアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を添加した。本実験法では、細 胞培養皿あたり０．６ｍｌの溶解緩衝液を４℃で２０分間加えた。次いて、２１ ゲーン針を通して吸引を繰り返して、細胞を分離させた。溶解と吸引後、細胞溶 解液を４０．０００ｒｐｍで２２分間遠心分離して細胞残渣を除いた。タンパク 質を含むこの上清は約０６ｍｌであった。この上清を、アプロチニン０．０５ｍ ｇ／ｍｌを含むＰＢ３０．４ｍｌと混合した。前免疫ウサギ血清１μｍを加え、 約４°Ｃで２時間振盪した。

１０％プロティンＡ−Ｓ、　ａ　ｕ　ｒ　ｅ　ｕ　ｓ細胞も調製した。再蒸留水 １０ｍ１で再構成したプロティンＡ陽性Ｓ、　ａ　ｕ　ｒ　ｅ　ｕ　ｓ細胞（Ｂ ｌｌＢ）Ｉｇを、１ｍｌもしくはさらに少量に分けて、−８０℃て凍結させた。

免疫沈降操作に使用する直前にこの１つを融解し、２，５００ｒｐｍで２分間微 量遠心分離した。ペレットを等量の再懸濁緩衝液（上述）に再懸濁させた。この 溶液はＳ、ａｕｒｅｕｓ細胞を１０％含んでいた。１０％プロティンＡ−Ｓ、　 ａ　ｕ　ｒ　ｅ　ｕ　ｓ細胞１０μｍを細胞溶解液に添加して、４℃で３０分間 振盪した。次にこの混合物を４℃で５分間、微量遠心機中で１３．ＯＯＯｒｐｍ で遠心分離して、沈殿した非特異的免疫複合体とＩｇＧを除去した。１０％プロ ティンＡ−３，ａｕｒｅｕｓ　１０μｌをさらにその上清に加えて、４℃で１時 間振盪した。この混合物を４℃で１５分間１３゜０００ｒｐｍで微量遠心分離し て、さらに沈殿した非特異的免疫複合体とＩｇＧをすべて除去した。“ 残っている上清は、抗Ｒｂ抗体を添加する用意ができていた。前述した精製操作 中に、本明細書に記載した緩衝液系を用いると高親和性抗Ｒｂ抗体は、２．４か ら２．２の低ｐＨ領域で回収されることがわかった。２．２から２．４のｐＨ領 域内の、より高度に特異的な抗体は、必ずしもタンパク質ピーク中に溶離すると は限らないことがわかった。このｐＨ勾配で回収された各分画は、高特異的高親 和性Ｒｂ抗体を含む分画を決定するために試験する必要がある。なぜならある場 合にはえり抜きの抗体が、免疫吸着体から解離した最大ピーク分画に含まれない ことがわかったからである。

選択した分画から、１％ＢＳＡを含む抗Ｒｂ　ＩｇＧ　Ｏ，１μｇ／１０μｍを この上清に添加して、４℃で少なくとも２時間振盪した。

新鮮な２％プロティンＡ−セファロース５０μｌを加えて、４°Ｃで２時間振盪 した。次いて、この混合物を微量遠心機中で、４°Ｃで５分間、８．ＯＯＯｒｐ ｍて遠心分離した。このプロティンＡ−セファロースヒーズを高塩濃度から低塩 濃度への緩衝液勾配で洗浄して、プロティンＡ−セファロースビーズにとどまっ ている残りの非特異的に結合したタンパク質をすべて洗い流した。このビーズを 、１０μｇ／ｍｌ　アプロチニン、０５μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、０７μｇ／ ｍｌ　ペプスタチンを使用直前に加えたＨ３Ｗ３Ｗ緩衝液ＮａＣ１，１０ｍＭ　 トリス塩酸ｐＨ７，４，０，２％ＮＰ−４０１ｍｌで洗浄した。このビーズをＨ ３Ｗ緩衝液で５分間洗浄して、４℃で５分間８，０００ｒｐｍで遠心分離する操 作を３回繰り返した。次いてこのビーズをＬＳＷ緩衝緩衝液１マｌ回５分間洗浄 し、それぞれ４℃で８．０００ｒｐｍで遠心分離した。ＬＳＷ緩衝液は、１０μ ｇ／ｍｌ　アプロチニン、０５μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、０７μｇ／ｍＩ　ペ プスタチンを使用前に加えた１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ　トリス塩酸ｐＨ７ ，４，０２％ＮＰ−４０から作った。次に、このビーズを洗浄緩衝液Ｗと共に５ 分間振盪して１回洗浄した。Ｗ緩衝液は、使用直前に１０μｇ／ｍＩ　アプロチ ニン、０．５μｇ／ｍｌ　ロイペプチンおよび０．７μｇ／ｍｌ　ペプスタチン を加えた１０ｍＭ　トリス塩酸ｐＨ７，４，０，２％ＮＰ−４０からなる。非特 異的タンパク質を除くための最後の洗浄後、ビーズを４℃で５分間８，０００ｒ ｐｍで遠心分離した。次いで、Ｒｂタンパク質免疫複合体を伴ったこのプロティ ンＡ−セファロースビーズを、Ｗ緩衝液１５μｍ中に入れた。

０．１２５Ｍ　トリス塩酸（ｐＨ６，８）、２０％グリセロール、４％（Ｗ／Ｖ ）ＳＤＳ、１０％β−メルカプトエタノールおよび０．００５％ブロモフェノー ルブルーの２ｘ試料緩衝液１５μｍで、タンパク質を可溶化した。この混合物を １００℃で５分間加熱し、次いで１３、ＯＯＯｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離 した。次に、可溶化したタンパク質を８％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。Ｂｏｎ ｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　。

蛍光写真法を行った。

免疫プロット法のための試料は、免疫沈降について記述したようにして調製した が、ただし電気泳動後、タンパク質はイモピロン（工ｍｍｏｂｉｌｏｎ）　Ｐ　 Ｖ　Ｄ　Ｆ膜（ミリポア）に電気プロッティングした。ウェスタン免疫プロット 法を、８％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した可溶化Ｒｂタンパク質免疫複合体につい て行った。この５ＤＳ−ＰＡＧＥ６１ゲルプレートを、３０Ｖ、０１Ａで１２時 間および６０Ｖ、０．２１Ａで１時間の電気プロッティングに供した。プロッテ ィング緩衝液は、１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭｈリスｐＨ８，３および２０％ メタノール、０．０１％ＳＤＳで作った。１０ｍＭ　トリス塩酸ｐＨ８，０およ び１５０ｍＭＮａＣｌのトリス緩衝化食塩水（ＴＢＳ）上にこの転移膜を浮かせ て均一に湿らせ、次いで沈めて簡単に濯いだ。この膜を、５％ＢＳＡを含むＴＢ Ｓ中で緩やかに振盪しながら室温で約１０分間インキュベートして、過剰のタン パク質結合部位を遮断した。次いで、プロトプロットウスタンプロットＡＰシス テム（Ｐｒｏｔｏ　Ｂｌｏｔ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　ＡＰ　ｓｙｓｔｅｍ Ｘプロメカ）　（Ｐｒｏｍｅｇａ）の改良法で、このプロットを加工した。この 遮断溶液を、選択したＲｂ抗体の膜１０１０Ｘ１５につき２０ｍ１の、５％ＢＳ Ａおよび０．０５．ｃｚｇ／ｍｌを含む１０ｍＭ）リス塩酸ｐＨ８，０゜１５０ ｍＭＮａＣ１および０．０５％ツヴイー　ン２０　（１）　Ｔ　Ｂ　Ｓ　Ｔで置 換することによって、−次抗体を結合させた。この溶液を膜と共に、室温で約１ ２時間緩やかに振盪しながらインキュベートした。

この膜をＴＢＳＴ中で各１ｏ分間緩やかに振盪して３回洗浄した。

二次抗体をこの膜上の一次抗体にＴＢＳＴ中で結合させた。プロメカキットで使 用される二次抗体は抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）アルカリフォスファターゼ複合体で あった。二次抗体（１：３７５０希釈）を含むＴＢＳＴ中でこの膜を緩やかに振 盪しながら１時間インキュベートした。呈色反応はプロメガ法に従った。この膜 を濾紙で半乾きにし、１００ｍＭ　トリス塩酸ｐＨ９，５，１００ｍＭ　ＮａＣ １，５ｍＭＭｇＣ１２のアルカリフォスファターセ（ＡＰ）緩衝液１０ｍ１に、 ７０％ンメンメチルホルムアミド中０ｍｇ／ｍｌ　ＮＥＴ　にトロブルーテトラ ゾリウム）６６μｍを加えて撹拌し、ジメチルホルムアミド中の５０ｍｇ／ｍｌ 　ＢＣＩＰ（，５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩）３３μｌを 加えて再度撹拌して調製した、呈色溶液中に置いた。この溶液を強い光から保護 し、１時間以内に使用した。膜を、この溶液と共に１５分から４時間インキュベ ートした。呈色を望ましい強度で停止させ、この膜を再蒸留水で２回濯いだ。

実施例１ 表２のペプチドＲｂ−１２を、予想されるＲｂタンパク質の２０アミノ酸残基の 順応性規準に基づいて選択した。ニューシーラント白ウサギに１０ｍｇのＲｂ− １２を筋肉的注射した。追加免疫を行って、前述のように本発明の方法を実行し た。精製したＩｇＧは高親和性抗体であり、洗浄度を増したときにＲｂタンパク 質を免疫沈降させた。この抗Ｒｂ抗体をＲｂ−ＷＬ−１と同定した。

Ｒｂ−ＷＬ−１抗体は、３５Ｓ標識した正常ヒト胎児線維芽細胞細胞ＷＴ３８か ら得たＲｂタンパク質を、図４に示した特定の様式で免疫沈降させた：レーン１ はレーン２の図式的な表現である。ＷＳＩヒト胎児線維芽細胞は同じ様式を示し た。正常胎児線維芽細胞株Ｗ１−３８、ＷＳｌはアメリカンタイプカルチャーコ レクンヨンから入手した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の様式は、Ｒｂの読み枠から予想 される理論上の分子質量に相当する１１０ｋＤのＭ、（見かけ上の相対分子質量 ）の下部バンドを含む。１１０ｋＤから１１６ｋＤまでのより不明瞭な多様な領 域は、種々の度合でリン酸化されたＲｂタンパク質を示している。Ｒｂタンパク 質の読み取り枠は、枠内第２ＡＵＧコドンをヌクレオチド４７５−４７７の位置 に含んでいる。（Ｌｅｅ等１９８７年）。第２コドンから開始したタンパク質は 、第１ＡＵＧコドンからのものより１２ｋＤ小さくなるだろう。本発明の免疫沈 降は長時間暴露後、予想した相違と正確に一致する９８ｋＤにバンドを現す。

リン酸化されたＲｂタンパク質を、３２ｐ−オルトリン酸塩を用いた代謝的標識 によって確認した。放射活性のあるタンパク質が、１１０ｋＤから１１６ｋＤの 間のＭ、をもつ濃いバンドとして移動した。脱リン酸化後には放射活性は検出さ れなかった。

また免疫沈降は、１２４ｋＤおよび５５ｋＤのＭ、をもつタンパク質をもたらし た。図４−レーン３（レーン４に図式的に示す）のウェスタンプロットは、１２ ４ｋＤおよび５５ｋＤのタンパク質以外のすべてのハンドを再現した。１２４ｋ Ｄおよび５５ｋＤのタンパク質は、前免疫血清や、過剰のペプチドＲｂ−１２で 前吸着させた抗体Ｒｂ−ＷＬ−１では検出されなかった。これらは非特異的な夾 雑物ではないと考えられる。１２４ｋＤおよび５５ｋＤのタンパク質はウェスタ ンプロット上で検出されないので、これらのタンパク質はエピトープをＲｂタン パク質と共有しておらず、おそら＜Ｒｂタンパク質との安定な複合体であろう。

Ｒｈ−ＷＬ−１抗体で検出した線維芽細胞Ｗｌ−３８タンパク質は、免疫沈降で 得たものと同じＲｈタンパク質様式を同定する、明瞭なウェスタンプロット様式 を作った。ウェスタンプロット上のこの正常Ｒｂタンパク質様式は、診断作業の 基準として使用できる。Ｒｂ−ＷＬ−１は、Ｒｂタンパク質を余分なバンドなし で観測できる、明瞭なウェスタンプロット様式を作った。

Ｒｂ遺伝子は高度に保存されていると考えられている。Ｒｂ−ＷＬ−１がマウス Ｒｂ遺伝子産物を免疫沈降させることを確認した。

おそらくこの抗体は、サル、ラットおよびニワトリを含むを推動物中のＲｂタン パク質を同定すると考えられる。多くの種についての研究が、Ｒｂ−ＷＬ−１お よび本発明の他の産物の利用を促進する。

実施例２ 表２のペプチドＲｂ−１２にアミン末端システィンを加えることによって、実施 例１と同じ品質の高特異的抗Ｒｂ抗体を与えるこの順応性ペプチドのもう一つの 態様が得られた。本実施例のペプチドをキーホールリムベットヘモシアニン（Ｋ ＬＨ）に共役させ、免疫化に使用した。本実施例のＫＬＨ−ｃｙｓ−Ｒｂ−１２ を用いた免疫化は、ペプチドのＫＬＨとの共役ゆえに、より少量のペプチドしか 必要としない。この方法は、使用前にｐＨ７，２の１０ｍＭ　リン酸緩衝液に対 して４℃で透析し、２０ｍｇ／ｍｌに調節したＫＬＨを使用した。共役性は、Ｋ ＬＨ／２００μｍ　４ｍｇをペプチド５ｍｇと共に使用した。即ち、まず１０ｍ Ｍ　リン酸緩衝液５５μｍをＫＬＨ４ｍｇ／２００μｌに加えた。さらに、ｍ− マレイミドヘンゾイルＮ−ヒトロキンスクノンイミドエステル（ＭＢＳ）（ジメ チルホルムアミト中３ｍｇ／ｍ１）８５μｌをゆっくり添加する。この混合物を 室温で３０分間撹拌した。この混合物をＧ−２５セフアデツクスカラムに通し、 １ｍ１分画を集めた。各分画のタンパク質ピークを分析し、体積を記録した。典 型的には、このカラムから８０％のＫＬＨが回収され、この回収率で、回収され たＫＬＨに５ｍｇのペプチドを加える。ｐＨを７−７５に調節し、次いて室温で ３時間撹拌する。共役されたペプチドは凍結保存できる。

ウサギをＫＬＨ−ｃｙｓ−Ｒｂ−１２で免疫化し、本明細書に記述したのと同じ 多段階精製法で高特異的抗Ｒｂ抗体を生産した。免疫沈降およびウェスタンプロ ットの結果は、実施例１に記述したものと同じか、もしくはより良いＲｂ遺伝子 産物の同定を与えた。

実施例３ Ｊ８２膀胱カン細胞は、そのＲｂ遺伝子中にエクソン２１欠失変異をもっており 、これか予想Ｍ、１０２．１ｋＤの短縮されたＲｂタンパク質を生産することが わかっている。Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、　Ｊ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、“点突然変異 による網膜芽腫抗腫瘍遺伝子の不活化”、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　２４３ 、ｐｐ、９３７−９４０　（１９８９圧、２月）。また、Ｋ、Ｇ、網膜芽腫腫瘍 細胞から得られた細胞培養は、そのＲｂ遺伝子中にエクソン１４−１７欠失変異 をもっており、予想Ｍ、９０．４ｋＤの短縮されたＲｂタンパク質を生産し、ロ ウ（Ｌｏｖｅ）網膜芽腫腫瘍はエクソン２］およびエクソン２２のＲｂ遺伝子欠 失変異をもっていて、予想Ｍ、９６．８　ｋＤの短縮されたＲｂタンパク質を生 産する。

細胞培養はこれらの３つの腫瘍細胞とに、　Ｇ、構成細胞から同様に調製した。

これらの細胞を３５５−メチオニンで代謝的に標識した。

王宮ＷＩ３８ヒト線維芽細胞Ｒｂタンパク質をその腫瘍タンノくり質と比較する 、Ｒｂ−ＷＬ−１との免疫沈降の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の結果は、Ｒｂ遺伝子のエ クソン欠失変異に対応する、小さくなった見かけ上の異常Ｒｂタンパク質分子質 量を反映した。

図５は、本実施例の短縮されたタンパク質の免疫沈降分析図の図式を、正常Ｒｂ タンパク質と比較したものである。例えばＪ８２夕ンパク質は、１１０ｋＤに現 れる正常Ｒｂタンパク質より約４ｋＤ小さかった。（１２４および５５ｋＤのタ ンパク質はＲｈタンパク質ではないと考えられる。実施例１参照。）同様に、９ ５ｋＤのＫ。

Ｇ、腫瘍Ｒｈタンパク質および１０１ｋＤのロウ腫瘍Ｒｂタンパク質は、エクソ ンの欠失変異および短縮されたｍＲＮＡにもとづいて、正常Ｒｂタンパク質に比 べて低い分子質量を反映した。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定は、二次タン パク質構造のために、正確な分子量を与えない。しかし免疫沈降によって相対分 子量は比較できる。Ｒｂ−ＷＬ−１の信頼性は、Ｒｂ遺伝子産物のような免疫沈 降可能なタンパク質によって立証された。次の表４は本実施例の結果の要約であ る。

表４ （レーン１） Ｊ８２　膀胱がん　エクソン２１欠失　１０２．１　１０６（レーン２） ロウ　ＩＩ芽腫ロウ（Ｔ）　エクソン２１および　９６．８　１０１（レーン３ ）　２１欠夫 に、Ｇ、　ＩＩＷＩＫ、Ｇ、（Ｔ）　エクソン１４−１７欠失　９０．４　９５ また図５には、レーン４に示したに、Ｇ網膜芽腫腫瘍の短縮されたタンパク質を もつ同じ個体から得たに、　Ｇ、構成細胞のＲｂ免疫沈降分析図がレーン５に示 しである。正常Ｒｂタンパク質の様式と短縮されたタンパク質の様式が共に存在 した。このＲｂ遺伝型をもっこの個体は、機能する正常Ｒｂ対立遺伝子および変 異した対立遺伝子を共に示す、正常および異常Ｒｂタンパク質を共にもっている 。腫瘍および構成細胞からの異なったＲｂタンパク質の存在を検出するこの方法 は、Ｒｂ遺伝子産物ための本発明の診断的な使用法をさらに支持する。

（以下、余白） 実施例４ 遺伝子産物に対する高特異的抗体の多くの用法の内の一つは、１細胞レベルで遺 伝子産物の存在もしくは欠失を検出するために、標識と共に用いることである。

染料と結合した抗体は、組織培養や生検からのインビボ組織切片のための、免疫 組織化学的研究に用いられてきた。抗体を使用する染色技術は、当業者に知られ ている。

精製した抗体Ｒｂ−ＷＬ−１を免疫染色に使用した。培養細胞と組織切片の染色 を共に行った。Ｒｂ−ＷＬ−１を用いた既知のＲｂ陽性株化細胞中の免疫染色は 、増殖細胞では核の染色を示し、また、インビボの正常Ｒｈ＋成体細胞を含む、 休止細胞では核の染色を示さなかった。既知のＲｂ陰性株化細胞中の免疫染色は 、全細胞中で染色を示さなかった。ウェスタン免疫プロッティング法は、生長細 胞中のより高いＲｂタンパク質質量量よび、成体あるいは休止細胞中のかなり減 少したレベルを確証した。染料と共役させた高感度の抗体は、正常およびカン細 胞中のＲｂ遺伝子の状態を決定するのに有効である。この抗体を、Ｒｂ遺伝子産 物の位置および細胞内濃度を示すために使用した。

Ｒｂ陽性および陰性染色を試験した細胞培養は以下のように調製した。付着細胞 を組織培養皿中の滅菌カバーグラス上で、明示した期間生長させた。懸濁細胞を 遠心分離後まずＰＢＳて１回洗浄し、次いてＰＢＳに再懸濁させた。細胞−滴を ポリーＬ−リジン被覆カバーガラス上に加えて、室温で２０分間インキュベート した。カバーグラス上の細胞を０．１Ｍ　リン酸緩衝液中の４５％アセトン、１ ０％ホルムアルデヒド中で５分間固定した。固定し透過性にした細胞をＰＢＳ中 で１５分間にわたって６回交換して洗浄し、次いで温室中でリン酸緩衝液中の４ ％正常ヤギ血清、５％ＢＳＡ中で室温で４時間、前インキュベートした。ＲＢ− ＷＬ−１抗体を、リン酸緩衝液中の５％ＢＳＡ、４％正常ヤギ血清および０．０ ２％トライトンＸ〜１００で１２５に希釈してＲＢ−ＷＬ−１の最終濃度を８μ ｇ／ｍｌにし、細胞と共に終夜インキュベートした。０．０２％トライトンＸ− １００を含むトリス緩衝化食塩水（ＴＢＳ）を１５分間に６回交換して洗浄した 後、ヤギの抗ウサギＩｇＧ−アルカリフォスファターセを共役させた、５％ＢＳ Ａ、４％正常ヤキ血清および００２％　トライトンＸ−１００を含むリン酸緩衝 液中で１：１０００に希釈した抗体で、この細胞を２時間標識した。次いで細胞 を、００２％　トライトンＸ−１００を含むＴＢＳで１時間洗浄した後、基質（ ブロモクロロインドリルリン酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム、ＢＣＩＰ／Ｎ ＢＴ、プロメガ）と共にインキュベートした。細胞を再蒸留水で洗浄することに よって、反応を７分から１０分後に停止させた。次に、細胞をオリンパス光学顕 微鏡で観察し、撮影した。

金コロイド法を用いて基本的に上述のように免疫染色を行った。ただし、ヤギの 抗つサキＴｇＧ−金標識抗体を二次抗体として使用し、ＰＢＳ（３Ｘ１０分）お よび蒸留水（３Ｘ３分）で洗浄した。次いてこの細胞を、インテンスＭ（ｉｎｔ ｅｎｓｅ　Ｍ）と名付けられた試薬（Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｎ、　 Ｖ、　Ｂ−２４３Ｑ　０１ｅｎ、　Ｂｅｌｇｉｕｍ製造）を用いて銀増幅のため に加工した。

凍結組織切片を調製するために小試料を、新しく調製した４％バラホルムアルデ ヒドを用いて４°Ｃで少なくとも２４時間固定した。

次いでこれを、５％ンヨ糖を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４ ）中に３時間から４時間浸し、さらに同じリン酸緩衝液中で３０％ンヨ糖に２４ ４時間浸た。この試料を液化窒素中で凍結させ、−２０℃の低温装置中で６μｍ 厚の切片に切断した。切片をポリーＬ−リジン被覆カバーカラス上で融解して、 ＰＢＳで１回洗浄し、次いで直ちにＯ，１Ｍリン酸緩衝液中の１０％ホルムアル デヒド、４５％アセトンで５分間固定した。ＰＢＳ中で切片を濯いだ後、アルカ リフォスファターゼもしくは金コロイド法を上述のように用いる免疫染色のため に、その組織切片を加工した。最後に試料をハリスへマドキシリン−エオシンＹ （Ｈａｒｒｉｓ　ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ　Ｙ）（シグマ）で対比 染色し、脱水し、設置し、試験した。

図６は、Ｒｂ−ＷＬ−１免疫染色を用いた細胞染色の写真である。

図６Ａ、Ｂ、Ｃはそれぞれ、既知のＲｂ十陽性株化細胞、胎児線維芽細胞Ｗｌ− ３８、乳腺ガン腫ＭＣＦ７および膀胱ガン腫Ｔ２４である。示した細胞は増殖状 態にあり、Ｒｂ遺伝子産物による核染色を証明する。図６Ｄおよび６Ｅは、染色 を示さない既知のＲｂ陰性株化細胞、線維肉腫Ｈｓ９１３Ｔおよび網膜芽腫ＷＥ ＲＩ−Ｒｂ−１−である。図６Ｆは、ＲＢ−ＷＬ−１抗体を用いる染色のために 加工したＲｂ陽性株化細胞膀胱カン腫Ｔ２４であり、これは過剰の免疫化ペプチ ドＲＢ−１２と共に前インキュベートし、対応する抗体Ｒｂ−ＷＬ−１での染色 を妨害したものである。

Ｒｂ−ＷＬ−１を用いる免疫染色は、本発明の方法によって開発された高特異的 抗体産物の使用法のもう一つの例である。抗体のこの用法は当業者に知られてい る。これは、この抗体のいかなる特定の使用あるいは抗体選択法についての本発 明の適用範囲を、制限するものではない。

実施例５ 本発明のエピトープ選択を、筋肉タンパク質ミオヘムエリトリンのエピトープを 同定するために用いた。ミオヘムエリトリンのアミノ酸配列およびいくつかの既 知のエピトープは既に発表されている。

Ｔａ１ｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、“抗ペプチド抗体の反応性はタンパク質中の部位 の原子移動度の関数である−　、３１２　Ｎａｔｕｒｅ　１２７−１４３　（１ ９８４）　：　Ｇｅｔｚ。

ｆｆ　ｅｔ　ａｌ、“抗体のタンパク質への結合機構”　、２３５５ｃｉｅｎｃ ｅ　１１９１−１１９６　（１９８７）。

下の表５は、１から４の番号を付けた、ミオヘムエリトリンの４つの既知のエピ トープを含んでいる。

既知のミオヘムエリトリンエピトーブ １　１６−２１　Ｖａｌ−［１ｈｅ−’ｌ°ｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ　Ｇ ｅ七２０ｆｆ　ｅヒ　ａｌ。

１　８０−８５　ｒ’ｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｙ　Ｇａヒ ｚｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ。

４、　９０−９５　Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Δ印−△ｌ’ａ−Ｌｙｓ−へｓｎ　Ｇａ辷 ｚｏｆｆ　ａｔ　ａｌ。

ミオヘムエリトリンのエピトープ選択は、順応性ペプチドのための本発明の方法 とＩ’１ｏｐｐおよびＷｏｏｄｓの方法にもとづいて行った。次に、それぞれの 方法で選択された上位３つのエピトープを、表５に示したミオヘムエリトリンの ４つの既知のエピトープと比較した。

もし予想したエピトープと既知のエピトープが一致すれば、エピトープ予想は正 しいと考えられる。

表６は、本発明のエピトープ選択とミオヘムエリトリンの既知のエピトープとの 比較である。本発明の方法は４つのエピトープのうち３つを正しく予想した。部 位２の既知のエピトープは、本発明の方法で選択した上位３つのエピトープには 該当しなかった。したがって本方法は３つのエピトープのうち３つを正しく予想 した。

チドの調製、抗血清あるいは抗体の調製、ポリクローン抗体もしくは単クローン 抗体の調製および抗血清あるいは抗体産物の診断的もしくは治療的処理のための 使用を含む、予想したエピトープ部位のあらゆる使用に限定されない。

（以下、余白） ｌＩ９　Ｐｈｃ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｂｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Δ５ＥＩ ＥＥ］Ｔｈｒ　八ｌａ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　kｅｕ　６４ ６５　Ｌｙｓ　工Ｌｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　１ｌｉｓ　Ｖａｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　 ＡｒＢ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　丁ｒｐ　Ｃ１ｕ@Ｌｙｓ　８０ ８１　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｃｒ　ＶａＬ　八ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｃ １ｙ　（Ｊｙ　Ｔｙｒ　工ｌｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　kｙｓ　９６ ９７　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌａ　Ｃｙｓ　工ｌｅ　ｒ’ｈｅ　 工ＩＣ八ｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　fｌｕ　１１２ １１３　Ｍｅ亡Ｓａｒ　Ｐｂｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅτｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　にｉ ｎ　ＬｙｓΔｓｎ　Ｉｌｅ　Ｃ１ｕ　ＸＬｅ　Ｓａｒ　Ｖａ戟@１２８ １２９　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　 Ｃ１ｕ　工１ｅ　八ｓｐ　Ｔｈｒ　’１ｉｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌ凾刀@Ｖａｌ　１４ ４ １４５　八５ｐ　Ｍｅｔ：　Ａｈａ　Ｍｕ　Ｓｅｒ　ＡｒＢ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ@Ａｈａ　１６０ ＩＧＬ　Ｌｅｕ　ｒ’ｂｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＧよＵ　Ａｒ＆　τｌ＋ ｒ　Ｃｙ＝、にＬｕ　Ｌｅｕ　工１ｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔ■秩@Ｇｉｎ　１７ ６ １７７　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　工１ｃ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ＧＬｕ工 １ＣΔｓｎ　ＳｅｒΔｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＬｙI＋１９２ １９３　Ｖａｌ　Ｓｅ！ｒ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ Δｌａ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｕ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ@Ｍｅｔ　２０８ ２０９　（：Ｌｕ　八Ｓｌｌ　八ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈ ｅ　にｉｎ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌ■普@Ａｓｐ　２２ ４ ２２５　Ｔｙｒ　Ｐｉｋｅ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　ｕｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉ’ｒｏ　ｒ’ ｒｏ　Ｈ（！仁　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ@Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　 ２４０ ２＋１９　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｉｋｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ｒｌ ＋ｃ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　ｒ’ｌ＋ｅ　Ｍｅｔ　Ａｓ＋ｔ　Ｓ■秩@Ｌａｕ　Ｇｌ ｙ　３０４ ３３７　戸口ｕ　Ａｓｐ　１ｌｉｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ｌ’ｈｒ　１．ｃｕ　Ｇ ｉｎ　Ｔｌ＋ｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ@Ｐｈｅ　Ｃ１ｕ　 ３５２ ＦＩＧＵＲＥ　Ｉ　ｃｏｎｔ。

３５３　Ｔｈｒ　にｉｎΔｒｇ　Ｔｈｒ　ＰｒｏΔｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｔ　Ａｓ ｎ　ＬｅｕΔｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＶａｎΔｓｎ　Ｖａ１R６８ ３６９　１１ｅ　Ｐｒｏ　［’ｒｏ　ｌ１ｉｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　八ｒ ３　ＴＩ＋ｒ　Ｖａｌ　Ｍｅｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　工１ｅ　fｉｎ　Ｇｉｎ　３ ８４ ３８５　Ｌｅｕ　Ｍｅｅ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　 Ｓｅｔ　八ｓｐ　Ｉｒ１ｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓ氏@Ｌｅｕ　４００ ４０１　１１ｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　八ｓｉ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　 Ｖ、１１　八ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｘ１■@Ｌｅｕ　４１６ ４１７　Ｌｙｓ　八ｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　 Ｉｌｅ　Ｐｂｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｈａ@Ｌｙｓ　４３２ ４３３　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＧＬｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　 Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｉｎΔｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　kｅｕ　４４８ に４９　Ｇｌｙ　ＶａＬ　八ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　八ｒ＋′！　Ｖｉ Ｌ　Ｍｌ！Ｌ：　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ@Ｓａｒ　Ｇｌｕ　 ４６４ ４６５　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　八ｓｎ　 Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ@Ａｓｎ　４８０ ４８１　Ｔ、ｌｅ　ｐＨｅ　ｌ１ｌｓ　Ｍｅｔ　Ｓｅｔ　Ｌｅｕ　ＬｅｕΔｌａ 　Ｃｙｓ　Ａｈａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＭｅZＡｈａ　４９６ ４９７　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　八ｒ＋３　Ｓｅｔ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ 　Δｒ、ｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａ唐吹@Ｌｅｕ　５１ ２ ５１３　Ｓｅｒ　ＰｈＱ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　ＩＬｅ　Ｌｅｕ　八ｓｎ　Ｖａｌ　 Ｌｅｕ　Δ！Ｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　八１ａ　Ｐｈｅ　Ａｓ吹@Ｐｈｅ　５２０ ５２９　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ＶａＩ　ＩＬｅ　Ｇｌｕ　！ｉｅｒ　Ｐｂｅ　Ｉｌｃ 　Ｌｙｓ　Ａｌａ　にｌｕ　Ｇｌｙ　八ｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈ秩@Ａｒｇ　５４４ ５／＋５　Ｇｌｕ　門ｅ仁　１１ｅ　Ｌｙｓ　１ｌｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　八ｒ ｇ　Ｃｙｓ　（ｉｌｕ　ｌ１ｉｓ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｍｅｅ@Ｇ１．ｕ　Ｓｅｒ 　５６０ ５ＧＩ　ＬｃｕΔｌａ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　ＳｅｔΔｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｃ ｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｓ■秩@５７６ ５７７　Ｌｙｓ　八ｓｐ　八ｒｇ　ＧＬｕ　ＧＬｙ　Ｉ’ｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ 　ｌ１ｌｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　八ｌａ　Ｃｙｓ　Ｐ窒潤@Ｌｅｕ　５９ ２ ５９３　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　１ｌｉｓ 　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｌｅ普@Ｓｅｒ　６０８ ６０９ＰｒｏＶａｌΔｒｇＳｅｒＰｒｏＬｙｓＬｙｓＬｙｓＣ］、ｙＳｅｒＴｈ ｒＴｈｒＡｒｇＶａ工Ａｓｎ５ｅｒ６２４６２５　Ｔｈｒ　Δ１５　Ａｓｎ　Ａ ｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　にｉｎ　八ｌａ　ＴＩ＋ｒ　Ｓｅｒ　八ｌａ　Ｐｈｅ　 Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｉ氏@Ｌｙｓ　６４０ ６／＋ｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｌ＋ｒ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅ ｒ　Ｌｃｕ　ｒ’ｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ＬｙＳＶａｌ　Ｔ凾秩@Ａｒ）；　６ ５６ ６５７　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　八ｒｇ　Ｌｃｕ　八ｓｎ　Ｔｈｒ　 Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ@Ｇｉｎ　６７２ ０７３　１１１ｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　１ｌｉｓ　Ｉｌｅ　Ｉｌ ｅ　Ｔｒｐ　Ｔｌ＋ｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　ｌ１ｉｓ@Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　 ６８８ ６８９　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　に］、ｕ　Ｔｙｒ　（１；ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　八 ｒＲ八ｓｐ　Ａｒｇ　ｌ１ｌｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　hｌｅ　Ｍｅｔ　７ ０４ ＦＩＧＵＲＥ　ｌ　ｃｏｎｔ。

７０５　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌ ｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｘｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　k）Ｉｌ＋　７２０ ７２１　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　ｌｌｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　 Ｌｙｓ　Ａ＋ｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ@Ｇｉｎ　７３６ ７３７　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　八ｒｇ　Ｖａｌ　工１ｅ　Ｉｌｅ　 Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ@ＩＬｅ　７５２ ７５３　１１ｅ　ＶａＩ　ＰｈＱ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　 Ｍｃｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｇｒh　Ｚｌｅ　７６８ ７６９　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ工ｌｅ　Ｐｒｏ　撃Pｌｓ　７［１４ ７８５１１ｅ　Ｐｒｏ　八ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐ ｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　工ｌｅ　oｒｏ　８００ ＳＱＬ　Ｇｌｙ　Ｇｕｙ　Ａｓｎ工１ｅ　Ｔｙｒ　Ｘｌ＠Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｃ ｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ工ｌｅ　Ｓｅ秩@８１６ ８１７　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　［’ｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ 　Ｍｅ　ｊ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｚｇ　Ｓｉｒ　Ａｒｇ　工撃■@Ｌｅｕ　１１ ３２ ８３３　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　（ｌＬｙ 　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＩＪｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙ刀@Ｉｌａ　８４８ 親水伸イ宵 親水性値 親水性値 ＦＩＧＵＲＥ　４ 免疫沈降　ウェスタン プロット法 ＦＩＧＵＲＥ　５ Ａ　Ｄ ＦＩＧＬ’ＲＥ　６ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．０．７５より大きい全アミノ酸配列の平均親水性および、その配列中の等級 ＩＩＩのアミノ酸数と等しいか、もしくはより大きい等級Ｉのアミノ酸数をもつ 、あるタンパク質のアミノ酸配列から選択された少なくとも１０アミノ酸を含む 、そのタンパク質に対する抗体の生産のための合成ポリペプチド抗原。 ２．０．７５より大きい全アミノ酸配列の平均親水性および、その配列中の等級 ＩＩＩのアミノ酸数より大きいか、もしくは等しい等級Ｉおよび等級ＩＩのアミ ノ酸数をもつ、あるタンパク質から選択された少なくとも１０アミノ酸を含む、 そのタンパク質に対する抗体の生産のための合成ポリペプチド抗原。 ３．請求項１および請求項２の抗原群から選択されるポリペプチド抗原の少なく とも１つによって生産される抗血清。 ４．請求項１および請求項２の抗原群から選択されるポリペプチドに応答して生 産されるＩｇＧ抗体産物。 ５．０．７５より大きい全アミノ酸配列の平均親水性および、その配列中の等級 １ＩＩのアミノ酸数と等しいか、もしくはより大きい等級Ｉのアミノ酸数をもつ 、推定Ｒｂタンパク質アミノ酸配列から選択された少なくとも１０アミノ酸を含 む、網膜芽腫遺伝子産物に対する抗体の生産のための合成ポリペプチド抗原。 ６．担体タンパク質と結合した請求項５の合成ポリペプチド抗原。 ７．請求項５および６のポリペプチド抗原の少なくとも１つによって生産される 抗血清。 ８．請求項５および６のポリペプチドに応答して生産される、網膜芽腫遺伝子産 物に対して免疫特異的なＩｇＧ抗体。 ９．０．７５より大きい全アミノ酸配列の平均親水性および、その配列中の等級 ＩＩＩのアミノ酸数より大きいか、もしくは等しい等級Ｉおよび等級ＩＩのアミ ノ酸数をもつ、推定Ｒｂタンパク質アミノ酸配列から選択された少なくとも１０ アミノ酸を含む、網膜芽腫遺伝子産物に対する抗体の生産のための合成ポリペプ チド抗原。 １０．請求項９のポリペプチド抗原の少なくとも１つによって生産される抗血清 。 １１．請求項９のポリペプチドに応答して生産される、網膜芽腫遺伝子産物に対 して免疫特異的なＩｇＧ抗体。 １２．担体タンパク質と結合した請求項９の合成ポリペプチド抗原。 １３．請求項１２のポリペプチド抗原の少なくとも１つによって生産される抗血 清。 １４．請求項１２のポリペプチドに応答して生産される、網膜芽腫遺伝子産物に 対して免疫特異的なＩｇＧ抗体。 １５．担体タンパク質結合アミノ酸を含まない、推定Ｒｂタンパク質アミノ酸配 列から選択された少なくとも１０アミノ酸、０．７５より大きい全アミノ酸配列 の平均親水性および、その配列中の等級１ＩＩのアミノ酸数より大きい等級Ｉの アミノ酸数を、その配列に加えられた担体タンパク質結合可能なアミノ酸と共に 含む、網膜芽腫遺伝子産物に対する抗体の生産のための合成ポリペプチド抗原。 １６．請求項１５のポリペプチド抗原の少なくとも１つによって生産される抗血 清。 １７．請求項１５のポリペプチドに応答して生産される、網膜芽腫に対して免疫 特異的なＩｇＧ抗体。 １８．担体タンパク質結合アミノ酸を含まない、推定Ｒｂタンパク質アミノ酸配 列から選択された少なくとも１０アミノ酸、０．７５より大きい全アミノ酸配列 の平均親水性および、その配列中の等級ＩＩＩのアミノ酸数より大きいか、もし くは等しい等級Ｉおよび等級ＩＩのアミノ酸数を、その配列に加えられた担体タ ンパク質結合可能なアミノ酸と共に含む、網膜芽腫遺伝子産物に対する抗体生産 のための合成ポリペプチド抗原。 １９．請求項１８のポリペプチド抗原の１もしくは複数によって生産される抗血 清。 ２０．請求項１８のポリペプチドに応答して生産される、網膜芽腫遺伝子産物に 対して免疫特異的なＩｇＧ抗体。 ２１．下記の配列： 【配列があります】 からなる群のアミノ酸配列から選択される、網膜芽腫遺伝子産物に対する抗体の 生産のための合成ポリペプチド。 ２２．請求項２１のポリペプチドによって生産される抗血清。 ２３．請求項２１のポリペプチドに応答して生産される、Ｒｂ遺伝子産物に対し て免疫特異的なＩｇＧ抗体。 ２４．請求項２３の抗体であって、その抗体の存在の検出のための標識と結合し た抗体。 ２５．免疫組織化学標識と結合した請求項２３の抗体。 ２６．担体タンパク質と結合した請求項２１のポリペプチド。 ２７．請求項２６のポリペプチドによって生産される抗血清。 ２８．請求項２６のポリペプチドに応答して生産されるＩｇＧ抗体。 ２９．ポリペプチド配列が請求項２１に列挙された配列に対して８０％のアミノ 酸相同性を保持する、網膜芽腫遺伝子産物に対する抗体の生産のための、請求項 ２１の合成ポリペプチド。 ３０．請求項２９のポリペプチドによって生産される抗血清。 ３１．請求項２９のポリペプチドに応答して生産される、Ｒｂ遺伝子産物に対し て免疫特異的なＩｇＧ抗体。 ３２．請求項３１の抗体であって、その抗体の存在の検出のための標識と結合し た抗体。 ３３．免疫組織化学標識と結合した請求項３１の抗体。 ３４．担体タンパク質と結合した請求項２９のポリペプチド。 ３５．請求項３４のポリペプチドによって生産される抗血清。 ３６．請求項３４のポリペプチドに応答して生産される、Ｒｂ遺伝子産物に対し て免疫特異的なＩｇＧ抗体。 ３７．請求項３６の抗体であって、その抗体の存在の検出のための標識と結合し た抗体。 ３８．免疫組織化学標識と結合した請求項３６の抗体。 ３９．少なくとも１０アミノ酸を含む、遺伝子産物アミノ酸配列の同定： ０．７５より大きい平均親水性からなる配列の分析；アミノ酸の溶解度に関する 、その配列の分析；（１）０．７５より大きい平均親水性および、等級ＩＩＩの アミノ酸数と等しいか、もしくはより多い等級１のアミノ酸、（２）０．７５よ り大きい平均親水性、等級ＩＩＩのアミノ酸数より大きいか、もしくは等しい等 級１および等級ＩＩのアミノ酸数、（３）０．７５の平均親水性、内部担体タン パク質結合アミノ酸の欠如および、担体タンパク質結合能をもつアミノ酸のその 配列への付加を伴う等級ＩＩＩのアミノ酸数と等しいか、もしくはより大きい等 級Ｉのアミノ酸数、および（４）０．７５の平均親水性、内部担体タンパク質結 合アミノ酸の欠如および等級ＩＩＩのアミノ酸数より大きいか、もしくは等しい 等級Ｉおよび等級ＩＩのアミノ酸数、の配列群から得られる、少なくとも１０ア ミノ酸を伴うアミノ酸配列の選択；および内部担体タンパク質結合アミノ酸を欠 く選択した配列への、担体タンパク質結合能をもつアミノ酸の付加の操作からな る、タンパク質に対する合成ポリペプチド抗原の選択法。 ４０．タンパク質に対して免疫特異的なＩｇＧ抗体を選択するための、動物の免 疫化、抗血清の回収およびＩｇＧ分画の精製の操作を含む請求項３９の方法。 ４１．請求項４０の方法によって生産される抗体。 ４２．請求項４０の方法によって調製される抗体であって、該抗体の存在の検出 のための標識と結合した抗体。 ４３．免疫組織化学標識と結合した、請求項４０の方法によって調製される抗体 。 ４４．少なくとも１０アミノ酸を含む、Ｒｂ遺伝子産物アミノ酸配列の同定； ０．７５より大きい平均親水性からなる配列の分析；アミノ酸の溶解度に関する 、その配列の分析；（１）０．７５より大きい平均親水性および、等級ＩＩＩの アミノ酸数と等しいか、もしくはより多い等級Ｉのアミノ酸、（２）０．７５よ り大きい平均親水性、等級ＩＩＩのアミノ酸数より大きいか、もしくは等しい等 級Ｉおよび等級ＩＩのアミノ酸数、（３）０．７５の平均親水性、内部担体タン パク質結合アミノ酸の欠如および、担体タンパク質結合能をもつアミノ酸のその 配列への付加を伴う等級ＩＩＩのアミノ酸数と等しいか、もしくはより大きい等 級Ｉのアミノ酸数、および（４）０．７５の平均親水性、内部担体タンパク質結 合アミノ酸の欠如および等級ＩＩＩのアミノ酸数より大きいか、もしくは等しい 等級Ｉおよび等級ＩＩのアミノ酸数、の配列群から得られる、少なくとも１０ア ミノ酸を伴うアミノ酸配列の選択；および内部担体タンパク質結合アミノ酸を欠 く選択した配列への、担体タンパク質結合能をもつアミノ酸の付加の操作からな る、Ｒｂ遺伝子産物に対する合成ポリペプチド抗原の選択法。 ４５．網膜芽腫遺伝子産物に対して免疫特異的なＩｇＧ抗体を選択するための、 動物の免疫化、抗血清の回収およびＩｇＧ分画の精製の操作を含む請求項４４の 方法。 ４６．請求項４５の方法によって調製された抗体であって、該抗体の存在の診断 的検出のための標識と結合した抗体。 ４７．請求項４５の方法によって調製された抗体であって、該標識が免疫組織化 学標識である抗体。