JPH0381299A - ほぼ純粋な腫瘍抗原 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は特定のモノクロナール抗体と結合することがで
きる腫瘍−会合した抗原を見出し単離したことに関する
。 腫瘍−会合した細胞表面抗原に対するモノクロナール抗
体の結合に関して種々調査が行われてきた。新生物細胞
による腫瘍抗原の優先的表現はヘルストレイム等による
アコンプリツシュメンツ・イン・ケンサー・リサーチ、
　１９８４　　プライス・イヤー、ジェネラル・モータ
ーズ・ケンサー・ファンデエーション（フォートナー・
アンド・ローズ・エズ６）第２１６〜２４０頁（１９８
５）およびライスフエシア・オン・モレキュラー・アン
ド・セルリュラー・バイオロジイ・ニュー・シリーズ、
第２７巻（１９８５）において一般的に論ぜられている
ように、抗原を診断および治療の手段として使用するこ
とを可能にする。 従来の調査によると、抗体サブクラスのＩｇＧｘａおよ
び１ｇＧ３は、腫瘍の治療において特別の約束を持つ。 この理由はこれ等のものがリンパ球または補体の存在下
で抗体−依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）をとりなすことが
できるからである。例えばこれ等の抗体のサブクラスを
ＡＤＣＣをとりなすのに使用することは、シアーズ等に
よりランセット１　：　７６２〜７６５（１９８’２）
およびホウトン等によりブロク・ナトル・アカド・サイ
、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）
　ＵＳＡ８２　：　１２４２〜１２４６（１９８５）に
記載されている如くヒト腫瘍を有するヌード　マウスお
よびラット並びにヒト癌患者で示されている。 本発明は一部分では免疫グロブリン　タイプＩｇＧ２．
である「Ｌ６」と称せられるモノクロナール抗体を含む
Ｌ６ｍＡｂは人間の肺、結腸、胸および卵巣の癌並びに
黒腫の表面エピトープに結合することが示された。ヘル
スト　レイム等、ブロク・ナトル・アカド・サイ、　Ｕ
ＳＡ　　８３　：　７ｃ５９〜７０６３（１９８３）。 従ってＬ６は腫瘍の治療および診断に対して特別に有望
である。特にこの理由はＬ６が新生物細胞を含む一定の
細胞を標的とする性能およびけっし類においてＡＤＣＣ
腫瘍細胞崩壊活性を表わす明らかな作用を示すからであ
る。 ここに記載するように本発明はＬ６モノクロナール抗体
が結合する特定の抗原を見出し、単離し、特徴づけたこ
とを含む。 本発明は一般に、特定のモノクロナール抗体に対する抗
原を分離し生成することを含む。特に「Ｌ６」として知
られているモノクロナール抗体はＬＸ−１ヒト肺腫瘍細
胞の細胞表面に表れる腫瘍−会合抗原に結合することが
示された。Ｌ６はまたラットに異種移植されたＬＸ−１
腫瘍細胞の表面にも結合スル。バソプレッシンおよびオ
キシトシン抗血清を使用する二重標識免疫組織化学の実
験は、視床下部のオキシトシンおよびバソプレッシン−
生成ニューロンにおけるＬ６抗原エピドームの局在を確
証した。これらの視床下部細胞において、エピトープは
、オキシトシンおよびバソプレッシンが軸索輸送された
分泌蛋白質であるという事実に従って細胞質であるよう
である。ウェスターンプロット解析により、ＬＸ−１腫
瘍細胞膜上のＬ６−免疫反応性物質がニューロフィシン
に関係していることおよびエピトープがオキシトシンお
よびバソプレッシンとそれぞれ会合したペプチドである
ニューフィシンＩおよび■により共有されるアミノ酸配
列を有することが確認された。ここで示す情報は癌組織
を診断し治療するため設計された方法を見出し履行する
上で有用である。 更に、ＬＸ−１細胞膜上のＬ６抗原は４５ｋｄバンドに
制限され、この場合分子量はイムノアフィニティークロ
マトグラフィー後ゲル電気泳動を介して測定される。こ
のバンドはＬ６と免疫反応するだけでなく、抗バソプレ
ッシンおよび抗ブロープレツソフイシン（ｐｒｏ−ｐｒ
ｅｓｓｏｐｈｙｓ　ｉｎ　）抗体と免疫反応する。 ４５ｋｄバンドのアミノ酸末端配列はヒトプロープレッ
ソフィシンのＣｙ　ｓ　３３の代わりにＬＸ−１抗原に
おいてＡｒｇ３３残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を用い、ヒト
　プロープレッソフィシンのＮ−末端を有する２１−ア
ミノ酸相同を示した。 ラットのブロープレッソフィシンのＣ−末端に３０−　
マー（３０−ｍａｒ）を伴うＬＸ−１ｍＲＮＡのノザン
法は、対応する視床下部ｍＲＮＡより約２５０ｂｐ大で
ある約１０００ｂｐのバンドを示した。同じプローブを
用いＬＸ−１腫瘍を有するヌードラットの系内ハイブリ
ット形成は、ラットの視床下部および異種移植したＬＸ
−１腫瘍細胞における特異のハイブリッド形成を示した
。 従ってＬＸ−１細胞は、細胞膜に特に存在するＬ６と免
疫反応するブロープレッソフイシン様蛋白質を有する。 従って本発明の目的は、Ｌ６モノクロナール抗体が結合
する純粋な腫瘍抗原を提供することにある。 本発明の他の目的は新生物の特徴付けおよび処理に使用
するのに適する抗体／抗原系を提供することにある。 ＬＸ−１ヒト肺の腫瘍細胞の二一一口フィシン　ペプチ
ド配列内のＬ６抗原エピトープが若干の方法により特徴
付けられた。 Ｌ６モノクロナール抗体が生成され、ＬＸ−１腫瘍異種
移植片を有するヌードラットにおける視床下部領域に結
合することが見出された。系統的に投与したモノクロナ
ール抗体は、脳の毛細管内皮細胞間の接合面を透過する
ことができないので、通常モノクロナール抗体は脳に入
らない。この問題は、一般にニューウェルト、インパク
ト・オブ・ザ・ブラッド−プレイン・バリア（第１およ
び２巻）、プリーナム・プレス、ニューヨーク（１９８
９）に記載されているように、脳血液関門（ＢＢＢ）を
動脈内高滲透性剤で一時的に崩解させることにより克服
された。 ここで使用する特徴付は方法は、二重標識実験を含み、
Ｌ６が結合する細胞の種類およびＬ６の結合を示すよう
な細胞内または細胞−ヒの特定の位置を決定するのに役
立つ免疫組織研究を含む。更に、ウェスターン　プロッ
ト解析を、Ｌ６が結合するようになった抗原の存在を特
徴づけるために行った。 更に、ノザン法および系内のハイブリット形成の研究を
抗原を特徴づけるために行った。最後にアミノ酸の配列
決定を純粋の抗原に使用して（エドマン分解）　ＬＸ−
１腫瘍抗原に若干類似する他の抗原と部分的に比較をす
るため精製したＬＸ−１腫瘍抗原のアミン末端の配列を
決定した。 本発明を次の実施例につき説明する。 次の実施例はＬＸ−１腫瘍抗原を単離し、精製し、特徴
づけるのに使用する上記および他の方法に関して必要な
詳細を説明する。 失塵狙土 Ｌ６モノクロナール抗体（ｍＡｂ）は免疫グロブリンタ
イプＩｇＧ、、である。これを培養したヒト肺腺癌細胞
で免疫にしたＢＡＬＳ／ｃマウスから誘導した肺臓細胞
の融合により生成するハイブリドーマにより生成した。 マウスＮ５−１骨髄腫細胞（腫瘍遺伝子、ジートル（Ｓ
ｅａｔｔｌｅ）、ＷＡ）を融合相手として使用した。Ｌ
６ｍＡｂはこれまでにヒトの肺、胞および結腸癌におい
て表われた細胞表面抗原を認知することが示された。ヘ
ルストレイム、ケンサー・レス。 ４６　：　３９１７〜３９２３（１９８６）。更にヘル
ストレイム等によりブロク・ナト・アカド・サイ、ＵＳ
Ａ　　８３ニア０５９〜７０６３（１９８６）で論ぜら
れているように、Ｌ６ｍＡｂはヒトのリンパ球または血
清の存在下でＬ６−抗原−陽性腫瘍細胞の崩壊を導くこ
とが示された。 ここに記載する肺癌細胞系ＬＸ−１はヒト肺癌から確立
された。腫瘍細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地で成長させ
た（ギブコ社グランド　アイランド、ニューヨーク）。 ナショナル・ケンサー・インスチチュートからの雄の１
２週令ヌード　ラットを右大脳半球に１０μｌのＬＸ−
１腫瘍細胞（８Ｘ１０’細胞／−）を脳内接種した。、
また１０匹の雄親のロング−エバンス（Ｌｏｎｇ−εｖ
ａｎｓ）ラットと５匹の雄親のホモ接合ブラットルボＤ
　（ＢｒａｔｔＪｅｂｏｒｏ）ラットの尿崩症にかかっ
たもの（約２５０〜３００ｇの重さ）につき研究をした
。 次いでラットをベンドパルビタール　ナトリウムで麻酔
しく６０■／ｋｇ体重ｉ、ｐ）　、Ｏ１９％食塩水次い
で４％水冷パラホルムアルデヒド緩衝液を胃を通る穿刺
により注入した。脳を取出し、冠状平面（ｃｏｒｏｎａ
ｌ　ｐｌａｎｅ）にブロックして（ヌードラットの）腫
瘍を有する領域および視床下部または（ロング　エバン
スおよびＨｏＤＩラットの）視床下部領域を含ませた。 また供試ラットの脳下垂体を取出して免疫化学分析した
。脳および脳下垂体組織を２４時間４％パラホルムアル
デヒド溶液中で後固定した。 試験に使用したヒト視床下部組織を死体検査で得、冠状
平面にブロックして視索上積および室傍核（それぞれＳ
ＯＳおよびＰＶＮ）を含ませ、水冷１０％ホルマリン緩
衝液中に数日間浸漬固定した。 多数の免疫細胞化学実験を、脳に見出される特定細胞に
対するＬ６　ｍＡｂの選択的結合挙動を明らかにするた
め行った。免疫細胞細胞化学を先ずシラン化ガラス（ｓ
ｉｌａｎａｔｅｄ　ｇｌａｓｓ）スライド上に塗布した
培養ＬＸ−１腫瘍細胞の細胞遠心分離した試料およびラ
ットとヒトの視床下部組織について行ってこれ等の細胞
および組織に対するＬ６　ｍＡｂの結合挙動を研究した
。上記スライド上で動かなくした腫瘍細胞を４％パラホ
ルムアルデヒド中に１０分間浸漬することにより固定し
た。ヌードラットの脳およびラット／ヒトの視床下部の
腫瘍を有する領域をビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｏｍ）
　　（オフスフオード・インスッルメンツ・ベツドホー
ド、ＭＡ）次いで適当な固定で１００μｍにつき連続的
に切断した。スライドに固定した腫瘍細胞および自由遊
淫する組織切片をトリス緩衝液（０，０５Ｍ、　０．９
％ＮａＣＩ！金含有ｐＨ７，６）で洗浄した。然し後、
これ等をＬ６モノクロナール抗体で免疫細胞化学的に標
識した。この段階で用いた基本的標識技術は、ニラバー
と３１〜２１５頁（１９８９）に記載されているように
、ビオチニル化プロティンＡおよびアビジン−ビオチン
ペルオキシダーゼ（ＡＢＣ，ベクター・ラボラトリーズ
、バーリンガム、カリフォルニア）を用いた。 特に、組織にＬ６　ｍＡｂを培養しく５０μｇ／７．　
４°Ｃで一夜）、次いでビオチニル化プロティンＡ　（
ベクター・ラボラトリーズ、バーリンガム、カリフォル
ニア）（１：４００希釈、常温で４５分）およびＡＢＣ
複合体（１：１０００希釈常温で１時間）と反応させた
。ＡＢＣ複合体を、使用する５分前に、ベクター・ラボ
ラトリーズ、バーリンガム、カリフォルニア）より市販
されているベクタスティンＡＢＣキットに入っているア
ビジン（Ａｖ　ｉｄ　ｉｎ　）ＤＨとビオチニル化ペル
オキシダーゼの１　：　１０００希釈液の等部を一緒に
混合することにより調製した。 然る後、試料を１５ｍｇｍ％の３，３′−ジアミノベン
ジンテトラヒドロクロリド（シグマ・コーポレーション
、セントルイス、ミズーリ）で処理した。 褐色の反応生成物が形成された。次いで腫瘍細胞（スラ
イド上の）を脱水し、キシレンで処理し、組織学的分析
を行うためカバースリップした。組織の断片をゼラチン
被覆スライド上にのせ、脱水し、キシレンで処理し、ま
たカバースリップ下にのせた。 処理した試料の試験により、Ｌ６　ｍＡｂがヌードラッ
トの脳における視床下部の視索上積および室傍核の領域
において、脳内異種移植したＬＸ−１腫瘍細胞に結合し
たことが示された。腫瘍移植片とのＬ６の免疫反応性は
ＬＸ−１腫瘍細胞の表面に専ら制限された。同様のパタ
ーンの表面染色が免疫組織化学染色前シラン化ガラス　
スライド上に細胞遠心分離された培養ＬＸ−１細胞に観
察された。 然し、視床下部の摸索および室傍ニューロンのＬ６免疫
反応性は近位樹状突起および軸索プロセスにのびる細胞
質に局限された。軸索染色は玉状外観を有し、下垂体の
複葉で終った。室傍および摸索ニューロン（およびこれ
らの軸索プロセス）の細胞質染色の同様のパターンがヒ
ト視床下部に見られた。更に、豚のニューロフィシンに
対するポリクロナール抗血清を用いた免疫組織学（ＩＣ
Ｎイムノバイオロジカルス、リスル（Ｌｉｓｌｅ）ＩＬ
）はラットの室傍および摸索ニューロン系において同様
のパターンの染色を示した。豚のニューロフィシンポリ
クロナール抗血清は、ラットの組織にオキシトシン−ニ
ューロフィシンおよびバソプレッシンニューロフィシン
を認め、１　：　１０００の希釈で使用された。この結
果はＬ６　ｍＡｂがオキシトシン−ニューロフィシンお
よびバソプレッシンニューロフィシンの両者に共通の抗
原エピトープを認めることを示した。この知見は、ラッ
トおよびヒト視床下部におけるＬ６標識した核周部が視
索系の腹側および背部面並びに室傍系の中心／周辺領域
の両者に分布されていたことを観察したことにより支持
された。 バソプレッシン、オキシトシンまたはこれ等の担体蛋白
質にニューロフィシン）に対しＬ６モノクロナール抗体
およびポリクロナール抗体による二重染色を使用する免
疫組織化学研究を、ヌードラット、普通のラットおよび
ＨｏＤＩラットの視床下部の選定した部分について行っ
てＬ６免疫反応性ニューロンのバソプレッシンおよびオ
キシトシン　ニューロン系に対する正確な関係を決定し
た。以下に述べる免疫細胞化学操作に使用するバソプレ
ッシンおよびオキシトシン抗血清を、うさぎで発生させ
たが、一般にワトソン等によりサイエンス２１６：８５
〜８７（１９８２）に記載されている。 前にＬ６　ｍＡｂと免疫反応させたヌードラット、普通
のラットおよびＨｏＤＩラット視床下部の選定した部分
を更にバソプレッシン、オキシトシンまたはこれ等の担
体蛋白質にニューロフィシン）に対シ免疫反応させた。 こり等の組織を、第２抗原に対し青色標識化を得るため
他の色原体としてベンジジン　ジクロリドを使用し、上
記ホルモンに特有のポリクロナール抗体を用いて培養し
た。 二重標識した組織部分を調べた結果、Ｌ６モノクロナー
ル抗体（ｍＡｂｓ）が室傍系の中心部および周辺部とに
おいてニューロンに結合し、一方Ｌ６−ボジテイブニユ
ーロンの約半分がバソプレッシン免疫反応性を表わした
。視索系において、Ｌ６−反応性ニューロンは核の背部
および腹部の領域を占有し、腹部ニューロンのみがバソ
プレッシンに対する付加的免疫反応性を示した。隣接し
たＬ６−染色した視床下部の部分を二重標識技術の第２
反応体としてオキシトシン抗血清を用いて培養した場合
、バソプレッシン抗体で見られるようにならなかったＬ
６−反応体ニューロンがオキトシン免疫反応性を表わす
ことが見出された。 更に、ＨｏＤ　ｌラットの視床下部の免疫染色は室傍ニ
ューロンおよび視索ニューロンの５０％だけにＬ６−免
疫反応性を示した。この結果は、ＨｏＤＩプロープレッ
ソフィシン遺伝子のニューロフィシン符号付はドメイン
における単一ベース（ｂａｓｅ）削除はバソプレッシン
およびその関連するニューロフィシンの翻訳を妨げる。 シュマール、ネイチャー　並＝７０５〜７０９（１９８
４）。ＨｏＤＩの視床下部におけるＬ６−免疫標識した
ニューロンは室傍系の周辺領域および視索系の背面部に
局限されるようである。また、Ｌ６−免疫反応性は室傍
および視索ニューロンのオキシトシンーアージック（ｅ
ｒｇｉｃ）サブ　ボブニレ−ジョン内に専ら残留するこ
とが見出された。 次に、モノクロナール抗体の優先的結合を示す性能に対
するＬ６　ｍＡｂの予備吸収の影響を研究するため実験
を行った。特に６容量の冷蒸留水で洗浄した１（Ｗのア
フィゲル−１Ｏを、豚のニューロフィシン（最終濃度１
５ｍｇ／７ｎｌ）　、バソプレッシン（１ｍｇ／ｍＡ’
）若しくはオキシトシン（１ｍｇ／ｙｎｌ　）を添加し
た８０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する１０７ｎｌの０．■
Ｍヘペス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７，５）溶液（緩衝液Ａ
）を用いて４時間４°Ｃでかきまぜ乍ら培養した。ゲル
上のあらゆる残留活性位置を、１Ｍのエタノールアミン
−ＨＣｌ（ｐＨ３，０；　０．１７ｒｌｌ／７ｒＬｌゲ
ル）を添加し４℃で回転させ乍ら１時間ブロックした。 次いでゲルを００２８０がバックグラウンド　レベルに
達するまで緩衝液Ａで洗浄した。結合効率を業界で知ら
れており、またブラッドフォート、アナル、バイオケム
、７２：２４８〜２５４（１９７６）に記載されている
方法を用いて洗浄中量白質の濃度をはかることにより測
定した。 結合したアフィゲル−ＩＯをソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ
）ＳＳ−３４０−夕で１２００Ｘｇで１５分間遠心分離
し、上層液をデカンテーション廃棄した。次いでゲルを
−夜４℃で回転させながらＣ６−モツクロナール抗体（
２００ｍｇ／ｍｌ　）を用いて培養した。次いでゲル−
抗体懸濁液を上述の如く１．１２００　Ｘ　ｇで１５分
間再遠心分離し、上層液（吸収された抗体）をデカンテ
ーションしウェスターン解析および免疫細胞化学に用い
た。結合したアフィゲル−１０を夫々１０容量の０．１
Ｍのグリシン（ｐＨ３，０）　、２５ｍＭのＮａＨＰＯ
ｉ　（ｐＨ８，５）、最後に緩衝液Ａで洗浄することに
より再生しｔ二。 前吸収試験結果は、合成アルギニンバソプレッシン若し
くはオキントシンー結合アフィゲル−１０（８０ｕｇ／
ｒ／ｄ！、）によるＣ６　ｍＡｂｓの固相吸収が視床下
部免疫反応性に対する効果がないことを示した。 然しＣ６モノクロナール抗体のアフィゲル−１０に結合
した豚のニューロフィシンの等モル量による前吸収は、
視床下部の免疫反応性を完全に取り除いた。 前記試験に加えて、エラスターンプロット分析を以下に
記載する如く行ってＣ６ｍＡｂが結合する抗原を明らか
にした。 蛋白質およびポリペプチド試料を１×１ミリ（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ）試料緩衝液中で可溶化し、１００℃に５分間加
熱した。次いで試料を、ファーゲル等によリアナル、バ
イオケム、二二３６８〜３７９（１９８７）に記載され
ている如くトリシン−５Ｏ３−ＰＡＧＥ系を用い１２．
５％全アシルアミド（アシルアミド：ビスアクリルアミ
ド＝　ｌ　：　ｉ５．５）で電気泳動にかけた。 ウェスターンプロット分析をローゼバウム等によりアナ
ル、バイオケム、旦：２５０〜２５７（１９８９）に記
載されている如く行った。簡単に述べると電気泳動後、
得られたゲルを２０％（Ｖ／Ｖ）グリセロールを含有す
る５０ｍＭのトリス（ｐＨ７，４）中で４回１０分ずつ
洗浄することにより復元した。次いで蛋白質を、１０ｍ
ＭのＮａＨＣＯｓ、　３ｍＭのＮａｚＣＯｓ　（ｐＨ１
０゜０）の２０％（Ｖ／Ｖ）のメタノール溶液中でＴＥ
−４２トランスファー装ｆｔ　（カリフォルニア州すン
フランシスコのへファー社製）を用い１アンペア（ａｍ
ｐ）で１時間電気泳動　　によりニトロセルロースに移
した。 −夜乾燥した後ニトロセルロース「プロット（ｂｌｏｔ
）　、Ｊを０．５％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド蒸
気中７０°Ｃで４時間固定してペプチドを固定した。 プロット上の非特異結合位置を、０．５ＭのＮａＣ１，
０，１％（Ｖ／Ｖ）　　トウイーンー２０および０．０
２（ｖ／ｖ）ＮａＮｓを含む２０ｍＭのトリス（ｐＨ７
，５）（ＴＴＢＳ）中に３％（ｖ／ｖ）ゼラチンを含む
溶液でブロックし、次いでＴＴＢＳ中で３回各５分洗浄
した。次いでプロットを０．１％（Ｗ／Ｖ）の再結晶し
た牛の血清アルブミンを含むＴＴＢＳ中で第１抗体を用
い常温で２〜４時間培養し、ＴＴＢＳ中で３回各５分洗
浄した。次いでプロットを、０．１％（Ｗ／Ｖ）の再結
晶した牛の血清アルブミンを含むＴＴＢＳ中でビオチニ
ル化プロティンＡを用いて２５℃で１時間培養し、ＴＴ
ＢＳ中で３回各５分間洗浄した。プロットを、エクスト
ラアビジン−アルカリ　ホスファターゼ（１：３０００
希釈）を含むＴＴＢＳ中で４５分間培養し、ＴＴＢＳ中
で３回各５分間洗浄し、清浄な皿に移した。次いでｐ−
ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（０，３３■／−
）と５−ブロム−４＝クロル−３−インドリル−ホスフ
ェ−）　（０，１６５■／−）の混合物を０．１ＭのＮ
ａＣ１，５ｍＭのＭｇＣ１ｔおよび０．５％（Ｖ／Ｖ）
　　）ウィーン　−２０を含有する０゜１Ｍのトリス（
ＰＨ９，５）に添加した溶液中でプロットを発見させる
ことによって固定したポリペプチド物質を検出した。Ｌ
６モノクロナール坑体のＦ（ａｂ’　）２のフラグメン
トを用いて培養したプロットをアルカリホスファクター
ゼー結合ヤギ坑マウスＩｇＧＦ（ａｂ’　）２　（１：
　５００希釈）と９０分間反応させ、ＴＴＢＳ中で３回
各５分間洗浄した。次いでこれ等を前述の如く、ｐ−ニ
トロブルーテトラゾリウムクロリド１５−ブロム−４−
クロル−３−インドリル−ホスフェート中で発現させた
。 ウェスターンプロット分析によりポリクロナール坑ブタ
ニューロフィシン（これはニューロフィシンＩおよびニ
ューロフィシン■と免疫反応する）が処理したニューロ
フィシン■およびニューロフィシンＩ並びにニューロフ
ィシン■調剤中に存在する前駆体ペプチド　プロープレ
ッソフィシンと免疫反応を示した。またこの分析は、Ｃ
６ｍＡｓがニューロフィシン■およびニューロフィシン
エとの免疫反応性により示されるように、２種の担体蛋
白質における共有配列を認めることを示した。これ等の
結果はＬ６がブロープレッソフィシンのニューロフィシ
ン　ドメインを認めるがブロープレツソフィシンのＣ−
末端グリコペプチドを認めないことを示す。 Ｌ６ｍＡｂのドメイン−特異結合は、免疫反応性を変え
なかったＬ６ｍＡｂを用いる免疫プロッティングおよび
電気泳動前にニューロフィシン■をグリコペプチターゼ
Ｆ酵素と反応させることにより確かめられた。Ｌ６と同
様のクラスおよびサブタイプのマウスのモノクロナール
抗体（ＰＬ、　１７）を用いプロットラフローブするこ
とは、ニューロフィシン■またはニューロフィシン■の
いずれかに対しての結合を示さず、これによりニューロ
フィシンに結合するＬ６の特異性を示す。 更に、ニューロフィシンに対するＬ６の免疫反応性の特
異性は、Ｌ６ｍＡｂをニューロフィシン結合アフィゲル
−１０を用い予備培養し、上層液を用いて免疫プロット
においてニューロフィシン■およびＩをプローブするこ
とにより確かめられた。この結果ニューロフィシン■お
よびニューロフィシン■の両者に対するすべての免疫反
応性が実際に取り除かれた。 ＬＸ−１腫瘍細胞に対するノーザン分析および系内のハ
イブリッド形成を、合成したヒトプロープレッソフィシ
ン　オリゴヌクレオチド　プローブを用いて行った。こ
れ等の研究は、これ等の細胞におけるブロープレッソフ
ィシンｍＲＮＡの表現を示した。 他の実験を、ＬＸ−１腫瘍細胞の細胞膜におけるブロー
プレッソフィシンの存在を確かめるために行った。Ｌ６
ｍＡｂアフィニアフィニティーＸ−１細胞膜のウェスタ
ーンプロッティングにより確認試験を行った。しかる後
、ポリクロナール抗ブロープレッソフィシン坑体を使用
しブロービングを完成した。 特に、ＬＸ−１細胞（約１０８）を５ｍＭのＥＧＴＡ、
　１ｍＭのＥＤＴＡ、　０．０２％のＮａＮ、および０
．００１　Ｍ　　ＰＭＳＦを含有する１０−の２５ｍＭ
イミダゾール中で均質にした。 等容量の５％トウイーン４０を添加し、均質液を２００
０×ｇで１時間遠心分離した。次いで、上層液を１００
．０００　ｘ　ｇで１時間遠心分離した。次いで、得ら
れたペレットを１■／１ｎｌの蛋白質濃度に再懸濁し、
ツウィツターゲント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）−１４
（７ｍＭ）に添加して３．５ｍＭの最終濃度にした。常
温でＩＯ分間培養した後、可溶化した腫瘍膜を１００，
０００　Ｘ　ｇで１時間遠心分離した。 可溶化膜をスタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａ　ｈ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の１０％原液の１７
５０容量で４℃にて３０分間培養し、次いで１００，０
００　Ｘ　ｇで３０分間遠心分離した。 次に、上層液を２０ｍＭのジメチルピメリミデート（ｄ
ｉｍｅｔｈｙｌｌ）ｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）で架橋さ
れたＬ６／プロティンＡ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）に対するバッチ吸着により、アフィニティー精
製した。０．５ＭのＮａＣＩを含有する５０ｍＭのトリ
ス（ｐＨ８，２）で十分に洗浄し７た後、特異的に結合
した抗原を５０ｍＭのジメチルアミン（ｐＨ１１，５）
で溶離した。溶離した試料を電気泳動にかけ、プロット
（ｂｌｏｔｌＬ、プローブした。 これら同定試験の結果より、ＬＸ−１腫瘍細胞膜におけ
るブロープレッソフィシンの特異的な表現が確かめられ
た。このことは、ブロープレッソフィシンがＬ６が結合
する細胞表面の抗原であることを示す。 本例で述べた試験結果は、Ｌ６　ｍＡｂが脳内に異種移
植したＬＸ−１腫瘍細胞の表面に結合し、かつニューロ
フィシンＩおよびニューロフィシ

【遺伝子配列がありま
す】の配列を認識することを示している。更に、この試
験では視索および室傍系のニューロン内の、ラットおよ
びヒトの視床下部における免疫反応性を示している。し
かし、視床免疫反応性は専ら細胞質にあり、ニューロン
の核層部、それらの隣接樹状突起およびこれら軸索プロ
セスの全長さに限られる。 また、上記試験結果では、二重染色−免疫組織化学によ
り視索および室傍系のバソプレッシンおよびオキシトシ
ン生成ニューロン内におけるＬ６の反応性により示され
るように、Ｌ６　ｍＡｂがニューロフィシンＩおよびニ
ューロフィシンＨに共通の抗原エピトープを認識するこ
とも示している。オキシトシンおよびバソプレッシン双
方の視床下部Ｌ６の免疫反応性をブロックする無能力は
、Ｌ６　ｍＡｂがこれらのノナペプチドのどちらも認識
しないことを意味するものである。この結果は更にＬ６
ｍＡｂによる合成バソプレッシンおよびオキシトシンの
ウェスターンプロット解析によっても実証された。 更に、ＨｏＤＩラットのオキシトシンニューロンにおけ
るＬ６免疫反応性の選択的表現（ブロープレッソフィシ
ン遺伝子における欠失のため、バソプレッシンまたはバ
ソプレッシンニューロフィシンを表現することはできな
い）は、Ｌ６　ｍＡｂ免疫反応性がニューロフィシンに
関係することを示している。 このことは、アフィゲル結合した豚のニューロフィシン
によるモノクロナール抗体の前吸収（ｐｒｅ−ａｂｓｏ
ｒｐｔｉｏｎ）により視床下部のＬ６免疫反応性を完全
に除去することにより確かめられた。 Ｌ６　ｍＡｂによる精製ウシおよびヒトニューロフィシ
ンのウェスターンプロット解析によっても、処理したニ
ューロフィシン１１ニユーロフイシンＩＩおよびプロー
プレッソフィシンに対応するバンドにおいて免疫反応性
が示された。これらバンドの同一性は豚のニューロフィ
シン、ヒトニューロフィシンおよびバソプレッシンに対
する抗血清の付加的使用により確かめられた。 ニューロフィシン■に対する結合の強さはニューロフィ
シンＨに対し観察されたそれよりも実質的に弱く、Ｌ６
　ｍＡｂが優先的にニューロフィシンＩＩおよびプロー
プレッソフィシンに結合する可能性が高められている。 ブロープレッソフィシンの免疫反応性の強さは、処理し
た二二一口フイシンのそれよりも著しく小さいので、プ
ロオキシフィシンに関する反応性は予期し得ない。ブロ
ープレツソフィシンのＣ−末端グリコペプチドドメイン
とのＬ６　ｍＡｂの潜在的交差反応性を排除する上記グ
リコペプチダーゼの研究結果ではまた、ブロープレッソ
フィシンに対するＬ６の優先的な結合を妨げている。更
に、免疫組織化学は、少なくともヒトおよびラットの視
床下部にけおるニューロフィシン■およびニューロフィ
シン■とＬ６　ｍＡｂとの等しい反応性を示している。 あるいはまた、プロオキシフィシンおよび処理したニュ
ーロフィシン■が分子量において９９０　ドルトンだけ
しか相異しないため、両ペプチドはここで述べた電気泳
動の条件において単一の幅広いバンドとして移動し、Ｌ
６　ｍＡｂによりプローブする際、明確なブローオキシ
フィシンバンドの同定を妨げている。 更なる証拠では、Ｌ６とニューロフィシンとの潜在的非
特異的反応性を妨げている。例えば、Ｌ６ｍＡｂとして
同様のサブクラスであるＰ　１．１７モノクロナ一ル抗
体は、ニューロフィシンプロットをプローブするのに使
用した際、免疫反応性を示さなかった。また、Ｐ　１．
１７はしＸ−Ｉ細胞、あるいはヒト視床下部またはラッ
ト視床下部組織の如何なる染色をも示さなかった。更に
、Ｌ６のＦ（ａｂ’　）２フラグメントを用いて免疫プ
ロット（ｉｍｍｕｎｏｂ　ｌｏ　ｔ　）によりヒトおよ
びウシのニューロフィシンをプローブした際、完全なま
まのＬ６　ｍＡｂに対し同様の強度を有する免疫反応性
が観察された。このことは、Ｌ６ｍＡｂ分子のＦ（ａｂ
’　）２部分のニューロフィシンに対する特異的結合を
示しており、これはＦ、、領域での潜在的非特異的結合
を排除したことによるものである。更に、Ｌ６　ｍＡｂ
のアフィゲルに結合したニューロフィシンに対する前吸
収は、ウシニューロフィ、シン■およびニューロフィシ
ンＨに関する全てのＬ６免疫反応性を排除する。アフィ
ゲル−ニューロフィシンに対するＬ６の結合が静電気的
相互作用よりもむしろ特異的抗原−抗体反応によりとり
なされることを確かめるため、Ｌ６　ｍＡｂを、ニュー
ロフィシン結合アフィゲル樹脂で培養する前にポリーＬ
−リジンで前吸収した。塩基性ペプチドのポリーＬ−リ
ジンを用いての静電荷の排除は、Ｌ６−ニューロフィシ
ン結合に影響を及ぼさなくなった。最後に、上述のニト
ロセルロースプロットをパラホルムアルデヒド蒸気に暴
露して、免疫プロット前に蛋白質を固定化した。この操
作はりジン残基上のε−アミノ基を不活性化し、静電的
相互作用を実質的に低減した。 実施例２ 本例においては、ニューロフィシン様前駆体を、ヒト肺
癌細胞系ＬＸ−１から単離して特徴づけた。ＬＸ−１細
胞は、かかる前駆体ペプチドを処理若しくは分泌しない
ようであった。代わりに、該前駆体は、Ｌｘ−１細胞膜
に完全に存在することが観られた。 ＬＸ−１細胞からの抽出物を次の手順により免疫沈降（
免疫精製の型）させた； メゾン　ラボラトリーズ、ウォルセスター、マサチュー
セッツ（ＭＡ）からＬＸ−１細胞を得た。継代した後２
日経て、Ｃ”Ｓ　］−システィンをＬＸ−１に添加（１
ｍＣｉ／１０’細胞）して、通常の培養条件下（３７°
Ｃ；　５％ＣＯ□）２０時間培養した。 ３５３−標識化（ｌａｂｅｌｅｄ　）細胞を、０．１５
ＭのＮａＣ１含む５０　ｍＭのＮａＨｔＰＯ＋　（ｐＨ
７，５）で３回洗浄した。 標識化ＬＸ−１細胞（５Ｘ１０’細胞／ＴＬ！りを、１
０ｍＭのトリスＨＣＩ　ｐＨ８，２，０，１５ＭのＮａ
Ｃｌ、　　１　ｍＭのＥＤＴＡ。 １０−’ＭのＰＭＳＦおよび０．５％（ｖ／ｖ）のノニ
デット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ−４０を含む溶菌緩衝液
に可溶化した。 氷上でＬ５分培養した後、懸濁液を、３０００　Ｘ　ｇ
で１０分間遠心分離し、堆積物を除去し、次いで１００
．００（０ｇで１時間、上層液の遠心を行なった。０，
５ＭのＮａＣ１に上層液を調整し、１１５０容量の１０
％ホルマリン固定したスタフィロコッカス　アウレウス
懸濁液を添加して（３０分間、４８Ｃ）、非特異結合を
除去した。 免疫沈降を行なうため、可溶化ＬＸ−１細胞抽出物（約
５Ｘ１０’細胞／チユーブ）を、ＰＰＹｓｉｎに対する
ＹＬ−３抗体と共に（１：５００の希釈液で）、４°Ｃ
でｌ夜培養した。ＹＬ−３は第１表に示されるヒトＰＰ
Ｙｓｉｎのデカペプチド配列に高められるポリクロナー
ル抗体である。かかる抗体は、特に、免疫組織化学によ
りサルおよびラットの視床下部の室傍核（ＰＶＮ”）お
よび視索上積（ＳＯＮ）並びにウェスターンプロット解
析によりヒトおよびウシ下垂体におけるＮＰ前駆体を標
識することが示された。次いでプロティンＡ−セファロ
ース（５０μｌ）を添加シて、３０分間４°Ｃで培養し
た。エッペンドルフマイクロフユージ（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ　Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で遠心分離を行ない、粒
状物を沈降させた後、ペレットを連続して、０．５Ｍの
ＮａＣｌを含む５０　ｍＭのトリスＨＣ１（ｐＨ８，２
）　、０．１％（ｖ／ｖ）ＳＯ３を含む５０ｍＭ）リス
ＨＣＩ（１）８８．２）　、および０．１％（ｖ／ｖ）
ノニデットＰ−４０を含む１０ｍＭ）リスＨＣＩで洗浄
した。次いで洗浄したペレットを２５ｒ＋＋ＭのＤＴＴ
を含むＩＸ　Ｌａｅｍｍｌｉ（レムリ）試料緩衝液中で
２分間沸騰させ、遠心分離し、上層液を電気泳動にかけ
た。レムリ試料緩衝液は１９７０年のネーチャー（ロン
ドン）２２７；６８０〜６８５のレムリに開示されてい
る。 抽出物の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動を
、レムリ（Ｓｕｐｒａ）に記載しである如く、１２．５
％の固定アクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリ
ルアミド；１：３０）を用いて行なった。ゲルは、コマ
ッシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）で、若
しくはホイケンショーフェン（Ｈｅｎｋｅｎｓｈｏｖｅ
ｎ）およびデルニック（Ｄｅｒｎｉｃｋ）等のエレクト
ロホリシス　！＝１０３〜１１２．　（１９８５）の方
法により、銀で染色した。 ０．５％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０中に可溶化した
細胞膜は、電気泳動にかけコマッシーブルーで染色した
場合、多くのバンドを呈した。細胞膜抽出物は、種々の
抗体でプロットしプローブした場合、比較的弱い免疫活
性を示し、特異腫瘍抗体を、抽出物からｐＨ１１，５で
、５０　ｍＭのジエチルアミンで溶離されるＬ６−免疫
アフィニティーカラムを用いて単離した。次いで中和試
料を電気泳動させて、銀染色により約４５．０００のＭ
２に対応するバンドが得られた。 明らかなＭ、約４２．０００を伴なう極めて弱いバンド
が、４５　ｋｄ蛋白質での共精製で現われた。かかるバ
ンドはＭ、　４５．０００ポリペプチドの蛋白質分解フ
ラグメントであるが、かかる研究において用いた抗体と
免疫活性があると考えられなかった。 次いで、免疫プロットをローゼンバウムらによるアナル
、バイオケム、　　１８３　　：２５０〜２５７（１９
８９）に従い４５　ｋｄフラグメントで行なった。 ４５　ｋｄフラグメントはヒトＰＰＹｓｉｎに対して高
められた抗体化ＹＬ−３との高い反応性を示した。この
抗体はＰＰＹｓ　ｉｎにおける無傷のＬｙｓ−Ａｒｇ切
断部位とのみ反応するので、ＹＬ−３と４５　ｋｄフラ
グメントとの免疫反応性は、Ｌ６−単離ＬＸ−１表面の
抗原がＰＰＹｓｉｎと関係することを強く示唆した。Ｌ
６　ｍＡｂは抗原に結合したが、同じサブ−タイプＬ６
　（Ｉｇ　Ｇ、）のｍＡｂ　Ｐ　１．１７　（腫瘍遺伝
、ワシントン、シアトル）は如何なる免疫反応性をも示
さなかった。ポリクロナール抗体をバソプレッシンに結
合させる４５ｋｄバンドの能力より、４５　ｋｄフラグ
メントはブロープレッソフィシン関連蛋白質であること
を確かめた。 処理したＮＰおよびオキシトシン（ＯＴ）に対するポリ
クロナール抗体は、精製した抗原との免疫反応性を示す
ことはなかった。 実施例１では、ＬＸ−１の腫瘍細胞の表面に専ら制限さ
れるＬ６免疫反応性を示したので、！、、Ｘ−１抗原は
抗−ヒトプロープレッソフィシンによる免疫沈降および
ウェススターンプロット解析により更に特徴付けられた
。これら解析においては、上述のように試料を電気泳動
にかけ、プロットし、プローブした。 ＬＸ−１抗原を精製するために、シュナイダー等による
ジス−。パイオル、ケム、　２５７　：　１０７６６〜
１０７６９　　（１９８２）に述べられているように、
Ｌ６をジメチルピメリミデート（２０ｍＭ）でプロティ
ンＡ−セファローゼ（１２■の抗体／−ゲル）に共有結
合的に架橋結合させて、本質的にＬ６／プロティンＡア
フィニティーマトリクスを形成した。非特異的結合を、
上述のようにしてニス、アウレウスを用いＬＸ−１細胞
抽出物から除去した後、この抽出物を１００．０００　
Ｘ　ｇで３０分間遠心分離し、上層液をＬ６／プロティ
ンＡアフィニティーマトリクスに加えた。 ４℃で一夜、穏やかに回転させた後、プロティンＡ−セ
ファローゼを２分間５００Ｘｇでペレットに成形し、０
．５ＭのＮａＣ１，ｌ　ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％
（ｖ／ｖ）ノニデットＰ−４０を含有する５０　ｍＭの
トリスＨＣＩ　ｃｐｎ　８．２）で洗浄し、次いで、Ａ
　ｔ　ｓ　ｏがバックグラウンドレベルに低減するまで
０．１５ＭのＮａＣ１を含有する５０　ｍＭのトリスＨ
ＣＩ（ｐＨ８，２）において洗浄した。特異的に結合し
た抗原を５０　ｍＭのジエチルアミンｐＨ１１，５の等
容積で２回溶離した。たまった溶離物を直ちに、１／１
０容量の０．５ＭのＮａＨｚＰＯ＋を加えることにより
中和した。 ＬＸ−１膜抗原は、ウェスターンプロット法でＹＬ−３
と強く反応し、Ｍ、約４５．０００を有するバンドを明
らかにすることが分かった。ＬＸ−１シトソール抽出物
は、ＹＬ−３でプローブした場合、４５　ｋｄで極めて
かすかなバンドのみと２３　ｋｄで軽微なバンドを示し
た。 また、ＹＬ−３は正常なＰＰＹｓｉｎ（Ｍ、　２３，０
００）と反応した。試験したシトソール抽出物中の全蛋
白質は膜抽出物中の全蛋白質の１００倍であったので、
極めて大多数のＬＸ−１抗原が細胞膜中にあり、シトソ
ール中にはないと結論された。更に培地は、ウェスター
ンプロット解析による抗−ｖＰ、抗−ＮＰ　。 ＹＬ−３、およびＬ６　ｍＡｂとの免疫反応性に対して
陰性であった。また、腫瘍を有するヌードラッ１〜から
の血清も対照ヌードラットと比較した場合、放射線免疫
検定法（ＲＩＡ）による■Ｐレベルの増加を示さなかっ
た。ＲＩＡは、モートン（Ｍｏｒｔｏｎ）等、ジエイ。 エンドクリノール（Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、）　
　６５：４１１〜４２４　（１９７５）に従って行った
。 また、ＬＸ−１細胞を、ラクトペルオキシダーゼ（５０
μｇ／７ｎｌ）、グルコースオキシダーゼ（２５μｇ／
７ｎｌ）およびＮａ１２’　　Ｉ　（Ｌ　ｍｃｉ／１０
’細胞）を用いて表面ヨウ素化した。反応をグルコース
（２５０μｇ／ｍｌ）の添加で開始し、２０分間常温で
培養し、Ｋｌ（０，４■／ｍｌ）で停止した。＋５■標
識化細胞を０．１５ＭのＮａＣ１を含有する５０　ｍＭ
ｏＮａＨａＰＯ４（ｐＨ７，５）中で３回洗浄し、上記
のように可溶化した。可溶化抽出物のＹＬ−３との引き
続く抗原結合は、更にＬＸ−１抗原の膜局在を示した。 これらの結果は、ＬＸ−１細胞の非分泌性およびブロー
プレッソフィシン関連蛋白質のＬＸ−１細胞膜への優先
的標的化を確認した。 ＰＰＹｓｉｎ様ＬＸ−１抗原の観察された高い分子量に
対する可能な説明は、ゲル上の移動度を変える高度のグ
リコジル化または正常２３　ｋｄ蛋白質の三量化であっ
た。これらの可能性を調べるため、精製ＬＸ−１腫瘍抗
原をグリコペプチルダーゼＦで消化し、プロッティング
しＹＬ−３抗体でプローブした。これは、Ｍ、約３５．
０００を有する弱い免疫反応性バンドを生じ４５　ｋｄ
バンドは完全に除かれた。更に、培養ＬＸ−１腫瘍細胞
を［：３６Ｓ　：ｌ−システィンで培養しＹＬ−３で免
疫沈澱した場合、精製抗体に対応する４５ｋｄバンドが
見られた。約５７　ｋｄの一層高い分子量のバンドも検
出されたが、これはポリペプチドのプレープロ形または
一層大きい、プロセッシングの少ない４５　ｋｄ蛋白質
を表す。これらの研究は、４５　ｋｄバンドが三量化ま
たは過度のグリコジル化の結果でなくて、むしろブロー
プレランフィシンの独特な形であることを示す。 次に、アミノ酸配列決定をＬＸ−１腫瘍抗原について行
って正常なヒトＰＰＹｓｉｎの配列およびＹＬ−３抗体
に対する免疫原と比較した。配列決定手法は次の通りで
あった：非変性イムノアフィニティー精製ＬＸ−１抗原
（１５０ｐｍｏｌ）を、０．３ｍＭのＮ−エチルモルホ
リンアセタート（ｐＨ８，５）中カルボキシペプチダー
ゼＢ（０，６μｇ）による制限蛋白質加水分解に５時間
３７°Ｃでかけた。反応を、酢酸をｐＨ３，０になるま
で加えることによりクエンチングした。次いで、試料は
上述のように電気泳動にかけイモピロン（Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｏｎ）　ＰＶＤＦ膜（ミリポア、コーポレーション（
ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　ｃｏｒｐ、、マサチューセッツ州
ベトフォード）上に検事、ジエイ、バイオ、ケム。 ２６２　：　１００３５〜１００３８　（１９８７）に
従って電気ブロッティングした。膜を０．１％（Ｗ／Ｖ
）コマッシープルーＲ−２５０中短時間染色し、脱染色
（ｄｅｓｔａｉｎ）　Ｌバンドを切除した。染色蛋白質
バンドは、アプライド・ビオシステムス・インコーホレ
ーテッド（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉ
ｎｃ　、　）１２０Ａ　ＰＴｆ（アナライザーを具する
気相シークエンサー（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（モデル　
４７０Ａ、アプライド・ビオシステムス、インコーポレ
ーテッド、カリフォルニア州、フォスター・シティ−）
中自動化エドマン分解により配列決定した。約６０ｐｍ
ｏ　ｌのＬＸ−１抗原を同定アラニンの収量に基づいて
配列決定した。 次の第１表は、配列決定分析の結果のまとめである。 アセトニトリル中の）ＩＰＬＣ画分から、又は直接ＰＶ
ＤＦ膜上に電気ブロッティングした蛋白質から直接イム
ノアフィニティー精製ＬＸ−１抗原の配列決定をする初
期の試みは、Ｎ−末端阻害により不成功であった。これ
を回避するために、該蛋白質はこん跡量のトリプシンを
含有するカルボキシペプチダーゼＢ（シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）、ミズーリ州、セントルイス）で制限蛋白質加水分
解にかけた。ＰＶＤＦ膜上に電気ブロッティングされた
分裂抗原の自動化エドマン分解は、ヒトＰＰＹｓ　ｉｎ
のＮ−末端部分を有する２１アミノ酸相同性（仮りの割
当てを含む）を有する配列を明らかにした（第１表参照
〉。二つの配列の間の主要な違いは、ヒトＰＰＹｓ　ｉ
ｎにおけるＣｙｓ３３の代わりにＬＸ−１腫瘍抗原中の
Ａ　ｒ　ｇ　３３残基の置換である。この変化は、蛋白
質の３次元構造上に重大な影響を有しうる。それにもか
かわらず、配列決定分析は、ｍＡｂ　Ｌ６−分離腫瘍抗
原のＰＰＹｓｉｎ様としての同定を確認した。 ＬＸ−１腫瘍細胞中のブロープレッソフィシン様蛋白質
（ＰＰＬＰ）の表現を更に特徴づけるためにヒトおよび
ラットのＰＰＹｓｉｎのＣ末端領域に指向されるオリゴ
ヌクレオチドをノーザンおよび系内ハイブリッド形成分
析で用いた。 系内ハイブリッド形成を行うために、ベンドパルビター
ル＋トリウム（５０ｍｇ／　ｋｇ体重、ｉ、　Ｉ）、　
）で麻酔し、塩水で次いで緩衝１０％ホルマリンで噴量
経由で（ｔｒａｍｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）潅流した。脳
を除去し、０．０２％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカルボナ
ート（ＤＢＰＣ）含有３０％（Ｗ／Ｖ）スクロースで凍
結防止した。クリオスタット切片（１０μｍ）を腫瘍を
有する領域と視床下部を含むように冠状平面（ｃｏｒｏ
ｎａｌ　ｐｌａｎｅ）で切断し、シラン化ガラススライ
ド上に載せた。系内ハイブリッド形成は、デービス（Ｄ
ａｖｉｓ）等、ブロク、ナトル、アカド、サイＵＳＡ　
　８３　：　１１４５〜１１４９　（１９８６）の技術
を用いてオリゴヌクレオチドプローブで行った。切片を
脱脂質化しく前進等級のアルコールおよびクロロホルム
により）、２×ＳＳＣに再水和した（後退等級アルコー
ルにより）。 次いで、切片を５０％（Ｖ／Ｖ）脱イオン化ホルムアミ
ド、ｉｏｘデンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ’　５
ｏｌｕｔｉｏｎ）。 ０．１％（ｖ／ｖ　）ＳＤＳ、および０．１％（ｗ／ｖ
）鮭精子ＤＮＡ（ハイブリッド形成緩衝液）を含有する
２ＸＳＳＣで予備ハイブリッド形成した（ｌｈｒ、　２
５°Ｃ）。次いで切片を３′の終りで３５３標識したオ
リゴヌクレオチドプローブ（３０μｌ中２．ＯＸ１０’
ｃｐｍ　）とＯ，１ＭのＤＴＴを含有するハイブリッド
形成緩衝液でおおった（２４　ｈｒ、　２５°Ｃ）。次
いで切片を２ＸＳＳＣ中洗浄しく４　ｈｒ、　２５°Ｃ
１１５分交換）、空気乾燥し、ハイパーフィルム（Ｈｙ
ｐｅｒｆ　ｉｌｍ）β−ｍａｘ　（アマ−ジャム（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）、イリノイ州、アーリントンハイツ）に
さらすかコダックエマルション（ＮＴＢ−３）中に浸漬
した。２週間後、切片を展開し、カウンター染色（ｃｏ
ｕｎｔｅｒ−ｓｔａｉｎ）　Ｌ、脱水し、顕微鏡分析の
ためカバーグラスをつけた。 研究に用いたオリゴヌクレオチドプローブの特異性は、
あらかじめノーザン分析で確認した（下記参照）。ラッ
トプローブの３０−マー（３０−ｍｅｒ）領域における
ラットとヒトＰＰＹｓ　ｉｎ間の配列相同性は、ラット
およびヒトＰＰＹｓｉｎ　ｍＲＮＡの両方の検出を可能
にする。これに比べて５０マーヒトオリゴマクレオチド
プローブは、ヒト配列の独特なドメイン認識し、したが
ってヒトＰＰＹｓｉｎでのみハイブリッド化すべきであ
る。次の追加の対照を誤った陽性信号の可能性を最小に
するために行った：（ｉ）組織の予備ハイブリッド形５
１１ＥＲＮＡｓｅ処理；（ｉｉ　）　ｃＤＮＨ−ｍＲＮ
Ａハイブリッド形成の過剰の未標識化プローブの添加に
よるブロッキング。 ノーザン分析は、次のように行った：全ＲＮＡは、カタ
ラ（Ｃａｔｈａｌａ）等によりＤＮＡ　　２　：３２９
〜３３５（１９８３）に記載されているように組織また
は細胞を５Ｍのグアニジンイソチオシアナート中にホモ
ジナイゼーションし、４ＭののＬｉＣ１で沈澱させるこ
とにより調製した。オリゴ（ｄＴ）−セルロースバッチ
法（ジャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）等、Ｊ、Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ、　　６：　１６８５〜１６９４　（１９８６）
記載）を用いてポリ（Ａ”）ＲＮＡｓを分離した。試料
を標準１．５％アガロースホルムアルデヒドゲル上で分
画し２０　Ｘ　ＳＳＣ中ナイロン膜に、受動的に移した
。２０％（Ｖ／Ｖ）脱イオン化ホルムアミド、５×デン
ハルト溶液（１％Ｃｗ／ｖ　）ポリビニルピロリドン、
Ｍ、４０，０００．１％〔ｗ／ｖ　）フイコル（Ｆｉｃ
ｏｌｌ）　Ｍ、　４００，０００　　；および１％［：
ｗ／ｖ　］　ＢＳＡ）、０．１％（ｖ／ｖ　）ＳＯ３お
よび１０μｇ／ｉ超音波処理し、熱変成鮭精子ＤＮＡを
含有する５ＸＳＳＣ／２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４，ｐｌ
（７，５中４５℃で一夜膜を予備ハイブリッド形成した
。次いでろ過器（ｆｉｌｔｅｒ）を１×デンハルト溶液
プラス１．０μｇ／Ｊ鮭精子ＤＮＡおよび３′後に５〜
８　Ｘ　１０”ｄｐｍ／ｎ　ｍｏｌの比活性に３２ｐ標
識化した４ｏＭの３０マーオリゴヌクレオチドを含有す
る同様な緩衝液中ハイブリッド化した（２４ｈｒ、　４
５°Ｃ）。オリゴヌクレオチドは、３′後に末端デオキ
シヌクレオチジル　トランスフェラーゼで標識され、精
製された（デービス等、ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（エルセピ
ア、ニューヨーク）　　（１９８６）に記載のように）
。膜を４５℃で１％（ｖ／ｖ　）ＳＤＳを含有する２Ｘ
ＳＳＣに厳重に洗浄しＸ−線フィルムに露出した。 ＬＸ−１腫瘍膜種移植片を有するヌードラットの脳の、
ラットＰＰＹｓ　ｉｎに対する３０−マーオリゴヌクレ
オチド　プローブによる系内ハイブリッド形成は、ラッ
ト視床下部のＳＯＮおよびＰＶＮ核におけるバソプレッ
シンニューロン内に特異ハイブリッド形成信号を示した
。またオートラジオクラフ粒子がヒト脳内腫瘍異種移植
片に局在し、ＬＸ−１腫瘍細胞におけるバソプレッシン
ｍＲＮＡの表現を確認した。 腫瘍を有するヌードラットの脳の一連の隣接する切片を
ヒトＰＰＹｓ　ｉｎに対する５０−マーオリゴヌクレオ
チド　プルーブでハイブリッド形成した場合、ハイブリ
ッド形成信号がヒト腫瘍異種移植片に局限され、ラット
視床下部のバソプレッシンニューロン内には標識化は検
出されなかった。これ等の研究により、実験において使
用したヒトおよびラットＰＰＹｓｊｎプローブの特異性
並びにハイブリット形成の厳格なことが確かめられた。 ３０−マーラットおよび５０−マーヒト合成ブローオキ
シフィシンプローブによる平行試験を、腫瘍を有するヌ
ードラットの脳の隣接する部分について行い、ＬＸ−１
腫瘍膜種移植片におけるオキシトシンｍＲＮＡの存在を
示すことができなかった。３ｏ−マーラットプローブを
用いてプローブした部分におけるラットＳＯＮおよびＰ
ＶＮのオキシトシンニューロン内の系内信号の存在は、
使用したプローブのハイブリッド形成の特異性および組
織ｍＲＮＡ５の安定性を確かめた。５０−マーヒトプロ
ーブを用いてプローブした部分の対応する視床下部領域
における信号の不存在はハイブリッド形成の特異性を更
に確認するのに役立った。 ラット視床下部全ＲＮＡを［３２Ｐ〕−標識ラット３０
−マーを用いプローブした場合、７５０　ｂｐのメツセ
ージサイズに対応する強力な信号が観察された。 ラット小脳からの全ＲＮＡは、ラット３０−マープロー
ブによるハイブリッド形成を示さなかった。ＬＸ−１腫
瘍細胞から単離したポリ（Ａ”　）ＲＮＡをラット３〇
−を用いてプローブした場合的１０００　ｂｐのメツセ
ージサイズに対応するバインドが観察された。 このメツセージは正常なＰＰＹｓ　ｉｎｍＲＮＡの報告
されたサイズより約２５０ｂｐ大であった。このことは
、一部分では、腫瘍膜におけるブロープレッソフィシン
様蛋白質（ＰＰＬＰ）の高分子量を証明することができ
る。系内ハイブリッド形成およびノーザン分析はＬＸ−
１ヒト腫瘍膜種移植片および培養した細胞におけるＶＰ
　ｍＲＮＡの選択的表現を示唆する。 Ｌ６モノクロナール抗体が結合する抗原の確認は、診断
および治療の有効性を有する。例えばＬ６モノクロナー
ル抗体を、所望の抗新生物剤を身体の新生物部位にｍＡ
ｂにより選択的に搬送するため結合する治療使薬として
用いることができる。脳の腫瘍を治療するため、先ずマ
ニトールまたはグリセロールの如き化学薬剤を用いて血
液−脳バリヤを開き、次いでＬ６ｍＡｂに結合する抗新
生物剤を投与する。Ｌ６ｍＡｂはまた診断像映剤と結合
させて腫瘍の診療および定位に役立てることもできる。 またＬ６　ｍＡｂを使用して動物におけるブロープレラ
ンフィシンおよびブローオキシフィシンのインビボ精製
および機能並びにヒト中枢神経系を研究することもでき
る。 更に、分泌腫瘍の場合に、ＬＸ−１腫瘍抗原に対するＬ
６　ｍＡｂおよび他の新世代ｍＡｂｓを血清診断試験に
用いることもできる。共役したＬ６　ｍＡｂを診断また
は治療薬として患者に投与して身体内の腫瘍細胞を確認
および定位することができる。この方法について関心が
もたれることはｍＡｂと循環ニューロフィシンとの反応
が含まれる。然し予備試験、がこれ等の問題は患者に対
し１ｇ以上投与した場合でも、殆んどおこらないことを
示す。 １．６抗体の更に可能な適用は、免疫治療法養生法の一
部分としＬＸ−１腫瘍抗体のクローンを使用することで
ある。かかるクローン抗体（ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｔｉｇ
ｅｎ）の適用は極めて重要である。この理由は、肺、胸
、結腸および卵巣癌くすべてＬ６と反応する）が最も普
通の形の４種の癌であるからである。例えばＬＸ−１抗
原またはウィルスベクターにおかれるＬＸ−１抗原に対
するクローン遺伝子（Ｃ１ｏｎｅｄ　ｇｅｎｅ）を有効
免疫療法用ワクチンとして投与することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）Ｌ６モノクロナール抗体との免疫反応性と、 （ｂ）ニューロフィシン I 、ニューロフィシンIIおよ
   びプロープレッソフィシンから成る群 から選ばれた抗原エピトープを含む特徴を有するほぼ純
   粋な腫瘍抗原 ２、正常な視床下部の視索および室傍ニューロンにより
   原形質内で合成される請求項１記載のほぼ純粋な腫瘍抗
   原。 ３、脳内に異種移植したＬＸ−１ヒト肺癌細胞により合
   成された請求項１記載のほぼ純粋な腫瘍抗原。 ４、ホルモンオキシトシンおよびバソプレッシンの存在
   下でＬ６モノクロナール抗体を結合する請求項１記載の
   ほぼ純粋な腫瘍抗原。 ５、アフィゲル−１０上に接合した豚のニューロフィシ
   ンで予備吸収されたＬ６モノクロナール抗体による抗結
   合性の請求項１記載のほぼ純粋な腫瘍抗原。 ６、Ｌ６モノクロナール抗体と免疫反応性で【遺伝子配
   列があります】 のアミノ末端アミノ酸配列を有するほぼ純粋な腫瘍抗原
   。 ７、ニューロフィシン I およびニューロフィシンIIに
   より共有された共通のアミノ酸配列を有する請求項６記
   載のほぼ純粋な腫瘍抗原。 ８、ニューロフィシン I 、ニューロフィシンIIおよび
   プロープレッソフィシンから成る群から選ばれた抗原エ
   ピトープを有する請求項６記載のほぼ純粋な腫瘍抗原。 ９、イムノアフィニティークロマトグラフィーおよびゲ
   ル電気泳動により測定された約４５，０００ドルトンの
   分子量を有する請求項６記載のほぼ純粋な腫瘍抗原。 １０、抗バソプレッシンおよび抗プロープレッソフィシ
   ン抗体を含む抗体と免疫反応性である請求項６記載のほ
   ぼ純粋な腫瘍抗原。 １１、ＬＸ−１ヒト肺癌細胞により合成された請求項６
   記載のほぼ純粋な腫瘍抗原。 １２、ラットのプロープレッソフィシンのＣ−末端に３
   ０−マーでノザン分析をした場合約１０００ｂｐのバン
   ドを示すＬＸ−１ｍＲＮＡからＬＸ−１細胞により合成
   された請求項１１記載のほぼ純粋な腫瘍抗原。 １３、更に、 （ａ）ＬＸ−１ヒト肺癌細胞の細胞膜上の存在および （ｂ）イムノアフィニティークロマトグラフィーおよび
   ゲル電気泳動により測定された約４５，０００ドルトン
   の分子量 と含む特徴を有する請求項１記載のほぼ純粋な腫瘍抗原
   。