CN104774844A

CN104774844A - 一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法

Info

Publication number: CN104774844A
Application number: CN201510181148.4A
Authority: CN
Inventors: 李德山; 白银; 徐黎明
Original assignee: HARBIN BOAO BIO-MEDICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co
Current assignee: HARBIN BOAO BIO-MEDICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co
Priority date: 2015-04-16
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2015-07-15

Abstract

本发明公开了一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法。该方法包括如下步骤：A)构建由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库；用于扩增抗体VH和VL的引物对均为同种属简并引物对，用于连接VH和VL的接头为同种属CH1；B)获得特异于所述靶标抗原的所述目标单链抗体的基因编码序列；靶标抗原和待检测单链抗体共表达，并用标签蛋白Flag标记抗原，借助荧光标记抗标签蛋白抗体通过流式细胞分选法筛选获得携带有目标单链抗体的重组细菌后，通过提取质粒重转宿主菌的方法拯救目标单链抗体。本发明在传统的细菌展示技术的基础上，做了改进和创新，根据抗体展示载体所必需的元件和基本原理构建了新的抗体细菌展示系统。

Description

一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法。

背景技术

细菌展示技术又称以细胞内膜为基础的细胞间质表达技术(anchored periplasmaexpression technology，APEx)。该技术特点是利用细胞间质膜脂蛋白的信号肽NlpA leader将目的蛋白运送到细菌间质腔，而NlpA leader在蛋白质跨膜运输过程中被逐步降解，剩下的6个氨基酸(CDQSSS)与细胞内膜外侧的磷脂层形成脂苷键，从而将与其融合的抗体片段展示于细菌内膜外侧。当细菌外膜被溶菌酶消化后成原生质球，孵育液中的抗原可进入细菌间质与锚定在细胞内膜外侧的抗体片段结合，然后将其与荧光标记的抗体进行共孵育，阳性克隆可被流式细胞仪高通量的检测分离。

pelB leader为果胶酶基因前导肽，可以引导与其融合的蛋白质进入细菌间质，并且在进入间质后也被降解完全。其融合的蛋白质在间质腔中和牟定的具有结合能力的抗体片段结合。

细菌展示技术在筛选抗体方面具有很多优势如：(l)高富集比；(2)高阳性率；(3)由于反应在溶液状态下进行，可克服常规生物淘洗过程中由于筛选配基固定化而导致的“亲和效应”。应用流式细胞术(FCM)进行筛选可以真正的做到实时监测同步跟进，非常直观的追踪抗原表位的甄别情况。此外，该技术相对简便易行，只要经过相应的酶切位点就可以直接将抗体片段插入到展示载体中，并且经过细菌电转化可获得库容量高达10⁹～10¹⁰的抗体库，满足了抗体筛选对库容量要求。

全世界范围内，只有美国Texas大学于2007年在美国科学院院报上报道了展示Fab抗体库的展示技术APEx 2-hybrid，所利用的宿主菌为E.coli DH10B，但是迄今为止尚无文献验证该方法的可行性和实用性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法。

本发明所提供的获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法，具体可包括如下步骤：

A)按照包括如下步骤的方法构建由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库：

(a1)根据已知的抗体框架区序列，设计并合成用于扩增抗体重链可变区的简并引物对1，以及用于扩增抗体轻链可变区的简并引物对2；

所述已知的抗体框架区序列为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的抗体框架区序列；如所述靶标抗原为能够感染人的乙肝病毒的某一蛋白，则所述已知的抗体框架区序列为人的抗体框架区序列；

(a2)采用所述简并引物1和所述简并引物对2从初始样本中分别扩增得到抗体重链可变区集合和抗体轻链可变区集合；

所述初始样本中含有由不同种抗所述靶标抗原的抗体组成的抗体库；

所述初始样本可为如下a)或b)：

a)健康个体的组织样本(如血液等)，所述健康个体为免疫了含有所述靶标抗原或其编码核酸的疫苗后，激起免疫反应产生相应抗体的健康个体；

b)患病个体的组织样品(如血液等)，所述患病个体为因携带所述靶标抗原的致病微生物(如病毒、细菌或真菌等)感染所引起的患病个体，且经证实已激起免疫反应并产生抗体。

所述抗体重链可变区集合为由不同重链可变区组成的集合；所述轻链可变区集合为由不同轻链可变区组成的集合；

所述简并引物对1和所述简并引物对2均既可为一个引物对，也可为多个引物对。当为多个引物对时，采用所述简并引物对1中的每个引物对分别对所述初始样本进行扩增，扩增所得片段的集合即为所述抗体重链可变区集合；采用所述简并引物对2中的每个引物对分别对所述初始样本进行扩增，扩增所得片段的集合即为所述抗体轻链可变区集合。

(a3)将所述抗体重链可变区集合中的不同重链可变区和所述抗体轻链可变区集合中的不同轻链可变区通过重链恒定区CH1进行随机连接，获得由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库；

所述重链恒定区CH1为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的重链恒定区CH1的前15个氨基酸；如所述靶标抗原为能够感染人的乙肝病毒的某一蛋白，则所述重链恒定区CH1为人的重链恒定区CH1的前15个氨基酸；

在本发明中，所述抗体重链可变区连接于所述重链恒定区CH1的上游；所述抗体轻链可变区连接于所述重链恒定区CH1的下游。

B)按照包括如下步骤的方法获得特异于所述靶标抗原的所述目标单链抗体的基因编码序列：

(b1)将所述基因编码库中的各待检测单链抗体编码基因分别与靶标抗原-标签蛋白融合基因共同构建于同一表达载体，并使所述待检测单链抗体编码基因融合于信号肽1的编码基因的下游，使所述靶标抗原-标签蛋白融合基因融合于信号肽2的编码基因的下游，获得重组表达载体库；所述重组表达载体库中各载体上均含有所述靶标抗原-标签蛋白融合基因和任一种所述待检测单链抗体编码基因；

所述靶标抗原-标签蛋白融合基因为由所述靶标抗原的编码基因和所述标签蛋白的编码基因融合而成的融合基因；

所述信号肽1为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白展示于细菌内膜外侧(即将所述与其融合的目的蛋白运送到细菌间质腔，并定位于细菌内膜外侧)；

所述信号肽2为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白运送到细菌间质腔后自身完全降解，所述目的蛋白游离于所述细菌间质腔内；

所述信号肽1不具有所述信号肽2的以上功能；且所述信号肽2也不具有所述信号肽1的以上功能。

(b2)将所述重组表达载体库中的各重组表达载体转入宿主细菌，得到重组细菌库；所述重组细菌库中各重组细菌中均含有任一种所述重组表达载体(即在所述重组细菌库中，每个所述重组细菌中均只含有一种所述重组表达载体，这一种重组表达载体可为所述重组表达载体库中的任一种所述重组表达载体)；

(b3)培养所述重组细菌库，诱导所述重组表达载体进行表达，由所述待检测单链抗体编码基因编码所得的待检测单链抗体被展示于所述细菌内膜外侧，由所述靶标抗原-标签蛋白融合基因编码所得的靶标抗原-标签融合蛋白游离于所述细菌间质腔内；

(b4)去除所述重组细菌库中各重组细菌的外膜(如用溶菌酶处理)，得到原生质球库；所述原生质球库中每个原生质球上均展示有任一种所述待检测单链抗体，游离于所述原生质球外的所述靶标抗原-标签融合蛋白能够被所述待检测单链抗体中的特异性单链抗体所捕获，形成抗原抗体复合物(而所述原生质球表面的非特异性单链抗体则不能捕获所述靶标抗原)；

(b5)将所述原生质球库与经荧光标记的抗所述标签蛋白的抗体共同孵育，只有表面形成了所述抗原抗体复合物的原生质球能够被标记上所述荧光，从所述原生质球库中获得表面被标记上了所述荧光的原生质球(如采用流式细胞仪对所述原生质球库进行流式分选)，记为荧光-原生质球；所述荧光-原生质球的表面展示的所述待检测单链抗体即为所述目标单链抗体；

(b6)从所述荧光-原生质球中提取质粒，再次转入所述宿主细菌，进行所述质粒的扩繁培养，从培养后的细菌中提取所述质粒，保种；

对所述质粒测序后获得所述目标单链抗体的基因编码序列。

本发明还提供了一种获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的方法，是构建单链抗体库并从中筛选单链抗体的方法。

该方法除了包括所述A)步骤和所述B)步骤，在所述B)步骤之后还包括如下步骤C)：

C)根据步骤B)获得的所述目标单链抗体的基因编码序列，进行蛋白表达，获得所述目标单链抗体。

在本发明中，所述信号肽1为NlpA leader信号肽；所述信号肽2为pelB leader信号肽。

所述NlpA leader信号肽的编码基因的序列为序列表中序列1的第5258-5344位；所述pelB leader信号肽的编码基因的序列为序列表中序列1的第167-232位。

在本发明中，所述宿主细菌为大肠杆菌；具体为大肠杆菌DH5α。

在本发明中，所述标签蛋白为Flag蛋白。所述Flag蛋白的氨基酸序列具体为序列表中序列2所示。

在本发明中，所述荧光的标记物为FITC。

在本发明中，步骤(b1)中，所述表达载体具体为pBGD载体；所述pBGD载体的序列具体如序列表中序列1所示。

在所述方法的步骤(b5)中，所述“从所述原生质球库中获得表面被标记上了所述荧光的原生质球”中，所述“获得”的方法即可为单轮筛选，也可为多轮(如2-4轮)筛选；当为多轮筛选时，自第2轮筛选起，每一轮筛选均从前一轮筛选所得的所述原生质球中提取质粒，再次转入所述宿主细菌，重复(b3)-(b5)的步骤。随着筛选轮数的增加可以逐渐降低经所述荧光标记的抗所述标签蛋白的抗体(如FITC标记的Flag抗体)的用量，这样有利于筛选到亲和力更强的抗体。

本发明的另一个目的是提供一种用于获得特异于靶标抗原的目标单链抗体或其编码基因的试剂盒。

本发明所提供的用于获得特异于靶标抗原的目标单链抗体或其编码基因的试剂盒，可包括表达载体、宿主细菌、经荧光标记的抗标签蛋白的抗体；

所述表达载体含有编码所述信号肽1和所述信号肽2的基因，用于共表达所述待检测单链抗体和所述靶标抗原-标签融合蛋白(如所述pBGD载体)；

所述宿主细菌可为大肠杆菌；具体如大肠杆菌DH5α；

所述经荧光标记的抗标签蛋白的抗体可为经FITC标记的抗Flag蛋白的抗体。

另外，所述试剂盒中还可含有记载有如上所述方法的可读性载体，如说明书。

所述试剂盒在获得特异于靶标抗原的目标单链抗体或其编码基因中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述靶标抗原为源自病原微生物(如病毒、细菌或真菌)的具有抗原活性的物质，如蛋白、多肽、多糖或小分子化合物和载体蛋白的偶联物等。

在本发明的一个实施例中，所述靶标抗原具体为传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2蛋白。所述VP2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4，所述VP2蛋白的编码基因的序列为序列表中序列5。所述重链恒定区CH1为鸡的重链恒定区CH1的前15个氨基酸。所述鸡的重链恒定区CH1的氨基酸序列为序列表中序列6的第125-139位(对应的编码基因序列为序列表中序列7的第373-417位)。所述信号肽1为NlpA leader信号肽(编码基因序列为序列1的第5258-5344位)；所述信号肽2为pelB leader信号肽(编码基因序列为序列1的第167-232位)。最终筛选所得的特异于所述VP2蛋白的所述目标单链抗体(记为anti-VP2scFV)的编码基因的序列为序列表中序列7，编码的所述anti-VP2scFV的氨基酸序列为序列表中序列6。

所述简并引物对1：

5’-CCCAAGCTTGGCCCAGCCGGCCGCCGTGACGTTGGACGAG-3’；

5’-CTAGCTAGCGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC-3’。

所述简并引物对2：

5’-CGCGGATCCGCGCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC-3’；

5’-CCGCTCGAGGGCCCCCGAGGCCTTAACCTAGGACGGTCAGGG-3’。

所述初始样本为IBDV病毒高免鸡法氏囊。

所述重组表达载体库的具体构建方法包括如下步骤：将所述待检测单链抗体编码基因正向插入到所述pBGD载体上所述NlpA leader信号肽编码基因下游的酶切位点Sfi I处；将所述靶标抗原-标签蛋白融合基因(所述VP2蛋白的编码基因与所述Flag蛋白的编码基因按照自5’至3’的方向顺次融合而成的融合基因)正向插入到pBGD载体上所述pelB leader信号肽编码基因下游的酶切位点Nhe I和BamH I之间，获得所述重组表达载体库。

在本发明的另一实施例中，所述靶标抗原具体为乙肝病毒(HBV)的前S1蛋白(preS1蛋白)。所述前S1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列8，所述前S1蛋白的编码基因的序列为序列表中序列9。所述重链恒定区CH1为人的重链恒定区CH1的前15个氨基酸。所述人的重链恒定区CH1的氨基酸序列为序列表中序列10的第128-142位(对应的编码基因序列为序列表中序列11的第382-426位)。所述信号肽1为NlpA leader信号肽(编码基因序列为序列1的第5258-5344位)；所述信号肽2为pelB leader信号肽(编码基因序列为序列1的第167-232位)。最终筛选所得的特异于所述前S1蛋白的所述目标单链抗体(记为anti-preS1scFv)的编码基因的序列为序列表中序列11，编码的所述anti-preS1scFV的氨基酸序列为序列表中序列10。

所述简并引物对1和所述简并引物对2均为多对引物，具体参见实施例2。

所述初始样本为采自于乙肝表面抗原抗体高效价的健康献血者的外周血白细胞。

所述重组表达载体库的具体构建方法包括如下步骤：将所述待检测单链抗体编码基因正向插入到所述pBGD载体上所述NlpA leader信号肽编码基因下游的酶切位点Sfi I处；将所述靶标抗原-标签蛋白融合基因(所述前S1蛋白的编码基因与所述Flag蛋白的编码基因按照自5’至3’的方向顺次融合而成的融合基因)正向插入到pBGD载体上所述pelB leader信号肽编码基因下游的酶切位点Nhe I和BamH I之间，获得所述重组表达载体库。

本发明在传统的细菌展示技术的基础上，做了改进和创新，根据抗体展示载体所必需的元件和基本原理构建了抗体细菌展示载体，并且利用不同宿主E.coli DH5α菌株成功展示了具有抗原结合能力的抗体。

附图说明

图1为实施例1中使用VH上游引物和VL下游引物对VH-CH1-VL进行PCR鉴定的结果。M：DL2000DNA Marker；1：阴性对照(没有加模版)；2：pTch1-1-scFv文库PCR鉴定。

图2为重组质粒pET-27b-anti-VP2scFv在大肠杆菌中的表达。M：蛋白质标准分子量；1：未诱导阳性菌；2：诱导菌上清；3：诱导菌沉淀。

图3为纯化后anti-VP2scFv抗体蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图4为ELISA检测anti-VP2scFv抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力的结果。纵坐标为OD450值。**表示与对照组相比，在P<0.01水平上差异极显著。

图5为ELISA检测anti-VP2scFv抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力的结果。纵坐标为OD450值。**表示与对照组相比，在P<0.01水平上差异极显著。

图6为人重链、轻链和VH-CH1-VL的PCR鉴定结果。

图7为流式细胞术筛选大肠杆菌DH5α(pBGD-Flag-preS1-scFv)展示文库结果。

图8为重组质粒pET-27b-anti-preS1scFv在大肠杆菌中的表达。M：蛋白质标准分子量1：诱导菌上清；2：诱导菌沉淀。

图9为纯化后的anti-preS1scFv抗体蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图10为ELISA检测anti-preS1scFv抗体对preS1蛋白的特异性和亲和力的结果。**表示与对照组相比，在P<0.01水平上差异极显著。

图11为用anti-preS1scFv阻断pre-S1-FITC蛋白和张氏肝细胞或HepG2细胞的结合。A为张氏肝细胞(Chang liver cell)相关结果。A中，阴性对照1：未经处理的张氏肝细胞(Changliver cell)；阴性对照2：用pre-S2-FITC 5μg/ml代替pre-S1-FITC。B为HepG2细胞相关结果。B中，阴性对照1：未经处理的HepG2细胞；阴性对照2：pre-S2-FITC 5μg/ml代替pre-S1-FITC。

图12为anti-preS1scFv对preS1-FITC蛋白的抑制率。A为张氏肝细胞(Chang liver cell)；B为HepG2细胞。阴性对照为图11中阴性对照2。

图13为用anti-preS1scFv阻断HBV感染张氏肝细胞。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中涉及的基因的设计、合成和克隆、表达载体的构建、核酸提取、测序和鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行(参见CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

pET-27b载体：购自Novagen公司，Cat.No.69337-3。大肠杆菌Rosetta：购自Novagen公司，Cat.No.71403-4。DF1细胞(鸡成纤维细胞)：购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，Cat.No.3131C0001000400030。SPF雏鸡：购自哈尔滨兽医研究所。鸡新城疫灭活疫苗(La Sota株)，购买自哈兽研维科生物公司，编号080012008。

鸡传染性法氏囊病活疫苗(Gt株)：哈兽研维科生物公司，编号080012122。鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(NF8株)：扬州威克生物工程有限公司，编号101042056。鸡传染性法氏囊病活疫苗(1-65株)：Shafit InterGumboro，编号S20651010A。鸡传染性法氏囊病活疫苗(BJ836株)：上海海利生物药品有限公司，编号090202026。鸡传染性法氏囊病活疫苗(MB株)：ABIC，编号20621150B。鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)：湖南省中岸生物药业有限公司，编号180022026。传染性法氏囊病病毒HB/11株：参考文献：黄显明,张小飞,丁美娟等，传染性法氏囊病病毒强毒株HB/11的分离与鉴定，《中国动物传染病学报》2012年第5期，8-11页。

HepG2细胞：可从商业途径获得，记载于文献如“唐孟萱,周万军,胡元佳等.HepG2细胞培养方法与条件的探讨.实用预防医学,2005年第12卷第1期”中。

Chang细胞(张氏肝细胞)：可从商业途径获得，记载于文献如“杨涛.张氏肝细胞Changliver cell移植改善急性肝衰竭的预后.2013年,华中科技大学,硕士论文”中。

HepG2.2.15细胞：可从商业途径获得，记载于文献如“韩建,王晓娟,刘鹏等.HepG2.2.15细胞模型功能的重新评价:分泌HBVDNA、cccDNA及血清学标志物的动态变化研究.中国病原生物学杂志,2013年05期”中。

实施例1、抗IBDV病毒VP2蛋白的单链抗体的筛选

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性高度接触性传染病，已经引起了世界的关注。IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，基因组由两个长度不相同的RNA组成。VP2分子量约为37kDa，是血清型特异性抗原，既是IBDV的主要结构蛋白，又是病毒的主要宿主保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异、细胞凋亡等有关。抗体药物是目前唯一有效的治疗药物，高免血清和高免卵黄抗体对IBD表现出良好的预防和治疗效果，但是由于成本和安全性等原因而受到限制，从而降低了他们的使用价值。而基因工程重组抗体作为高亲和性、以蛋白为基础的靶向诊断和治疗用生物制品，在病毒性疾病防制方面越来越受到重视。因此有必要研制抗IBDV的基因工程抗体药物，填补应用基因工程抗体治疗鸡传染性法氏囊病的空白，也为研制其他动物病毒性疾病药物奠定基础。

本实施例提取从自然感染动物体内获得抗体基因，利用TRIZOL提取法氏囊的RNA后反转录为cDNA。根据GenBank上的抗体序列，设计出克隆抗体可变区的简并引物，以cDNA为模板，使用PCR的方法克隆抗体可变区。使用高效的电转化方法，将VH与VL片段分别插入到pTch1载体Linker的上游和下游，构建出scFv抗体库再将其连入到pBGD细菌展示载体NlpA leader的下游，在这之前先将抗原片段插入pelB leader的下游，构建抗原抗体共表达的细菌表面展示文库。应用流式细胞仪对抗体文库进行筛选，将筛选到的单克隆基因连入pET-27b载体，并进行诱导表达。

一、初始样本

以IBDV病毒高免鸡法氏囊为初始样本(经证实已激起免疫反应并产生抗体)，作为抗体库基因的来源。这不但可以增加天然抗体的峰度，而且从中可以挑选出针对流行毒株的中和抗体，达到事半功倍的作用。

二、总RNA的提取

取新鲜鸡法氏囊(步骤一的初始样本)0.1g至于预冷的研钵中，不断加入液氮，迅速研磨成粉末。将组织粉末移至预冷的Eppendorf(Ep)管中，加1ml冷TRIzol，反复吹打，混匀，冰上放置10min，12000rpm，4℃离心10min。将上清转移至新的Ep管中，加200μl预冷的酚氯仿(酚：氯仿＝1：5，体积比)，剧烈振荡混匀30sec，12000rpm，4℃离心10min。取上清，重复加入200μl酚氯仿振荡后离心。取上清，加等体积冷异丙醇，-20℃放置15min，12000rpm，室温离心10min。小心吸去上清液，将离心管倒置，使液体尽量流干。用1ml预冷75％乙醇，12000rpm，4℃离心5min洗涤RNA沉淀，弃上清，重复3次，室温干燥。用30μl灭菌DEPC水溶解RNA，-20℃保存备用。

三、cDNA的合成

以步骤二提取的组织总RNA为模板，Oligo(dT)₁₈为引物，参照反转录酶(M-MLVRT)说明书进行cDNA第一条链的合成。

反应体系及反应条件如下：Oligo(dT)₁₈1.0μl；总RNA模板5.0μl；DEPC-H₂O 5.0μl。70℃水浴中5min，放置冰上5min，依次加入：RNasin 1.0μl；5×M-MLVRT buffer 5.0μl；dNTPs5.0μl；DTT 5.0μl；M-MLVRT 1.0μl。42℃水浴2h，70℃水浴15min，取1μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳上观察片段大小。

四、克隆scFv文库引物的设计

引物的准确性和高效性是克隆可变区基因的关键，本发明的发明人根据GenBank鸡抗体框架区序列，设计PCR扩增引物用于轻链和重链可变区的扩增，并在重链可变区基因上下游分别加入Hind III、Nhe Ⅰ酶切位点，轻链可变区基因上下游分别加入BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点，引物由TaKaRa公司合成。

用于扩增重链可变区的引物对：

HF(重链上游)：

5’-CCCAAGCTT-GGCCCAGCCGGCCGCCGTGACGTTGGACGAG-3’(下划线部分依次为酶切位点Hind III和Sfi I的识别序列)；

HR(重链下游)：5’-CTAGCTAGCGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC-3’(下划线部分为酶切位点Nhe I的识别序列)。

用于扩增轻链可变区的引物对：

LF(轻链上游)：5’-CGCGGATCCGCGCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC-3’(下划线部分为酶切位点BamH I的识别序列)；

LR(轻链下游)：

5’-CCGCTCGAG-GGCCCCCGAGGCCTTAACCTAGGACGGTCAGGG-3’(下划线部分依次为酶切位点Xho I和Sfi I的识别序列)。

五、抗体可变区的PCR扩增

以步骤三中合成的cDNA为模板，分别以步骤四设计合成的VH上下游引物和VL上下游引物进行梯度PCR扩增，确定最佳退火温度。

PCR反应(25μl体系)如下：10×PCR buffer 2.5μl；dNTPs 2.0μl；模板1.0μl(10ng)；上游引物1.0μl(10pmol/μl)；下游引物1.0μl(10pmol/μl)；Taq酶0.5μl；ddH₂O 17μl。

混匀后进行PCR扩增。循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性1min，梯度退火温度为45℃～60℃(45.0℃、46.0℃、47.5℃、49.0℃、50.5℃、52.0℃、53.5℃、55.0℃、56.5℃、57.4℃、58.9℃、60.0℃)，退火1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。另设阴性对照，其中不加模板，其余成分相同，用灭菌去离子水补齐至相同体积。

扩增结束后，取1μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳上观察片段大小和亮度，选择最适的退火温度(重链和轻链都是55.0℃)进行抗体可变区的扩增(反应体积为250μl)。PCR反应(250μl体系)如下：10×PCR buffer 25μl；dNTPs 20μl；模板10μl(10ng)；上游引物10μl(10pmol/μl)；下游引物10μl(10pmol/μl)；Taq酶5μl；ddH₂O 170μl。

PCR产物利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化。其中，VH约372bp，VL约315bp。

六、大肠杆菌电转化感受态细胞的制备及转化

挑取冻存的大肠杆菌DH5α菌液，于LB固体平板培养基表面划线，37℃培养过夜。次日挑取中等大小单一菌落，接种于10ml LB液体培养基中，37℃、120rpm振荡培养约10h。用接种环沾取菌液接入10ml LB液体培养基中，37℃、120rpm振荡培养约10h。将上述已活化的菌种以1/1000的比例接入200ml LB液体培养基中，37℃、120rpm振荡培养，当OD₆₀₀达到0.35～0.4之间时，收集菌液至50ml离心管中，4℃、3000rpm，离心10min。弃上清，加入40～50ml预冷去离子水重悬菌体，4℃、3000rpm，离心10min，重复操作一次。弃上清，加入40～50ml预冷10％(体积分数)甘油重悬菌体，4℃、3000rpm，离心10min，重复操作一次。吸尽上清，加入少量新鲜预冷10％(体积分数)甘油将菌体重悬后分装，每管100μl、-80℃冻存备用。此步骤中用到的所有三角瓶都用浓酸浸泡过，一方面保证绝对干净无菌，又可以去除三角瓶内壁吸附的离子。

每管感受态细胞加入5ng pUC19标准质粒，3kV、25μF、200Ω条件下进行电转，加入400μl LB培养基37℃振荡培养1h，涂布平板，37℃培养12～16h，次日观察电转化结果并计算转化率。结果显示：转化效率为1.4×10⁹。

七、pTch1-1-scFv文库的构建

pTch1-1载体为本发明的发明人自主设计的载体(序列12)，其linker序列为鸡的CH1的前15个氨基酸，用于连接着VH和VL，CH1前端有Hind III、Nhe I酶切位点，后端有BamHI、Xho I酶切位点，便于VH片段和VL片段插入。

鸡的重链恒定区CH1的前15个氨基酸的编码序列：

5’-gcgagccccacatcgcccccccgattgtaccctctatccgcctgt-3’(序列7的第373-417位)

鸡的重链恒定区CH1的前15个氨基酸的序列为序列表中序列6的第125-139位。

取步骤五获得的VH胶回收产物与pTch1-1载体进行Hind III、Nhe I双酶切，37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将上述酶切产物进行胶回收。将VH及pTch1酶切片段利用T4Ligase进行连接。将2μl上述连接产物加入到步骤六制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行电转化构建VH抗体库。

次日，收集所有菌落并提取质粒，进行Xho I、BamH I双酶切，同时用Xho I、BamH I对步骤五获得的VL回收产物进行双酶切。酶切后进行胶回收，连接并转化步骤六制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布平板，37℃过夜培养。收集菌落并提取质粒，即为pTch1-1-scFv文库。

取构建的pTch1-1-scFv文库进行酶切鉴定和PCR鉴定。用Hind III、Nhe I和Xho I、BamHI对pTch1-1-scFv文库进行双酶切。取pTch1-1-scFv文库质粒为模板，分别使用VH上游引物和VL下游引物对VH-Linker-VL进行PCR鉴定。

结果显示(图1)：VH和VL已连接上，目的条带大小为760bp左右。

八、将抗原连入pBGD质粒pelB leader下游

1、Flag-VP2融合基因的获得

设计克隆传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2抗原的PCR引物，上游引物加入Nhe I酶切位点，下游引物加入Flag序列(核苷酸序列为序列表中序列3所示，编码序列表中序列2所示的Flag蛋白)和BamH I酶切位点。

传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2抗原：氨基酸序列为序列表中序列4所示，其编码基因如序列表中序列5所示。

VP2-F：5'-GCTAGCATGACAAACCTGCAAGATC-3'(下划线部分为Nhe I的识别序列，其后的序列为序列表中序列5的第1-19位)；

VP2-R：

5'-GGATCCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC-TGCTCCTGCAATCTTCAGGGGAGAGTTG-3'(下划线部分为BamH I的识别序列，斜体部分为Flag序列，-后的序列为序列表中序列5的第1296-1323位)。

以IBD野毒株法氏囊病料为模板，采用引物VP2-F和VP2-R进行PCR扩增。

混匀后进行PCR扩增。循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性1min，梯度退火温度为40℃～65℃，退火1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。另设阴性对照，其中不加模板，其余成分相同，用灭菌去离子水补齐至相同体积。

扩增结束后，取1μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳上观察片段大小和亮度，选择最适的退火温度(62℃)进行VP2抗原基因的扩增，PCR产物利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化。

2、pBGD-Flag-VP2重组载体的构建

pBGD载体为本发明的发明人自主设计载体(序列1)，该载体上pelB leader信号肽编码基因(序列1的第167-232位)下游有NheI、BamH I酶切位点，便于抗原片段插入。

取步骤1获得的VP2抗原基因胶回收产物与pBGD载体进行NheI、BamHI双酶切，37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将上述酶切产物进行胶回收。将回收后的VP2抗原基因及pBGD载体酶切片段利用T4Ligase进行连接。将2μl上述连接产物加入到步骤六制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行转化，次日，挑取单克隆提取质粒，进行NheI、BamH I双酶切鉴定。

结果显示：酶切后的目的条带大小约为1347bp，与预期结果一致。

将初步鉴定正确的质粒送样测序。将经测序表明在pBGD载体的酶切位点Nhe I和BamHI之间插入由序列5和序列3顺次首尾相连后所得序列(即VP2-Flag融合基因的序列)的重组质粒命名为pBGD-VP2-Flag。

九、抗原抗体共表达文库的构建

pBGD载体上NlpA leader信号肽编码基因(序列1的第5258-5344位)下游有Sfi I酶切位点，可以将scFv片段从步骤七构建的pTch1-1-scFv文库上切下来再连接到步骤八构建的pBGD-Flag-VP2载体的NlpA leader信号肽编码基因下游，构建成抗原抗体共表达细菌展示文库。

取步骤七构建的pTch1-1-scFv文库和步骤八构建的pBGD-Flag-VP2载体进行SfiI酶切，37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将上述酶切产物进行胶回收。将回收的scFv片段及pBGD-Flag-VP2载体酶切片段利用T4Ligase进行连接。将2μl上述连接产物加入到步骤六制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行电转化构建成抗原抗体共表达的文库。转化后次日挑取单克隆提取质粒，进行Sfi I酶切鉴定。

结果显示：酶切后获得一条大小约为735bp的目的条带(与预期结果一致)。将经酶切鉴定正确的重组载体库命名为pBGD-Flag-VP2-scFv。

此步中用到的限制内切酶(SfiI)的识别序列在抗体序列中少见，可避免限制内切酶将一些抗体片段切碎，而且就用SfiI一种限制内切酶，可以避免双酶切过程中由于反应条件的不一致而导致酶切效率降低，致使酶切不完全，以致抗体文库的库容量降低。

十、大肠杆菌DH5α的诱导及原生质球制备

收集步骤九构建的文库所有菌落用LB液体培养基稀释至OD₆₀₀≈0.2，37℃培养2h，使之OD₆₀₀≈0.4，加入IPTG至终浓度为2.5mmol/L，37℃诱导4h。

在1.5ml Eppendorf管中加入1.5ml培养物，6 000rpm离心3min，去掉上清。菌体沉淀用350μl蔗糖(0.75mmol/L)/Tris(0.1mol/L)溶液重悬；加入35μl浓度为10mg/ml新鲜配制的溶菌酶母液(溶剂为350μl蔗糖(0.75mmol/L)/Tris(0.1mol/L)溶液，溶菌酶的酶活为20U/g)；逐滴加入700μl 1mmol/L EDTA溶液(溶剂为水)，同时涡旋混匀；冰上孵育15min；加入50μl 0.5mol/L MgCl₂溶液，并在冰上孵育10min；4℃，10000rpm离心10min；收集沉淀即为原生质球。原生质球沉淀用1ml PBS溶液重悬洗涤，6 000rpm离心3min，去上清；原生质球沉淀用100μl PBS重悬。

十一、流式细胞术筛选大肠杆菌DH5α展示文库

细菌细胞壁被溶菌酶打孔后形成原生质球，此时抗原、抗体等物质均可透过细胞壁与细胞膜相接触发生反应。用FITC标记的Flag抗体(Sigma公司产品，其产品目录号为F4049)孵育细胞膜上与锚定的scFv结合的Flag-VP2抗原片段，如果表达成功或所表达scFv为阳性克隆则能够检测到荧光，反之则不能。具体方法如下：

在100μl步骤十获得的PBS重悬菌液(已经IPTG诱导)中加入10μl 1％(1g/100ml)BSA贮存液、5μg FITC标记的Flag抗体，冰上避光孵育1h；8 000rpm，离心3min，1ml PBS重悬洗涤一次，沉淀用100μl PBS重悬。设置阴性对照，将含重组载体库pBGD-Flag-VP2-scFv中重组质粒的菌液(未经IPTG诱导)处理成为原生质球后用FITC标记的Flag抗体孵育。用流式细胞仪于488nm波长激光下检测样品及阴性对照的荧光强度，收集样品中荧光强度高于阴性对照的部分。

将分选所得细菌进行质粒提取、电击转化至新的大肠杆菌DH5α，构建次级筛选库，按上述的方法进行第二轮筛选(FITC标记的Flag抗体用量降低为3μg)，将每个峰值范围内的细胞分选出来，制备质粒后转化大肠杆菌DH5α，构建次级筛选库，按上述的方法进行第三轮筛选(FITC标记的Flag抗体用量降低为1.5μg)后，挑取单菌落20个，扩培后逐个用流式细胞仪进行检测，选出荧光信号比阴性对照强的克隆，进行测序并分析。在后面几步筛选中逐渐降低FITC标记的Flag抗体，有利于筛选到亲和力更强的抗体。

本发明通过从分选出来的细菌中提取质粒、电转化新的大肠杆菌DH5α的方式拯救阳性抗体基因，简化了试验程序，也避免了传统PCR拯救可能造成的突变和链置换的发生，增加了该方法的可行性和实用性。而且在提取质粒的时候加入不含任何质粒的感受态细菌，这样可以减少提取质粒时不可避免的损失(粘附损失)，可以增加最后提取质粒的总量。

经过三轮筛选，得到一个与VP2抗原具有结合能力的单克隆抗体，将其命名为anti-VP2scFv抗体。

anti-VP2scFv抗体(为单链抗体)的编码基因为序列表中序列7所示，编码序列表中序列6所示的anti-VP2scFv抗体。

十二、单链抗体表达载体(pET-27b-anti-VP2scFv)的构建

利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计PCR引物用于单链抗体基因的克隆。设计上游引物时加入Nco I酶切位点，下游加入Hind III酶切位点，由Invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

anti-VP2scFv-F：CATGCCATGGGT-GCCGTGACGTTGGACGAG(下划线部分为Nco I的识别序列，-后的序列为序列7的第1-18位)；

anti-VP2scFv-R：CCCAAGCTTTTA-ACCTAGGACGGTCAGGG(下划线部分为Hind III的识别序列，-后的序列为序列7的第716-732位的反向互补序列)。

使用上述引物对以经步骤十一流式细胞(FACS)筛选得到的重组质粒(携带序列表中序列7所示DNA片段，可表达序列6所示anti-VP2scFv抗体)为模板PCR扩增基因片段。循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，20个循环后，72℃延伸10min。扩增结束后，取1μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳上观察片段大小。结果显示，PCR产物大小约为732bp。PCR产物利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化。纯化后和pMD18-T载体进行连接、转化、挑取单克隆、提质粒并送测序。将经测序表明在pMD18-T载体上连接了“CATGCCATGGGT-序列7-TAAAAGCTTGGG”所示DNA片段后的重组质粒命名为pMD18-T-anti-VP2scFv。

用限制性内切酶Nco I和Hind III酶切pMD18-T-anti-VP2scFv质粒，回收大小约为732bp的目的片段，与经过同样双酶切的pET-27b载体(购自Novagen公司，Cat.No.69337-3)骨架大片段相连。将10μl上述连接产物先用大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化，挑取单克隆，提取质粒后Nco I和Hind III酶切鉴定。将酶切初步鉴定正确(得到大小约为5414bp和732bp的两个条带)的重组质粒测序。将经测序表明在pET-27b载体的酶切位点Nco I和Hind III之间插入了“GT-序列7-TAA”所示DNA片段后的重组质粒命名为pET-27b-anti-VP2scFv。

十三、重组质粒pET-27b-anti-VP2scFv在大肠杆菌中的表达和纯化

取10ng步骤十一获得的阳性重组质粒pET-27b-anti-VP2scFv转化Rosetta(DE3)感受态菌，涂布于含有50μg/ml Kan的LB固体培养基平板上，37℃培养12～16h。

挑取几个转化菌分别接种于含浓度50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集菌体进行PCR鉴定。

挑取鉴定正确的pET-27b-anti-VP2scFv质粒转化Rosetta(DE3)单菌落，接种于含有50μg/ml Kan的LB液体培养基中。次日取上述培养物按照1％(体积比)的比例接种于含有100μg/ml Kan的培养基中，37℃培养2h，当OD₆₀₀值至约0.4时，加入IPTG(至终浓度为0.25mmol/L)，37℃培养，诱导4h。另设不加IPTG诱导的对照组，其余条件相同。

诱导结束后分别取诱导组和对照组培养物1ml加入1.5ml Ep管中，室温12000r/m离心1min收集菌体。弃上清，用100μl的预冷PBS(pH7.4)洗涤菌体沉淀，室温12 000r/m离心1min后弃上清。向诱导组菌体中加入100μl的预冷PBS(pH7.4)悬浮后超声破碎，12 000r/m离心10min，吸取上清至另一Ep管中，向沉淀中加入100μl预冷PBS(pH7.4)重悬。同时对照组用100μl预冷PBS(pH7.4)重悬。

向诱导组上清、诱导组沉淀和对照组菌体悬浮液中加入1/3体积4×SDS样品缓冲液(含DTT)，100℃煮沸5min。取20μl样品进行15％SDS-PAGE。电泳后，经考马斯亮蓝R-250染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色观察结果以确定目的蛋白的表达情况。

结果显示(图2)：anti-VP2scFv抗体主要以包涵体的形式表达于大肠杆菌中。

将诱导组诱导后菌体离心弃上清，用适量PBS重悬并加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰上放置60min，超声破碎，4℃，10000g离心30min，收集包涵体，洗涤后用溶解缓冲液(8mol/L尿素溶液，pH8.0)充分溶解。用100毫升溶解缓冲液(8mol/L尿素水溶液，pH8.0)充分溶解，然后上样于HiLoad 16/60Superdex75pg柱子(购自GE公司)，然后用500毫升复性缓冲液(2mol/L尿素水溶液，pH8.0)洗脱并收集过柱后的洗脱液，然后在PBS缓冲液中透析过夜，得到溶液即为anti-VP2scFv抗体溶液。所有步骤均在4℃环境下。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，利用高效液相色谱仪(购自Waters公司)对其纯度进行分析。并用紫外分光光度计(ND-1000型Spectrophotometer)检测其浓度。

结果显示：纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳可得到大小约为28KD的蛋白条带(蛋白条带大小与预期结果一致)(图3)，回收蛋白条带并测序，N端前15个氨基酸残基如序列表中序列6的第1-15位氨基酸残基所示，即AVTLDEPGGGLQTPG。另外，蛋白纯度达到87％，浓度达到1.4mg/ml。

十四、ELISA检测anti-VP2scFv抗体的亲和力和特异性

(一)ELISA检测anti-VP2scFv抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力

1、分别用蛋白浓度为300μg/ml、60μg/ml、12μg/ml、2.4μg/ml的anti-VP2scFv抗体溶液(即步骤十三制备的anti-VP2scFv抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度)包被酶标板，4℃过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

2、每孔加入100μl蛋白浓度为40μg/ml的VP2蛋白溶液(VP2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4，用PBS缓冲液调整蛋白浓度)，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

3、加入血清抗体(B87株免疫鸡得到的，工作浓度为1:200倍稀释)，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

4、加入HRP标记的兔抗鸡抗体(Cat.No.11-7018购自eBioscience公司，工作浓度为1:7500倍稀释)，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

5、加入TMB底物显色液，37℃避光显色5min。

6、每孔加入50μl 2mol/L的H₂SO₄水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值。

设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的anti-VP2scFv抗体溶液、步骤2中的VP2蛋白溶液和步骤3中的抗体的PBS组。步骤1中用蛋白浓度为300μg/ml的anti-VP2scFv抗体溶液包被酶标板时：设置步骤2中不加入VP2蛋白溶液的对照组1，步骤3中不加入抗体的对照组2，步骤2中不加入VP2蛋白溶液且步骤3中不加入抗体的对照组3，用等体积且等蛋白浓度的BSA溶液代替VP2蛋白溶液的对照组4。

每个处理设置3个复孔。

结果见图4。ELISA结果表明，anti-VP2scFv抗体可以与VP2蛋白特异性结合。

(二)ELISA检测anti-VP2scFv抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力

1、用蛋白浓度为300μg/ml的anti-VP2scFv抗体溶液(即步骤十三制备的anti-VP2scFv抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度)包被酶标板，4℃过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

2、每孔加入100μl IBDV病毒液(病毒剂量为10^5.0TCID₅₀)，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

5、加入TMB底物显色液，37℃避光显色5min。

分别采用如下IBDV的毒株进行上述实验：Gt株、NF8株、1-65株、BJ836株、MB株、B87株。

设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的anti-VP2scFv抗体溶液、步骤2中的IBDV病毒液和步骤3中的抗体的PBS组。设置步骤2中不加入IBDV病毒液的对照组1，步骤3中不加入抗体的对照组2，步骤2中不加入IBDV病毒液且步骤3中不加入抗体的对照组3，用等体积等滴度的新城疫病毒液代替IBDV病毒液的对照组4。

每个处理设置3个复孔。

结果见图5。ELISA结果表明，anti-VP2scFv抗体可以与不同IBDV毒株特异性结合，对不同的IBDV毒株具有不同的亲和力。

十五、anti-VP2scFv抗体的中和活性测定

(一)IBDV滴度的测定

将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基10¹至10¹¹梯度稀释的IBDV病毒液(B87株)接种到单层细胞中(每孔100μl)，每一稀释度接种8个细胞孔；设置不加入IBDV病毒液的对照组。将细胞培养板放到细胞培养箱中，37℃、5％CO₂培养，连续观察7天，每天记录细胞生长状态。计算病毒滴度，第7天结果见表1。

表1 IBDV滴度的测定的结果

稀释度	出现CPE的细胞孔的数目	未出现CPE的细胞孔的数目	CPE百分比
				10¹	8	0	100％
10²	8	0	100％
				10³	8	0	100％
10⁴	8	0	100％
				10⁵	8	0	100％
10⁶	4	4	50％
				10⁷	3	5	37.5％
10⁸	0	8	0％
				10⁹	0	8	0％
10¹⁰	0	8	0％
				10¹¹	0	8	0％
10¹²	0	8	0％

按照Reed-Muench两氏法计算TCID₅₀＝10^-6.8/0.1ml。

(二)anti-VP2scFv抗体的中和活性

将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基梯度稀释后的anti-VP2scFv抗体溶液(即步骤十三制备的anti-VP2scFv抗体溶液)和100TCID₅₀的IBDV病毒液(B87株)等体积混合并37℃孵育1h，然后接种到单层细胞中，每一梯度接种8个细胞孔；设置不加入抗体溶液且不加入病毒液的正常对照，设置只不加入抗体溶液只加入病毒液的病毒对照。将细胞培养板放到细培养箱中，37℃，5％CO₂培养连续观察7天，每天记录细胞生长状态。第7天结果见表2。

表2 anti-VP2scFv抗体的中和活性的测定的结果

梯度稀释后的scFv抗体溶液中的蛋白浓度(μg/ml)	CPE百分比(％)
		300	0
150	0
		75	0
37.5	0
		18.75	0
9.375	0
		4.688	0
2.344	0
		1.172	100
0.586	100

结果表明，anti-VP2scFv抗体具有中和活性，阻断或抑制CPE的最小蛋白浓度为2.344μg/ml。

十六、anti-VP2scFv抗体对IBDV感染鸡的保护作用

(一)安全性检测

取10只13日龄SPF雏鸡，分别胸肌注射蛋白浓度为2mg/ml的anti-VP2scFv抗体溶液(即步骤十三制备的scFv抗体溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度)，每只1ml，观察14天。无注射局部及全身不良反应。

(二)IBDV半致死率的测定

取9日龄的鸡胚，分成9组，每组10只，第1组至第8组，分别注射200μL用PBS缓冲液稀释后的稀释梯度为10¹-10⁸的传染性法氏囊病病毒HB/11株病毒液，第9组为生理盐水的对照组(每胚注射200μl生理盐水)。观察3-6天，记录鸡胚存活情况。

结果显示：6天后的鸡胚半数感染量EID₅₀为10^7.5/0.1ml

(三)抗体效力试验

13日龄SPF鸡分为五组，每组10只。

第一组：每只胸肌注射0.2ml PBS缓冲液；

第二组：接种B87株疫苗，每只胸肌注射0.2ml；

第三组：每只胸肌注射anti-VP2scFv抗体溶液(1mg蛋白/kg体重)，每只注射0.2ml；

第四组：每只胸肌注射anti-VP2scFv抗体溶液(0.5mg蛋白/kg体重)，每只注射0.2ml；

第五组：每只胸肌注射anti-VP2scFv抗体溶液(0.1mg蛋白/kg体重)，每只注射0.2ml。

免疫21天后检测中和抗体效价并接种传染性法氏囊病病毒HB/11株病毒液(每只胸肌注射0.2ml，接种剂量为4×10⁴EID₅₀)进行攻毒。

中和抗体效价的测定方法(微量滴定法)：(1)取血清，56℃水浴灭活30min，自然冷却，用Hank’s液将血清作2倍系列稀释(从1：2稀释到1：16384)，每种稀释液加入等体积病毒悬液(100TCID₅₀/0.1ml)充分震荡混合，37℃培养1h；将(2)鸡成纤维细胞接种于细胞培养板，每孔100微升，每孔加入100微升步骤(1)得到的混合液；设置正常对照、阴性血清对照、阳性对照及病毒对照；37℃，5％CO₂培养，连续观察3-5天，若抗体有中和活性，则DF1细胞不会出现病变，计算第7天的抗体效价(即能抑制DF1细胞发生病变的最大稀释度)。结果见表3。

攻毒72h后，统计每组中死亡鸡的只数。结果见表3。

表3抗体效价结果和每组的死亡鸡数

浓度	中和抗体效价	死亡鸡数
			第一组	1：2³	6/10
第二组	1：2¹²	0/10
			第三组	1：2¹⁰	1/10
第四组	1：2⁹	1/10
			第五组	1：2⁸	2/10

实施例2、抗乙肝表面抗原前S1的单链抗体的筛选

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙型病毒性肝炎(简称乙肝)是一类严重危害人体健康的感染性疾病，全球约有3.5亿人感染乙肝病毒(HBV)，其中近10％的病人可因持续感染导致慢性化、肝硬化或肝细胞癌，乙型肝炎的防治已成为一个全球性公共卫生问题。乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。致病性的HBV颗粒是一种直径约为42nm的球形DNA被膜病毒颗粒，其被膜外壳的主要成分是乙肝表面抗原(HBsAg)和来自宿主的脂质，在HBsAg中前S1蛋白在病毒颗粒的装配、感染以及肝癌发生中起重要作用。抗preS1的抗体可以阻断HBV的preS1和肝细胞结合，具有中和病毒的作用，与HBV感染的恢复有关，但是获得人抗preS1的抗体十分困难，因而限制了其临床应用。随着基因工程细菌展示抗体库技术的出现，使获得基因工程人抗preS1抗体成为可能。基因工程重组抗体作为高亲和性、以蛋白为基础的靶向诊断和治疗用生物制品，在病毒性疾病防制方面越来越受到重视。因此有必要研制抗preS1的基因工程抗体药物，填补应用基因工程抗体治疗乙肝的空白。

本实施例收集表面抗原抗体高效价的献血者血液，从中分离出白细胞，利用TRIZOL提取外周血白细胞的RNA后反转录为cDNA。根据GenBank上的人抗体框架区序列，设计出克隆抗体可变区的简并引物，以cDNA为模板，使用PCR的方法克隆抗体可变区。使用高效的电转化方法，将VH与VL片段分别插入到pTch1载体Linker的上游和下游，构建出scFv抗体库再将其连入到pBGD细菌展示载体NlpA leader的下游，在这之前先将抗原片段插入pelB leader的下游，构建抗原抗体共表达的细菌表面展示文库。应用流式细胞仪对抗体文库进行筛选，将筛选到的单克隆基因连入pET-27b载体，并进行诱导表达。

一、初始样本

以表面抗原抗体高效价的献血者的外周血白细胞为初始样本，作为抗体库基因的来源。这不但可以增加天然抗体的峰度，而且从中可以挑选出针对流行毒株的中和抗体，达到事半功倍的作用。

二、RNA的提取

取新鲜外周血白细胞10⁶预冷的Eppendorf(Ep)管中加1ml冷TRIzol，反复吹打，混匀，冰上放置10min，12000rpm，4℃离心10min。将上清转移至新的Ep管中，加200μl预冷的酚氯仿(酚：氯仿＝1:5，体积比)，剧烈振荡混匀30sec，12000rpm，4℃离心10min。取上清，重复加入200μl酚氯仿振荡后离心。取上清，加等体积冷异丙醇，-20℃放置15min，12000rpm，室温离心10min。小心吸去上清液，将离心管倒置，使液体尽量流干。用1ml预冷75﹪乙醇，12000rpm，4℃离心5min洗涤RNA沉淀，弃上清，重复3次，室温干燥。用30μl灭菌DEPC水溶解RNA，-20℃保存备用。

三、cDNA的合成

四、克隆scFv文库引物的设计

引物的准确性和高效性是克隆可变区基因的关键，本发明的发明人根据GenBank人抗体框架区序列，设计PCR扩增引物用于轻链和重链可变区的扩增，并在重链可变区基因上下游分别加入HindI II、Nhe Ⅰ酶切位点，轻链可变区基因上下游分别加入BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点，引物由TaKaRa公司合成。引物序列具体如下：

轻链分Kappa型和Lambda型

Kappa链上游：BamH I酶切位点(下划线部分)

KU1：

5'-CGCGGATCCGACATCCAGATGACCCAGT-3'；

5'-CGCGGATCCGACATCGTGATGACCCAGT-3'；

5'-CGCGGATCCGATATTGTGATGACTCAGTCTCCA-3'；

5'-CGCGGATCCGAAATTGTGTTGACGCAGT-3'；

5'-CGCGGATCCGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCA-3'；

5'-CGCGGATCCGAAACGACACTCACGCAGTCTCCA-3'。

Kappa链下游：Xho I酶切位点(下划线部分)

KD1：

5'-CCGCTCGAGTTAACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3'；

5'-CCGCTCGAGTTAACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3'；

5'-CCGCTCGAGTTAACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3'；

5'-CCGCTCGAGTTAACGTTTTATTTCCACCTTGGTCCC-3'；

5'-CCGCTCGAGTTAACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3'；

5'-CCGCTCGAGTTAACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3'。

Lambda上游：BamH I酶切位点(下划线部分)

LU1：

5'-CGCGGATCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTG-3'；

5'-CGCGGATCCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCAC-3'；

5'-CGCGGATCCTCCTATGAGCTGACACAGCCAC-3'；

5'-CGCGGATCCTCCTATGAGCTGACTCAGCCAC-3'；

5'-CGCGGATCCTCCTATGAGCTGACTCAGGCAC-3'；

5'-CGCGGATCCAATTTTATGCTGACTCAGCCCC-3'；

5'-CGCGGATCCTCGTCTGAGCTGACTCAGGACC-3'；

5'-CGCGGATCCTCTGAGCTGACTCAGGACCCTG-3'。

Lambda下游：Xho I酶切位点(下划线部分)

LD1：

5'-CCGCTCGAGTTACTAGGACGGTCAGCTTGGTCC-3；5'-CCGCTCGAGTTAACCTAGGACGGTGACCTTGGTC-3'；5'-CCGCTCGAGTTAACCTAGGACGGTCAGCTTGGTC-3'；5'-CCGCTCGAGTTACTGTGACGGTCAGCTTGGTCCC-3'。重链

Ig Gamma链上游：Hind III酶切位点(下划线部分)

IGU1：

5'-CCCAAGCTTGAGGTGCAGCTGCTCGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTGAGGTGCAGTTGTTGGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTGAGGTGCAGCTGGTGGAATCT-3'；

5'-CCCAAGCTTGAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCC-3'；

5'-CCCAAGCTTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTGCAGATGGTGGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTGCAACTGGTGGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTGCAGCTGGTGGAATCT-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTGCAGTTGGAAGAATCT-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTGCAGTTGGAGGAATCT-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCG-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTGAGGTGCAGCTGCTGGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTCCAGCTGGTGCAG-3'；

5'-CCCAAGCTTCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3'；

Ig Gamma链下游：Nhe I酶切位点(下划线部分)

IGD1：

5'-CGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTC-3'；

5'-CGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCATGGTC-3'；

5'-CGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3'；

5'-CGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCAGGGTT-3'；

5'-CGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3'；

5'-CGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGATT-3'。

五、抗体可变区的PCR扩增

以步骤三中合成的cDNA为模板，分别以VH上下游引物和VL上下游引物进行梯度PCR扩增，确定最佳退火温度。其中，VL上下游引物中针对Kappa链和Lambda链的引物分开单独使用，即扩增Kappa链的VL时，上游引物为KU1中的各条引物的等摩尔混合物，下游引物为KD1中的各条引物的等摩尔混合物；扩增Lambda链的VL时，上游引物为LU1中的各条引物的等摩尔混合物，下游引物为LD1中的各条引物的等摩尔混合物。采用VH上下游引物进行PCR扩增时，上游引物为IGU1中的各条引物的等摩尔混合物，下游引物为IGD1中的各条引物的等摩尔混合物。

PCR反应(25μl体系)如下：10×PCR buffer 2.5μl；dNTPs 2.0μl；模板1.0μl(10ng)；上游引物1.0μl(混合后引物的浓度为10pmol/μl)；下游引物1.0μl(混合后引物的浓度为10pmol/μl)；Taq酶0.5μl；ddH₂O 17μl。

混匀后进行PCR扩增。循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性1min，梯度退火温度为48.5℃～61.5℃(48.5℃、48.9℃、49.8℃、51.1℃、52.6℃、54.2℃、55.8℃、57.4℃、58.9℃、60.2℃、61.1℃、61.5℃)，退火1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。另设阴性对照，其中不加模板，其余成分相同，用灭菌去离子水补齐至相同体积。

扩增结束后，取1μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳上观察片段大小和亮度，选择最适的退火温度(Kappa链的最适的退火温度为：57.4℃，Lambda链的最适的退火温度为：61.1℃，VH链的最适的退火温度为：58.9℃)进行抗体可变区的扩增。PCR反应(250μl体系)如下：10×PCRbuffer 25μl；dNTPs 20μl；模板10μl(10ng)；上游引物10μl(10pmol/μl)；下游引物10μl(10pmol/μl)；Taq酶5μl；ddH₂O 170μl。

PCR产物利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化，并将对Kappa链、Lambda链PCR反应的扩增产物混合。其中，VH约385bp，VL约345bp。

六、大肠杆菌电转化感受态细胞的制备

每管感受态细胞加入5ng pUC19标准质粒，3kV、25μF、200Ω条件下进行电转，加入400μl LB培养基37℃振荡培养1h，涂布平板，37℃培养12～16h，次日观察电转化结果并计算转化率。结果显示：转化效率为1.1×10⁹。

七、pTch1-2-scFv文库的构建

pTch1-2载体为本发明的发明人自主设计的载体(序列13)，其linker序列为人的CH1的前15个氨基酸，用于连接着VH和VL，CH1前端有Hind III、Nhe I酶切位点，后端有BamHI、Xho I酶切位点，便于VH片段和VL片段插入。

人的重链恒定区CH1的前15个氨基酸的编码序列：

5’-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCT-3’(序列11的第382-426位)

人的重链恒定区CH1的前15个氨基酸的序列为序列表中序列10的第128-142位。

取步骤五获得的VH胶回收产物与pTch1-2载体进行Hind III、Nhe I双酶切，37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将上述酶切产物进行胶回收。将VH及pTch1-2酶切片段利用T4Ligase进行连接。将2μl上述连接产物加入到步骤六制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行电转化构建VH抗体库。

次日，收集所有菌落并提取质粒，进行Xho I、BamH I双酶切，同时用XhoI、BamH I对步骤五获得的VL回收产物进行双酶。酶切后进行胶回收，连接并转化步骤六获得的大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布平板，37℃过夜培养。收集菌落并提取质粒，即为pTch1-2-scFv文库。

取构建的pTch1-2-scFv文库进行酶切鉴定和PCR鉴定。用Hind III、Nhe I和Xho I、BamHI对pTch1-2-scFv文库进行双酶切。取pTch1-2-scFv文库质粒为模板，分别使用VH上游引物和VL下游引物对其进行PCR鉴定。

结果显示(图6)，VH和VL已经连在一起，大小约770bp。

八、将抗原连入pBGD质粒pelB leader下游

设计乙肝病毒前S1抗原的PCR引物，上游引物加入Nhe I酶切位点，下游引物加入Flag序列(核苷酸序列为序列表中序列3所示，编码序列表中序列2所示的Flag蛋白)和BamHI酶切位点。

乙肝病毒前S1抗原：氨基酸序列为序列表中序列8所示，其编码基因如序列表中序列9所示。

preS1-F：GCTAGCATGGGAGGTTG(下划线部分为Nhe I的识别序列，其后的序列为序列表中序列9的第1-11位)

preS1-R：GGATCCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGCCTGAGGATG(下划线部分为BamHI的识别序列，斜体部分为Flag标签的编码基因序列，其后的序列为序列表中序列9的第346-357位的反向互补序列)。

以人工合成的基因库里GenBank Accession No.AB205124的所示的HBV基因组序列为模板，采用引物preS1-F和preS1-R进行PCR扩增。

扩增结束后，取1μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳上观察片段大小和亮度，选择最适的退火温度(48.9℃)进行抗体可变区的扩增，PCR产物利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化。

2、pBGD-Flag-preS1重组载体的构建

取步骤1获得的前S1胶回收产物与pBGD载体进行Nhe I、BamH I双酶切，37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将上述酶切产物进行胶回收。将回收后的preS1抗原及pBGD载体酶切片段利用T4Ligase进行连接。将2μl上述连接产物加入到步骤六制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行转化，次日，挑取单克隆提取质粒，进行Nhe I、BamH I双酶切鉴定。

结果显示：切下大小约为381bp的preS1-Flag融合基因片段。

将初步鉴定正确的质粒送样测序。将经测序表明在pBGD载体的酶切位点Nhe I和BamHI之间插入“由序列9和序列3顺次首尾相连后所得序列(即preS1-Flag融合基因的序列)的重组质粒命名为pBGD-preS1-Flag。

九、抗原抗体共表达文库的构建

pBGD载体上NlpA leader信号肽编码基因(序列1的第5258-5344位)下游有Sfi I酶切位点，可以将scFv片段从步骤七构建的pTch1-2-scFv文库上切下来再连接到步骤八构建的pBGD-Flag-preS1载体的NlpA leader信号肽编码基因下游，构建成抗原抗体共表达细菌展示文库。

取步骤七构建的pTch1-2-scFv文库和步骤八构建的pBGD-Flag-preS1载体进行SfiI酶切，37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将上述酶切产物进行胶回收。将回收的scFv片段及pBGD-Flag-preS1载体酶切片段利用T4Ligase进行连接。将2μl上述连接产物加入到步骤六制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行电转化构建成抗原抗体共表达的文库。转化后次日挑取单克隆提取质粒，进行Sfi I酶切鉴定。

结果显示：切下大小约为760bp的scFv文库片段。将经酶切鉴定正确的重组载体库命名为pBGD-Flag-preS1-scFv。

十、大肠杆菌DH5α的诱导及原生质球制备

收集步骤九构建的文库所有菌落用LB液体培养基稀释至OD₆₀₀≈0.2，37℃培养2h，使之OD₆₀₀≈0.4，加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L，37℃诱导4h。

收集2mL培养物，12 000rpm离心1min，弃上清。菌体沉淀用350μl Sucrose(0.75mmol/L)/Tris(0.1mol/L)solution重悬；加入35μl浓度为10mg/ml新鲜配制的溶菌酶母液(溶剂为350μl Sucrose(0.75mmol/L)/Tris(0.1mol/L)solution，溶菌酶的酶活为20U/g)；逐滴加入700μl 1mmol/L EDTA溶液(溶剂为水)，同时涡旋混匀；冰上孵育15min；加入50μl 0.5mol/L MgCl₂溶液，并在冰上孵育10min；4℃，10 000rpm离心10min；原生质球沉淀用1ml PBS溶液重悬洗涤，6 000rpm离心3min，去上清；原生质球沉淀用100μl PBS重悬。

十一、流式细胞术筛选大肠杆菌DH5α展示文库

细菌细胞壁被溶菌酶打孔后形成原生质球，此时抗原、抗体等物质均可透过细胞壁与细胞膜相接触发生反应。用FITC标记的Flag抗体(Sigma公司产品，其产品目录号为F4049)孵育细胞膜上与锚定的scFv结合的Flag-preS1抗原片段，如果表达成功或所表达scFv为阳性克隆则能够检测到荧光，反之则不能。具体方法如下：

在100μl PBS重悬的菌液(已经IPTG诱导)中加入10μl 1％(1g/100ml)BSA贮存液、5μg FITC标记的Flag抗体，冰上避光孵育1h；8 000rpm，离心3min，1ml PBS重悬洗涤一次，沉淀用100μl PBS重悬。设置阴性对照，将含重组载体库pBGD-Flag-preS1-scFv中重组质粒的菌液(未经IPTG诱导)处理成为原生质球后用FITC标记的Flag抗体孵育。用流式细胞仪于488nm波长激光下检测样品及阴性对照的荧光强度，收集样品中荧光强度高于阴性对照的部分。

将分选所得细菌进行质粒、电击转化至新的大肠杆菌DH5α，构建次级筛选库，按上述的方法进行第二轮筛选(FITC标记的Flag抗体用量降低为3μg)，将每个峰值范围内的细胞分选出来，制备质粒后转化大肠杆菌DH5α，构建次级筛选库，按上述的方法进行第三轮筛选(FITC标记的Flag抗体用量降低为1.5μg)后，挑取单菌落20个，扩培后逐个用流式细胞仪进行检测，选出荧光信号比阴性对照强的克隆，进行测序并分析。在后面几步筛选中逐渐降低FITC标记的Flag抗体，有利于筛选到亲和力更强的抗体。

流式细胞筛选结果如图7所示。经过三轮筛选，得到一个与preS1抗原具有结合能力的单克隆抗体，将其命名为anti-preS1scFv抗体。

anti-preS1scFv抗体(为单链抗体)的编码基因为序列表中序列11所示，编码序列表中序列10所示的anti-preS1scFv抗体。

十二、单链抗体表达载体(pET-27b-anti-preS1scFv)的构建

利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计PCR引物用于单链抗体基因的克隆。设计上游引物时加入Nco I酶切位点，下游加入XhoI酶切位点，由Invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

anti-preS1scFv-F：CCATGGGT-TCGGTGCAGTTGGTG(下划线部分为Nco I的识别序列，-后的序列为序列11的第1-15位)；

anti-preS1scFv-R：CTCGAGTTAACGTTTGATATCC(下划线部分为XhoI的识别序列，-后的序列为序列11的第753-768位的反向互补序列)。

使用引物以经步骤十一流式细胞(FACS)筛选得到的重组质粒(携带序列表中序列11所示DNA片段，可表达序列10所示anti-preS1scFv抗体)为模板PCR扩增基因片段。循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，20个循环后，72℃延伸10min。扩增结束后，取1μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳上观察片段大小。结果显示，PCR产物大小约为768bp。PCR产物利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化。纯化后和pMD18-T载体进行连接、转化、挑取单克隆、提质粒并送测序。将经测序表明在pMD18-T载体上连接了“CCATGGGT-序列11-CTCGAG”所示DNA片段后的重组质粒命名为pMD18-T-anti-preS1scFv。

用限制性内切酶Nco I和XhoI酶切pMD18-T-anti-preS1scFv质粒，回收大小约为768bp的目的片段，与经过同样双酶切的pET-27b载体(购自Novagen公司，Cat.No.69337-3)骨架大片段相连。将10μl上述连接产物先用大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化，挑取单克隆，提取质粒后Nco I和XhoI酶切鉴定。将酶切初步鉴定正确(得到大小约为5414bp和768bp的两个条带)的重组质粒测序。将经测序表明在pET-27b载体的酶切位点Nco I和XhoI之间插入了“GT-序列11”所示DNA片段后的重组质粒命名为pET-27b-anti-preS1scFv。

十三、重组质粒pET-27b-anti-preS1scFv在大肠杆菌中的表达和纯化

取10ng步骤十二获得的阳性重组质粒pET-27b-anti-preS1scFv转化Rosetta(DE3)感受态菌，涂布于含有50μg/ml Kan的LB固体培养基平板上，37℃培养12～16h。

挑取鉴定正确的pET-scFv转化Rosetta(DE3)单菌落，接种于含有50μg/ml Kan的LB液体培养基中。次日取上述培养物按照1％(体积比)的比例接种于含有100μg/ml Kan的培养基中，37℃培养2h，当OD₆₀₀值至约0.4时，加入IPTG(至终浓度为0.25mmol/L)，37℃培养，诱导4h。另设不加IPTG诱导的对照组，其余条件相同。

结果显示(图8)：anti-preS1scFv抗体主要以包涵体的形式表达于大肠杆菌中。

将诱导组诱导后菌体离心弃上清，用适量PBS重悬并加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰上放置60min，超声破碎，4℃，10000g离心30min，收集包涵体，洗涤后用溶解缓冲液(8mol/L尿素溶液，pH8.0)充分溶解。用100毫升溶解缓冲液(8mol/L尿素水溶液，pH8.0)充分溶解，然后上样于HiLoad 16/60Superdex75pg柱子(购自GE公司)，然后用500毫升复性缓冲液(2mol/L尿素水溶液，pH8.0)洗脱并收集过柱后的洗脱液，然后在PBS缓冲液中透析过夜，得到溶液即为anti-preS1scFv抗体溶液。所有步骤均在4℃环境下。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，利用高效液相色谱仪(购自Waters公司)对其纯度进行分析。并用紫外分光光度计(ND-1000型Spectrophotometer)检测其浓度。结果显示：纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳可得到大小约为27.1KD的蛋白蛋白条带(蛋白条带大小与预期结果一致)(图9)，回收蛋白条带并测序，N端前15个氨基酸残基如序列表中序列10的第1-15位氨基酸残基所示，即SVQLVESGGGLVQPG。另外，蛋白纯度达到78％，浓度达到1.7mg/ml。

十四、ELISA检测anti-preS1scFv抗体的亲合力强弱

将步骤十三制备的anti-preS1scFv抗体包被于ELISA板并4℃过夜，包被浓度梯度为100μg/mL、50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL，用于检测anti-preS1scFv对preS1蛋白的特异性，同时设置阴性对照组。包被过夜后用PBST洗3次，每次2min，用5％(5g/100ml)脱脂奶粉37℃封闭2h，经过洗涤后，加入10μg/mL的preS1蛋白(氨基酸序列为序列表中序列8)，37℃孵育1h，洗涤同前，加入一抗(preS1单克隆抗体，Fitzgerald(Massachusetts,America)公司产品，其产品目录号为Cat.No.10-H07A；稀释2000倍)，孵育洗涤同上。再加入二抗(HRP-goatanti-mouse antibody，eBioscienc(San Diego,America)公司产品，其产品目录号为Cat.No.11-7018；稀释7500倍)，37℃孵育1h，洗涤后，加入TMB底物液，于37℃避光显色5min，每孔加入50μL终止液(2mol/L的H₂SO₄)，用酶标仪于波长450nm下检测其OD值。

设置用等体积的PBS缓冲液代替anti-preS1scFv抗体溶液、preS1蛋白和抗体的PBS组。设置不加入preS1蛋白的对照组1，不加入抗体的对照组2，不加入preS1蛋白且不加入抗体的对照组3，用等体积且等蛋白浓度的抗hIL-1β的scFv(氨基酸序列为序列表中序列14)代替anti-preS1scFv的对照组4。

每个处理设置3个复孔。

结果见图10。ELISA结果表明，anti-preS1scFv抗体可以与preS1蛋白特异性结合。

十五、anti-preS1scFv抗体的中和活性鉴定

将步骤十三制备的anti-preS1scFv抗体，以浓度梯度5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL各200μl和5μg/mL的preS1-FITC(FITC标记的preS1蛋白)在4℃预反应1h后，将反应液和HepG2细胞或Chang细胞(也称为张氏肝细胞或Chang liver cell)(10⁵个细胞)在4℃孵育1h后，PBS洗涤细胞两次，用流式细胞仪进行检测。设置了没有加反应液的空白对照组，只加5μg/mLpreS1-FITC的阳性对照组和用5μg/mL preS2-FITC(FITC标记的preS2蛋白，preS2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列15)代替5μg/mL preS1-FITC的阴性对照组。

结果如图11所示，可见preS1-FITC可与HepG2细胞或张氏肝细胞发生特异性结合，anti-preS1scFv抗体可以和preS1蛋白的功能性表位结合，阻止preS1-FITC与HepG2细胞或张氏肝细胞发生的结合。图12为anti-preS1scFv抗体对preS1-FITC蛋白的抑制率，用图11的结果换算来的抑制率，公式为：[(preS1-FITC组的平均荧光强度-anti-preS1scFv和preS1-FITC组的平均荧光强度)/(preS1-FITC组的平均荧光强度-阴性对照1组的平均荧光强度)]×100。可以看出anti-preS1scFv抗体对preS1-FITC蛋白的抑制成计量依赖性。

从HepG2.2.15细胞培养上清中收集10⁴拷贝的HBV病毒颗粒，和浓度为50μg/ml、100μg/ml的anti-preS1scFv抗体混合充分，在室温(25℃)反应1h。将混合物和Chang细胞(10⁵个细胞)在37℃孵育1h后，弃掉孵育液用PBS洗涤细胞两次，加入培养基在37℃培养箱中继续培养细胞72小时。分别收集细胞上清，用荧光定量PCR的方法检测Chang细胞上清中HBV病毒颗粒的含量，用HBeAg ELISA检测试剂盒检测细胞上清中HBV e抗原的分泌情况，具体步骤如下：

用病毒DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek,Inc.USA)提取细胞上清中HBV DNA，其DNA含量用荧光定量PCR检测，反应体系为：25μl FastStart Universal Probe Master(Roche,Mannheim,Germany)、0.5μl荧光探针、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、18.5μl水充分混匀后加入5μl提取的HBV DNA。循环条件：94℃预变性10min，按照94℃15s→60℃60s扩增40个循环。细胞上清中HBV e抗原的含量用上海科华生物工程股份有限公司生产的乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)进行检测，具体步骤参见说明书。

其中，荧光探针：5'-FAM-CCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-TAMRA-3'；

上游引物：5'-CCATGGGTCTAGTGCAGATGGTG-3'；

下游引物：5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'。

实验同时设置如下对照：阳性对照为只用HBV感染张氏肝细胞；阴性对照为用抗hIL-1β的scFv(氨基酸序列为序列表中序列14)代替anti-preS1scFv。

结果如图13所示，可见实验组Chang细胞上清中HBV病毒颗粒的含量和HBeAg的含量都要比对照组低，且存在显著性差异，说明anti-preS1scFv抗体可以阻止HBV病毒感染张氏肝细胞。将HBeAg换算成抑制率，公式为：[(阳性对照OD₄₅₀-加anti-preS1scFv的OD₄₅₀)/阳性对照OD₄₅₀]×100。从结果(表4)可以看出anti-preS1scFv抗体阻止HBV病毒感染张氏肝细胞成计量依赖性。

表4 anti-preS1scFv抗体阻止HBV病毒感染张氏肝细胞的抑制率

Claims

1.一种获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法，包括如下步骤：

所述已知的抗体框架区序列为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的抗体框架区序列；

所述重链恒定区CH1为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的重链恒定区CH1的前15个氨基酸；

所述信号肽1为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白展示于细菌内膜外侧；

(b2)将所述重组表达载体库中的各重组表达载体转入宿主细菌，得到重组细菌库；所述重组细菌库中各重组细菌中均含有任一种所述重组表达载体；

(b4)去除所述重组细菌库中各重组细菌的外膜，得到原生质球库；所述原生质球库中各原生质球上均展示有任一种所述待检测单链抗体，游离于所述原生质球外的所述靶标抗原-标签融合蛋白能够被所述待检测单链抗体中的特异性单链抗体所捕获，形成抗原抗体复合物；

(b5)将所述原生质球库与经荧光标记的抗所述标签蛋白的抗体共同孵育，只有表面形成了所述抗原抗体复合物的原生质球能够被标记上所述荧光，从所述原生质球库中获得表面被标记上了所述荧光的原生质球，记为荧光-原生质球；所述荧光-原生质球的表面展示的所述待检测单链抗体即为所述目标单链抗体；

对所述质粒测序后获得所述目标单链抗体的基因编码序列。

2.一种获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的方法，其特征在于：所述方法包括权利要求1中的所述A)步骤和所述B)步骤，在所述B)步骤之后还包括如下步骤C)

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述信号肽1为NlpA leader信号肽；和/或

所述信号肽2为pelB leader信号肽。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细菌为大肠杆菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述标签蛋白为Flag蛋白。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(b1)中，所述表达载体为pBD载体；所述pBD载体的序列如序列表中序列1所示。

8.一种用于获得特异于靶标抗原的目标单链抗体或其编码基因的试剂盒，包括表达载体、宿主细菌、经荧光标记的抗标签蛋白的抗体；

所述表达载体含有权利要求1-7任一中所述的信号肽1的编码基因和所述的信号肽2的编码基因，用于共表达权利要求1-7任一中所述的待检测单链抗体和权利要求1-7任一中所述的靶标抗原-标签融合蛋白；

所述宿主细菌为权利要求1-7任一中所述的宿主细菌；

所述经荧光标记的抗标签蛋白的抗体为权利要求1-7任一中所述的经荧光标记的抗标签蛋白的抗体。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有记载有权利要求1-7中任一所述方法的可读性载体。

10.权利要求8或9所述的试剂盒在获得特异于靶标抗原的目标单链抗体或其编码基因中的应用。