CN103160538A - 表面进行磷酸钙修饰的病毒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面进行磷酸钙修饰的病毒及其制备方法。表面进行磷酸钙修饰的病毒是采用CaCl2和Na2HPO4将病毒进行生物矿化得到的。表面进行磷酸钙修饰的病毒具有如下优点:可以被快速高效的富集;在细胞和生物体内的转染效率大大增强;可以适应静脉注射途径给药,其表面的磷酸钙外壳能够保护腺病毒载体颗粒,使其不被预先存在的免疫力或抗体所抑制,从而更好的实现其作为药物载体的功能。本发明在新型疫苗、基因治疗以及领域有着广泛的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种表面进行磷酸钙修饰的病毒及其制备方法。
背景技术
腺病毒(Adenovirus)是一种非包膜具有双链DNA的动物病毒,基因组大小约为36kb。腺病毒有近50个血清型,其中人2型和5型腺病毒常用作载体。腺病毒作为载体,具有宿主范围广、基因组稳定、转染效率高等优点,在基因治疗和疫苗研究领域有着广泛的应用。目前,已有多个采用重组腺病毒作为载体的产品进入临床研究阶段。
然而重组腺病毒作为载体的临床应用仍然面临许多问题,其中最主要的就是由于具有腺病毒感染史,大多数人体内均存在一定水平的腺病毒抗体,而这些预先存在的抗体能够与作为载体的腺病毒发生反应,从而导致腺病毒携带的目的基因表达水平降低甚至无法表达,使治疗或免疫失败,阻碍了腺病毒型疫苗在临床中的应用。2007年底,默克公司采用腺病毒作为载体的艾滋病疫苗二期临床实验最终失败,有可能与人群中预存的腺病毒中和抗体有关。此外,如果需要多次给药,初次接种的腺病毒将诱导中和抗体的产生,将直接影响后续腺病毒的应用。
因此,为了适应腺病毒作为载体在临床上的应用,必须对现有腺病毒进行改造,从而够克服人群中预存腺病毒抗体或免疫力的不利影响。目前已经存在不同的腺病毒改造方法。如通过分离稀有的人源腺病毒血清型从而避免预存抗体的影响,但是部分研究结果发现,异种血清型腺病毒仍然会发生一定交叉免疫反应。另一种方法通过提高腺病毒的给予剂量也能够抵抗预免疫产生的干扰,但是大剂量的的病毒注射会产生较大的毒性反应(如肝脏毒性),甚至会导致宿主死亡。也有研究对腺病毒表面蛋白进行突变从而设计出新型载体以适应临床应用。用不同功能序列替换原有5型腺病毒表面衣壳蛋白得到的新型嵌合腺病毒,具有较好的免疫原性并且能够在高水平预存抗体的动物体内表达。但是嵌合病毒的开发过程会产生不可避免的突变,如病毒致死性突变会使嵌合体克隆失去感染性,这些突变还可能影响恢复病毒的生物学特性(如毒力、抗原性、组织嗜性等),为避免以上困难,嵌合病毒的研究周期往往比较长,需要大量的探索性试验。
研究发现,针对腺病毒的中和抗体主要是针对Ad5病毒颗粒外表面的六邻体衣壳蛋白(Hexon)。通过直接对腺病毒表分布最广的面六邻体蛋白的修饰改造腺病毒能够有利于避免抗Ad5免疫,因此腺病毒的优化手段主要集中在对病毒表面蛋白的修饰。除了基因修饰的方法,目前通过化学的方法将聚乙二醇(PEG)等可降解的聚合物通过共价键接枝在病毒表面蛋白上,通过阻止病毒与抗体的直接识别保护病毒不受中和抗体的影响。但是这种方法对腺病毒的在生物体内的效价产生影响从而潜在影响其临床效果。研发一种简单易行的能够逃避预存腺病毒抗体的技术,将能够及大地推动以腺病毒为载体的产品在基因治疗和疫苗开发等方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种表面进行磷酸钙修饰的病毒及其制备方法。
本发明保护表面进行磷酸钙修饰的病毒。所述病毒可为腺病毒,如Ad5病毒(人5型腺病毒)、Ad5-Luc2病毒或Ad5-EGFP病毒。所述病毒可为重组腺病毒,如插入外源治疗性DNA的重组腺病毒。
本发明还保护表面进行磷酸钙修饰的病毒的制备方法,是采用CaCl2和Na2HPO4将病毒进行生物矿化,得到表面进行磷酸钙修饰的病毒。
所述生物矿化可包括如下步骤:
(1)将病毒液的pH调整为6.8-8.0;
(2)在步骤(1)的病毒液中加入CaCl2,调整pH至6.8-8.0,静置孵育12-24小时;
(3)向步骤(2)的体系中加入Na2HPO4,调整pH至7.8-9.0,搅拌孵育4-10小时,得到表面进行磷酸钙修饰的病毒;
所述病毒、所述CaCl2和所述Na2HPO4的配比范围为:107PFU-108PFU∶10mol∶6mol-10mol。
所述步骤(1)和所述步骤(2)中的pH具体可为6.8-7.2。
所述步骤(2)和所述步骤(3)具体是在4℃条件下进行的。
所述Na2HPO4具体可通过Na2HPO4水溶液的形式加入所述体系,所述Na2HPO4水溶液具体可为12-20mM Na2HPO4水溶液。
所述方法还可包括如下步骤:将完成所述步骤(3)的反应体系离心收集沉淀,用生理盐水重悬并加入MgCl2。所述离心的参数具体可为:4℃、7000g、10min。所述MgCl2的加入量可为:使其在体系中的浓度达到0.2μM。
所述病毒可为腺病毒,如Ad5病毒(人5型腺病毒)、Ad5-Luc2病毒或Ad5-EGFP病毒。
所述步骤(1)、所述步骤(2)和所述步骤(3)中均可采用氨水调节pH。
所述方法具体包括如下步骤:
(1)将病毒液用氨水调pH为6.8-7.2;
(2)在10mL步骤(1)得到的病毒液中加入CaCl2,使CaCl2的终浓度达到20mM,用氨水调pH为6.8-7.2,4℃静置12-24小时;所述病毒液的浓度为2×107-2×108PFU/ml;
(3)向步骤(2)的体系中缓慢滴加10mL 12-20mM Na2HPO4水溶液并保持搅拌,用氨水调pH为7.8-9.0,4℃搅拌4-10小时(从开始滴加Na2HPO4水溶液开始计时);
(4)将完成步骤(3)的反应体系离心(离心参数可为4℃、7000g、10min)收集沉淀,在1-5mL生理盐水中重悬,加入MgCl2,使MgCl2的浓度达到0.2μM,,即为含有表面进行磷酸钙修饰的病毒的溶液。
表面进行磷酸钙修饰的病毒可用于制备疫苗和/或药物。
本发明将腺病毒表面进行了磷酸钙修饰(在腺病毒表面形成具有保护作用的无机外壳,磷酸钙薄层)。本发明提供的方法简单、快速。表面进行磷酸钙修饰的病毒具有如下优点:表面矿化提高了病毒沉降性,使得病毒能够在低速离心条件下快速高效的富集;生物可逆的矿化相能够在细胞内溶解并且释放病毒颗粒,矿物相能够辅助提高病毒的转染效率,使其在细胞和生物体内的转染效率大大增强;可以适应静脉注射途径给药,其表面的磷酸钙外壳能够保护腺病毒载体颗粒,使其不被预先存在的免疫力或抗体所抑制,从而更好的实现其作为药物载体的功能。本发明通过病毒表面的矿化修饰,能够高效地解决实验和临床应用中常见的腺病毒预先免疫个体以及腺病毒重组疫苗的多次给药后造成的疫苗失活的问题。本发明在新型疫苗、基因治疗以及领域有着广泛的应用。
附图说明
图1为两步法制备表面修饰有磷酸钙的病毒颗粒的流程示意图。
图2为Ad5-EGFP-CaPi在透射电子显微镜下的照片(bar=100nm),左下角为局部放大图(bar=50nm)。
图3为Ad5-EGFP-CaPi的X射线能谱分析图。
图4为Ad5-EGFP-CaPi的X射线粉末衍射仪检测图。
图5为Ad5-EGFP-CaPi的傅立叶变换红外光谱图。
图6为矿化后病毒的斑点杂交实验结果;1为Ad5-EGFP病毒液;2为Ad5-EGFP-CaPi病毒液。
图7为不同MOI下Ad5-Luc2和Ad5-Luc2-CaPi在HEK293细胞内表达荧光素酶的定量分析。
图8为Ad5-Luc2和Ad5-Luc2-CaPi在小鼠体内表达荧光素酶光强度的量时曲线。
图9为腺病毒抗体中和作用对Ad5-EGFP和Ad5-EGFP-CaPi在细胞中表达EGFP的影响。
图10为Ad5-Luc2(左侧)和Ad5-Luc2-CaPi(右侧)在免疫小鼠体内表达荧光素酶信号的观察。
图11为Ad5-Luc2和Ad5-Luc2-CaPi在免疫小鼠体内表达荧光素酶光强度的量时曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。实施例中的病毒液使用时均用生理盐水稀释为预期浓度。
HEK293细胞:购自ATCC,产品目录号为CRL-1573。
Ad5-Luc2病毒液,即表达Luc2报告基因(启动子为CMV启动子)的复制缺陷型Ad5腺病毒(缺失区域为E1/E3区域)的病毒液:购自白泽生物(http://www.abcgene.com/product/?index_page=index&parent_flag=Eb&level=3),产品目录号为a010050。Luc2报告基因编码荧光素酶。
Ad5-EGFP病毒液,即表达EGFP报告基因(启动子为CMV启动子)的复制缺陷型Ad5腺病毒(缺失区域为E1/E3区域)的病毒液:购自白泽生物(http://www.abcgene.com/product/?index_page=index&parent_flag=Eb&level=3),产品目录号为a010010。EGFP报告基因编码绿色荧光蛋白。
实施例1、腺病毒的原位矿化
腺病毒原位矿化的流程示意图见图1。
一、Ad5-EGFP病毒的原位矿化
1、将Ad5-EGFP病毒液用氨水调pH为7.2。此时测量病毒颗粒的表面Zeta电位,为-28mV。经测定pH在6.8-8.0范围内病毒颗粒的表面Zeta电位均为负电性,能够吸附阳离子。
2、在10mL步骤1得到的病毒液(2×108PFU/ml)中加入CaCl2,使CaCl2的终浓度达到20mM,用氨水调pH为7.2,4℃静置12小时(目的是使Ca2+充分在病毒颗粒周围富集);缓慢滴加10mL 20mM Na2HPO4水溶液并保持搅拌,用氨水调pH为9.0,4℃搅拌10小时(从开始滴加Na2HPO4水溶液开始计时)。
在步骤2中,病毒颗粒总数(PFU)、Ca2+的总摩尔数(mol)和HPO4 2-的总摩尔数(mol)的配比为:108(PFU)∶10(mol)∶10(mol)。
3、将完成步骤2的反应体系离心(4℃、7000g、10min)收集沉淀,在5mL生理盐水中重悬,加入MgCl2(作用是防止磷酸钙发生相变结晶),使MgCl2的浓度达到0.2μM,4℃保存待用,即为矿化后病毒的病毒液,将其命名为Ad5-EGFP-CaPi病毒液,将矿化后病毒命名为Ad5-EGFP-CaPi病毒(又称表面进行磷酸钙修饰的Ad5-EGFP病毒)。
二、Ad5-Luc2病毒的原位矿化
1、将Ad5-Luc2病毒液用氨水调pH为6.8。此时测量病毒颗粒的表面Zeta电位,为-28mV。经测定pH在6.8-8.0范围内病毒颗粒的表面Zeta电位均为负电性,能够吸附阳离子。
2、在10mL步骤1得到的病毒液(2×107PFU/ml)中加入CaCl2,使CaCl2的终浓度达到20mM,用氨水调pH为6.8,4℃静置24小时(目的是使Ca2+充分在病毒颗粒周围富集);缓慢滴加10mL 12mM Na2HPO4水溶液并保持搅拌,用氨水调pH为7.8,4℃搅拌4小时(从开始滴加Na2HPO4水溶液开始计时)。
在步骤2中,病毒颗粒总数(PFU)、Ca2+的总摩尔数(mol)和HPO4 2-的总摩尔数(mol)的配比为:107(PFU)∶10(mol)∶6(mol)。
3、将完成步骤2的反应体系离心(4℃、7000g、10min)收集沉淀,在1mL生理盐水中重悬,加入MgCl2(作用是防止磷酸钙发生相变结晶),使MgCl2的浓度达到0.2μM,4℃保存待用,即为矿化后病毒的病毒液,将其命名为Ad5-Luc2-CaPi病毒液,将矿化后病毒命名为Ad5-Luc2-CaPi病毒(又称表面进行磷酸钙修饰的Ad5-Luc2病毒)。
三、矿化后病毒的鉴定
将Ad5-EGFP-CaPi病毒和Ad5-Luc2-CaPi病毒分别进行透射电子显微镜观察、X射线能谱分析、X射线粉末衍射仪检测和红外光谱仪检测。
Ad5-EGFP-CaPi病毒在透射电子显微镜下的照片见图2,得到的样品不经过任何染色处理即能够通过透射电子显微镜进行观察,说明表面矿物层增加了病毒表面的电子密度。Ad5-EGFP-CaPi病毒的X射线能谱分析图见图3,其表面仅含有磷和钙矿物相。Ad5-EGFP-CaPi病毒的X射线粉末衍射仪检测图见图4。Ad5-EGFP-CaPi病毒的傅立叶变换红外光谱图见图5。图4和图5表明,所述矿物相为无定型磷酸钙。
Ad5-Luc2-CaPi病毒的各个检测图谱与Ad5-EGFP-CaPi病毒的各个检测图谱一致。
将Ad5-Luc2-CaPi病毒液、Ad5-EGFP-CaPi病毒液、Ad5-Luc2病毒液和Ad5-EGFP病毒液分别进行低速离心(4℃、7000g、10min)。Ad5-Luc2-CaPi病毒液和Ad5-EGFP-CaPi病毒液均在离心管底部得到白色沉淀,Ad5-Luc2病毒液和Ad5-EGFP病毒液没有观察到沉淀生产。结果表明:表面进行磷酸钙修饰的病毒颗粒能够在普通转速的离心条件下快速、高效的富集,而不需要经过超速离心机处理;表面未进行磷酸钙修饰的普通病毒颗粒沉降能力很差,不能通过低速离心富集。
实施例2、矿化后病毒的斑点杂交实验
抗腺病毒六邻体(Hexon)单克隆抗体:购自Abcam,货号ab8249,名称Mousemonoclonal to Adenovirus hexon。
碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG:购自Jackson,货号,515-055-003,名称AlkalinePhosphatase-conjugated AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG(H+L)。
BCIP/NBT(染液):购自Sigma,货号B1911-100ML。
腺病毒鼠多抗采用如下方法制备:选用4周龄Balb/C雌性小鼠,将Ad5-EGFP病毒液稀释于100μl PBS缓冲液中,采用皮下多点注射进行免疫;免疫过程如下:初次免疫,每只小鼠注射200μl病毒液的稀释液(含1.28×107PFU);每2周加强免疫1次,共加强免疫3次,每只小鼠每次免疫注射200μl病毒液的稀释液(含1.28×107PFU);第三次加强免疫两周后采小鼠尾静脉血,分离血清,即为腺病毒鼠多抗。
一、非变性样品的斑点杂交
为确认Ad5-EGFP-CaPi病毒的表面是否被磷酸钙完全掩盖,采用原位斑点杂交对矿化后病毒表面的衣壳蛋白进行检测,具体步骤如下(各步骤依次进行):
1、将5μl实施例1得到的Ad5-EGFP-CaPi病毒液(或Ad5-EGFP病毒液)滴加在硝酸纤维素酯膜上,形成直径约为0.6cm的斑点,在常温下晾干。
2、将硝酸纤维素酯膜置于封闭液(含5%FBS的TBST缓冲液)中4℃封闭过夜。
3、洗去封闭液,加入1∶500倍稀释的抗腺病毒六邻体(Hexon)单克隆抗体和1∶1000倍稀释的腺病毒鼠多抗,37℃孵育1h。
4、用TBST缓冲液洗膜3次,每次10min。
5、加入1∶3000倍稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育30min。
6、用TBST缓冲液洗膜3次,每次10min。
7、加入BCIP/NBT进行显色。
结果见图6A。Ad5-EGFP-CaPi病毒液没有显示斑点,Ad5-EGFP病毒液显示斑点。
二、变性样品的斑点杂交
1、实施例1得到的Ad5-EGFP-CaPi病毒液(或Ad5-EGFP病毒液)煮沸变性。
2、将5μl变性后的Ad5-EGFP-CaPi病毒液(或Ad5-EGFP病毒液)滴加在硝酸纤维素酯膜上,形成直径约为0.6cm的斑点,在常温下晾干。
3、同步骤一的2。
4、同步骤一的3。
5、同步骤一的4。
6、同步骤一的5。
7、同步骤一的6。
8、同步骤一的7。
结果见图6B。Ad5-EGFP-CaPi病毒液和Ad5-EGFP病毒液均显示斑点。
图6的结果表明,磷酸钙外壳对病毒表面的蛋白质具有保护作用,但该保护作用会因变性丧失。
将实施例1制备的Ad5-Luc2-CaPi病毒液代替上述Ad5-EGFP-CaPi病毒液,用Ad5-Luc2病毒液代替上述Ad5-EGFP病毒液进行步骤一和步骤二的实验,结果与图6一致。磷酸钙外壳对病毒表面的蛋白质具有掩蔽和保护作用。
在细胞内的溶酶体的天然酸性环境下,表面进行磷酸钙修饰的病毒颗粒的矿物相会溶解,从而溶解释放完整的活病毒颗粒。
实施例3、矿化后病毒在细胞水平和动物体内的转染效率
一、Ad5-Luc2-CaPi病毒在细胞水平的转染效率
将实施例1制备的Ad5-Luc2-CaPi病毒液和Ad5-Luc2病毒液分别进行下述实验:
1、用感染剂量(MOI)分别为100、10、1的剂量用病毒液感染HEK293细胞,在感染后12h、24h、48h和72h分别收集细胞。
2、将步骤1收集的细胞在细胞裂解液中裂解15min,离心取上清。
3、取步骤2的上清,采用NanoDrop 1000进行蛋白含量检测,单位为mg。
4、将步骤2的上清加入荧光专用96孔板的三个副孔中,每孔20μl,置于GloMax96微孔板发光检测仪中,每孔加入100μl荧光素酶底物后检测化学发光强度,检测光强度,单位为RLU(Relative Light Units)。
5、将光强度检测结果除以蛋白含量,得到相对光强度(单位为RLU/mg),结果见图7。结果表明,矿化后病毒的转染效率显著高于未经矿化处理的病毒,证明磷酸钙修饰能够显著加强转染效率的作用。
二、Ad5-Luc2-CaPi在动物体内的转染效率
将实施例1制备的Ad5-Luc2-CaPi病毒液和Ad5-Luc2病毒液分别进行下述实验:
选取体重在20g左右的雌性6周龄Balb/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心),通过小鼠尾静脉注射病毒液(含1.64×107PFU病毒),分笼饲养保证小鼠正常进食进水,注射后2天、4天、6天、7天、8天、10天、12天和15天分别对小鼠进行活体成像观察。
荧光素酶的表达强度通过Xenogen IVIS-50系统中成像软件进行分析,其表达强度以相对光强度为单位(RLU,Photons s-1cm-2sr-1)表示。结果见图8。磷酸钙修饰的病毒经静脉注射途径进入动物体内之后仍然具有加强病毒转染效率的作用。
实施例4、小鼠免疫血清对矿化病毒在细胞水平上的中和作用
为考察小鼠免疫血清对矿化病毒感染能力的影响,在细胞水平观察与血清反应后矿化病毒的复制情况。
1、制备免疫血清
选用4周龄Balb/C雌性小鼠,将Ad5-EGFP病毒液稀释于100μl PBS缓冲液中,采用皮下多点注射进行免疫。
初次免疫,每只小鼠注射200μl(含1.28×107PFU);每2周加强免疫1次,共加强免疫3次,每只小鼠每次免疫注射200μl(含1.28×107PFU);第三次加强免疫两周后采小鼠尾静脉血,分离血清(免疫血清)。
2、将实施例1制备的Ad5-EGFP-CaPi病毒液和Ad5-EGFP病毒液分别进行下述实验:
(1)将免疫血清(或用做对照的正常Balb/C雌性小鼠的血清)56℃灭活30min,然后用生理盐水稀释至5倍体积。
(2)将0.5ml步骤(1)的血清稀释液、0.5ml病毒液(含100TCID50病毒),室温孵育4h,使血清与病毒表面充分作用。
(3)取步骤(2)的上清,与HEK293细胞共孵育2h,用PBS缓冲液洗涤细胞后培养24h,然后将细胞置于荧光显微镜下,观察病毒报告基因6FP的表达情况。
结果见图9。矿化外壳能够阻止腺病毒与血清中的中和抗体结合,保护病毒不被灭活,并且仍然具有转染活性。
实施例4、预先免疫动物中腺病毒基因表达的效果评价
1、预先免疫动物
选用4周龄Balb/C雌性小鼠,将Ad5-Luc2病毒液稀释于100μl PBS缓冲液中,采用皮下多点注射进行免疫。
初次免疫,每只小鼠注射200μl(1.28×107PFU);每2周加强免疫1次,共加强免疫3次,每只小鼠每次免疫注射200μl(1.28×107PFU);初次免疫前、第二次加强免疫后两周、第三次加强免疫后两周采小鼠尾静脉血,分离血清测定IgG抗体效价。
抗体效价的检测方法为:在微量酶联板中加入100μl Ad5-Luc2病毒液(用碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5μg/ml),4℃过夜,弃上清。用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次,30s/次,拍干。加入150μl封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液),37℃孵育1h,弃上清,洗涤同前。加入100μl不同稀释度的小鼠血清,37℃孵育1h,弃上清,洗涤同前。加入100μl工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育30min,弃上清,洗涤同前。加入100μl TMB底物,37℃避光显色15min,加入100μl 2M H2SO4终止显色,测定波长450nm的光吸收值。并将OD值大于阴性对照2.1倍的组视为阳性。
第三次加强免疫后,小鼠的血清IgG抗体效价达到1∶5120。
2、第三次将强免疫后,将小鼠分为两组,每组6只。第一组通过尾静脉注射实施例1制备的Ad5-Luc2-CaPi病毒液(含6.56×106PFU病毒),第二组通过尾静脉注射Ad5-Luc2病毒液(含6.56×106PFU病毒)。于注射后第1天、第2天、第4天、第6天、第9天分别通过活体成像设备Xenogen IVIS-50观察腺病毒中携带的荧光素酶基因的活体表达情况。活体观察前10分钟,需要观察的小鼠通过腹腔注射50mg/kg体重的荧光素底物,注射后将小鼠转移到具有3.0%异氟醚的氧气箱中进行麻醉。麻醉完成后将小鼠放入具有鼻腔麻醉维持系统的仪器中进行观察。
结果见图10。预先免疫的小鼠再次注射Ad5-Luc2后,由于病毒被预先存在的抗体中和而不能够表达荧光素酶。预先免疫的小鼠再次注射Ad5-Luc2-CaPi后,腺病毒并未被中和抗体灭活,而是仍然高效的表达荧光素酶。
荧光素酶的表达强度通过Xenogen IVIS-50系统中成像软件进行分析,其表达强度以相对光强度为单位(RLU,Photons s-1cm-2sr-1)表示。结果见图11。矿化后的腺病毒在预免疫小鼠体内的转染效率与未经免疫处理的小鼠相当,说明表面矿化修饰能够保护病毒,使其不被预先存在的免疫因子清除,使其能够在预免疫动物体内应用。矿化后的腺病毒在预免疫小鼠体内的转染效率大大高于未经矿化的病毒。
Claims (10)
1.表面进行磷酸钙修饰的病毒。
2.如权利要求1所述的病毒,其特征在于:所述病毒为腺病毒。
3.如权利要求1所述的病毒,其特征在于:所述病毒是通过权利要求4至9中任一所述方法制备得到的。
4.表面进行磷酸钙修饰的病毒的制备方法,是采用CaCl2和Na2HPO4将病毒进行生物矿化,得到表面进行磷酸钙修饰的病毒。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于:所述生物矿化包括如下步骤:
(1)将病毒液的pH调整为6.8-8.0;
(2)在步骤(1)的病毒液中加入CaCl2,调整pH至6.8-8.0,静置孵育12-24小时;
(3)向步骤(2)的体系中加入Na2HPO4,调整pH至7.8-9.0,搅拌孵育4-10小时,得到表面进行磷酸钙修饰的病毒;
所述病毒、所述CaCl2和所述Na2HPO4的配比范围为:107PFU-108PFU∶10mol∶6mol-10mol。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)和所述步骤(2)中的pH为6.8-7.2。
7.如权利要求5或6所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)和所述步骤(3)是在4℃条件下进行的。
8.如权利要求5或6或7所述的方法,其特征在于:所述方法还包括如下步骤:将完成所述步骤(3)的反应体系离心收集沉淀,用生理盐水重悬并加入MgCl2。
9.如权利要求4至8中任一所述的方法,其特征在于:所述病毒为腺病毒。
10.权利要求1至3中任一所述表面进行磷酸钙修饰的病毒在制备疫苗和/或药物中的应用。
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Cited By (4)
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Citations (1)
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---|---|---|---|---|
AU7713387A (en) * | 1986-08-17 | 1988-02-18 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Hepatitis vaccine |
-
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Patent Citations (1)
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---|---|---|---|---|
AU7713387A (en) * | 1986-08-17 | 1988-02-18 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Hepatitis vaccine |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
KOPPAD S.等: "Calcium phosphate coupled Newcastle disease vaccine elicits humoral and cell mediated immune responses in chickens", 《RESEARCH IN VETERINARY SCIENCE》 * |
LEE J.等: "Delivery of an Adenovirus Vector in a Calcium Phosphate Coprecipitate Enhances the Therapeutic Index of Gene Transfer to Airway Epithelia", 《HUMAN GENE THERAPY》 * |
匡志鹏等: "一种新的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP的构建", 《肿瘤防治研究》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110141552A (zh) * | 2019-05-07 | 2019-08-20 | 天津大学 | 一种脂质体包裹的溶瘤腺病毒制剂的制备方法和用途 |
CN110833566A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-02-25 | 天津大学 | 基于矿化仙台病毒的肿瘤联合治疗纳米制剂的合成方法 |
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