CN101868250B - 包含hcmv颗粒的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物，其包括选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP的组中的试剂，其中所述组合物在所述病毒体、NIEP和/或密体是非融合的时，能够阐明免疫反应。

Description

包含HCMV颗粒的组合物
本发明涉及包括一种试剂的组合物，所述组合物的应用和制备所述组合物的方法，其中所述试剂选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMVNIEP的组。
人巨细胞病毒(HCMV)，一种β-疱疹病毒，是普遍存在的病原体。在具免疫活性的人群中，HCMV感染通常不引人注意，最多具有轻微非特定症状。相反，在某些风险组中，例如，在受免疫抑制的患者，诸如AIDS患者或移植受体中，和在产前感染后，HCMV感染具有严重表现。
化学疗法可以用于治疗HCMV感染。然而，HCMV感染的抗病毒化学疗法的成功受到，具体地如果延长治疗期的药物毒性和病毒抗性变体发展的限制。另外，抗病毒超免疫血清的预防或治疗应用被证实仅具有有限的功效。
开发抗HCMV疫苗的工作已经进行了许多年。因此，已经进行了使用弱化的(减毒的)活疫苗的尝试，以诱导理想的免疫性。然而，该疫苗被证实仅具有有限的功效。其原因可能是，特别地，所述减毒病毒在人中受限存活力和抗原性的毒株-特异性变化。除了不足以诱导持久的免疫性外，活疫苗的使用必须严格对待；缺乏关于HCMV感染中致病机制的知识以及免疫抑制后重新激活疫苗毒株使得活疫苗在这些临床情形中的应用似乎至少是有疑问的。
为了避免这些风险，近期优选遵从的策略是开发抗HCMV的亚单位疫苗，其包含来自在多种表达系统中合成的病毒包膜的蛋白质。所述包膜蛋白，具体地糖蛋白gB和gH，是中和抗HCMV抗体的主要靶抗原。中和抗体能够防止感染。可能在实验动物中和在临床研究中关于gB亚单位疫苗诱导所述中和抗体。然而，在人中，以这种方式诱导的抗体反应被证明是短寿命的且不适合于在所有情形中防止感染。这不利于专门基于HCMV的gB的亚单位疫苗的广泛应用。随之对所述抗原制剂有限功效提出的原因是免疫反应中的种系-特异性变化，缺乏充足的细胞免疫反应的诱导，和所用抗原的结构限制，已知所述抗原的表位在一些情形中是构象-依赖性的。
因此，基于该经验，有效且广泛使用的抗HCMV疫苗所需达到的要求如下：(1)长期-持久诱导中和抗体，所述中和抗体以毒株-重叠方式保护免受HCMV感染。这些需要有效诱导所谓的抗HCMV的“辅助性细胞反应”(CD4-阳性T淋巴细胞)，从而协助抗体-分泌性B淋巴细胞的熟化。(2)诱导抗HCMV的细胞毒性T细胞的形成。这种类型的淋巴细胞对于终止发生的HCMV感染和限制病毒在体内扩散至关重要。(3)最小化由疫苗引起的副作用。根据目前的知识，可能源自接种活病毒的风险应该是具有在免疫抑制后建立无法估计的潜伏的能力。因此目标应该是制备不能生活的病毒抗原作为疫苗。
那种类型的疫苗记述在国际专利申请WO 00/53729中。
尽管这些类型的疫苗的确有帮助，但是由于可能存在残余的感染性HCMV病毒体，所以在减少该类型病毒颗粒的残余感染性方面必须达到高标准。因此，本发明待解决的问题是提供包含HCMV颗粒，且更具体地不具有残余感染性，特别是在本文中所述的测定中不具有残余感染性的HCMV病毒体和/或HCMV密体的组合物。
本发明待解决的另一个问题是提供一类非-感染性但提供抗原特异性CD8+、细胞毒性T细胞反应的HCMV颗粒。本发明待解决的另一个问题是提供一类非-感染性但提供抗原特异性免疫反应的HCMV颗粒，其中所述免疫反应包括抗所述抗原的抗体，优选抗所述抗原的中和抗体。
这个以及其他问题通过独立权利要求的主题解决。优选的实施方案可以获自从属权利要求。
更具体地，本发明待解决的问题在第一方面通过包含选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP的组中的试剂的组合物解决，其中所述组合物能够在所述病毒体、NIEP和/或密体是非-融合的时，阐明(elucidating)免疫反应。在一个实施方案中，所述试剂是非-感染性的。
本发明待解决的问题在第二方面通过包含选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP的组中的试剂的组合物解决，其中所述组合物能够在所述病毒体、NIEP和/或密体是非-融合时，阐明免疫反应，其中所述组合物可以通过包括以下步骤的方法获得：
a)提供一种或多种所述试剂；
b)处理所述试剂以致使它们在仍能够诱导免疫反应的同时是非-融合的。
在一个实施方案中，所述试剂是非-感染性的。
在所述第一和第二方面的实施方案中，所述免疫反应是抗原特异性CD8+反应。
在所述第一和第二方面的实施方案中，所述免疫反应是抗原特异性细胞毒性T细胞反应。
在所述第一和第二方面的实施方案中，所述免疫反应是抗原特异性CD8+、细胞毒性T细胞反应。
在所述第一和第二方面的实施方案中，所述免疫反应是抗原特异性抗体反应，优选地所述免疫反应是抗原特异性抗体反应，其中所述抗体是中和抗体。
在所述第一和第二方面的实施方案中，所述免疫反应是抗原特异性CD4+T辅助细胞反应。
在所述第一和第二方面的实施方案中，所述抗原是HCMV抗原，其中所述HCMV抗原优选选自包括以下各项的组：pp65抗原，pp65抗原衍生物，pp28和pp28衍生物，pp150和pp150衍生物，gB和gB衍生物，gH和gH衍生物，及其即时早期抗原和衍生物，糖蛋白和糖蛋白衍生物，优选HCMV糖蛋白和HCMV糖蛋白衍生物，其中所述糖蛋白优选是gM和gM衍生物，或gN和gN衍生物。
在所述即时早期抗原组中，即时早期抗原-1(IE-1)是特别优选的。
在所述第一和第二方面的实施方案中，所述试剂是灭活的。
在所述第一和第二方面的实施方案中，所述组合物是药物组合物或诊断组合物。
本发明待解决的问题在第三方面通过试剂，或包含所述试剂的组合物，用于制备药物，优选用于阐明针对一种或多种HCMV抗原的免疫反应的药物的应用解决，其中所述试剂选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP的组，其中所述试剂是非-融合的。
本发明待解决的问题在第四方面通过试剂，或包含所述试剂的组合物，优选地如所述第三方面中定义的组合物制备用于阐明免疫反应，优选地针对一种或多种HCMV抗原的免疫反应的药物的应用解决，其中所述试剂选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP的组，其中所述组合物和/或所述试剂经历过灭活。
本发明待解决的问题在第五方面通过试剂或包含所述试剂的组合物制备疫苗的应用解决，其中所述试剂选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP的组，其中所述试剂是非-融合的。
本发明待解决的问题在第六方面通过试剂，或包含所述试剂的组合物，优选地如所述第三方面中定义的组合物制备疫苗的应用解决，其中所述试剂选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP的组，其中所述组合物和/或所述试剂经历过灭活。
在所述第三和第四方面的实施方案中，所述免疫反应是抗原特异性CD8+反应。
在所述第三至第六方面的实施方案中，所述免疫反应是抗原特异性细胞毒性T细胞反应。
在所述第三至第六方面的实施方案中，所述免疫反应是抗原特异性CD8+、细胞毒性T细胞反应。
在所述第三至第六方面的实施方案中，所述免疫反应是抗原特异性抗体反应，优选地所述免疫反应是抗原特异性抗体反应，其中所述抗体是中和抗体。
在所述第三至第六方面的实施方案中，所述免疫反应是抗原特异性CD4+T辅助细胞反应。
在所述第三至第六方面的实施方案中，所述抗原是HCMV抗原，其中所述HCMV抗原优选选自包括以下各项的组：pp65抗原，pp65抗原衍生物，pp28和pp28衍生物，pp150和pp150衍生物，gB和gB衍生物，gH和gH衍生物，和即时早期抗原及其衍生物，糖蛋白和糖蛋白衍生物，优选HCMV糖蛋白和HCMV糖蛋白衍生物，其中所述糖蛋白优选是gM和gM衍生物，或gN和gN衍生物。
在所述第五和第六方面的实施方案中，所述疫苗用于治疗和/或预防HCMV感染。
在所述第五和第六方面的实施方案中，所述疫苗用于治疗和/或预防在移植供体和/或移植受体中由HCMV引起的疾病。
本发明待解决的问题在第七方面通过试剂，或包含所述试剂的组合物用于制备诊断剂的应用解决，其中所述试剂选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP的组，其中所述试剂是非-融合的，。
本发明待解决的问题在第八方面通过试剂，或包含所述试剂的组合物制备诊断剂的应用解决，其中所述试剂选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP的组，其中所述组合物和/或所述试剂经历过灭活。
本发明待解决的问题在第九方面通过用于制备如所述第一和第二方面定义的组合物的方法解决，所述方法包括以下步骤：
a)提供选自包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP的组的试剂；
b)处理所述试剂，以致使所述试剂在仍能够诱导免疫反应的同时是非-融合的。
在第九方面的实施方案中，步骤b)的处理是选自包括UV处理、高能量照射、低pH处理、热处理和用交联剂处理的组中的方法中的一种或任意组合。
在第九方面的优选实施方案中，UV处理是UVC处理，其中波长是约100nm-280nm，或用长波UV处理。
除使用UVC进行灭活外还可以使用长波UV属于本发明的范围内。在这种情形中，长波UV与受所述长波UV活化的光敏剂一起使用。在一个实施方案中，所述光敏剂分别是与UVA一起使用的amotosalen，与UVA一起使用的4’-氨基甲基-4，5’，8-三甲基补骨脂素，和与UVA和UVB一起使用的二甲基亚甲基蓝。
在第九方面的实施方案中，UV处理使用的剂量范围是约100-约2000mJ/cm2，优选约100-约1000mJ/cm2和更优选约150-约900mJ/cm2。
在第九方面的实施方案中，UV处理之前，伴随着UV处理或在UV处理之后，所述试剂经历γ照射。
在第九方面的优选实施方案中，所述高能量照射是γ照射。
在第九方面的进一步优选实施方案中，以约15-约70KGy，更优选约20-约65KGy和更优选约20-约60KGy的剂量范围施加与γ照射有关的γ辐射。
在第九方面的实施方案中，所述处理是低pH处理且所述低pH处理包括将所述试剂暴露于约0-5，优选1-4.5和更优选地约2-4.5的pH。
在第九方面的优选实施方案中，所述试剂经历低pH处理约0.5-24小时，优选约0.5-12小时和更优选约0.5-6小时的时期。
在第九方面的实施方案中，所述试剂在约1-50℃，优选在约1-约45℃和更优选在约1-约40℃下经历低pH处理。
在第九方面的实施方案中，所述热处理包括以约37.5℃-约65℃的温度，优选以约37.5-约60℃的温度和更优选以约37.5-约56℃的温度温育所述试剂。
在第九方面的优选实施方案中，温育所述试剂约5秒-约36小时，优选约5秒-约30小时，和更优选约5秒-约24小时的时期。
在第九方面的实施方案中，所述处理是使用一种或多种交联剂的处理，且其中所述交联剂分别独立地选自包括内酯、乙醇盐和醛的组。
在第九方面的实施方案中，所述交联剂是β-丙酸内酯。
在第九方面的实施方案中，所述交联剂是环氧乙烷。
在第九方面的实施方案中，所述交联剂是甲醛。
在第九方面的实施方案中，所述试剂暴露于交联剂，包含所述试剂的培养基中的所述交联剂的浓度和更优选β-丙酸内酯的浓度是约0.05-约10％(v/v)，优选约0.05-约10％(v/v)，和更优选约0.05-约7.5％(v/v)。
在第九方面的实施方案中，用交联剂和优选地β-丙酸内酯温育所述试剂一段约1分钟-约72小时，优选约1分钟-约48小时，和更优选约1分钟-约24小时的时期。
在第九方面的实施方案中，以约1℃-约60℃的温度，优选以约1℃-约50℃的温度，和更优选以约1℃-约40℃的温度温育所述试剂。
根据现有技术，认为HCMV颗粒，为了针对病毒抗原和病毒感染的细胞产生抗原特异性CD8+、细胞毒性T-细胞反应，必须与靶细胞膜融合(Pepperl等2000 J Virol(病毒学杂志)74：6132-6146)。认为该融合是在进入细胞后直接或在细胞内转录和翻译病毒蛋白后，引导病毒抗原进入抗原处理和呈递的MHC I类途径的先决条件(Pepperl等2000J Virol(病毒学杂志)74：6132-6146)。抗原通过MHC I类途径呈递随之是免疫系统能够针对病毒抗原和病毒感染的细胞发动(mount)或阐明抗原特异性CD8+、细胞毒性T-细胞反应的先决条件。
本发明人现已发现不再是融合的HCMV颗粒仍能够针对病毒抗原和病毒感染的细胞激发该类抗原特异性CD8+，细胞毒性T-细胞反应。这特别应用于这样的HCMV颗粒，所述HCMV颗粒是已经或正在分别通过应用一种或多种本文中所述分别关于或与任何灭活和灭活程序有关的方式和方法处理或产生的。本发明的第一个发现就根据现有技术而言是令人惊讶的，即如上所概述地，现有技术认为HCMV颗粒的融合性(fusiogenicity)是该类T-细胞反应的先决条件。
所述非-融合性可以通过对HCMV颗粒应用本质上本领域中常规已知的用于灭活HCMV或减小HCMV和HCMV颗粒感染性的方法(measure)和方法(method)，优选本文中所述的那些还分别被称为本文中所述关于或与灭活和灭活程序有关的方式和方法的方法(measure)和方法(method)产生。这些灭活或灭活方法(measure)和方法(method)分别使用和进行到一定程度，以将所述非-融合性施加于或赋予给所述HCMV颗粒。
作为本发明基础的第二个发现涉及提供HCMV颗粒或包含所述HCMV颗粒的组合物，其不具有感染性，优选无残余感染性，其中所述HCMV颗粒和包含所述HCMV颗粒的组合物是通过分别应用连同本发明第一方面在本文中公开的方法(measure)和方法(method)之一产生的，其由HCMV颗粒或仍包含感染性HCMV颗粒和具体地HCMV病毒体的包含HCMV颗粒的组合物开始。而且，意外地发现这类HCMV颗粒适合于激发如本文中所述的免疫反应，即具体地，抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞反应，抗原特异性抗体反应，其中所述抗体反应优选是提供抗原特异性中和抗体的反应，和抗原特异性CD4+T辅助细胞反应。
本领域中技术人员普遍已知，诱导抗原-特异性抗体反应和抗原-特异性CD8+细胞毒性T细胞反应分别需要产生抗原-特异性CD4+T辅助细胞。因此，在本发明中，产生抗原-特异性CD4+T辅助细胞是通过显示pp65-特异性CD8+细胞毒性T细胞反应和产生特异于HCMV抗原的抗体，具体地中和抗体而证明。因此，接受灭活残余HCMV感染性和导致该材料非-融合(non-fusiogenic)的处理的HCMV颗粒仍能够诱导抗原-特异性CD4+T辅助细胞。
当优选地用于本文中时，术语无残余感染性意指利用感染性测定，更优选本文中所述的感染性测定不能在包含HCMV颗粒的样品或组合物中检测到感染性颗粒和具体地感染性HCMV颗粒。换言之，包含一种或多种HCMV密体、HCMV病毒体和/或HCMV NIEP的组合物或制剂分别是这样的组合物和制剂，其中在恰当的感染性测定中不能检测到感染性HCMV或HCMV颗粒。本领域中的技术人员应该公认，检测范围应该限定有无和如果有，达到何种程度，即多少所述HCMV颗粒仍然分别存在于各种组合物和制剂中。
当优选地用于本文中时，术语HCMV颗粒包括HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP。
当优选地用于本文中时，HCMV病毒体是感染性病毒颗粒，其由膜、间层和包含病毒DNA的壳体组成。
当优选地用于本文中时，HCMV密体(DB)是非感染性HCMV颗粒，其缺少HCMV壳体和HCMV DNA，但包含膜和间层。
当优选地用于本文中时，HCMV NIEP是非-感染性，有包膜HCMV颗粒，其缺少DNA但包含膜、壳体和间层。
当优选地用于本文中时，术语密体包括非-重组和重组密体。重组密体优选表达一种或多种异种抗原。
当优选地用于本文中时，术语NIEP包括非-重组和重组NIEP。重组NIEP优选表达一种或多种异种抗原。
当优选地用于本文中时，术语病毒体包括非-重组和重组病毒体。重组病毒体优选表达一种或多种异种抗原。
当优选地用于本文中时，术语异种抗原是处于不同表达环境中表达的抗原。在一个实施方案中，所述不同的表达环境是这样的环境，其中所述抗原是不对各种野生型密体、野生型NIEP和野生型病毒体固有的抗原。更具体地，所述异种抗原优选是作为HCMV颗粒内在或内部成分的抗原，包括但不限于非-结构性HCMV抗原，或异种生物体的抗原，所述异种生物体优选异种病原体。在另一个实施方案中，所述不同的环境是与野生型环境不同的环境，其中控制抗原表达的启动子与控制野生型密体、野生型NIEP和野生型病毒体中的抗原表达的启动子不同。在另一个实施方案中，所述不同的环境由在其中表达所述抗原的不同翻译系统或翻译背景组成，其，同样与野生型系统或野生型背景不同。更具体地，所述野生型密体是HCMV野生型密体，所述野生型NIEP是野生型HCMV NIEP且所述野生型病毒体是野生型HCMV病毒体。
当优选地用于本文中时，野生型意指或来自优选在体外细胞培养条件下能够形成密体的毒株。所述野生型或野生型毒株优选是Ad169和Towne。
应该公认，本文中关于HCMV颗粒所述的任何陈述、实施方案、特征或优势也且特别适用于HCMV密体和HCMV NIEP，且更特别适用于HCMV密体。
当优选地用于本文中时，术语融合性指由病毒和亚病毒颗粒膜分别与靶细胞的细胞膜融合介导的病毒和亚病毒颗粒诸如HCMV融合靶细胞的能力。这样的病毒和亚病毒颗粒，分别，称为“融合的”；而不能与靶细胞融合的病毒和亚病毒颗粒分别称为非-融合的。
基于本发明人的发现，即所述HCMV颗粒包括，但不限于，进行或已经进行了处理以灭活其残余HCMV感染性的HCMV病毒体、HCMV密体和HCMV NIEP，尽管证明缺失融合性，仍能够针对病毒抗原有效诱导抗原特异性CD8+、细胞毒性T细胞反应，分别通过适应(go along with)缺少融合性的方式和在适应缺少融合性的条件下用于灭活HCMV感染性和更具体地灭活残余HCMV感染性的方式和方法(method)可以分别应用于包含HCMV颗粒的制剂和组合物，从而产生安全的HCMV疫苗和抗原特异性CD8+、细胞毒性T-细胞反应。
形成用于分别产生分别作为本发明主题的HCMV颗粒和包含所述HCMV颗粒的组合物的起始原料的HCMV颗粒，优选是由HCMV感染哺乳动物细胞后释放的病毒颗粒。所述作为起始材料使用的HCMV颗粒由脂质膜包围，这使得所述颗粒有可能与某些哺乳动物细胞融合，从而使其内容物进入细胞的胞质内，尽管，根据本发明的第一方面，所述通过对其进行本文中所述关于或适合于灭活的方式和方法(method)获得的颗粒是非融合的。与此无关地，HCMV颗粒的膜含有病毒糖蛋白，其代表病毒-中和抗体的主要抗原。另外，它们包含病毒抗原pp65(ppUL83)，其正是T-辅助细胞的免疫原性靶标并是用于诱导抗HCMV的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的基本抗原。
分别由HCMV颗粒和具体地HCMV病毒体、HCMV NIEP和/或HCMV密体，和包括所述HCMV颗粒和具体地HCMV病毒体、HCMV NIEP和/或HCMV密体的组合物引起的免疫反应类型，各自根据本发明，与施用Th1型T-辅助细胞反应无关。由于该特征，HCMV颗粒和具体地HCMV病毒体、HCMV密体和/或HCMV NIEP，和包括它们中至少一种的组合物分别适合作为抗HCMV的疫苗。
本领域中技术人员应该公认，本发明的HCMV颗粒和包括所述HCMV颗粒的任何组合物可以用于制备用于治疗和/或预防疾病的药物，优选地，所述疾病是涉及HCMV作为病原体或机会病原体的疾病。
在优选的实施方案中，所述药物是疫苗。
按照本发明使用所述药物治疗和/或预防的具体的受试者，优选哺乳动物受试者和更优选人受试者的组是遭受或处于发展由HCMV引起的疾病的风险中的那些，其中所述受试者是移植供体和/或移植受体。本领域中的技术人员还应该公认，本发明的HCMV颗粒和包括所述HCMV颗粒的任何组合物可以用于制备诊断剂。更优选地，所述诊断剂是一种用于诊断涉及HCMV作为病原体或机会病原体的疾病的诊断剂。
最后，所述HCMV颗粒可以用于产生或制备药物或诊断剂，其中所述药物和诊断剂是选自包括抗体、适体和spiegelmer的组中的一种试剂，其中所述试剂针对，优选特别针对本发明的一种或多种HCMV颗粒。所述抗体、适体和spiegelmer的产生是本领域中技术人员已知的。
制备特异于本发明HCMV颗粒的抗体是本领域中技术人员已知的，例如，记述在Harlow，E.，和Lane，D.，″Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，″Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold SpringHarbor(冷泉港)，NY，(1988)中。优选地，可以根据Cesar和Milstein的方案和基于其上的进一步发展制备的单克隆抗体可以连同本发明一起使用。抗体，用于本文中时，包括，但不限于，完整抗体、抗体片段或衍生物，诸如Fab片段、Fc片段和单链抗体，条件是它们适合于且能够结合本发明的HCMV颗粒。除单克隆抗体外，还可以使用和/或产生多克隆抗体。多克隆抗体的产生也是本领域中技术人员已知的，且，例如，记述在Harlow，E.，和Lane，D.，′Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，″ColdSpring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，NY，(1988)中。优选地，用于治疗目的的抗体是如上定义的人源化或人抗体。
可以按照本发明使用的抗体可以具有一种或多种标记或标签。所述标记或标签可以有效用于在其诊断应用中或在其治疗应用中检测抗体。优选地，所述标记和标签选自包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、金和荧光素的组，并用于，例如，ELISA法中。这些和其他标记以及方法，例如，记述在Harlow，E.，和Lane，D.，″Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，″Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，ColdSpring Harbor(冷泉港)，NY，(1988)中。
本发明还包括，所述标签或标记表现出除检测以外的另外的功能，诸如与其他分子相互作用。所述相互作用可以是，例如，与其他化合物的特异性相互作用。这些其他化合物可以是使用所述抗体的系统，诸如人或动物体固有的那些，或利用各种抗体分析的样品。合适的标记可以，例如，是与其配偶体，诸如抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白特异性相互作用的生物素或荧光素，和存在于各种化合物或结构上从而与由此标记或标明的抗体相互作用的类似物。
适体，作为本发明的主题，是D-核酸，其是单链的或双链的，且与靶分子特异性相互作用。适体的制备或选择，例如，记述在欧洲专利EP 0 533838中。基本上，实行以下步骤。第一，提供核酸，即潜在适体的混合物，其中每种核酸典型地包括若干，优选至少8个随后随机化核苷酸的片段。该混合物随后与靶分子相接触，由此所述核酸，诸如基于与候选混合物相比针对所述靶标增高的亲和力或以比其更大的力与靶分子结合。结合的核酸随后与混合物的剩余部分分开。任选地，利用例如聚合酶链反应扩增由此获得的核酸。这些步骤可以重复若干次，最终提供具有增高比例的特异性结合所述靶标的核酸的混合物，然后任选地从所述混合物中选择最终的结合核酸。这些特异性结合的核酸称为适体。显然，在用于产生或鉴定适体的方法的任何阶段，可以取各种核酸的混合物利用标准技术确定其序列。本发明的范围包括，所述适体可以诸如，例如，通过引入定义的本领域中技术人员已知的产生适体的化学基团而稳定化。这样的修饰可以例如位于在核苷酸的糖部分的2’-位置处引入氨基基团。适体目前用作治疗剂。然而，本发明的范围还包括，由此选择或产生的适体可以用于靶标确认和/或作为开发药物，优选基于小分子的药物的前导物质。这实际上是通过竞争测定完成的，其中靶分子与适体之间的特异性相互作用受候选药物的抑制，由此从靶标和适体的复合物中替换适体时，可以假定各种药物候选物允许特异性抑制靶标和适体之间的相互作用，且如果该相互作用是特异性的，则所述候选药物应该，至少原则上，适合于阻断该靶标并由此降低其在各种包括所述靶标的系统中的生物利用率或活性。然而，可以对由此获得的小分子进一步进行衍生化和修饰，从而最优化其物理、化学、生物学和/或医学特征，诸如毒性、特异性、生物可降解性和生物利用率。
利用本发明的HCMV颗粒生产或制备可以按照本发明使用或产生的spiegelmer基于类似的原则。Spiegelmer的制备记述在国际专利申请WO98/08856中。Spiegelmer是L-核酸，这意味着它们由L-核苷酸组成，而不如适体那样，由D-核苷酸组成。Spiegelmer的特征在于这样的事实，即它们在生物学系统中具有非常高的稳定性，且与适体相当，与它们针对的靶分子特异性相互作用。在生产spiegelmer的目的中，构建D-核酸的异源种群，并在存在例如天然存在的本发明HCMV颗粒的L-对映异构体或其üart的D-对映异构体的条件下，使该种群与靶分子的光学对映体相接触。随后，分离这些D-核酸，其不与靶分子的光学对映体相互作用。然而，对与靶分子的光学对映体相互作用的那些D-核酸进行分离、任选地确定和/或测序，并随后基于由D-核酸获得的核酸序列信息合成相应的L-核酸。这些在序列上与前述与靶分子的光学对映体相互作用的D-核酸相同的L-核酸应该与天然存在的靶分子，而非其光学对映体特异性相互作用。类似于生成所述适体的方法，还可能重复多种步骤若干次，并由此富含与靶分子的光学对映体特异性相互作用的那些核酸。
本发明的范围包括，所述药物和诊断剂可以用于分别治疗、预防和诊断与使用本发明的HCMV颗粒相关的本文中所述的各种和任何疾病和病症。本领域中的技术人员应该理解，本发明的HCMV颗粒还可以用作治疗和/或预防可以由激发针对抗原的免疫反应治疗的那些疾病，且所述抗原通过本发明的HCMV颗粒表达。本发明的范围包括所述抗原，具体相对于所述HCMV颗粒是同种或异种的。
至少根据本发明，确定HCMV颗粒和具体地HCMV病毒体和/或HCMV密体和包含它们中的至少一种的组合物在所述颗粒、病毒体和/或密体优选是非-融合的时，是否分别能够阐明免疫反应的方法对本领域中的技术人员是显然的。各种测试中的一些记述在本文中，具体地在其实施例部分中。
为了提供免疫反应，本发明的HCMV颗粒必须包含或提供相关抗原，从而诱导抗原特异性抗体，优选中和抗体并刺激辅助细胞(TH-淋巴细胞)和细胞毒性T细胞(CTL)。
原则上，适合于激发免疫反应的HCMV抗原，优选地在人中，具体是以下的一种，尽管本领域中的技术人员应该公认其他HCMV抗原也可以达到起作用的程度(Sylwester AW，JEM卷202，2005年9月5日，p.673-685)。
由CD4+T细胞识别的HCMV抗原优选地选自包括以下各项的组：UL55(gB)，UL83(pp65)，UL86，UL99(pp28)，UL122(IE2)，UL36，UL48，UL32(pp150)，UL113，IRS-1，UL123(IE1)，UL25，UL141，UL52，UL82(pp71)，US22，UL75(gH)，US23，UL69，US26，UL44(pp50)，UL16，US3，US18，UL78，UL18，UL17，TRL14，UL100，UL45，UL145，UL154，UL43，UL152，UL144，UL24，UL4(gp48)，UL49，UL102和UL87。更优选地，经历CD4+T细胞反应的抗原选自包括UL55，UL83，UL86，UL99，UL153和UL32的组。
由CD8+T细胞识别的HCMV抗原优选地选自包括以下各项的组：UL48，UL83(pp65)，UL123(IE1)，UL122(IE2)，US32，UL28，US29，US3，UL32(pp150)，UL55(gB)，UL94，UL69，UL105，UL82(pp71)，UL99(pp28)，UL154，UL44(pp50)，UL86，UL33，UL49，US1，UL150，UL34，US30，TRL14，IRS-1，UL36，UL37，UL75(gH)，UL45，UL153，UL116和UL54。更优选地，经历CD8+T细胞反应的抗原选自包括UL123，UL83，UL122，UL28，UL48，US3，UL151，UL82，UL94，US29，UL99，UL103，US32，US24和UL36的组。
中和抗体，按照现有技术，在HCMV感染后专门针对病毒包膜蛋白，和具体地针对糖蛋白gB，gH，gM和gN形成(Shen等，Vaccine(疫苗)20，2007)。
TH细胞主要针对病毒的间层蛋白，和具体针对所谓的pp65(ppUL83)，gH和gB形成(Sylwester等.，J.Exp.Medicine(实验医学杂志)卷202，2005)。更具体地，pp65是诱导抗HCMV的CTL的基本抗原。pp65的呈递不仅照常在关于MHC I类分子由细胞从头合成后发生；而且还可以通过所谓的“外源负载”将其引入到MHC I呈递途径中。
所述抗原是本发明的HCMV颗粒和更具体地本发明的HCMV密体和HCMV NIEP的基本成分。更具体地，所述密体(DB)是在电子显微镜下可视的结构。DB中最富含的蛋白质(质量)是间层蛋白pp65。DB在拥有细胞脂质膜的方面与病毒颗粒相当，所述细胞脂质膜也回复为包膜，由病毒糖蛋白修饰。病毒糖蛋白在该包膜中非常可能处于天然构象。由于DB不含有病毒DNA且不含有病毒壳体，所以它们是非-感染性的。它们可以通过已确定方法从细胞培养上清液中大量浓缩。
以下实施方案通过参考pp65进行描述。然而，应该理解，原则上，相同的考虑适用于其他适合于实践本发明的抗原和/或本文中直接或通过参考所述的抗原。
在另一个实施方案中，公开并描述了包含融合蛋白的HCMV颗粒，所述融合蛋白在一部分包括病毒T-细胞抗原pp65(ppUL83)的一个或多个部分或完整蛋白，且在另一部分包括一种或多种其他蛋白的一个或多个部分。
这使得可能最优化HCMV颗粒的抗原性，因为该融合蛋白大量存在于所述颗粒中。另外已知细胞和体液免疫反应的抗原在一个分子中的表达可以明显地增加抗原性。pp65和其他蛋白的不同部分可以直接融合在一起，但是也可能例如在不同部分之间存在接头序列，所述接头序列不是所涉及的蛋白之一的天然成分。这种类型的序列可以由于克隆或有意的引入而产生，从而影响抗原的性质。然而，融合蛋白优选不包含不是融合配偶体之一的成分的外源序列。在这样的实施方案中，融合蛋白由pp65的一个或多个部分和一种或多种其他蛋白的一个或多个部分组成。
对下文中提到的所有实施方案应用融合蛋白中可以存在的完整pp65或其一个或多个部分。语句“pp65(组成)的融合蛋白”不是为了使该应用被理解为局限于完整pp65的目的。融合蛋白中存在的“部分(part)”或“部分(section)”包括至少6，优选至少8，更优选至少9，15或20个源自该蛋白的连续氨基酸。
优选的实施方案包括pp65(ppUL83)的融合蛋白和病毒糖蛋白gB或gH的一种或多种中和表位。这种类型的颗粒可以如图1中所述产生。融合蛋白可以通过抗原-特异性吸收，在MHC II类环境中，进入糖蛋白-特异性B细胞，所述糖蛋白-特异性B细胞又能够呈递糖蛋白和pp65的表位。另外，还可能在MHC II类环境中，由专职抗原-呈递细胞(APC)呈递融合蛋白的一部分。在这两种情形中，结果是有效刺激针对pp65和病毒糖蛋白的TH反应。这些CD4阳性TH细胞能够刺激糖蛋白-特异性B细胞，所述糖蛋白-特异性B细胞在MHC II类环境中呈递pp65和病毒糖蛋白的肽，从而形成抗体，具体地中和抗体，其中所述抗体在一个实施方案中针对同种抗原，且在另一个实施方案中针对异种抗原。另外，这种类型的颗粒可以，如感染性病毒体，被吸收到细胞中，且pp65的肽可以通过外源负载被引入到MHC I类途径中。这难得地对于死疫苗，获得对针对HCMV的CTL反应的刺激。
在进一步优选的实施方案中，HCMV颗粒包含这样的融合蛋白，其由pp65和另一种HCMV蛋白，IE1蛋白(ppUL123)的一个或多个部分组成。待呈递的IE1蛋白的部分特别是天然感染过程中在人体内针对其形成细胞毒性T细胞的那些。IE1蛋白的肽在一些情形中由与pp65的肽不同的MHCI类分子呈递。加入所述来自IE1的其他“CTL表位”意欲确保免疫后表达不同MHC I类分子的接种受试者能够以尽可能广泛的方式产生抗HCMV的CTL。
在进一步优选的实施方案中，HCMV颗粒包含这样的融合蛋白，其由pp65，由HCMV糖蛋白的一个或多个中和表位和由IE1的一个或多个CTL表位组成。pp65与中和表位和CTL表位的融合意欲确保接种的受试者以尽可能广泛的方式，即最大数量在MHC I类模式上不同的人可能同时形成中和抗体和CTL。
在进一步优选的实施方案中，HCMV颗粒包含pp65和另一种人病原体的一个或多个表位的融合蛋白。其他人病原体的合适部分是针对其在人中形成中和抗体的抗原。通过这样的“中和抗原”与T-细胞抗原pp65的融合可能与使用分离的“中和抗原”相比，预期免疫反应，即抗体反应显著增加。应该提到的这样的“中和抗原”的实例是乙型肝炎病毒的表面蛋白(来自HBsAG区)、丙型肝炎病毒(例如E2)的表面蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV，来自Env区)的表面蛋白、流感病毒(血凝素、神经氨酸酶、核蛋白)或其他病毒病原体的表面蛋白。其他适合的人病原体是细菌，诸如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)和其他。最后，来自真核病原体诸如疟原虫(疟疾)的抗原可以与pp65融合。这样的抗原或融合蛋白在本文中也称为抗原衍生物，且其作用为抗原包括全长或颗粒pp65的融合蛋白在本文中也称为pp65抗原衍生物。
在进一步优选的实施方案中，HCMV颗粒包含由pp65和其它病原体的蛋白或肽的一个或多个部分组成的融合蛋白，其中所述pp65作用可以分别起所述蛋白和肽的aq支架的作用，在被所述其它病原体天然感染的人中针对这些病原体产生CTL。可以提及的这样的CTL表位的实例是HIV-1、HBV、HCV或流感病毒的蛋白的部分。该程序的目的是利用DB在人中产生抗异种病原体的保护性CTL，即细胞毒性T淋巴细胞，优选CD8+细胞毒性T细胞的独特免疫原性性质。
在进一步优选的实施方案中，HCMV颗粒包含由pp65，由异种病原体的一个或多个中和表位和由相同病原体的一个或多个CTL表位组成的融合蛋白。该融合意欲确保接种的受试者能够针对该病原体形成保护性抗体和CTL。
本发明另外涉及包含至少两种不同的糖蛋白的HCMV颗粒，所述不同的糖蛋白是相同糖蛋白来自不同HCMV毒株的变体。
优选的实施方案包括正好两种变体，一种变体对应于HCMV Towne毒株，且另一种变体对应于HCMV Ad169毒株。优选的实施方案包括Towne毒株和Ad169毒株的糖蛋白gB。
可以以相同的功效将这两种蛋白引入到感染的细胞的重组密体的膜中。所述重组密体不仅适合于针对这两种原型HCMV毒株诱导毒株-重叠，而且还适合于诱导毒株-特异性中和免疫反应。
本发明的范围包括，除野生型抗原，即诸如HCMV野生型毒株中存在的抗原，或非-重组抗原外，其衍生物可以用于实践本发明。术语衍生物连同抗原一起用于本文中时优选指这样的抗原，即重组抗原。重组抗原是一种抗原，在一个实施方案中，其与平截的全长抗原相比，在与野生型抗原具有相同的长度的同时包括一个或多个氨基酸改变，或包括另外的氨基酸残基。本发明的范围包括，可以将另外的氨基酸残基添加到抗原的平截形式或包括一个或若干个氨基酸改变的形式中。所述平截可以以这样的程度进行，即使得所述平截的抗原的抗原特征仍存在。在另一个实施方案中，重组抗原包括，除全长抗原或平截抗原外，另一个部分。所述另一个部分优选源自病毒的抗原，其中所述病毒与HCMV不同，是微生物，优选病原性微生物的抗原，或非-微生物病原体的抗原。优选地，病原性微生物是对哺乳动物和更具体地对人致病的微生物，且病原体是对哺乳动物和更具体地对人致病的病原体。所述另一个部分可以是全长抗原或其平截形式。在一个实施方案中，所述另一个部分适合于激发本文中所述的一种或多种免疫反应。在另一个实施方案中，抗原的衍生物是异种抗原。在再一个实施方案中，抗原的衍生物优选是如本文中所定义的异种抗原。优选地，可以由处于其不同形式的HCMV颗粒激发的免疫反应是以下各项中的至少一种：抗原特异性CD8+T细胞反应、抗原特异性细胞毒性T细胞反应、抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞反应、抗原特异性抗体反应、抗原特异性CD4+T辅助细胞反应，其中，优选地，所述抗体反应的抗体是中和抗体。
特别有效用于实践本发明的HCMV的病毒体和/或密体可以如国际专利申请WO 00/53729中所述制备。
本领域中的技术人员应该公认，本文中所述的用于灭活的多种方法同样是本领域中已知的且可以应用于本发明。
现通过附图和实施例进一步举例说明本发明，其中可以采用其他特征、实施方案和优点，其中
图1显示用于产生重组DB的策略，所述重组DB包含具有同种或异种抗原的融合蛋白；
图2显示当用pp65肽混合物(图2a)和用非-HCMV肽(图2b)再刺激时，针对用多种灭活程序处理过的DB制剂的CD8+细胞毒性T细胞反应；
图3显示用多种灭活程序处理过的DB制剂的抗HCMV IgG反应；
图4显示当用pp65肽混合物(图4a)和用非-HCMV肽(图4b)再刺激时，针对用两种不同灭活程序处理过的DB制剂的CD8+细胞毒性T细胞反应；
图5显示用两种不同灭活程序处理过的DB制剂的抗HCMV IgG反应；
图6显示针对DB制剂的CD8+细胞毒性T细胞反应，其中所述DB制剂受到灭活残余感染性或致使其具有非-融合性的处理(半动态UVC照射)，或未受到这样的处理。用pp65肽混合物(图6a)和用非-HCMV肽(图6b)再刺激；
图7-12是显示融合性测定结果的显微照片，其中进行融合性测试的HCMV颗粒经历了不同的灭活方法；和
图13-19是显示感染性测定结果的显微照片，其中进行融合性测试的HCMV颗粒经历了不同的灭活方法。
实施例1：材料和方法
以下是实践本发明中使用的或本领域中的技术人员应该有效用于实践本发明的多种材料和方法的概述。
简言之，HCMV DB制剂接受处理，以灭活残余HCMV感染性并致使该材料是非-融合的。然后，对灭活的材料进行4种不同的主要类型的分析。分析在小鼠中诱导抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞反应的能力。分析诱导特异性抗-HCMV抗体的能力。分析受到过灭活残余感染性的处理的DB材料的感染性。分析灭活的材料的融合性。
1.灭活残余HCMV感染性
关于本发明使用了多种方法，以使得灭活包含HCMV病毒体和/或HCMV密体的组合物中的残余HCMV感染性。
1.1半动态UVC处理
由来自以上的UVC光(254nm；UVC剂量720mJ/cm2；UVC光：SchüttOsram HNS 11 Watt)照射处于缓慢摇动的24-孔细胞培养板中的300μl DB制剂等分试样(0.2mg蛋白/ml PBS)达5分钟。
1.2γ照射
处于2ml玻璃瓶中的675μl DB制剂等分试样(0.2mg蛋白/ml)在干冰上接受52KGy的γ辐射。灭活过程后，将该材料冷冻于-80℃，以用于后继的分析。
1.3低pH
将1.15ml DB制剂(0.2mg蛋白/ml)与100mM柠檬酸钠pH4.5混合并在30℃温育60分钟。随后，通过超速离心法沉淀该材料(45分钟，SW 50.1转子)并悬浮在1.1ml PBS中以用于后继的分析(贮存与-80℃)。
1.4热处理
将1.15ml DB制剂(0.2mg蛋白/ml)在56℃温育30分钟。灭菌过程后，将该材料冷冻于-80℃，以用于后继的分析。
1.5β-丙酸内酯(BPL)
将1.15ml样品(0.2mg蛋白/ml)与10ml 50mM Tris/HCl pH 8.0和0.24ml在50mM Tris/HCl pH 8.0中新鲜制备的10％BPL溶液(0.21％v/v BPL终浓度)混合。样品在30℃温育60分钟。随后，通过超速离心法沉淀该材料(45分钟，SW 50.1转子)并悬浮在1.1ml PBS中以用于后继的分析(保存在-80℃)。
1.6随后进行γ照射的动态UVC处理
包含细胞培养上清液(无染料的培养基)的HCMV颗粒接受使用小UVivatec Lab单位(由BTS Bayer Technology Services(BTS Bayer技术服务)提供，D-51368 Leverkusen，德国)产生的剂量为200mJ/cm2的动态UVC。按照由BTS提供的计算书计算254nm处的剂量。随后，将DB制剂填充到玻璃瓶中并在干冰上接受23.8KGy的γ照射。保存在-80℃，以用于后继的分析。
2.测试HCMV病毒体和HCMV密体在小鼠中诱导抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞反应的能力
总述：用经过处理灭活残余HCMV感染性的DB材料免疫小鼠。将小鼠处死，并摘除脾。随后，制备脾单细胞混悬液，并裂解红血细胞。
然后，将剩余的脾细胞置于细胞培养基中，并且与定义的肽一起温育。稍后，分析脾细胞的IFN-γ阳性CD8+T细胞的数量。特异于HCMV抗原pp65的肽会再刺激脾细胞，因为它们源自用DB中包含的pp65免疫的小鼠。在该测定中，特异于pp65的CD8阳性细胞毒性T-细胞(包含在脾细胞混悬液中)将产生IFN-γ。用无关、非-HCMV肽处理脾细胞作为阴性对照。用无关、非-HCMV肽的处理不应该引起诱导IFN-γ阳性CD8+细胞毒性T细胞，因为小鼠之前未受到该抗原的免疫。产生IFN-γ的CD8+T细胞毒性细胞的分析将通过流式细胞术(FACS)进行。
2.1小鼠的免疫
用20μg DB制剂免疫(s.c.)8周龄雌性BALB/c小鼠。3周后，它们接受用20μg DB制剂的加强(s.c.)。另外2周后，处死动物，以分析pp65-特异性CTL反应，分析抗原-特异性CD4+T辅助细胞，分析HCMV-特异性抗体反应和分析HCMV-中和抗体反应。
2.2在小鼠脾中再-刺激pp65特异性CTL
2.2.1制备脾细胞
-将所有需要的缓冲液加温到37℃
-取脾
-将100μm Falcon尼龙筛置于50ml falcon管上，挤榨脾通过筛孔产生单细胞混悬液，用总共10ml PBS/1％FCS冲洗
-离心1400rpm(250-300g)，5分钟，20℃
-弃去上清液，将沉淀重新悬浮在10ml红细胞裂解缓冲液中(37℃)
-在室温(RT)温育3分钟
-离心1400rpm(250-300g)，4分钟，20℃
-用10ml PBS/1％FCS清洗沉淀；离心1400rpm，4分钟，20℃；用10ml PBS/1％FCS重新悬浮第二次并去除结缔组织块
-取等分试样确定细胞浓度(使用1∶10稀释度进行确定)
-离心1400rpm(250-300g)，4分钟，20℃
-将沉淀重新悬浮在Click RPMI/完全培养基中，将浓度调节到1.5×107个细胞/ml
-4个平行孔(100μl细胞混悬液/孔)/所需再刺激类型(一式四份)
2.2.2肽
2.2.2.1用于用HCMV pp65特异性肽再刺激
试剂：PepMix pp65 HCMVA，来自JPT Peptide Technologies GmbH(JPT肽技术GmbH)，10115柏林；pp65(HCMVA)#P06725，1瓶1＝25μg/肽；138种肽的混合物(15mers，重叠11)；400μg/ml的处于分析级DMSO中的储液(保存在-20℃)；制备2μg/ml的工作储液。
2.2.2.2用于用非-相关对照肽再刺激
试剂：非-相关九碱基顺序对照肽。例如，对于BALB/c小鼠，Kd结合疟疾肽(SYVPSAEQI)；1mg/ml处于DMSO中的储液(保存在-20℃)；制备2μg/ml的工作储液。
2.2.3布雷菲德菌素A
在DMSO中制备10mg/ml的布雷菲德菌素A储液(Sigma#B-7651)；在Click RPMI/完全培养基中制备20μg/ml的工作溶液(在再刺激孔中的的终浓度为5μg/ml)。
布雷菲德菌素A阻断高尔基体的运输由此抑制产生的细胞因子的分泌。细胞因子在布雷菲德菌素A的处理下保持在细胞内，由此产生细胞因子的细胞可以利用细胞内染色法检测。
2.2.4PMA/伊屋诺霉素
PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)，Sigma#P8139；在DMSO中制备1mg/ml的储液；在Click RPMI/完全培养基中制备0.4μg/ml的工作溶液(在再刺激孔中0.05μg PMA/ml)。
伊屋诺霉素，Sigma#I0634；在DMSO中制备1mg/ml的储液；在ClickRPMI/完全培养基中制备4μg/ml的工作溶液(在再刺激孔中0.5μgPMA/ml)。
PMA和伊屋诺霉素多克隆地刺激T细胞。其在测定中起阳性对照的作用，从而确保细胞质量和细胞内染色程序最佳。
2.2.5Click RPMI/完全培养基
10.81g粉末Click RPMI(+L-谷氨酰胺/-NaHCO3)来自AppliChem#A2504.
+1.175g NaHCO3
用蒸馏水加到1升→无菌过滤
+谷氨酰胺2mM
+PenStrep-100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素
+5％胎牛血清(FCS)，Invitrogen/Gibco#10106-185，
+β-巯基乙醇4×10-6M
+Hepes缓冲液10mM，Invitrogen/Gibco#15630-049
2.2.6再刺激设置(set up)
-每一种用于再刺激的脾和肽，分别将100μl脾细胞混悬液吸取到96-圆底板的4个孔中(最终1,5×106个细胞/孔)
-加入50μl肽工作溶液或25μl PMA/25μl伊屋诺霉素工作溶液
-加入50μl布雷菲德菌素A(具有20μg/ml)
-FACS分析前，在37℃(5％CO2)温育4h
2.3CD8阳性(CD8+)T细胞/用于FACS分析的细胞内IFNγ染色
第1天：
-将固定缓冲液调节至室温(RT)
-离心包含再刺激设置的96-孔圆底板(1400rpm/4分钟/4℃/具有制动减速；250-300g)。
-将平行温育的沉淀(一式四份)与90μl缓冲液A(PBS+0.5％(w/v)BSA+0.1％(w/v)NaN3)汇集在一起并转移到新的96-孔圆底板中。重复用90μl体积冲洗，以从再刺激装置中获得所有剩余细胞。
-＞180μl总体积/设置类型。
-离心新板
-加入120μl杂交瘤上清液(2.4G2)/孔，混合并在4℃温育15分钟
-离心板+除去上清液
-加入100μl抗-小鼠CD8.PE(在缓冲液A中稀释1∶200)→重新悬浮沉淀→在4℃温育20分钟
-温育时间后加入100μl缓冲液A
-离心板并用150μl Puffer A/离心清洗2次
-向沉淀加入150μl固定缓冲液(处于PBS中的1％低聚甲醛)，重新悬浮→在RT温育15分钟(在黑暗中)
-离心板→用150μl缓冲液A重新悬浮沉淀
-在进行细胞内染色前，像这样将板保存在4℃一或两夜第2天：
-离心板→用150μl缓冲液B/孔重新悬浮→在RT温育15分钟(黑暗中)
-离心→加入50μl/孔的抗-IFNγ.FITC(在缓冲液B中1∶200稀释)
→重新悬浮并在RT温育30分钟(黑暗中)
-加入100μl缓冲液B(PBS+0.5％(w/v)BSA+0.5％(w/v)皂苷+0.05％(w/v)NaN3)，旋转。
-用150μl缓冲液B/孔清洗3次
-将细胞重新悬浮在150μl缓冲液A/孔中并转移到FACS-管中
-再次将剩余细胞重新悬浮在150μl Puffer A中并汇集到相同的FACS管中
-通过流式细胞术分析60.000CD8+T细胞/样品
其他试剂
Falcon尼龙-筛100μm(Falcon Cat#352360)。
抗小鼠CD8a PE缀合物，0.2mg/ml；Cat#553033；BD Biosciences(BD生物科学)。
大鼠抗小鼠IFNy FITC缀合的，0.1mg；大鼠IgG1；克隆XMG1.2，Cat#554411；BD Biosciences(BD生物科学)。
低聚甲醛EM级，Cat#00380-250；250mg Polysciences Europe.
皂苷(来自Quillaja树皮)，Sigma#S-2149；25g；
红细胞裂解混悬液
制备NH4Cl储液0.16M。制备Tris储液0.17M。混合4.5升NH4Cl储液和0.5升Tris储液，搅拌1小时，然后将pH调节到7.2。高压灭菌。
2.4G2杂交瘤上清液
抗-Fcγ受体FcRII；来自约4-天培养的培养上清液(密集细胞菌苔)。
抗-Fcγ受体FcRII用于防止用于染色CD8和IFNγ的抗体与细胞Fc受体的非特异性结合。用于染色的抗体的非特异性结合会导致假阳性信号。
2.4G2杂交瘤可获自ATCC。
固定缓冲液
PBS中的1％的低聚甲醛：1g低聚甲醛处于100ml PBS中(在化学通风橱中称重)；在70℃加热1小时溶解；保存在4℃。
3.ELISA确定小鼠中的抗HCMV IgG反应
材料：SERION ELISA经典CMV IgG(Clindia)；条带覆盖有HCMV裂解物，备用(ESR109G)
样品：小鼠血清(见2.1)
程序：
-血清  向每个孔中加入100μl稀释的血清(在PBS/T中)
       例如1∶125；1∶250；1∶500；1∶1000；1∶2000；1∶4000和
       1∶8000
       在37℃不摇动温育1小时
-清洗：将抗体溶液轻拍到水槽中。
       通过每次用200μ清洗缓冲液冲洗孔5次清洗板
       第三次清洗步骤后，通过轻拍面向下置于若干张
       纸巾层上的板除去剩余的液体
-AK/HRP：加入在PBS/T中1∶1000稀释的AK抗-小鼠IgG
       HRP缀合物100μl/孔，在37℃不摇动温育1小
       时
-清洗：重复步骤2
-染色：在即将使用前制备染色溶液：1mg OPD/mL底
       物缓冲液+1μl/ml H2O2
       (例如，溶解11mg OPD/11ml底物缓冲液，加入
       11μl H2O2)
       加入染色液100μl/孔，在RT，黑暗中温育10-15
       分钟
-终止  加入50μl终止溶液并在ELISA读数器中在492
       nm处测量。
试剂
PBST          具有0.05％(v/v)吐温20的PBS
底物缓冲液    0.1M KH2PO4pH 6.0
终止溶液      1N H2SO4(＝0.5M H2SO4)
底物(OPD)     邻苯二胺，晶体状；Sigma P-2903
              H2O230％
抗体          多克隆兔抗-小鼠IgG HRP缀合物，DAKO
              (1.3g/l)，#P0260
4.测试HCMV颗粒的融合性
本测定的目的是测试HCMV颗粒是否仍能够与颗粒靶细胞诸如MRC5人成纤维细胞融合。分析HCMV pp65蛋白是否可以被引入到各自的靶细胞中。这是通过免疫荧光显微镜法完成的(抗pp65；核中的绿色荧光染色)。通过DB与成纤维细胞的融合，pp65蛋白得到释放进入靶细胞的胞质中。当pp65被运送到核中时，通过免疫染色在其中检测。在不与HCMV-阴性靶细胞融合的HCMV颗粒中，间层蛋白pp65位于HCMV颗粒内。其不存在于靶细胞中。反之亦然，在与HCMV颗粒融合的细胞中，该细胞中应该存在绿色荧光染色，表示该细胞的核中存在pp65。
融合性测定流程：
-将100μl来自正在进行培养的MRC5人成纤维细胞细胞(ATCC，#ATCC-CCL-171)置于新鲜培养基(1×105个细胞/ml培养基；37℃，5％CO2；一式四份；96孔板)中。
-在37℃温育过夜
-从每个孔中除去70μl培养基并加入5μl待测试融合性的样品
-1小时后加回70μl培养基并温育24小时
-从细胞中除去上清液(96孔板)
-加入200μl/孔的96％乙醇并在RT温育20分钟
-用150μl PBS/0.1％Triton X100/孔清洗4次
-用50μl的SN2.4G2/孔在RT封闭15分钟
-从细胞中除去上清液
-加入初次抗体(50μl/孔)：抗-pp65，在PBS中1∶100稀释，#C8A023M。
-在37℃温育1小时
-用150μl PBS/0.1％Triton X100/孔清洗3次
-50μl/孔：加入二次抗体+伊文思蓝(Evans Blue)(在PBS中，2.Ab1∶50/伊文思蓝1∶25)，#E0413，并在37℃温育30分钟。
-用150μl PBS/0.1％Triton X100/孔清洗4次
-加入50μl/孔链霉抗生物素蛋白/FITC(在PBS中1∶100)，BeckmanCoulter，#PN IM 0307。
-在4℃温育15分钟。
-用150μl PBS/0.1％Triton X100/孔清洗3次
-加入150μl PBS/孔(无TX100)并保存在4℃，用铝箔包裹(避光)直到准备用于通过荧光显微镜法进行分析。
-通过荧光显微镜法的方式进行分析。
初次抗体：
为了显示融合性：抗pp65，克隆1-L-11，小鼠腹水，Biodesign，Cat#C8A023M，1mg/ml；在PBS中1∶100稀释使用。
二次抗体：
多克隆兔抗-小鼠Ig/生物素化的兔F(ab’)2Dako，#E0413，(0.79g/l)；在PBS中1∶50稀释使用。
伊文思蓝：
Fluka#46160-在PBS中溶解到0.5％并在PBS中1∶25稀释使用。
链霉抗生物素蛋白-DTAF(Strep/FITC)
Beckman Coulter，#PN IM 0307(1.8mg/ml)；在PBS中1∶100稀释使用。
PBS/0.1％Triton X-100(用于清洗)。
SN2.4G2杂交瘤上清液
抗-FcγRezeptor FcRII；来自约4-天培养物的培养上清液(密集细胞菌苔)。
抗-Fcγ受体FcRII用于防止用于染色CD8和IFNγ的抗体与细胞Fc受体的非特异性结合。用于染色的抗体的非特异性结合会导致假阳性信号。
2.4G2杂交瘤可获自ATCC。
培养基：
具有10％FCS的MEM
2mM谷氨酰胺
50mg/ml庆大霉素
1mM MEM丙酮酸钠
1x NEAA(非必需氨基酸)
5.测试HCMV颗粒的感染性
感染性测试测定用于确定有效的病毒灭活。在该测定中，成纤维细胞与包含感染性(阳性对照)或灭活的(非-感染性)病毒的样品一起温育。随后的AEC(＝3-氨基-9-乙基咔唑)染色是视觉化靶蛋白的免疫组化测定。在该情形中，单克隆小鼠抗体靶向HCMV IEA(即时早期抗原)，所述HCMV IEA是细胞感染IEA在48小时达到强度峰之后不久出现并在整个HCMV感染周期过程中保持的病毒蛋白。二次抗体是与HRP(辣根过氧化物酶)缀合的抗-小鼠多克隆抗体。洗去未结合的缀合物并加入显色底物(AEC)。该底物由结合的酶缀合物水解并产生不溶性终产物，所述终产物是红色的并可以通过显微镜法视觉观察。由于IEA是核蛋白，已经受HCMV感染的细胞可以通过它们的带色的核来识别。参考项仅起染色程序对照的作用。当各自孔中无细胞核被染色时，认为给定样品是非-感染性的。
感染性测定流程
-将100μl来自正在进行培养的MRC5人成纤维细胞细胞(ATCC，#ATCC，#CCL-171)置于新鲜培养基(1×105个细胞/ml培养基；37℃，5％CO2；一式四份；96孔板)中。
-24小时后，将100μl待测试感染性的材料的稀释物加入到100μl细胞中(例如，在表2中：分别地，1∶200的参考项稀释物或0.3μg测试项蛋白)
-在37℃温育48小时
-48小时后除去HCMV上清液
-分别用150μl PBS/孔清洗细胞
-用96％乙醇(200μl/孔)在RT固定细胞20分钟
-用PBS(150μl/孔)清洗2次
-加入针对IE抗原的初次抗体(αHCMV IEA，Argene；#11-003)，在PBS中稀释1∶100(50μl/孔)
-在37℃温育60分钟；在保湿室(培养箱)中用塑料包裹物包裹
-分别用PBS/0.1％Triton X100，150μl/孔清洗3次。
-加入二次抗体：在PBS中1∶500稀释的抗-小鼠过氧化物酶(例如，Dako P0260)(50μl/孔)
-在37℃温育60分钟；在保湿室(培养箱)中用塑料包裹物包裹
-分别用PBS/0.1％Triton X100，150μl/孔清洗3次。
-染色：在乙酸盐缓冲液中1∶20稀释的AEC-储液，经过之前用乙酸盐缓冲液预湿的滤纸过滤2次。
-在即将染色程序之前加入1∶1000H2O2(30％)
-从该染色溶液加入100μl/孔
-在37℃，黑暗中温育正好1小时(培养箱)
-分别用2xPBS清洗，150μl/孔
-对于显微镜观察，加入1xPBS(150μl/孔)；保存在4℃。感染的核应该是亮红色。
AEC储液：
用DMF(二甲基-甲酰胺(Formamid)；Roth；#6251.1)将400mg AEC(＝3-氨基-9-乙基咔唑；Sigma；#A6926)配制为100ml；制备2ml等分试样并保存在-20℃。
乙酸盐缓冲液：
13.6g乙酸钠x 3H2O+2.88ml冰乙酸+H2O达到1000ml，调节到pH4.9。
培养基：
具有10％FCS的MEM
2mM谷氨酰胺
50mg/ml庆大霉素
1mM MEM丙酮酸钠
1x NEAA(非必需氨基酸)
实施例2
结果
pp65特异性CD8+CTL反应的结果
总之，这显示，受到灭活残余HCMV感染性和使DB制剂非-融合处理的DB制剂保持能够在小鼠中诱导pp65特异性CD8+细胞毒性T细胞反应(图2和4)。受处理的样品，如图7-12中所示，是非-融合的，且如表2中所示，是非感染性的。
受到灭活残余HCMV感染性和使DB制剂非-融合处理的DB制剂显示出与未处理的HCMV制剂具有相等的免疫原性(图6)。这是通过小鼠中HCMV pp65-特异性CD8+细胞毒性T细胞反应判断的。
图2显示来自用DB材料免疫的Balb/C小鼠的结果，所述DB材料受到如实施例1中所概述的灭活残余感染性和使其非融合的处理：分别地，UVC(720mJ/cm2)，低pH，高温，γ照射(52KGy)和β-丙酸内酯。X-轴表示产生IFN-γ的CD8+细胞毒性T细胞的数量/105个CD8+T细胞。在该测定中，特异于pp65的CD8阳性细胞毒性T-细胞(包含在脾细胞混悬液中)会产生IFN-γ(图2a)。用无关、非-HCMV肽处理脾细胞起关于再刺激的阴性对照的作用(图2b)。结果显示，即使受到灭活残余感染性处理的DB制剂仍能够诱导特异于HCMV pp65的CD8+细胞毒性T细胞反应。用PBS免疫的小鼠几乎不表现出任何产生IFN-γ的CD8+T细胞。
图4显示来自用DB材料免疫的Balb/C小鼠的结果，所述DB材料受到如实施例1中所概述的灭活残余感染性和使其非融合的处理：分别地，单独的UVC照射或动态UVC和随后γ照射(23.8KGy)。X-轴表示产生IFN-γ的CD8+细胞毒性T细胞的数量/105个CD8+T细胞。在该测定中，特异于pp65的CD8阳性细胞毒性T-细胞(包含在脾细胞混悬液中)会产生IFN-γ(图4a)。用无关、非-HCMV肽处理脾细胞起关于再刺激的阴性对照的作用(图4b)。结果显示，即使受到两种照射程序的组合处理的DB制剂仍能够诱导特异于HCMV pp65的CD8+细胞毒性T细胞反应。用PBS免疫的小鼠几乎不表现出任何产生IFN-γ的CD8+T细胞。
图6显示来自用DB材料免疫的Balb/C小鼠的结果。该材料受到灭活残余感染性和使其非融合(半动态UVC照射)的处理，或该材料未接受这样的处理。
X-轴表示产生IFN-γ的CD8+细胞毒性T细胞的数量/105个CD8+T细胞。在该测定中，特异于pp65的CD8阳性细胞毒性T-细胞(包含在脾细胞混悬液中)会产生IFN-γ(图6a)。用无关、非-HCMV肽处理脾细胞起关于再刺激的阴性对照的作用(图6b)。结果显示，受到灭活残余HCMV感染性和使DB制剂非融合处理的DB制剂具有与未处理的HCMV制剂相等的免疫原性。这是通过小鼠中HCMV pp65-特异性CD8+细胞毒性T细胞反应判断的。用PBS免疫的小鼠几乎不表现出任何产生IFN-γ的CD8+T细胞。
抗HCMV IgG反应的结果
总之，这显示，受到灭活残余HCMV感染性和使DB制剂非-融合处理的DB制剂保持能够诱导特异性抗HCMV IgG反应(图3和5)。样品，如图7-12中所示，是非-融合的，且如表2中所示，是非感染性的。
图3显示来自用DB材料免疫的Balb/C小鼠的结果，所述DB材料受到如实施例1中所概述的灭活残余感染性和使其非融合的处理：分别地，UVC(720mJ/cm2)，低pH，高温，γ照射(52KGy)和β-丙酸内酯。仍能够诱导测定信号的最大血清稀释度越高，则诱导的抗-HCMV反应越强。结果显示，即使受到两种照射程序的组合处理的DB制剂仍能够诱导特异性抗-HCMV IgG反应。
图5显示来自用DB材料免疫的Balb/C小鼠的结果，所述DB材料受到如实施例1中所概述的灭活残余感染性和使其非融合的处理：分别地，单独的UVC照射或动态UVC和随后γ照射(23.8KGy)。仍能够诱导测定信号的最大血清稀释度越高，则诱导的抗-HCMV反应越强。结果显示，即使受到两种照射程序的组合处理的DB制剂仍能够诱导特异性抗-HCMV IgG反应。
融合性测定结果：
总之，结果显示，用于显示pp65特异性CD8+细胞毒性T细胞反应(图2和4)以及诱导特异性抗-HCMV抗体(图3和5)的灭活DB制剂是非融合的；且如表2中所示，是非感染性的。如实施例1中所概述地处理样品。样品P4中的非特异性绿色染色归因于人为产物。
典型感染性测定结果
总之，结果显示，受到灭活残余HCMV感染性和使DB制剂非-融合处理的DB制剂是非感染性的。然而，如通过其诱导特异于HCMV抗原pp65的CD8阳性细胞毒性T细胞反应的能力判断(图2和4)和如通过其诱导特异性抗-HCMV IgG的能力(图3和5)判断，这些样品保持免疫原性。仅与培养基一起温育的细胞起阴性对照的作用。只有未-灭活参考项能够诱导红色染色的核，即是感染性的。如实施例1所概述地处理样品。
表2：
样品类型 使用的或最初稀释的蛋白的量 其中显示各自细胞核染色的图像文件   感染性HCMV颗粒/ml
  半动态UVC照射(5分钟，720mJ/cm2) 0.3μg蛋白 图13 0
  pH 4.5，60分钟，30℃   0.3μg蛋白   图14   0
  30分钟，56℃   0.3μg蛋白   图15   0
  γ-照射(52KGy)   0.3μg蛋白   图16   0
  β-丙酸内酯(0.21％BPL，60分钟，30℃)   0.3μg蛋白   图17   0
  动态UVC(200mJ/cm2)和γ-照射(23.8KGy) 0.3μg蛋白   未照相；文件记录结果 0
  参考项：未-灭活的HCMV病毒体Ad169 1∶200 图18 6.82e6
  单独的培养基   N/A   图19   0
本说明中、权利要求和/或附图中公开的本发明特征可以分开地和以其任何组合地作为以其多种形式实现本发明的材料。
序列表
 
<110>莱因生物技术有限公司
     疫苗工程管理有限公司
     莱安德·格罗德
 
<120>包含HCMV颗粒的组合物
 
<130>V 10018 EP
 
<160>1
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的
 
<400>1
Ser Tyr Val Pro Ser Ala Glu Gln Ile
1               5

Claims (44)

1.一种组合物，所述组合物包括HCMV密体，其中尽管所述密体是非融合的，但是所述组合物仍能够诱导免疫反应，其中所述免疫反应是抗原特异性CD8+、细胞毒性T细胞反应，其中所述HCMV密体是非感染性HCMV颗粒，其缺少HCMV壳体和HCMV DNA但包含膜和间层；
其中所述组合物可以通过包括下列步骤的方法获得：
a)提供HCMV密体；
b)处理a)中所述的HCMV密体以致使其在仍能够诱导免疫反应的同时是非-融合的，
其中所述步骤b)的处理是选自包括UV处理、高能量照射、低pH处理、热处理和用交联剂处理的组中的方法中的一种或任意组合，
其中所述UV处理是UVC处理，其中波长是100nm–280nm，或用长波UV处理，其中所述UV处理使用的剂量范围是100-2000mJ/cm2；
所述高能量照射是γ照射，其中连同所述γ照射的γ辐射在15-70KGy的剂量范围内施用；
所述低pH处理包括将所述HCMV密体暴露于0-5的pH，其中所述HCMV密体在1-50℃经历低pH处理0.5-24小时；
所述热处理包括在37.5℃-65℃的温度温育所述HCMV密体，其中温育所述HCMV密体5秒-36小时的时期；
所述交联剂选自包括内酯、乙醇盐和醛的组，其中所述HCMV密体暴露于交联剂，包含所述HCMV密体的培养基中的所述交联剂的浓度是0.01-10v/v％，其中所述HCMV密体与所述交联剂一起温育1分钟-72小时的时期，其中所述HCMV密体在1℃-60℃的温度下温育。
2.按照权利要求1的组合物，其中所述免疫反应是抗原特异性抗体反应。
3.按照权利要求2的组合物，其中所述抗体是中和抗体。
4.按照权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述免疫反应是抗原特异性CD4+T辅助细胞反应。
5.按照权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述抗原是HCMV抗原，其中所述HCMV抗原选自包括以下各项的组：pp65抗原,pp65抗原衍生物,pp28和pp28衍生物,pp150和pp150衍生物,gB和gB衍生物,gH和gH衍生物,和即时早期抗原及其衍生物,糖蛋白和糖蛋白衍生物。
6.按照权利要求5的组合物，其中所述抗原是HCMV糖蛋白或HCMV糖蛋白衍生物。
7.按照权利要求5的组合物，其中所述糖蛋白是gM或gM衍生物,或gN或gN衍生物。
8.按照权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述组合物是药物组合物或诊断组合物。
9.HCMV密体或包括所述HCMV密体的组合物用于制备药物的用途，其中所述HCMV密体是非融合的，所述药物用于诱导针对一种或多种HCMV抗原的免疫反应，其中所述免疫反应是抗原特异性CD8+、细胞毒性T细胞反应，其中所述HCMV密体是非感染性HCMV颗粒，其缺少HCMV壳体和HCMV DNA但包含膜和间层；
其中所述组合物或非融合的HCMV密体可以通过包括下列步骤的方法获得：
a)提供HCMV密体；
b)处理a)中所述的HCMV密体以致使其在仍能够诱导免疫反应的同时是非-融合的，
其中所述步骤b)的处理是选自包括UV处理、高能量照射、低pH处理、热处理和用交联剂处理的组中的方法中的一种或任意组合，
其中所述UV处理是UVC处理，其中波长是100nm–280nm，或用长波UV处理，其中所述UV处理使用的剂量范围是100-2000mJ/cm2；
所述高能量照射是γ照射，其中连同所述γ照射的γ辐射在15-70KGy的剂量范围内施用；
所述低pH处理包括将所述HCMV密体暴露于0-5的pH，其中所述HCMV密体在1-50℃经历低pH处理0.5-24小时；
所述热处理包括在37.5℃-65℃的温度温育所述HCMV密体，其中温育所述HCMV密体5秒-36小时的时期；
所述交联剂分别且独立地选自包括内酯、乙醇盐和醛的组，其中所述HCMV密体暴露于交联剂，包含所述HCMV密体的培养基中的所述交联剂的浓度是0.01-10v/v％，其中所述HCMV密体与所述交联剂一起温育1分钟-72小时的时期，其中所述HCMV密体在1℃-60℃的温度下温育。
10.HCMV密体或包括所述HCMV密体的组合物用于制备疫苗的用途，其中所述HCMV密体是非融合的，所述疫苗能够诱导免疫反应，其中所述免疫反应是抗原特异性CD8+、细胞毒性T细胞反应，其中所述HCMV密体是非感染性HCMV颗粒，其缺少HCMV壳体和HCMV DNA但包含膜和间层；
其中所述组合物或非融合的HCMV密体可以通过包括下列步骤的方法获得：
a)提供HCMV密体；
b)处理a)中所述的HCMV密体以致使其在仍能够诱导免疫反应的同时是非-融合的，
其中所述步骤b)的处理是选自包括UV处理、高能量照射、低pH处理、热处理和用交联剂处理的组中的方法中的一种或任意组合，
其中所述UV处理是UVC处理，其中波长是100nm–280nm，或用长波UV处理，其中所述UV处理使用的剂量范围是100-2000mJ/cm2；
所述高能量照射是γ照射，其中连同所述γ照射的γ辐射在15-70KGy的剂量范围内施用；
所述低pH处理包括将所述HCMV密体暴露于0-5的pH，其中所述HCMV密体在1-50℃经历低pH处理0.5-24小时；
所述热处理包括在37.5℃-65℃的温度温育所述HCMV密体，其中温育所述HCMV密体5秒-36小时的时期；
所述交联剂分别且独立地选自包括内酯、乙醇盐和醛的组，其中所述HCMV密体暴露于交联剂，包含所述HCMV密体的培养基中的所述交联剂的浓度是0.01-10v/v％，其中所述HCMV密体与所述交联剂一起温育1分钟-72小时的时期，其中所述HCMV密体在1℃-60℃的温度下温育。
11.按照权利要求9-10中任一项的用途，其中所述免疫反应是抗原特异性抗体反应。
12.按照权利要求11的用途，其中所述抗体是中和抗体。
13.按照权利要求9-10中任一项的用途，其中所述免疫反应是抗原特异性CD4+T辅助细胞反应。
14.按照权利要求9-10中任一项的用途，其中所述抗原是HCMV抗原，其中所述HCMV抗原选自包括以下各项的组：pp65抗原,pp65抗原衍生物,pp28和pp28衍生物,pp150和pp150衍生物,gB和gB衍生物,gH和gH衍生物,和即时早期抗原及其衍生物,糖蛋白和糖蛋白衍生物。
15.按照权利要求14的用途，其中所述抗原是HCMV糖蛋白或HCMV糖蛋白衍生物。
16.按照权利要求14的用途，其中所述糖蛋白是gM或gM衍生物,或gN或gN衍生物。
17.按照权利要求10的用途，其中所述疫苗用于治疗和/或预防HCMV感染。
18.按照权利要求10的用途，其中所述疫苗用于治疗和/或预防移植供体和/或移植受体中由HCMV引起的疾病。
19.HCMV密体或包括所述HCMV密体的组合物用于制备诊断剂的用途，其中所述HCMV密体是非融合的，所述诊断剂能够诱导免疫反应，其中所述免疫反应是抗原特异性CD8+、细胞毒性T细胞反应，其中所述HCMV密体是非感染性HCMV颗粒，其缺少HCMV壳体和HCMV DNA但包含膜和间层；
其中所述组合物或非融合的HCMV密体可以通过包括下列步骤的方法获得：
a)提供HCMV密体；
b)处理a)中所述的HCMV密体以致使其在仍能够诱导免疫反应的同时是非-融合的，
其中所述步骤b)的处理是选自包括UV处理、高能量照射、低pH处理、热处理和用交联剂处理的组中的方法中的一种或任意组合，
其中所述UV处理是UVC处理，其中波长是100nm–280nm，或用长波UV处理，其中所述UV处理使用的剂量范围是100-2000mJ/cm2；
所述高能量照射是γ照射，其中连同所述γ照射的γ辐射在15-70KGy的剂量范围内施用；
所述低pH处理包括将所述HCMV密体暴露于0-5的pH，其中所述HCMV密体在1-50℃经历低pH处理0.5-24小时；
所述热处理包括在37.5℃-65℃的温度温育所述HCMV密体，其中温育所述HCMV密体5秒-36小时的时期；
所述交联剂分别且独立地选自包括内酯、乙醇盐和醛的组，其中所述HCMV密体暴露于交联剂，包含所述HCMV密体的培养基中的所述交联剂的浓度是0.01-10v/v％，其中所述HCMV密体与所述交联剂一起温育1分钟-72小时的时期，其中所述HCMV密体在1℃-60℃的温度下温育。
20.用于制备如权利要求1-8中任一项所定义的组合物的方法，包括以下步骤：
a)提供HCMV密体；
b)处理所述HCMV密体，以致使所述HCMV密体在仍能够诱导免疫反应的同时是非-融合的，
其中所述步骤b)的处理是选自包括UV处理、高能量照射、低pH处理、热处理和用交联剂处理的组中的方法中的一种或任意组合，
其中所述UV处理是UVC处理，其中波长是100nm–280nm，或用长波UV处理，其中所述UV处理使用的剂量范围是100-2000mJ/cm2；
所述高能量照射是γ照射，其中连同所述γ照射的γ辐射在15-70KGy的剂量范围内施用；
所述低pH处理包括将所述HCMV密体暴露于0-5的pH，其中所述HCMV密体在1-50℃经历低pH处理0.5-24小时；
所述热处理包括在37.5℃-65℃的温度温育所述HCMV密体，其中温育所述HCMV密体5秒-36小时的时期；
所述交联剂分别且独立地选自包括内酯、乙醇盐和醛的组，其中所述HCMV密体暴露于交联剂，包含所述HCMV密体的培养基中的所述交联剂的浓度是0.01-10v/v％，其中所述HCMV密体与所述交联剂一起温育1分钟-72小时的时期，其中所述HCMV密体在1℃-60℃的温度下温育。
21.按照权利要求20的方法，其中所述UV处理使用的剂量范围是100-1000mJ/cm2。
22.按照权利要求20的方法，其中所述UV处理使用的剂量范围是150-900mJ/cm2。
23.按照权利要求20的方法，其中在所述UV处理之前，过程中或之后，对所述HCMV密体进行γ照射。
24.按照权利要求20的方法，其中连同所述γ照射的γ辐射在20-65KGy的剂量范围内施用。
25.按照权利要求20的方法，其中连同所述γ照射的γ辐射在20-60Kgy的剂量范围内施用。
26.按照权利要求20的方法，其中所述处理是低pH处理且所述低pH处理包括将所述HCMV密体暴露于1-4.5的pH。
27.按照权利要求20的方法，其中所述处理是低pH处理且所述低pH处理包括将所述HCMV密体暴露于2-4.5的pH。
28.按照权利要求20的方法，其中所述HCMV密体经历低pH处理0.5-12小时。
29.按照权利要求20的方法，其中所述HCMV密体经历低pH处理0.5-6小时。
30.按照权利要求20的方法，其中所述HCMV密体在1-45℃经历低pH处理。
31.按照权利要求20的方法，其中所述HCMV密体在1-40℃经历低pH处理。
32.按照权利要求20的方法，其中所述热处理包括在37.5-60℃的温度温育所述HCMV密体。
33.按照权利要求20的方法，其中所述热处理包括在37.5-56℃的温度温育所述HCMV密体。
34.按照权利要求20的方法，其中在所述热处理中温育所述HCMV密体5秒-30小时的时期。
35.按照权利要求20的方法，其中在所述热处理中温育所述HCMV密体5秒-24小时的时期。
36.按照权利要求20的方法，其中所述交联剂是β-丙酸内酯。
37.按照权利要求20的方法，其中所述交联剂是环氧乙烷。
38.按照权利要求20的方法，其中所述交联剂是甲醛。
39.按照权利要求20的方法，其中所述HCMV密体暴露于交联剂，包含所述HCMV密体的培养基中的所述交联剂的浓度是0.05-10v/v％。
40.按照权利要求20的方法，其中所述HCMV密体暴露于交联剂，包含所述HCMV密体的培养基中的所述交联剂的浓度是0.05-7.5v/v％。
41.按照权利要求20的方法，其中所述HCMV密体与所述交联剂一起温育1分钟-48小时的时期。
42.按照权利要求20的方法，其中所述HCMV密体与所述交联剂一起温育1分钟-24小时的时期。
43.按照权利要求20的方法，其中所述HCMV密体与所述交联剂一起在1℃-50℃的温度下温育。
44.按照权利要求20的方法，其中所述HCMV密体与所述交联剂一起在1℃-40℃的温度下温育。
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