JP2014237697A - Hcmv粒子を含有する組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)因子のうちの一つまたはいくつかを提供する工程;
(b)依然として免疫応答を誘導し得るにも関わらず、非融合性であるようにするため、該因子を処理する工程:
を含む方法により入手可能な、ビリオン、NIEP、および/またはデンスボディが非融合性であるにも関わらず、免疫応答を明らかにすることができる、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子を含む組成物により解決される。一つの態様において、因子は非感染性である。
(a)HCMVビリオン、HCMV NIEP、およびHCMVデンスボディを含む群より選択される因子を提供する工程;
(b)依然として免疫応答を誘導し得るにも関わらず、非融合性であるようにするため、該因子を処理する工程:
を含む、第一および第二の局面において定義されたような組成物の製造のための方法により解決される。
[本発明1001]
HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子を含む組成物であって、ビリオン、NIEP、および/またはデンスボディが非融合性であるにも関わらず、免疫応答を明らかにすることができる、組成物。
[本発明1002]
以下の工程を含む方法により入手可能な、ビリオン、NIEP、および/またはデンスボディが非融合性であるにも関わらず、免疫応答を明らかにすることができる、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子を含む組成物:
(c)該因子のうちの一つまたはいくつかを提供する工程;
(b)依然として免疫応答を誘導し得るにも関わらず、非融合性であるようにするため、該因子を処理する工程。
[本発明1003]
免疫応答が抗原特異的CD8+応答である、本発明1001または1002記載の組成物。
[本発明1004]
免疫応答が抗原特異的細胞障害性T細胞応答である、本発明1001〜1003いずれか一項記載の組成物。
[本発明1005]
免疫応答が抗原特異的CD8+細胞障害性T細胞応答である、本発明1001〜1004いずれか一項記載の組成物。
[本発明1006]
免疫応答が抗原特異的抗体応答であり、好ましくは、免疫応答が、抗体が中和抗体である抗原特異的抗体応答である、本発明1001〜1005いずれか一項記載の組成物。
[本発明1007]
免疫応答が抗原特異的CD4+ヘルパーT細胞応答である、本発明1001〜1006いずれか一項記載の組成物。
[本発明1008]
抗原がHCMV抗原であり、該HCMV抗原が、好ましくは、pp65抗原、pp65抗原誘導体、pp28およびpp28誘導体、pp150およびpp150誘導体、gBおよびgB誘導体、gHおよびgH誘導体、ならびに最初期抗原およびそれらの誘導体、糖タンパク質および糖タンパク質誘導体、好ましくは、HCMV糖タンパク質およびHCMV糖タンパク質誘導体を含む群より選択され、糖タンパク質が、好ましくは、gMおよびgM誘導体またはgNおよびgN誘導体である、本発明1001〜1007いずれか一項記載の組成物。
[本発明1009]
因子が不活化されている、本発明1001〜1008いずれか一項記載の組成物。
[本発明1010]
薬学的組成物または診断用組成物である、本発明1001〜1009いずれか一項記載の組成物。
[本発明1011]
医薬、好ましくは、HCMVの抗原のうちの一つまたはいくつかに対する免疫応答を明らかにするための医薬の製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物の使用であって、因子が非融合性である、使用。
[本発明1012]
免疫応答、好ましくは、HCMVの抗原のうちの一つまたはいくつかに対する免疫応答を明らかにするための医薬の製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物、好ましくは、本発明1011記載の組成物の使用であって、該組成物および/または因子が不活化に供されている、使用。
[本発明1013]
ワクチンの製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物の使用であって、因子が非融合性である、使用。
[本発明1014]
ワクチンの製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物、好ましくは、本発明1011記載の組成物の使用であって、該組成物および/または因子が不活化に供されている、使用。
[本発明1015]
免疫応答が抗原特異的CD8+応答である、本発明1011または1012記載の使用。
[本発明1016]
免疫応答が抗原特異的細胞障害性T細胞応答である、本発明1011〜1015いずれか一項記載の使用。
[本発明1017]
免疫応答が抗原特異的CD8+細胞障害性T細胞応答である、本発明1011〜1016いずれか一項記載の使用。
[本発明1018]
免疫応答が抗原特異的抗体応答であり、好ましくは、免疫応答が、抗体が中和抗体である抗原特異的抗体応答である、本発明1011〜1017いずれか一項記載の使用。
[本発明1019]
免疫応答が抗原特異的CD4+ヘルパーT細胞応答である、本発明1011〜1018いずれか一項記載の組成物。
[本発明1020]
抗原がHCMV抗原であり、該HCMV抗原が、好ましくは、pp65抗原、pp65抗原誘導体、pp28およびpp28誘導体、pp150およびpp150誘導体、gBおよびgB誘導体、gHおよびgH誘導体、ならびに最初期抗原およびそれらの誘導体、糖タンパク質および糖タンパク質誘導体、好ましくは、HCMV糖タンパク質およびHCMV糖タンパク質誘導体を含む群より選択され、糖タンパク質が、好ましくは、gMおよびgM誘導体またはgNおよびgN誘導体である、本発明1011〜1019いずれか一項記載の使用。
[本発明1021]
ワクチンが、HCMV感染の処置および/または防止のためのものである、本発明1013〜1020いずれか一項記載の使用。
[本発明1022]
ワクチンが、移植ドナーおよび/または移植レシピエントにおけるHCMVにより引き起こされる疾患の処置および/または防止のためのものである、本発明1013〜1021いずれか一項記載の使用。
[本発明1023]
診断剤の製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物の使用であって、該因子が非融合性である、使用。
[本発明1024]
診断剤の製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物の使用であって、該組成物および/または因子が不活化に供されている、使用。
[本発明1025]
以下の工程を含む、本発明1001〜1010いずれか一項記載の組成物の製造のための方法:
(a)HCMVビリオン、HCMV NIEP、およびHCMVデンスボディを含む群より選択される因子を提供する工程;
(b)依然として免疫応答を誘導し得るにも関わらず、非融合性であるようにするため、該因子を処理する工程。
[本発明1026]
工程(b)の処理が、UV処理、高エネルギー照射、低pH処理、熱処理、および架橋剤による処理を含む群より選択される措置のうちの一つまたは任意の組み合わせである、本発明1025記載の方法。
[本発明1027]
UV処理が、波長が約100 nm〜280 nmであるUVC処理、または長波UVによる処理である、本発明1026記載の方法。
[本発明1028]
UV処理が、100〜2000 mJ/cm2、好ましくは100〜1000 mJ/cm2、より好ましくは150〜900 mJ/cm2の線量範囲を使用する、本発明1026または1027記載の方法。
[本発明1029]
UV処理の前に、UV処理と同時に、またはUV処理に続いて、因子がガンマ線照射に供される、本発明1026〜1028いずれか一項記載の方法。
[本発明1030]
高エネルギー照射がガンマ線照射である、本発明1026記載の方法。
[本発明1031]
ガンマ線照射に関して、ガンマ線が、約15〜70 KGy、より好ましくは20〜65 KGy、より好ましくは20〜60 KGyの線量範囲で投与される、本発明1030記載の方法。
[本発明1032]
処理が低pH処理であり、該低pH処理が、約0〜5、好ましくは1〜4.5、より好ましくは2〜4.5のpHへの因子の曝露を含む、本発明1020記載の方法。
[本発明1033]
因子が、約0.5〜24時間、好ましくは0.5〜12時間、より好ましくは0.5〜6時間、低pH処理に供される、本発明1032記載の方法。
[本発明1034]
因子が、約1〜50℃、好ましくは1〜45℃、より好ましくは1〜40℃で、低pH処理に供される、本発明1032または1033記載の方法。
[本発明1035]
熱処理が、37.5〜65℃の温度、好ましくは37.5〜60℃の温度、より好ましくは37.5〜56℃の温度での因子のインキュベーションを含む、本発明1026記載の方法。
[本発明1036]
因子が、約5秒〜36時間、好ましくは5秒〜30時間、より好ましくは5秒〜24時間にわたりインキュベートされる、本発明1035記載の方法。
[本発明1037]
処理が、ラクトン、エトキシド、およびアルデヒドを含む群より各々独立に選択される一つまたはいくつかの架橋剤による処理である、本発明1026記載の方法。
[本発明1038]
架橋剤がβ-プロピオラクトンである、本発明1037記載の方法。
[本発明1039]
架橋剤がエチレンオキシドである、本発明1037記載の方法。
[本発明1040]
架橋剤がホルムアルデヒドである、本発明1037記載の方法。
[本発明1041]
因子が架橋剤に曝され、該因子を含有している媒体中の架橋剤、より好ましくはβ-プロピオラクトンの濃度が、0.01〜10%(v/v)、好ましくは0.05〜10%(v/v)、より好ましくは0.05〜7.5%(v/v)である、本発明1037〜1040いずれか一項記載の方法。
[本発明1042]
因子が、1分〜72時間、好ましくは1分〜48時間、より好ましくは1分〜24時間にわたり、架橋剤、より好ましくはβ-プロピオラクトンと共にインキュベートされる、本発明1037〜1041いずれか一項記載の方法。
[本発明1043]
因子が、約1℃〜約60℃の温度、好ましくは約1〜50℃の温度、より好ましくは約1〜40℃の温度でインキュベートされる、本発明1037〜1042いずれか一項記載の方法。
以下は、本発明の実施において使用された、または当業者が本発明を実施するために有用であろう、様々な材料および方法の概要である。
HCMVビリオンおよび/またはHCMVデンスボディを含有している組成物における残存HCMV感染性を不活化するため、本発明に関して様々な方法を使用した。
低速で振とう中の24穴細胞培養プレートにおいて、5分間、DB調製物の300μlアリコート(0.2mgタンパク質/ml PBS)に、上からUVC光を照射した(254 nm;720 mJ/cm2のUVC線量;UVC光:Schutt Osram HNS 11ワット)。
ドライアイス上で、2mlガラスバイアルにおいて、DB調製物の675μlのアリコート(0.2mgタンパク質/ml)に、52 KGyのガンマ線を与えた。不活化過程の後、その後の分析のため材料を-80℃で凍結させた。
DB調製物1.15ml(0.2mgタンパク質/ml)を、100mMクエン酸ナトリウムpH4.5と混合し、30℃で60分間インキュベートした。その後、超遠心分離(45分、SW50.1ローター)により材料をペレット化し、その後の分析のため1.1mlのPBSに再懸濁させた(-80℃で保管)。
DB調製物1.15ml(0.2mgタンパク質/ml)を、56℃で30分間インキュベートした。不活化過程の後、その後の分析のため材料を-80℃で凍結させた。
試料1.15ml(0.2mgタンパク質/ml)を、10mlの50mMトリス/HCl pH8.0および0.24mlの新鮮に調製された50mMトリス/HCl pH8.0(0.21%v/v BPL最終濃度)中の10%BPL溶液と混合した。試料を、30℃で60分間インキュベートした。その後、超遠心分離(45分、SW50.1ローター)により材料をペレット化し、その後の分析のため1.1mlのPBSに再懸濁させた(-80℃で保管)。
HCMV粒子を含有している細胞培養上清(色素を含まない培地)に、小型UVivatec Labユニット(BTS Bayer Technology Services, D-51368 Leverkusen, Germanyより供給)を用いて、200 mJ/cm2の動的UVC線量を与えた。254 nmにおける線量を、BTSより供給された計算書に従って計算した。続いて、DB調製物をガラスバイアルに充填し、ドライアイス上で23.8 KGyのガンマ線照射を与えた。その後の分析のため-80℃で保管。
概要:残存HCMV感染性を不活化するために処理されたDB材料により、マウスを免疫感作する。マウスを屠殺し、脾臓を取り出す。続いて、脾単細胞懸濁物を調製し、赤血球を溶解させる。その後、残存する脾細胞を、細胞培養物に入れ、明確なペプチドと共にインキュベートする。その後、脾細胞を、IFNガンマ陽性CD8+T細胞の数について分析する。HCMV抗原pp65に特異的なペプチドは、DBに含有されていたpp65により免疫感作されたマウスに起因するため、脾細胞を再刺激するであろう。このアッセイにおいて、pp65に特異的な(脾細胞懸濁物に含有されていた)CD8陽性細胞障害性T細胞は、IFNガンマを産生するであろう。無関係の非HCMVペプチドによる脾細胞の処理は、陰性対照として役立つ。無関係の非HCMVペプチドによる処理は、マウスがこの抗原により以前に免疫感作されていないため、IFNガンマ陽性CD8+細胞障害性T細胞の誘導に至らないはずである。IFNガンマ産生CD8+T細胞傷害性細胞の分析を、フローサイトメトリー(FACS)によって実施する。
8週齢雌BALB/cマウスを、20μgのDB調製物により免疫感作した(s.c.)。3週間後、20μgのDB調製物により追加刺激した(s.c.)。さらに2週間後、動物を、pp65特異的CTL応答の分析のため、抗原特異的CD4+ヘルパーT細胞の分析のため、HCMV特異的抗体応答の分析のため、そしてHCMV中和抗体応答の分析のために屠殺した。
2.2.1. 脾細胞の調製
・全ての必要とされる緩衝液を37℃に加温する。
・脾臓を採取する。
・50mlファルコンチューブに100μm Falcon Nylonシーブを取り付け、単細胞懸濁物を作製するために脾臓をメッシュに押し通し、全部で10mlのPBS/1%FCSで濯ぐ。
・20℃で1400rpm(250〜300g)で5分間、遠心分離する。
・上清を廃棄し、10mlの赤血球溶解緩衝液(37℃)にペレットを再懸濁させる。
・室温(RT)で3分間、インキュベートする。
・20℃で1400rpm(250〜300g)で4分間、遠心分離する。
・10mlのPBS/1%FCSでペレットを洗浄し;20℃で1400rpmで4分間、遠心分離し;10mlのPBS/1%FCSで2回目の再懸濁を行い、結合組織の塊を除去する。
・細胞濃度を決定するためにアリコートを採取する(決定のために10倍希釈を使用する)。
・20℃で1400rpm(250〜300g)で4分間、遠心分離する。
・Click's RPMI/完全培地にペレットを再懸濁させ、濃度を1.5×107細胞/mlに調整する。
・再刺激の型一つにつき4個の平行のウェル(1ウェル当たり100μlの細胞懸濁物)(四連)が必要。
2.2.2.1 HCMV pp65特異的ペプチドによる再刺激の場合
試薬:JPT Peptide Technologies GmbH(10115 Berlin)製のPepMix pp65 HCMVA;pp65(HCMVA)#P06725(1バイアル=各ペプチド25μg);138種のペプチドのミックス(15量体、オーバーラップ11);分析等級DMSO中400μg/mlの保管ストック(-20℃で維持);2μg/mlのワーキングストックを調製する。
試薬:非関連9量体対照ペプチド。例えば、BALB/cマウスのため、Kd結合マラリアペプチド
;DMSO中1mg/mlの保管ストック(-20℃で維持);2μg/mlのワーキングストックを調製する。
DMSO中10mg/mlのブレフェルジンAストック(Sigma#B-7651)を調製する;Click's RPMI/完全培地中20μg/mlのワーキング溶液を調製する(再刺激ウェルにおいて5μg/mlの最終濃度)。ブレフェルジンAはゴルジ輸送を阻止し、それにより、産生されたサイトカインの分泌を阻害する。ブレフェルジンA処理下では、サイトカインは細胞内に残留するため、細胞内染色法を使用して、サイトカイン産生細胞を検出することが可能である。
PMA(ホルボール12-ミリステート13-アセテート)(Sigma#P8139);DMSO中1mg/mlのストックを調製する;Click's RPMI/完全培地中0.4μg/mlのワーキング溶液を調製する(再刺激ウェルにおいて0.05μg PMA/ml)。
AppliChem#A2504製の10.81gの粉末Click's RPMI(+L-グルタミン/−NaHCO3)
+1.175gのNaHCO3
蒸留水で1lにする→滅菌濾過
+グルタミン2mM
+PenStrep−100U/mlペニシリン、l00μg/mlストレプトマイシン
+5%ウシ胎仔血清(FCS)(Invitrogen/Gibco#10106-185)
+β-メルカプトエタノール4×10-6M
+ヘペス緩衝液10mM(Invitrogen/Gibco#15630-049)
・再刺激のために使用された脾臓およびペプチド一種につき、100μlの脾細胞懸濁物を96丸底プレートの4個のウェルに各々ピペットで移す(最終的に1ウェル当たり1.5×106細胞)。
・50μlペプチドワーキング溶液または25μl PMA/25μlイオノマイシンワーキング溶液を添加する。
・50μlブレフェルジンA(20μg/ml)を添加する。
・FACS分析前に37℃(5%CO2)で4時間インキュベートする。
1日目:
・固定緩衝液を室温(RT)に調整する。
・再刺激セットアップを含有している96穴丸底プレートを遠心分離する(1400rpm/4分/4℃/ブレーキ使用;250〜300g)。
・90μlの緩衝液A(PBS+0.5%(w/v)BSA+0.1%(w/v)NaN3)により、平行のインキュベーション(4連)のペレットをプールし、新たな96穴丸底プレートに移す。90μlの容量での濯ぎを繰り返し、再刺激セットアップから全ての残存する細胞を得る→各セットアップ型につき180μlの全容量。
・新たなプレートを遠心分離する。
・各ウェルに120μlのハイブリドーマ上清(2.4G2)を添加し、混合し、4℃で15分間インキュベートする。
・プレートを遠心分離し、上清を除去する。
・100μlの抗マウスCD8.PE(緩衝液Aで200倍希釈)を添加する→ペレットを再懸濁させる→4℃で20分間インキュベートする。
・インキュベーション時間の後、l00μlの緩衝液Aを添加する。
・プレートを遠心分離し、150μlの緩衝液Aで2回洗浄/遠心分離する。
・ペレットに150μlの固定緩衝液(PBS中1%パラホルムアルデヒド)を添加し、再懸濁させ→RTで15分間インキュベートする(暗所で)。
・プレートを遠心分離する→150μlの緩衝液Aにペレットを再懸濁させる。
・プレートは、細胞内染色に進む前に、一晩または二晩このように4℃で保存され得る。
・プレートを遠心分離する→1ウェル当たり150μlの緩衝液Bに再懸濁させる→RTで15分間インキュベートする(暗所)。
・遠心分離する→50μl/ウェルの抗IFNγ.FITC(緩衝液Bで200倍希釈)を添加する→再懸濁させ、RTで30分間インキュベートする(暗所で)。
・100μlの緩衝液B(PBS+0.5%(w/v)BSA+0.5%(w/v)サポニン+0.05%(w/v)NaN3)を添加し、スピンする。
・1ウェル当たり150μlの緩衝液Bにより3回洗浄する。
・1ウェル当たり150μlの緩衝液Aに細胞を再懸濁させ、FACSチューブに移す。
・残りの細胞を150μlの緩衝液Aに再懸濁させ、同FACSチューブにプールする。
・フローサイトメトリーにより各試料60000個のCD8+T細胞を分析する。
Falcon Nylonシーブ100μm(Falcon Cat#352360)。
抗マウスCD8a PEコンジュゲート、0.2mg/ml;Cat#553033;BD Biosciences。
FITCコンジュゲートラット抗マウスIFNy、0.1mg;ラットIgG1;クローンXMG1.2、Cat#554411;BD Biosciences。
パラホルムアルデヒドEM等級、Cat#00380-250;250mg Polysciences Europe。
サポニン(キラヤ皮由来)、Sigma#S-2149;25g;
NH4Clストック溶液0.16Mを調製する。トリスストック溶液0.17Mを調製する。4.5リットルのNH4Clストックおよび0.5リットルのトリスストックを混合し、1時間撹拌し、次いでpH7.2に調整する。オートクレーブする。
抗Fcγ受容体FcRII;約4日間の培養からの培養上清(密な細胞叢)。抗Fcγ受容体FcRIIは、CD8およびIFNγの染色のために使用された抗体の細胞Fc受容体との非特異的結合を防止するものである。染色のために使用された抗体の非特異的結合は、偽陽性シグナルに至るであろう。
PBS中1%パラホルムアルデヒド:100mlのPBS中1gのパラホルムアルデヒド[ケミカルフードの下での重量];溶解させるため、70℃で1時間加熱する;4℃で保存する。
材料:SERION ELISA古典的CMV IgG(Clindia);HCMV溶解物がコーティングされた既製ストリップ(ESR109G)。
・血清 各ウェルに(PBS/Tで)希釈された血清100μlを添加する:例えば、125倍、250倍、500倍、1000倍、2000倍、4000倍、および8000倍。振とうせずに37℃で1時間インキュベートする。
・洗浄:抗体溶液をシンクに注ぎ出す。各200μlの洗浄緩衝液で5回ウェルを濯ぐことによりプレートを洗浄する。3回目の洗浄工程の後、積み重ねた数枚のペーパータオルの上にプレートを逆さにして軽くたたくことにより残存液体を除去する。
・AK/HRP:PBS/Tで1000倍希釈されたAK抗マウスIgG HRPコンジュゲートを100μl/ウェルで添加し、振とうせずに37℃で1時間インキュベートする。
・洗浄:工程2を繰り返す。
・染色:使用直前に染色溶液を調製する:1mg OPD/mL基質緩衝液+1μl/ml H2O2(例えば、11mlの基質緩衝液に11mgのOPDを溶解させ、11μlのH2O2を添加する)。100μl/ウェルの染色液を添加し、暗所でRTで10〜15分間インキュベートする。
・停止:50μlの停止溶液を添加し、492 nmでELISAリーダーで測定する。
PBST 0.05%(v/v)Tween 20を含むPBS
基質緩衝液 0.1M KH2PO4 pH6.0
停止溶液 1N H2SO4(=0.5M H2SO4)
基質(OPD) O-フェニレンジアミン結晶;Sigma P-2903 H2O2 30%
抗体 ポリクローナルウサギ抗マウスIgG HRPコンジュゲート、DAKO(1.3g/l)、#P0260
このアッセイの目的は、HCMV粒子が、MRC5ヒト繊維芽細胞のような特定の標的細胞と依然として融合し得るか否かを試験することである。HCMV pp65タンパク質がそれぞれの標的細胞に導入され得るか否かが分析される。これは、免疫蛍光顕微鏡検により行われる(抗pp65;核内の緑色蛍光染色)。DBの繊維芽細胞との融合により、pp65タンパク質は標的細胞の細胞質に放出される。pp65は、核に輸送されるため、免疫染色により核内に検出される。HCMV陰性標的細胞と融合していないHCMV粒子において、テグメントタンパク質pp65はHCMV粒子内に位置する。それは標的細胞内には存在しない。逆に、HCMV粒子と融合した細胞においては、細胞内に緑色蛍光染色が存在し、それは、細胞の核内のpp65の存在を示すであろう。
・進行中の培養物から100μlのMRC5ヒト繊維芽細胞(ATCC#ATCC-CCL-171)を新鮮な培養物に移す(1×105細胞/ml培養培地;37℃、5%CO2;4連;96穴プレート)。
・37℃で一晩インキュベートする。
・各ウェルから70μlの培地を除去し、融合性について試験すべき試料5μlを添加する。
・1時間後、70μlの培地を戻し入れ、24時間インキュベートする。
・細胞から上清を除去する(96穴プレート)。
・200μl/ウェルの96%エタノールを添加し、RTで20分間インキュベートする。
・1ウェル当たり150μlのPBS/0.1%Triton X100で4回洗浄する。
・RTで15分間、1ウェル当たり50μlのSN2.4G2でブロッキングする。
・細胞から上清を除去する。
・一次抗体(50μl/ウェル)を添加する:抗pp65、PBS中100倍希釈、#C8A023M。
・37℃で1時間インキュベートする。
・1ウェル当たり150μlのPBS/0.1%Triton X100で3回洗浄する。
・50μl/ウェル:二次抗体+エバンスブルー(2.AbはPBSで50倍希釈/エバンスブルーはPBSで25倍希釈)#E0413を添加し、37℃で30分間インキュベートする。
・1ウェル当たり150μlのPBS/0.1%Triton X100で4回洗浄する。
・50μl/ウェルのストレプトアビジン/FITC(PBS中100倍)(Beckman Coulter#PNIM0307)を添加する。
・4℃で15分間インキュベートする。
・1ウェル当たり150μlのPBS/0.1%Triton X100で3回洗浄する。
・1ウェル当たり150μlのPBS(TX100不含)を添加し、蛍光顕微鏡顕による分析の準備が整うまで、アルミニウムホイルで覆って(遮光)、4℃で保存する。
・蛍光顕微鏡顕により分析する。
融合性を示すため:抗pp65、クローン1-L-11、マウス腹水、Biodesign,Cat#C8A023M、1mg/ml;PBSで100倍希釈して使用する。
ポリクローナルウサギ抗マウスIg/ビオチン化ウサギF(ab')2、Dako#E0413(0.79g/l);PBSで50倍希釈して使用する。
Fluka#46160−PBSに0.5%で溶解させ、PBSで25倍希釈して使用する。
Beckman Coulter#PNIM0307(1.8mg/ml);PBSで100倍希釈して使用する。
抗Fcガンマ受容体FcRII;約4日間の培養からの培養上清(密な細胞叢)。抗Fcガンマ受容体FcRIIは、CD8およびIFNγの染色のために使用された抗体の細胞Fc受容体との非特異的結合を防止するものである。染色のために使用された抗体の非特異的結合は、偽陽性シグナルに至るであろう。
10%FCSを含むMEM
2mMグルタミン
50mg/mlゲンタマイシン
1mM MEMピルビン酸ナトリウム
1×NEAA(非必須アミノ酸)
感染性試験アッセイは、効果的なウイルス不活化を確認するために使用される。このアッセイにおいては、繊維芽細胞を、感染性ウイルスを含有している試料(陽性対照)または不活化ウイルスを含有している試料(非感染性)と共にインキュベートする。その後のAEC(=3-アミノ-9-エチルカルバゾール)染色は、標的タンパク質を可視化する免疫組織化学アッセイである。この場合、細胞感染の直後に出現するウイルスタンパク質であるHCMV IEA(最初期抗原)(IEAは48時間で強度ピークに達し、HCMV感染周期全体にわたり持続する)に対して、モノクローナルマウス抗体がターゲティングされる。二次抗体はHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)にコンジュゲートされた抗マウスポリクローナル抗体である。未結合のコンジュゲートを洗浄除去し、色素生産性基質(AEC)を添加する。この基質は結合した酵素コンジュゲートにより加水分解され、顕微鏡検により視覚的に観察され得る赤色の不溶性最終生成物を生ずる。IEAは核タンパク質であるため、HCMV感染細胞は、有色の核により同定され得る。標準品は、染色手法の対照としてのみ機能する。所定の試料は、細胞核がそれぞれのウェルにおいて染色されない場合、非感染性と見なされる。
・進行中の培養物から100μlのMRC5ヒト繊維芽細胞(ATCC, #CCL-171)を新鮮な培養物に移す(1×105細胞/ml培養培地;37℃、5%CO2;4連;96穴プレート)。
・24時間後、感染性について試験すべき材料の希釈物100μlを100μlの細胞に添加する(例えば、表2において:それぞれ、標準品の200倍希釈物または試験品のタンパク質0.3μg)。
・37℃で48時間インキュベートする。
・48時間後、HCMV上清を除去する。
・各150μlのPBS/ウェルで細胞を洗浄する。
・RTで20分間、細胞を96%エタノール(200μl/ウェル)で固定する。
・PBS(150μl/ウェル)で2回洗浄する。
・PBSで100倍希釈されたIE抗原に対する一次抗体(αHCMV IEA、Argene;#11-003)を添加する(50μl/ウェル)。
・プラスチックラップで覆い、湿潤チャンバー(インキュベーター)内で37℃で60分間インキュベートする。
・各150μl/ウェルのPBS/0.1%Triton X100で3回洗浄する。
・PBSで500倍希釈された二次抗体;抗マウスペルオキシダーゼ(例えば、Dako P0260)を添加する(50μl/ウェル)。
・プラスチックラップで覆い、湿潤チャンバー(インキュベーター)内で37℃で60分間インキュベートする。
・各150μl/ウェルのPBS/0.1%Triton X100で3回洗浄する。
・染色:酢酸緩衝液で20倍希釈し、予め酢酸緩衝液で湿らせたペーパーフィルターで2回濾過したAECストック。
・染色手法の直前に、1000倍希釈のH2O2(30%)を添加する。
・この染色溶液から100μl/ウェルを添加する。
・暗所(インキュベーター)で37℃で正確に1時間インキュベートする。
・各150μl/ウェルのPBSで2回洗浄する。
・顕微鏡顕のため1×PBS(150μl/ウェル)を添加する;4℃で保存する。感染核は明るい赤色になる。
400mgのAEC(=3-アミノ-9-エチルカルバゾール;Sigma;#A6926)をDMF(ジメチルホルムアミド;Roth;#6251.1)で100mlにする;2mlアリコートを調製し、-20℃で保存する。
13.6gの酢酸ナトリウム×3 H2O+2.88mlの氷酢酸+H2Oで1000mlにする。pH4.9に調整する。
10%FCSを含むMEM
2mMグルタミン
50mg/mlゲンタマイシン
1mM MEMピルビン酸ナトリウム
1×NEAA(非必須アミノ酸)
結果
pp65特異的CD8+CTL応答の結果
要約すると、これは、残存HCMV感染性を不活化し、かつDB調製物を非融合性にするために処理されたDB調製物が、マウスにおいてpp65特異的CD8+細胞障害性T細胞応答を誘導する能力を維持していたことを示している(図2および4)。処理された試料は、図7〜12に示されるように非融合性であり、かつ表2に示されるように非感染性であった。
要約すると、これは、残存HCMV感染性を不活化し、かつDB調製物を非融合性にするために処理されたDB調製物が、特異的な抗HCMV IgG応答を誘導する能力を維持していたことを示す(図3および5)。試料は、図7〜12に示されるように非融合性であり、かつ表2に示されるように非感染性であった。
要約すると、結果は、pp65特異的CD8+細胞障害性T細胞応答(図2および4)のみならず、特異的抗HCMV抗体の誘導(図3および5)も示すために使用された不活化DB調製物が、非融合性であり;かつ、表2に示されるように非感染性であったことを示す。試料は、実施例1に概説されたように処理された。試料P4における非特異的な緑色染色は、アーチファクトによるものであった。
要約すると、結果は、残存HCMV感染性を不活化し、かつDB調製物を非融合性にするために処理されたDB調製物が、非感染性であったことを示す。しかしながら、HCMV抗原pp65に特異的なCD8陽性細胞障害性T細胞応答を誘導する能力により判断されるように(図2および4)、そして特異的抗HCMV IgGを誘導する能力により判断されるように(図3および5)、これらの試料は免疫原性を維持していた。培地のみと共にインキュベートされた細胞は、陰性対照として機能した。不活化されていない標準品のみが、赤く染色された核を誘導することができた、即ち、感染性であった。試料は、実施例1に概説されたように処理された。
Claims (43)
- HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子を含む組成物であって、ビリオン、NIEP、および/またはデンスボディが非融合性であるにも関わらず、免疫応答を明らかにすることができる、組成物。
- 以下の工程を含む方法により入手可能な、ビリオン、NIEP、および/またはデンスボディが非融合性であるにも関わらず、免疫応答を明らかにすることができる、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子を含む組成物:
(c)該因子のうちの一つまたはいくつかを提供する工程;
(b)依然として免疫応答を誘導し得るにも関わらず、非融合性であるようにするため、該因子を処理する工程。 - 免疫応答が抗原特異的CD8+応答である、請求項1または2記載の組成物。
- 免疫応答が抗原特異的細胞障害性T細胞応答である、請求項1〜3いずれか一項記載の組成物。
- 免疫応答が抗原特異的CD8+細胞障害性T細胞応答である、請求項1〜4いずれか一項記載の組成物。
- 免疫応答が抗原特異的抗体応答であり、好ましくは、免疫応答が、抗体が中和抗体である抗原特異的抗体応答である、請求項1〜5いずれか一項記載の組成物。
- 免疫応答が抗原特異的CD4+ヘルパーT細胞応答である、請求項1〜6いずれか一項記載の組成物。
- 抗原がHCMV抗原であり、該HCMV抗原が、好ましくは、pp65抗原、pp65抗原誘導体、pp28およびpp28誘導体、pp150およびpp150誘導体、gBおよびgB誘導体、gHおよびgH誘導体、ならびに最初期抗原およびそれらの誘導体、糖タンパク質および糖タンパク質誘導体、好ましくは、HCMV糖タンパク質およびHCMV糖タンパク質誘導体を含む群より選択され、糖タンパク質が、好ましくは、gMおよびgM誘導体またはgNおよびgN誘導体である、請求項1〜7いずれか一項記載の組成物。
- 因子が不活化されている、請求項1〜8いずれか一項記載の組成物。
- 薬学的組成物または診断用組成物である、請求項1〜9いずれか一項記載の組成物。
- 医薬、好ましくは、HCMVの抗原のうちの一つまたはいくつかに対する免疫応答を明らかにするための医薬の製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物の使用であって、因子が非融合性である、使用。
- 免疫応答、好ましくは、HCMVの抗原のうちの一つまたはいくつかに対する免疫応答を明らかにするための医薬の製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物、好ましくは、請求項11記載の組成物の使用であって、該組成物および/または因子が不活化に供されている、使用。
- ワクチンの製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物の使用であって、因子が非融合性である、使用。
- ワクチンの製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物、好ましくは、請求項11記載の組成物の使用であって、該組成物および/または因子が不活化に供されている、使用。
- 免疫応答が抗原特異的CD8+応答である、請求項11または12記載の使用。
- 免疫応答が抗原特異的細胞障害性T細胞応答である、請求項11〜15いずれか一項記載の使用。
- 免疫応答が抗原特異的CD8+細胞障害性T細胞応答である、請求項11〜16いずれか一項記載の使用。
- 免疫応答が抗原特異的抗体応答であり、好ましくは、免疫応答が、抗体が中和抗体である抗原特異的抗体応答である、請求項11〜17いずれか一項記載の使用。
- 免疫応答が抗原特異的CD4+ヘルパーT細胞応答である、請求項11〜18いずれか一項記載の組成物。
- 抗原がHCMV抗原であり、該HCMV抗原が、好ましくは、pp65抗原、pp65抗原誘導体、pp28およびpp28誘導体、pp150およびpp150誘導体、gBおよびgB誘導体、gHおよびgH誘導体、ならびに最初期抗原およびそれらの誘導体、糖タンパク質および糖タンパク質誘導体、好ましくは、HCMV糖タンパク質およびHCMV糖タンパク質誘導体を含む群より選択され、糖タンパク質が、好ましくは、gMおよびgM誘導体またはgNおよびgN誘導体である、請求項11〜19いずれか一項記載の使用。
- ワクチンが、HCMV感染の処置および/または防止のためのものである、請求項13〜20いずれか一項記載の使用。
- ワクチンが、移植ドナーおよび/または移植レシピエントにおけるHCMVにより引き起こされる疾患の処置および/または防止のためのものである、請求項13〜21いずれか一項記載の使用。
- 診断剤の製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物の使用であって、該因子が非融合性である、使用。
- 診断剤の製造のための、HCMVビリオン、HCMVデンスボディ、およびHCMV NIEPを含む群より選択される因子、またはそのような因子を含む組成物の使用であって、該組成物および/または因子が不活化に供されている、使用。
- 以下の工程を含む、請求項1〜10いずれか一項記載の組成物の製造のための方法:
(a)HCMVビリオン、HCMV NIEP、およびHCMVデンスボディを含む群より選択される因子を提供する工程;
(b)依然として免疫応答を誘導し得るにも関わらず、非融合性であるようにするため、該因子を処理する工程。 - 工程(b)の処理が、UV処理、高エネルギー照射、低pH処理、熱処理、および架橋剤による処理を含む群より選択される措置のうちの一つまたは任意の組み合わせである、請求項25記載の方法。
- UV処理が、波長が約100 nm〜280 nmであるUVC処理、または長波UVによる処理である、請求項26記載の方法。
- UV処理が、100〜2000 mJ/cm2、好ましくは100〜1000 mJ/cm2、より好ましくは150〜900 mJ/cm2の線量範囲を使用する、請求項26または27記載の方法。
- UV処理の前に、UV処理と同時に、またはUV処理に続いて、因子がガンマ線照射に供される、請求項26〜28いずれか一項記載の方法。
- 高エネルギー照射がガンマ線照射である、請求項26記載の方法。
- ガンマ線照射に関して、ガンマ線が、約15〜70 KGy、より好ましくは20〜65 KGy、より好ましくは20〜60 KGyの線量範囲で投与される、請求項30記載の方法。
- 処理が低pH処理であり、該低pH処理が、約0〜5、好ましくは1〜4.5、より好ましくは2〜4.5のpHへの因子の曝露を含む、請求項20記載の方法。
- 因子が、約0.5〜24時間、好ましくは0.5〜12時間、より好ましくは0.5〜6時間、低pH処理に供される、請求項32記載の方法。
- 因子が、約1〜50℃、好ましくは1〜45℃、より好ましくは1〜40℃で、低pH処理に供される、請求項32または33記載の方法。
- 熱処理が、37.5〜65℃の温度、好ましくは37.5〜60℃の温度、より好ましくは37.5〜56℃の温度での因子のインキュベーションを含む、請求項26記載の方法。
- 因子が、約5秒〜36時間、好ましくは5秒〜30時間、より好ましくは5秒〜24時間にわたりインキュベートされる、請求項35記載の方法。
- 処理が、ラクトン、エトキシド、およびアルデヒドを含む群より各々独立に選択される一つまたはいくつかの架橋剤による処理である、請求項26記載の方法。
- 架橋剤がβ-プロピオラクトンである、請求項37記載の方法。
- 架橋剤がエチレンオキシドである、請求項37記載の方法。
- 架橋剤がホルムアルデヒドである、請求項37記載の方法。
- 因子が架橋剤に曝され、該因子を含有している媒体中の架橋剤、より好ましくはβ-プロピオラクトンの濃度が、0.01〜10%(v/v)、好ましくは0.05〜10%(v/v)、より好ましくは0.05〜7.5%(v/v)である、請求項37〜40いずれか一項記載の方法。
- 因子が、1分〜72時間、好ましくは1分〜48時間、より好ましくは1分〜24時間にわたり、架橋剤、より好ましくはβ-プロピオラクトンと共にインキュベートされる、請求項37〜41いずれか一項記載の方法。
- 因子が、約1℃〜約60℃の温度、好ましくは約1〜50℃の温度、より好ましくは約1〜40℃の温度でインキュベートされる、請求項37〜42いずれか一項記載の方法。
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