CN108624611A

CN108624611A - 传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备及其应用

Info

Publication number: CN108624611A
Application number: CN201810464623.2A
Authority: CN
Inventors: 陈博; 金梅林; 徐高原; 张娟; 李冉; 杨应立
Original assignee: WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Current assignee: WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Priority date: 2018-05-15
Filing date: 2018-05-15
Publication date: 2018-10-09

Abstract

本发明涉及基因工程疫苗领域。具体地说，涉及传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备方法及其应用。本发明首次利用原核表达的方式获得了高效价的法氏囊病毒病毒样颗粒，使抗原的生产变得容易，成本低廉而且产量高，效价高，病毒样颗粒同时具有安全性高的优点，具有很大的生产优势。

Description

传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程疫苗领域。具体地说，涉及传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备方法及其应用。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。幼鸡感染后可引起严重的免疫抑制，对疫苗的免疫应答能力降低，对多种病原体的易感性增强，目前仍然是养鸡业的主要传染病之一。病理特征是胸肌、腿肌出血，法氏囊肿大、出血、坏死、萎缩，肾脏肿大并有尿酸盐沉积。世界动物卫生组织将本病列为B类疫病，我国农业部列为二类疫病。

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)属于双RNA病毒科(Birn aviridae)禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)。病毒粒子为球形，无囊膜，直径为55～65nm。针对该病，目前商品化的疫苗较多，可分为弱毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗。然而各种疫苗都有一些不可避免的缺陷，影响着这些疫苗在实际中的使用。弱毒疫苗模拟自然感染的过程，保护力较好，但是无法避免对鸡的损伤。免疫后，可能导致反应过大并造成法氏囊病。灭活疫苗虽然具有很好的安全性和免疫原性，但由于灭活疫苗中仍然含有病毒DNA，因此存在着免疫毒株与天然毒株发生重组的可能。亚单位疫苗主要是指使用重组法氏囊病病毒衣壳蛋白VP2作为免疫分子的疫苗，但是由于法氏囊病病毒的中和表位依赖于VP2蛋白正确的空间构象，因此这类蛋白的实际保护效力比较有限。为了避免上述这些问题，病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)疫苗成为了一种比较好的选择。

VLPs是由病毒单一或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白质颗粒，直径大小介于20～150nm，保持了病毒抗原蛋白的天然构象，因而具备激发宿主先天和适应性免疫反应功能。在形态上，VLPs类似未成熟的病毒粒子，但是由于缺乏调节蛋白和感染性核酸，无复制和感染能力。通俗的讲，类病毒颗粒就是去除病毒遗传物质之后剩余物质重新进行装配，结构上仍然具有原病毒特征，但其相对于病毒来说无繁殖能力，也就是无致病力，但仍能使动物机体产生针对该病毒的免疫应答，从而产生抗体使机体对该病毒的侵蚀具有很好的防御能力。在过去的三十年中，病毒样颗粒技术应用逐渐广泛，尤其在疫苗领域。事实上，一些基于病毒样颗粒的疫苗已经用于商业化生产，或者已进入临床研究的不同阶段。三种基于VLP的人用疫苗已经被正式批准用于预防乙型肝炎病毒、人类乳头状瘤病毒和戊型肝炎病毒，另外，基于VLP的动物病毒也在不断开发和被批准，如2型猪圆环病毒VLP疫苗等。

目前，表达与组装VLP疫苗的系统有很多。常用的有大肠杆菌表达系统、杆状病毒表达系统和酵母表达系统等。由于IBDV具有很高的宿主专一性，其病毒颗粒的组装高度依赖于真核宿主的蛋白酶系统和表达系统。因此，杆状病毒表达系统和酵母表达系统已被报道可以用于IBDV-VLP的包装。而原核表达系统(如大肠杆菌表达系统)和真核表达系统差异巨大，因此使得IBDV-VLP的包装难度巨大。如果能实现大肠杆菌表达系统用于IBDV-VL P的包装将能加大的降低IBDV-VLP的生产成本。

IBDV的衣壳蛋白为VP2，其空间构象多变，不同的构象可组装成不同大小的VLP，如T＝1的正二十面体(直径约20nm)、T＝13的正二十面体等(直径约60nm)。其中只有T＝13的正二十面体为天然病毒的正确构象并能够产生有效的中和抗体。本研究采用大肠杆菌表达系统，重组表达IBDV-VP2蛋白，并在一定的条件下使其包装成正确的T＝13的正二十面体VLP。

发明内容

针对目前存在的各种问题，本发明提供了一种传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备方法，方法简单，可大量制备法氏囊病毒病毒样颗粒。

本发明的另一个目的在于提供了一种传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备方法的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1)将452VP2克隆至pET28a载体上，而获得重组质粒pET28a-452，所述的452VP2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；

2)452VP2的诱导表达。

将pET28a-452转入大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)，使用IPTG诱导表达重组蛋白，收集诱导后的菌株；

3)使用组装缓冲液重悬菌体，菌体破碎处理后，离心去除不可溶蛋白，保留可溶性上清，即得传染性法氏囊病毒VLP；

所述的组装缓冲液的配方：0.1M磷酸盐缓冲液、0.9％氯化钠、pH7.4。

一种传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备方法的应用，包括利用本发明的制备方法制备得到的法氏囊病毒样颗粒在制备法氏囊病毒疫苗中的应用；

以上所述的应用中，优选的，将制备的传染性法氏囊病毒VLP溶液通过固定化多粘菌素B树脂，得到低内毒素VLP后，再制备疫苗。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

IBDV作为一种养鸡业的主要传染病，其防控一直没有很好且安全的疫苗。相对于传统的灭活苗，病毒样颗粒有着安全性更高，生产更便宜的优点，被广泛用于病毒性疾病的疫苗和诊断试剂的开发。本发明首次利用原核表达的方式获得了高效价的法氏囊病毒病毒样颗粒，使抗原的生产变得容易，成本低廉而且产量高，效价高，具有很大的生产优势。

附图说明

图1为452VP2蛋白SDS-PAGE电泳检测结果示意图；

其中：第1泳道为诱导前，第2泳道为诱导表达后，目的蛋白位于25KDa至35KDa之间。

图2为组装后的VLP病毒电镜图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例以及附图对本发明进一步的详细描述，而本发明的实施方式不限于此。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

452VP2蛋白表达载体的构建及表达菌的构建

1)452VP2基因的克隆

利用PCR方法，以f：5'-CGACCATGGCGATGACAAACCTGCAAGATC-3'和r：CACG AATTCTCACCTTAAGGCCCGAATTATG-3'为上下游引物，以合成的序列SEQ ID NO.1为模板，扩增452VP2基因，扩增产物经NcoI和EcoRI双酶切后回收纯化，pET28a也进行与452VP2同样的处理。将处理好的pET28a和452VP2在16℃连接过夜，之后将连接产物转化到E.coli DH5ɑ感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃培养16h。挑取平板上的单菌落，然后进行菌落PCR鉴定和送测序。将测序正确的菌落加入到新鲜的含卡那霉素的LB中，培养过夜，之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pET28a-452VP2。

2)重组CAP蛋白表达菌的构建

将pET28a-452VP2质粒转入大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)，命名为R452，即为重组表达菌株。

实施例2：

重组452VP2蛋白的诱导表达

将R452按照1:1000(V/V)的比例接种于含有卡那霉素的液体LB中培养过夜。再取过夜培养的R452菌液以1:100(V/V)接种到新鲜的1L含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，200rpm摇床上培养3h，使OD600的值达到0.6。然后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，16℃，200rpm进行诱导表达16h。随后离心收集菌体。

菌体处理过后进行SDS-PAGE分析。结果见图1，可以看到明显的诱导条带。

实施例3：

452VP2蛋白的组装和电镜观察

使用100ml组装缓冲液(0.1M磷酸盐缓冲液、0.9％氯化钠、pH7.4，)重悬实施例2收集的R452菌体。经菌体破碎处理后，离心去除不可溶蛋白，保留可溶性上清。取上清5mL于超速离心管中，然后在离心管中依次加入30％，45％，60％的蔗糖。11万g离心2.5h，然后收集形成的白色的雾状层。取20μl所收集的白色雾状层滴到200目铜网上，室温静置3min，用滤纸轻轻吸去多余的液体。然后用3％的磷钨酸染色3min，待完全干燥后在透射电镜下观察。电镜结果见图2，可观察到大量直径60nm左右的颗粒(即T＝13)。

实施例4：

IBDV病毒样颗粒疫苗的制备与免疫：

1)病毒样颗粒内毒素的去除

将实施例3中所述上清通过固定化多粘菌素B树脂，从而得到低内毒素VLP。

2)IBDV病毒样颗粒疫苗的制备

利用琼脂扩散实验，测定上述IBDV病毒样颗粒的中和效价，中和效价为1：128，然后按照1:1的体积比例将VLP与法国赛比克公司提供的201佐剂混合，接着进行超声乳化。经检测粘度和稳定性合格后置于4℃保存。可保存18个月，效价无显著改变。

3)IBDV病毒样颗粒疫苗仔鸡免疫实验

将30只经抗原抗体检测双阴性的1日龄仔鸡随机分为3组，每组10只。各组均采用肌肉注射的方式免疫，共免疫两次。第一组：每只仔鸡每次免疫0.1ml灭菌后的PBS。第二组：每只仔鸡每次免疫0.1ml由201佐剂乳化的VLP。第三组：每只仔鸡每次免疫0.1ml甲醛灭活的法氏囊灭活疫苗。一免后两周，第二次免疫。第二次免疫后10天，使用IBDV强毒株BC 6/85(购自于中国兽药监察所)攻毒，攻毒计量为2×10⁴鸡胚半数感染量。攻毒后观察仔鸡10天，并记录病死情况。第二组和第三组能很好的保护仔鸡抵抗超强毒力毒株的人工感染，即VLP疫苗能产生和灭活疫苗相同的保护效力(见表1)。

表1.免疫后攻毒保护效果

表2.VLP疫苗组抗体水平变化(琼扩)

结果显示，根据本方法制备的传染性法氏囊VLP疫苗能够很好的为仔鸡提供保护。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60

ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaaacacac tctcaggtca 120

gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180

cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240

aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300

ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcatta 360

aacggaacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420

tacaatgggt tgatgtctgc aacggccaac atcaacgaca aaattgggaa cgtcctagta 480

ggggaagggg tgactgtcct cagcttaccc acatcatatg atctggggta tgtgagactc 540

ggtgacccca ttcctgctat agggcttgac ccaaagatgg tagcgacatg tgacagcagt 600

gacaggccca gagtctacac cataactgca gccaatgatt accaattctc atcacagtac 660

caagcaggtg gagtgacaat cacactgttc tcagcaaata tcgatgccat tacaagcctc 720

agcatcgggg gggaactcgt gtttcaaaca agcgtccaag gtcttatact gggcgctacc 780

atctacctta taggcttcga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcagacaat 840

gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaata ttgtgatacc gaccagcgag 900

ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtta cctccaaaag tggtggtcag 960

gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cggtgacgat ccacggtggc 1020

aactacccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggctacagga 1080

tctgtcgtta cggtcgctgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140

aagaacctgg tcacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200

atactgagtg agagggaccg tctaggcatc aagaccgtat ggccaacaag ggagtacact 1260

gactttcgcg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320

gcatttggct tcaaagacat aattcgggcc ttaagg 1356

<210> 2

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg

1 5 10 15

Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr

20 25 30

Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr

35 40 45

Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro

50 55 60

Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr

65 70 75 80

Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr

85 90 95

Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr

100 105 110

Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr

115 120 125

Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu

130 135 140

Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val

145 150 155 160

Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly

165 170 175

Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys

180 185 190

Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile

195 200 205

Thr Ala Ala Asn Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly

210 215 220

Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu

225 230 235 240

Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile

245 250 255

Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile

260 265 270

Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn

275 280 285

Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro

290 295 300

Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln

305 310 315 320

Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr

325 330 335

Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val

340 345 350

Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val

355 360 365

Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val

370 375 380

Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu

385 390 395 400

Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr

405 410 415

Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu

420 425 430

Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Leu Arg

450

Claims

1.一种传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1）将452VP2克隆至pET28a载体上，而获得重组质粒pET28a-452，所述的452VP2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；

2）452VP2的诱导表达。

2.将pET28a-452转入大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)，使用IPTG诱导表达重组蛋白，收集诱导后的菌株；

3）使用组装缓冲液重悬菌体，菌体破碎处理后，离心去除不可溶蛋白，保留可溶性上清，即得传染性法氏囊病毒VLP；

所述的组装缓冲液的配方：0.1 M 磷酸盐缓冲液、0.9% 氯化钠、pH7.4。

3.权利要求1所述的方法在制备法氏囊病毒疫苗中的应用；

根据权利要求2所述的应用，将制备的传染性法氏囊病毒VLP溶液通过固定化多粘菌素B树脂，得到低内毒素VLP后，再制备疫苗。