CN101952320A - 具有免疫原性的物质 - Google Patents

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Abstract

提供了一种融合蛋白，其包含人乳头瘤病毒E7抗原、病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白。还提供了一种由该融合蛋白聚合形成的具有免疫原性的大分子，该大分子的颗粒形态不同于病毒样颗粒，其能用于治疗人乳头瘤病毒相关疾病。

Description

具有免疫原性的物质
技术领域
本发明涉及一种包含人乳头瘤病毒E7抗原、病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白的融合蛋白，由所述融合蛋白聚合而成的具有免疫原性的大分子及其应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)是小的非包被的双链DNA病毒，与多种疾病相关，可通过皮肤或粘膜表面感染。皮肤HPV感染可导致手或足的疣，可持续几个月到几年，这种良性的病变除个别情况外一般不危及生命，但可造成患者的伤痛。粘膜型HPV感染肛门与生殖器区域以及口腔。至今已经鉴定了接近100种不同类型的HPV。接近40种亚型的HPV特异性感染生殖器和口腔粘膜，这些类型的HPV在感染时不会引起任何症状且不常产生可见的生殖器疣，通常在感染病毒2-3个月后症状逐步显示出来。在感染后3周至许多年可得知发生了感染，因此HPV可以不知不觉地被传播。大部分感染是无症状的，但可导致生殖器疣、肛门或生殖道癌的发生。粘膜型HPV感染引起的生殖器疣被作为多种性传播疾病(STD)中的一种，在全球范围内发生率是单纯疱疹病毒感染的两倍。HPV持续感染可导致癌前病变宫颈内上皮瘤样病变(CIN)，部分进而发展成为宫颈癌，宫颈癌是全球范围内发生率很高的癌症，大多检测到HPV16和HPV18的DNA(＞99％)。宫颈癌的患病率为9.98/10万，每年全球新增500,000名患者，是导致50岁以下妇女死亡的最大诱因。除了宫颈癌，HPV还与许多肛门和肛周癌症相关。
目前已经开发出了预防性疫苗，已经在真核细胞中表达了HPV的主要衣壳蛋白，并且该主要衣壳蛋白在表达宿主中可形成病毒样颗粒(VLP)。纯化的VLP是有效的对抗HPV的预防性疫苗，对于预防HPV感染是有用的。然而，还没有有效的可治愈感染的治疗组合物。因为病毒在复制中使用许多宿主细胞的自身机制，开发在不伤害宿主的情况下抑制病毒复制的药物很困难。已知免疫系统在控制HPV感染中起着重要的作用，接受免疫抑制治疗的人患HPV感染的机率升高也证实许多病毒感染受免疫系统控制。对自然发生的疣的消退的研究也是免疫系统具有控制感染能力的证据。在一些有外生殖器疣的个体中疣会自然消退，组织学研究表明，大量的T淋巴细胞出现在患处，因此认为针对HPV感染的有效免疫反应主要是细胞免疫介导的。而且，抑制疣的自然消退常伴随着淋巴细胞浸润、瘙痒、感染区域发红以及其它细胞介导的免疫反应相关症状。在细胞介导的免疫力受到损害的患者中HPV感染进而引发病损更为常见。因此，诱导有效的抗HPV抗原的细胞介导的免疫反应是研究防治HPV感染的疫苗的重点。
对预防性疫苗的研究集中在L1蛋白，其能够有效地激发机体产生强而持久的体液免疫，因而能够有效预防特定亚型的HPV感染，但不能有效地治疗已感染HPV的病损。E6和E7两种HPV蛋白可诱导和维持细胞转化，它们被表达在感染HPV的肿瘤细胞中，是理想的治疗性靶标。因此，针对E6和E7的治疗组合物可作为控制HPV感染相关疾病的选择。通过使用适当的抗原递呈系统(或抗原载体)，E6和E7或其决定簇可被递送到宿主以引起强烈的、长效的且特异性的细胞介导的免疫反应，这可能可以治愈HPV相关的疾病。
HPV的L1和L2衣壳蛋白已经被用作递送系统来运载HPV的E6或E7蛋白抗原，以诱导细胞介导的免疫反应。由于感染者对于HPV具有一定的免疫力，或由于HPV可在感染者中潜伏或持续感染，HPV可在宿主中产生免疫耐受。事实上，虽然HPV衣壳具有潜在的免疫原性，仅有半数宫颈癌患者可产生衣壳蛋白特异的免疫球蛋白G(IgG)。这种预先存在的由HPV L1或L2衣壳蛋白引起的免疫性或免疫耐受可限制治疗性疫苗的药效。
当在适当的表达系统中重组表达时，获自其它病毒的衣壳蛋白也能够在适当的宿主中自组装成VLP。这些VLP也能用作抗原递送系统(或抗原载体)来提呈E6或E7抗原或其决定簇以诱导细胞介导的免疫反应。然而，在VLP的纯化方面仍然存在问题，如果VLP获自以人为宿主的病毒，其治疗性疫苗也可能面临免疫耐受的问题。
因此，本领域需要提供可用于治疗HPV感染相关疾病的治疗组合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种具有免疫原性的大分子，其主要由本发明的融合蛋白自我装配聚合而成。
本发明的另一目的在于提供包含所述的具有免疫原性的大分子的组合物(如疫苗)。
在本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，包含以下的蛋白：人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白，和分子伴侣蛋白。
在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒E7抗原是全长的人乳头瘤病毒E7抗原，或其含有抗原决定簇的蛋白片段。
在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒E7抗原、病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白之间，通过化学键相连或相互偶联；所述的化学键是共价键或非共价键。
在另一优选例中，所述的化学键是肽键。
在另一优选例中，所述的融合蛋白从氨基端到羧基端依次包含：人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白，和分子伴侣蛋白。
在另一优选例中，在病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白之间，还包括一连接肽(如2-20aa；较佳的如2-10aa)，所述的连接肽上包含至少一个酶切位点。
在另一优选例中，所述的酶切位点选自(但不限于)：肠激酶酶切位点，凝血酶酶切位点，或胰蛋白酶酶切位点。
在另一优选例中，所述的病毒衣壳蛋白是乙肝病毒核心抗原。
在另一优选例中，所述的病毒衣壳蛋白是全长的衣壳蛋白，或其保留自我装配能力的片段，或其保留自我装备能力的变体。
在另一优选例中，所述的分子伴侣蛋白是选自分子伴侣蛋白家族的一种蛋白。
在另一优选例中，所述的分子伴侣蛋白是全长的分子伴侣蛋白，或其保留生物学活性的片段，或其保留生物学活性的变体。
在另一优选例中，所述的分子伴侣蛋白选自：热休克蛋白65(Hsp65)，热休克蛋白60(Hsp60)，热休克蛋白70(Hsp70)，热休克蛋白90(Hsp90)或热休克蛋白100(Hsp100)。
在另一优选例中，所述分子伴侣蛋白是热休克蛋白65。
在另一优选例中，所述分子伴侣蛋白是M.bovis BCGHsp65。
在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒E7抗原是：(a1)如SEQ ID NO：1中第1-98位所示氨基酸序列的蛋白，或由(a1)限定的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a1)限定的蛋白相同抗原性的由(a1)衍生的蛋白；或
所述的病毒衣壳蛋白是：(b1)如SEQ ID NO：1中第99-283位所示氨基酸序列的蛋白，或由(b1)限定的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(b1)限定的蛋白相同功能的由(b1)衍生的蛋白；或
所述的分子伴侣蛋白是：(c1)如SEQ ID NO：1中第284-823位所示氨基酸序列的蛋白，或由(c1)限定的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(c1)限定的蛋白相同功能的由(c1)衍生的蛋白。
在本发明的第二方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于制备具有免疫原性的大分子。
在本发明的第三方面，提供一种核酸分子，所述的核酸分子编码所述的融合蛋白。
在本发明的第四方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸。
在本发明的第五方面，提供一种细胞，所述的细胞含有所述的载体或其基因组中整合有所述的核酸分子。
在本发明的第六方面，提供一种具有免疫原性的大分子，所述的大分子是一种多分子聚合物，该聚合物主要由所述的融合蛋白自我装配而成，其分子量超过1000KD。
在另一优选例中，所述的具有免疫原性的大分子是颗粒状的多分子聚合物，其形态与病毒样颗粒不同。
在另一优选例中，所述的具有免疫原性的大分子颗粒的直径为1-1000nm。
在另一优选例中，所述的大分子中还包含：至少一种免疫刺激物，用于增强机体的免疫反应。
在另一优选例中，所述的免疫刺激物与所述的具有免疫原性的大分子相偶联，或被包装入所述具有免疫原性的大分子；所述的免疫刺激物选自：双链RNA，或非甲基化的CpG-DNA。
在本发明的第七方面，提供一种制备所述的具有免疫原性的大分子的方法，所述方法包括：
(1)培养所述的细胞，从而表达所述的融合蛋白；
(2)分离纯化(1)获得的融合蛋白，在一步或多步的分离纯化步骤中使用离液剂；
(3)通过移除离液剂使(2)获得的融合蛋白自我装配成所述的具有免疫原性的大分子。
在另一优选例中，所述的离液剂选自：尿素或盐酸胍。
在另一优选例中，所述的尿素的浓度是1-10M，较佳的2-8M，更佳的4-8M。
在另一优选例中，所述的盐酸胍的浓度是1-10M，较佳的1-6M，更佳的3-6M。
在本发明的第八方面，提供所述的大分子的用途，用于制备预防或治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染相关疾病的组合物。
在另一优选例中，所述的疾病选自(但不限于)：肿瘤(如宫颈癌、阴道癌、肛门或肛周的癌、口咽部的癌、上颌窦癌、肺癌)、宫颈上皮内瘤样病变、外生殖器疣。
在另一优选例中，所述具有免疫原性的大分子作为抗原载体或疫苗可避开机体所存在的针对病毒样颗粒的免疫反应或免疫耐受。
在本发明的第九方面，提供一种具有免疫原性的组合物，所述的组合物包含：(a)所述的具有免疫原性的大分子；和(b)药学上可接受的载体。
在本发明的第十方面，提供所述的具有免疫原性的组合物的用途，用于预防或治疗人乳头瘤病毒感染相关疾病。
在本发明的第十一方面，提供一种预防或治疗人乳头瘤病毒感染相关疾病的方法，所述方法包括：给予需要预防或治疗的对象有效量的所述的具有免疫原性的大分子，或所述的具有免疫原性的组合物。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的重组质粒构建图；
图2是本发明实施例2重组表达E7-Core-BCG65的12％SDS-PAGE电泳图；
图3是本发明实施例2中经分离纯化所得的E7-Core-BCG65融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；
图4是本发明实施例2的分子筛柱层析比较图；
图5是本发明多分子聚合物的电镜图；
图6是多分子聚合物颗粒大小测定，其中A为颗粒的光强分布；B为颗粒的体积分布；C为测定结果的质量报告。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示一种融合蛋白，该融合蛋白包含人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白。该融合蛋白在表达和变性(如采用高浓度的离液剂(chaotropic agent))纯化后，可以以可溶性的形式进行复性和自我装配，从而形成具有强免疫原性的大分子，该大分子是颗粒状的多分子聚合物，其形态与病毒样颗粒不同；可避开机体所存在的针对病毒样颗粒的免疫反应或免疫耐受。
如本文所用，术语“本发明的融合蛋白”、“人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白的融合蛋白”、“E7-Core-Hsp65融合蛋白”等可互换使用，都指由人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白融合而成的蛋白，其中在人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白或分子伴侣蛋白之间可以通过化学键相连接或偶联；较佳的它们之间通过化学键(如肽键)相连接，它们之间有或者没有连接肽序列。
如本文所用，术语“具有免疫原性的大分子”是一种含有多条单体融合蛋白的大分子，优选地由多条单体融合蛋白聚合或组装而成。所述的具有免疫原性的大分子是颗粒状的，其形态与病毒样颗粒不同。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”，“具有”或“包括”的下位概念。
融合蛋白
本发明提供一种融合蛋白，该蛋白包含人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白，该分子能用于形成具有免疫原性的大分子。较佳的，所述的融合蛋白是一种分离的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。
1、人乳头瘤病毒E7抗原
人乳头瘤病毒E7抗原或其生物活性片段(如含有抗原决定簇的蛋白片段)均可用于本发明。人乳头瘤病毒E7抗原的生物活性片段是指作为一种多肽片段，在与病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白连接(优选与病毒衣壳蛋白相连接，更优选与病毒衣壳蛋白的N端相连接)并形成融合蛋白后，其仍然能保持全长的人乳头瘤病毒E7抗原的全部或部分抗原性。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长人乳头瘤病毒E7抗原的抗原性。在更优选的条件下，所述的生物活性片段能够保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的全长人乳头瘤病毒E7抗原的抗原性。
人乳头瘤病毒E7抗原或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述经氨基酸替换的序列基本上不影响其抗原性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。表1是这种替换的一些示例。
表1
  原氨基酸残基   保守性置换
  Ala(A)   Gly；Ser
  Arg(R)   Lys
  Asn(N)   Gln；His
  Cys(C)   Ser
  Gln(Q)   Asn
  Glu(E)   Asp
  Gly(G)   Ala；Pro
  His(H)   Asn；Gln
  Ile(I)   Leu；Val
  Leu(L)   Ile；Val
  Lys(K)   Arg；Gln；Glu
  Met(M)   Leu；Tyr；Ile
  Phe(F)   Met；Leu；Tyr
  Ser(S)   Thr
  Thr(T)   Ser
  Trp(W)   Tyr
  Tyr(Y)   Trp；Phe
  Val(V)   Ile；Leu
可能还有其它的类似的可替换性，这种可替换性往往可以根据经验确定或者根据已知的保守序列进行确定。
在本发明的优选方式中，所述的人乳头瘤病毒E7抗原的氨基酸序列可以与SEQID NO：1中第1-98位所示的序列基本上相同；其编码序列可以与SEQ ID NO：2中第1-294位所示的序列基本上相同。
2、病毒衣壳蛋白
所述的病毒衣壳蛋白可以是任何合适的来源于病毒的衣壳蛋白，只要其能够自我装配，且在与人乳头瘤病毒E7抗原和分子伴侣蛋白形成本发明的融合蛋白后，仍然能够保留自我装配能力。
所述的病毒衣壳蛋白是全长的衣壳蛋白，或其保留自我装配能力的生物活性片段，或其保留自我装备能力的变体。
病毒衣壳蛋自的生物活性片段是指作为一种多肽片段，其仍然能够保留全长病毒衣壳蛋白的全部或部分自我装配能力。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长病毒衣壳蛋白的自我装配能力。在更优选的条件下，所述的生物活性片段能够保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的全长病毒衣壳蛋白的自我装配能力。
全长病毒衣壳蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述经氨基酸替换的序列基本上不影响其自我装配能力。表1是这种替换的一些示例。可能还有其它的类似的可替换性，这种可替换性往往可以根据经验确定或者根据已知的保守序列进行确定。
作为本发明的优选方式，所述的病毒衣壳蛋白是乙肝病毒(HBV)核心抗原；在本发明的一个具体实施例中，所述的病毒衣壳蛋白是乙肝病毒ADW2亚型。
产生所述衣壳蛋白分子的生物活性片段或其变体的方法可通过公开发表的文献获得(Koschel M，Thomssen R，Bruss V.1999.Extensive mutagenesis of the hepatitis Bvirus core gene and mapping of mutations that allow capsid formation.J Virol.73(3)：2153-60；Pa.intsil J，Muller M，Picken M，Gissmann L，Zhou J.1996.Carboxylterminus of bovine papillomavirus type-1L1protein is not required for capsid formation.Virology.223(1)：238-44；Beames B，Lanford RE.1995.Insertions within the hepatitis Bvirus capsid protein influence capsid formation and RNA encapsidation.J Virol.69(11)：6833-8)。
在本发明的优选方式中，所述的病毒衣壳蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：1中第99-283位所示的序列基本上相同；其编码序列可以与SEQ ID NO：2第295-849位所示的序列基本上相同。
3、分子伴侣蛋白
所述的分子伴侣蛋白可以是任何合适的来源于分子伴侣蛋白家族的蛋白，只要其在与非天然构型的或变性的蛋白结合后可防止变性聚集体的形成并协助后者正确地复性，使变性的融合蛋白能够进行复性和自我装配。
所述的分子伴侣蛋白是全长的分子伴侣蛋白，或其保留生物学功能的生物活性片段，或其保留生物学功能的变体。
分子伴侣蛋白的生物活性片段是指作为一种多肽片段，其仍然能够保留全长分子伴侣蛋白的全部或部分生物学功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长分子伴侣蛋白的功能。在更优选的条件下，所述的生物活性片段能够保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的全长分子伴侣蛋白的功能。
全长分子伴侣蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述经氨基酸替换的序列基本上不影响其生物学功能。表1是这种替换的一些示例。可能还有其它的类似的可替换性，这种可替换性往往可以根据经验确定或者根据已知的保守序列进行确定。
产生所说的分子伴侣蛋白或其变体的方法可通过公开发表的文献获得(Jewett AI，Shea JE.2006.Folding on the chaperone：yield enhancement through loose binding J MolBiol.363(5)：945-57；Bhattacharyya J，Padmanabha Udupa EG，Wang J，Sharma KK 2006.Mini-alphaB-crystallin：a functional element of alphaB-crystallin with chaperone-likeactivity.Biochemistry.45(9)：3069-76；Ramon-Luing LA，Cruz-Migoni A，Ruiz-McdranoR，Xoconostle-Cazares B，Ortega-Lopez J.2006.One-step purification andimmobilization in cellulose of the GroEL apical domain fused to a carbohydrate-bindingmodule and its use in protein refolding.Biotechnol Lett.28(5)：301-7；Fox JD，RoutzahnKM，Bucher MH，Waugh DS.2003.Maltodextrin-binding proteins from diverse bacteriaand archaea are potent solubility enhancers.FEBS Lett.537(1-3)：53-7；Fox JD，KapustRB，Waugh DS.2001.Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia colimaltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteinsProtein Sci.10(3)：622-30；Chatellier J，Buckle AM，Fersht AR.1999.GroEL recognisessequential and non-sequential linear structural motifs compatible with extendedbeta-strands and alpha-helices.JMol Biol.292(1)：163-72)。细菌中，例如大肠杆菌的分子伴侣蛋白在不利条件下，比如高温条件下往往有很高的表达水平。因此，传统上这一类的分子伴侣蛋白也被称为热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)。分子伴侣蛋白的表达往往与热诱导或其他的对细胞不利的条件的诱导有关。其中的原因是，在较高温度下，蛋白的正确折叠过程受到较大的影响，需要分子伴侣蛋白修复由于部分蛋白错误折叠而可能产生的对细胞的损害。一些常见的分子伴侣蛋白家族包括Hsp60，Hsp70，Hsp90，Hsp100和小分子量的Hsp蛋白。分子伴侣蛋白并不仅仅包括热休克蛋白，其它分子伴侣蛋白也可以用本发明提供的方法与衣壳蛋白构建成融合蛋白，用于制备本发明所述的具有免疫原性的大分子。
作为本发明的优选方式，所述的分子伴侣蛋白是M.bovis BCG hsp65。
在本发明的优选方式中，所述的分子伴侣蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：1中第284-823位所示的序列基本上相同；其编码序列可以与SEQ ID NO：2中第850-2469位所示的序列基本上相同。
4、连接
所述的人乳头瘤病毒E7抗原、病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白之间，通过化学键相连或相互偶联；所述的化学键是共价键或非共价键。
作为本发明的优选方式，所述的人乳头瘤病毒E7抗原、病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白之间通过化学键相连；更佳的，所述的化学键是肽键。
作为另一种可选的方式，所述的病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白之间通过化学键相连，而人乳头瘤病毒E7抗原与病毒衣壳蛋白之间以偶联的方式相连。
作为本发明的优选方式，所述的融合蛋白从氨基端到羧基端依次包含：人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白。
所述的人乳头瘤病毒E7抗原、病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-50个氨基酸；较佳地为1-30个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白自我装配形成具有免疫原性的大分子。
作为本发明的优选方式，在病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白之间包括一连接肽(如2-20aa；较佳的如2-10aa)，所述的连接肽上包含至少一个特异性酶切位点。所述的酶切位点选自(但不限于)：肠激酶酶切位点，凝血酶酶切位点，或胰蛋白酶酶切位点。酶切位点的设置便于后续从融合蛋白或大分子颗粒上切下分子伴侣蛋白。由此设计构建的融合蛋白经重组表达、分离纯化、复性和自我装配形成的具有免疫原性的大分子(多分子聚合物)，可采用特异的酶切除分子伴侣蛋白，使最终的大分子中仅包含衣壳蛋白分子。例如，Asp Asp Asp Asp Lys的序列可特异地被肠激酶识别，当引入该段序列至本发明所述的融合蛋白的结合点时，由该融合蛋白形成的大分子可用肠激酶切除分子伴侣蛋白，经分离纯化后可得到仅含衣壳蛋白的大分子。
5、核酸分子
另一方面，本发明还提供了编码所述的融合蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。任何编码所述的融合蛋白的核酸都适用于本发明。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。
编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得编码人乳头瘤病毒E7抗原、病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白氨基酸的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
6、表达载体
本发明还提供了包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。
如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。
7、宿主细胞
此外，含有编码所述融合蛋白的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在本发明的优选实施方式中，采用原核细胞作为宿主细胞。
8、生产融合蛋白的方法
生产融合蛋白的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有融合蛋白编码核酸的重组细胞。所述方法可包括让细胞表达编码的融合蛋白，以及使表达的融合蛋白的复性。所述方法还可包括复性的融合蛋白的分离和/或纯化。
可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。
9、融合蛋白的用途
本发明的融合蛋白可用于制备具有免疫原性的大分子，所述的大分子可在体内引起免疫反应，所述的免疫反应包括细胞介导的免疫反应。
具有免疫原性的大分子及其制备方法
本发明还提供一种具有免疫原性的大分子，所述的大分子是一种多分子聚合物，该聚合物含有所述的融合蛋白；较佳的基本上由所述的融合蛋白聚合而成。所述的具有免疫原性的大分子是颗粒状的多分子聚合物，其形态与病毒样颗粒不同。所述的大分子颗粒的直径通常约为1-1000nm，较佳的是5-500nm，更佳的是10-100nm，如约20nm，40nm，60nm，80nm。
机体免疫系统的MHC I型和MHC II型对以颗粒状形式存在的外原性抗原的提呈较对可溶性单体抗原的提呈要强1000或10000倍，即以颗粒状形式存在的抗原比可溶性单体抗原具有更强的免疫原性，机体免疫系统的MHC I型和MHC II途径对以颗粒状形式存在的外源性抗原的提呈较对可溶性单体抗原的提呈要强1000或10000倍，即以颗粒状形式存在的抗原比可溶性单体抗原具有更强的免疫原性。
单独的衣壳蛋白分子经变性后，在复性的过程中往往形成一些无定型的聚集体沉淀而无法形成病毒样颗粒，而且单独的衣壳蛋白分子变性后，在不含离液剂的溶液中往往因为形成聚集体沉淀而无法以可溶的形式存在。其可能的原因与衣壳蛋白分子中的疏水基团之间的相互作用有关。衣壳蛋白分子中的疏水基团对于其自我装配形成病毒样颗粒以及维持病毒样颗粒的稳定性起极其重要的作用，并且疏水基团包埋在正常的病毒样颗粒当中。在高浓度的离液剂溶液中，例如尿素或盐酸胍溶液中，病毒样颗粒因高浓度离液剂的作用部分或完全解离，蛋白的高级结构受到破坏，使包埋在正常的病毒样颗粒当中的疏水基团暴露于溶液中，当离液剂被逐渐地从溶液中移出时，暴露的疏水基团之间的相互作用逐渐增强从而使变性的衣壳蛋白形成聚集体沉淀。融合蛋白在高浓度的离液剂溶液中，例如尿素或盐酸胍溶液中，其衣壳蛋白的疏水性基团也暴露于溶液中，但当离液剂被逐渐地从溶液中移出时，衣壳蛋白暴露的疏水基团被融合蛋白中的分子伴侣蛋白所保护，因而融合蛋白得以以可溶性的形式存在于溶液中完成复性和自我装配的过程，最终形成颗粒状的具有免疫原性的大分子。融合蛋白与衣壳蛋白相比是不同的分子，最主要的原因是融合蛋白在体外的这种变性、复性和重新自我装配的过程与衣壳蛋白在体内进行的天然的衣壳蛋白分子的折叠以及自我装配的过程，在所处的环境条件、参与的因素以及进程等方面，本质上是完全不同的。因此本发明由融合蛋白经体外变性、复性和重新自我装配形成的大分子的形态学持征与真实的病毒样颗粒是不同的。
本发明的具有免疫原性的大分子不具有真实病毒样颗粒的形态学特征，但仍然具有非常强的免疫原性。这种形态学特征上的差异可能导致本发明的具有免疫原性的大分子中衣壳蛋白所暴露的抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒中衣壳蛋白所暴露的抗原或抗原决定簇不同。由于机体的免疫反应，特别是体液免疫反应与暴露的抗原或抗原决定簇密切相关，因而本发明的具有免疫原性的大分子与病毒样颗粒在衣壳蛋白分子抗原或抗原决定簇暴露上的差异有以下一些优点；
1.机体内因早期病毒感染产生的免疫反应对本发明的具有免疫原性的大分子不起作用，使用本发明的具有免疫原性的大分子作为免疫原可躲避机体针对病毒衣壳蛋白的免疫攻击，而病毒样颗粒可受机体免疫反应的攻击使其无法有效的作为免疫原激发机体的免疫反应；
2.如果机体对病毒的感染产生了免疫耐受性，该类病毒样颗粒的免疫原性就有可能因免疫耐受而受影响，而使用本发明的具有免疫原性的大分子有可能避开机体免疫耐受性的影响；
3.使用本发明的具有免疫原性的大分子作为免疫原可避免产生针对商业性衣壳蛋白免疫分析的干扰。
本发明的具有免疫原性的大分子具有很强的免疫原性的原因是：(1)本发明的具有免疫原性的大分子由多个单体或亚基构成，具有超过1000KD的分子量，且具有颗粒状的特征，颗粒状的抗原一般都具有较强的免疫原性，其免疫原性较单体的可溶性抗原强1000或10000倍；(2)融合蛋白中的衣壳蛋白的某些序列可能被机体的先天性免疫机制所识别，并协同机体的后天性免疫产生强烈和持久的免疫反应。
本发明的融合蛋白经重组DNA技术表达后，在随后对其进行的分离纯化过程中，可在一个或多个步骤中使用高浓度的离液剂，比如尿素或盐酸胍等，对含衣壳蛋白的融合蛋白进行分离纯化，纯化后的融合蛋白可通过逐步移出离液剂的方式进行复性和自我装配成为本发明所述的具有免疫原性的大分子。
一种制备所述的具有免疫原性的大分子的方法包括：(1)培养含有编码所述融合蛋白的核酸的细胞，从而表达所述的融合蛋白；(2)分离纯化(1)获得的融合蛋白，在一步或多步的分离纯化步骤中使用离液剂；(3)通过移除离液剂使(2)获得的融合蛋白自我装配成所述的具有免疫原性的大分子。
可以采用离液剂选自但不限于：尿素或盐酸胍。在使用所述的离液剂时，尿素的浓度可以是1-10M，较佳的2-8M；所述的盐酸胍的浓度可以是1-10M，较佳的1-6M。
融合蛋白分子中的衣壳蛋白在进行自我装配时，还可将核酸也包装在内形成具有免疫原性的大分子，有些核酸分子，例如双链RNA和没有甲基化的CpG-DNA是很强的免疫刺激因子，可较大地提高机体的免疫反应。
本发明的融合蛋白经分离纯化后，仍能复性和自我装配成分子量超过1000KD的具有免疫原性的大分子(即多分子聚合物)，该具有免疫原性的大分子具有颗粒状的特征，其免疫原性较单体的可溶性抗原强1000或10000倍。经分子筛柱层析测试，本发明的具有免疫原性的大分子的洗脱峰出峰位置与衣壳蛋白形成的病毒样颗粒的出峰位置基本一致。
本发明还提供所述的具有免疫原性的大分子的用途，用于制备预防或治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染相关疾病的组合物。所述的疾病选自(但不限于)：肿瘤(如宫颈癌、阴道癌、肛门或肛周的癌、口咽部的癌、上颌窦癌、肺癌)、宫颈上皮内瘤样病变、外生殖器疣。
组合物
本发明还提供一种具有免疫原性的组合物(预防性或治疗性疫苗)，所述的组合物包含：有效量的本发明所述的具有免疫原性的大分子，和药学上可接受的载体。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。
可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。
动物实验表明，利用本发明的具有免疫原性的大分子制成的疫苗免疫后，小鼠的肿瘤生长速度减慢，体积缩小，有效提高了被接种肿瘤的小鼠的存活率。
在使用时，是将安全有效置的本发明所述的具有免疫原性的大分子施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1  携带HPV抗原的FCCP分子的基因的设计和合成
所用分子伴侣蛋白来源于Mycobacterium bovis BCG的Hsp65(Thole JE，KeulenWJ，De Bruyn J，Kolk AH，Groothuis DG，Berwald LG，Tiesjema RH，van Embden JD.1987.Characterization，sequence determination，and immunogenicity of a 64-kilodaltonprotein of Mycobacterium bovis BCG expressed in escherichia coli K-12.Infect Immun.55(6)：1466-75；GenBank登录号：M17705.1)，将该分子伴侣蛋白融合到乙型肝炎病毒(HBV)的ADW2亚型的衣壳蛋白(核心抗原：NCBI核苷酸登录号：AF324148)的C-末端形成一个FCCP(Fusion Capsid-chaperone Protein)分子。所携带的抗原选用人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的16型E7蛋白(GenBank登录号：#K02718)，将E7蛋白融合至FCCP的衣壳蛋白分子的N-末端形成FCCP携带一个E7抗原的融合蛋白，即E7-Core-Hsp65，其氨基酸序列见SEQIDNO：1。
从氨基酸序列推断的E7-Core-Hsp65融合蛋白的分子量为89245Kd。根据来源于GenBank的序列，通过化学方法人工全合成总共2479bp的编码E7-Core-Hsp65(也称为E7-Core-BCG65)融合蛋白的DNA序列，其序列见SEQ ID NO：2。所合成的2479bp的DNA序列称为Ankegens 2479bp，并克隆入pBluescript II SK(+/-)(Stratagene)载体的SmaI酶切位点得到重组质粒pBSK-Ankegens-2479bp(见图1)。
实施例2  E7-Core-Hsp65融合蛋白的重组表达和分离纯化
E7-Core-Hsp65融合蛋白的DNA片断由NdeI和EcoRI双酶切pBSK-Ankegens-2479bp质粒后分离得到并克隆入pET-23a表达质粒(Emdbioseiences)的相应位点得到重组质粒pET-23a-2479。将重组质粒pET-23a-2479转化入Novagen公司的受体菌Rosetta-gami(DE3)中进行E7-Core-Hsp65融合蛋白的表达。根据Novagen公司的《pET System Manual》，转化入重组质粒的大肠杆菌菌株Rosetta-gami(DE3)经培养发酵和0.5mM IPTG(isopropyl-thio-galatopyranoside，异丙基硫代半乳糖苷)诱导后获得了E7-Core-BCG65融合蛋白的表达，表达产物进行SDS-PAGE电泳检测的结果见图2。在图2中，泳道1代表宿主Rosetta-gami(DE3)全菌(无重组质粒)电泳结果，泳道2、3、4、5都代表转化入重组质粒pET-23a-2479的Rosetta-gami(DE3)经IPTG诱导后全菌电泳结果，泳道6代表低分子量标准蛋白电泳结果。
发酵结束后，通过离心方法收获菌体。取100g湿菌悬浮于1000ml的缓冲液A(100mM Tris-Hcl pH 9.0；5mM EDTA)，待菌体充分悬浮后8500rpm离心30分钟，弃去上清，沉淀以1000ml的缓冲液B(50mM乙酸钠；2mM EDTA)悬浮，待菌体充分悬浮后，细菌细胞经760bar的高压匀浆破碎。高压匀浆破碎后的裂解液经8500rpm离心30分钟后，取上清液并弃去沉淀。在所取的上清液中按每毫升加入0.7g尿素的标准加入尿素，加入NaCl至终浓度为100mM，加入L-Cysteine至终浓度为20mM。经室温下充分搅拌，待尿素完全溶解后4℃搅拌过夜。4℃搅拌过夜后的样品直接上样于一根XK-50(GE Health)装有300ml SP-Sepharose填料(GE Health)的层析柱。该层析柱在上样前经1M的NaCl清洗后以缓冲液C(50mM乙酸钠；100mM NaCl；2mM EDTA；8M尿素；10mM L-Cysteine)充分平衡。上样后，以10个柱体积的缓冲液D(50mM乙酸钠；100mM NaCl；2mM EDTA；8M尿素；10mM L-Cy steine，2.5％Triton-X-100)清洗柱子过夜以保证去除内毒素的污染。随后，以5个柱体积的缓冲液C清洗柱子以去除Triton-X-100，以3个柱体积的缓冲液E(50mM乙酸钠；300mMNaCl；2mM EDTA；8M尿素；10mM L-Cysteine)清洗柱子以去除其他污染物。E7-Core-BCG65融合蛋白经缓冲液H(50mM乙酸钠；800mM NaCl；2mM EDTA；8M尿素；10mM L-Cysteine)洗脱。收集洗脱后的蛋白峰并对4×40倍体积的缓冲液F(50mM乙酸钠；6M尿素)透析去除NaCl和L-Cysteine。透析后，在样品中加入亚硫酸钠和连四硫酸钠分别至终浓度200mM和50mM在室温下保温过夜进行二硫键分解的反应。随后，样品经5倍的缓冲液F稀释后上样于一根XK-50装有150mlQ-Sepharose填料(GE Health)的层析柱。该层析柱在上样前经1M的NaCl清洗后以缓冲液F充分平衡。上样后，层析柱经2个柱体积的95％的缓冲液F和5％的缓冲液G(50mM乙酸钠；1M NaCl；6M尿素)清洗。E7-Core-BCG65融合蛋白经8个柱体积的线性梯度从95％缓冲液F和5％缓冲液G到50％缓冲液F和50％缓冲液G洗脱。收集洗脱后的E7-Core-BCG65融合蛋白，对1×40倍体积的Tris HCl pH90，1×40倍体积的Tris.HCl pH7.5含100mM NaCl的透析液透析去除尿素并使E7-Core-BCG65融合蛋白复性和自我装配成为多分子聚合物。
最终分离纯化所得的样品在透析前经SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定，结果显示E7-Core-BCG65融合蛋白为分子量接近90KD的主要条带(见图3)。在图3中，泳道1代表低分子量标准蛋白的电泳结果，泳道2代表上样量为0.8ug的E7-Core-BCG65融合蛋白的电泳结果，泳道3代表上样量为1.7ug的E7-Core-BCG65融合蛋白的电泳结果。
经分子筛柱层析测试，复性后的E7-Core-BCG65的洗脱峰表现出的分子量远远大于相应单体蛋白(牛血清白蛋白)的分子量，其洗脱峰出峰位置与由人乳头瘤病毒16型L1主要衣壳蛋白形成的病毒样颗粒的出峰位置基本一致，表现出多分子聚合物的特征(见图4)。在图4中，A图是蛋白浓度为1.2mg/ml的牛血清白蛋白(68kD)的分子筛柱层析测试图，B图是蛋白浓度为1.5mg/ml的本发明复性后的E7-Core-BCG65的分子筛柱层析测试图，C图是蛋白浓度为1.3mg/ml的人乳头瘤病毒L1形成的病毒样颗粒的分子筛柱层析测试图。分子筛柱层析的基本参数为：层析柱直径1.6cm；柱长100cm；填料装量180ml；填料为Sepharose 4FF(GE Healthcare)；流动相为100mM PB，0.4M NaCl，pH6.5；流速为2ml/min；上样量为1ml。
电镜观察下，本实施例的多分子聚合物不具有典型人乙肝病毒的衣壳蛋白形成的病毒样颗粒的形态学特征(见图5)。图5B比图5A放大更高的倍数。
对本实施例所得的多分子聚合物采用蛋白N-端氨基酸序列测序后，其N-端氨基酸序列确定为MHGDTPTLHEYMLD，与理论上E7-Core-BCG65的N-端氨基酸序列完全一致。结合SDS-PAGE所确定的分离纯化所得产物的分子量与预期的E7-Core-BCG65的分子量一致(图3)，可以确定本实施例所得的多分子聚合物是由E7-Core-BCG65所构成的。
采用Abcam公司抗HBV (Hepatitis B Virus，乙型肝炎病毒)核心抗原的单克隆抗体对本实施例制备的多分子聚合物进行Western Blotting分析，发现该单克隆抗体不能识别E7-Core-BCG65中的核心抗原。因而本实施例制备的多分子聚合物有可能使用其作为免疫原时可以躲避机体针对HBV病毒衣壳蛋白(核心抗原)的免疫攻击。
本实施例所制备的最终产物的内毒素含量每毫克蛋白小于5EU。
实施例3  多分子聚合物颗粒大小的测定
前述实施例2制备的多分子聚合物用50mmol/L mops缓冲液+0.5mol/LNaCl+0.03％吐温-80，pH7.0稀释约3倍。采用Malvern Zetasizer Nano ZS(英国马尔文公司(Marvern Instruments Ltd.))测定多分子聚合物颗粒大小。
测定条件为：25℃，平衡时间为3min，以水作对照，测量杯型号DTS0012-Disposable sizing cuvette；重复测定两次。
测定结果如图6，其中A为颗粒的光强分布；B为颗粒的体积分布；C为测定结果的质量报告。由结果可知：所述的多分子聚合物的Z-Average size为61.3nm，PDI＜0.2，测定的数据可信。
实施例4  由E7-Core-BCG65融合蛋白形成的多分子聚合物在动物实验中的治疗性和预防性应用的效果
由E7-Core-BCG65融合蛋白形成的多分子聚合物携带有人乳头瘤病毒16型的E7抗原(E7蛋白)，本发明利用表达E7抗原的TC-1肿瘤细胞株对其在小鼠实验中的治疗性和预防性应用的效果进行评估。
C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，20.0±2.0g，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，合格证号：SCXK(沪)2003-0003。
表达E7抗原的TC-1肿瘤细胞株来源于C57BL/6小鼠的肺原代细胞，通过导入人乳头瘤病毒16型的E7基因和被激活的人C-Ha-ras基因，该原代细胞株被转化并获得了无限繁殖的能力。
TC-1细胞于添加了青/链霉素、2mM L-谷胺酰胺、1mM丙酮酸钠、2mM非必需氨基酸、10％FBS的RPMI-1640培养基中常规培养。收集体外培养生长良好的TC-1细胞，PBS洗3次，调整细胞密度至5×105/ml，给予C57BL/6小鼠左侧腋皮下注射，每只接种0.2ml，接种后随机分组，按预定方案给予药物治疗，样品用生理盐水稀释以后，给予小鼠背部皮下注射。每天观察动物肿瘤生长情况，记录接种后不同时间出现肿瘤的动物数，计算成瘤率，即出现肿瘤动物数与每组实际动物数之比；肿瘤可触及后，每周2次用游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积，即肿瘤体积＝(长径×短径2)/2；记录动物带瘤生存时间。数据以均数和标准差(x±s)表示。实验动物随机分成6组(见表2)。
表2  实验动物分组
  组别   数量(只)   剂量(/只)   给药时间
  大剂量治疗组   8   500μg   接种后48h第一次免疫，16天加强
  中剂量治疗组   8   100μg   接种后48h第一次免疫，16天加强
  小剂量治疗组   8   20μg   接种后48h第一次免疫，16天加强
  大剂量预防组   8   100μg   两次免疫，间隔14天，第2次免疫以后14天接种肿瘤细胞
  小剂量预防组   8   20μg   两次免疫，间隔14天，第2次免疫以后14天接种肿瘤
  模型对照组   6   生理盐水   接种后48h给药，周期同上
C57BL/6小鼠腋皮下接种1.0×105TC-1细胞，4天后即可观察到肿瘤在小鼠皮下生长。接种10天时，对照组动物肿瘤形成率达100％，肿瘤大小均匀，体积约40mm3。肿瘤生长迅速，在接种肿瘤细胞的第36天，对照组的平均肿瘤体积为7499.84mm3。45天后，对照组小鼠由于肿瘤负荷过大，开始大量死亡，第60天，所有的对照小鼠全部死亡。
治疗组动物在接种肿瘤48h进行第一次免疫(即给予实施例2制备的多分子聚合物)，第16天加强一次。经过HPV治疗性疫苗免疫后，小鼠的肿瘤生长速度减慢，体积缩小，大小剂量组之间呈现量效关系。接种后60天，治疗组小鼠全部存活(见表2)。
预防组动物先给予疫苗免疫2次，间隔14天，第二次免疫后2周给予肿瘤细胞接种。100μg和20μg免疫后，动物成瘤率降低。接种后60天，预防组小鼠全部存活(见表3)。
表3  不同实验组的平均肿瘤体积(mm3)(x±s)
Figure G2008800206420D00161
实施例5E7-Core-BCG65融合蛋白变体
基于实施例1中E7-Core-BCG65的氨基酸序列，建立E7-Core-BCG65的变体，称为E7-Core-BCG65-M，其与E7-Core-BCG65的不同在于：第8位氨基酸由Leu变为Ile；第812位氨基酸由Val变为Leu；且在第283-284位氨基酸之间加入氨基酸Asp Asp Asp Asp Lys。通过化学方法人工全合成融合蛋白E7-Core-BCG65-M的编码序列，按照实施例1相同的方法克隆入pBluescript II SK(+/-)(Stratagene)载体的SmaI酶切位点。
采用实施例2相同的方法重组表达和分离纯化E7-Core-Hsp65-M融合蛋白。结果，E7-Core-Hsp65-M形成了呈现颗粒状的多分子聚合物。
采用实施例4所述的方法对由E7-Core-Hsp65-M形成的多分子聚合物进行动物实验，结果发现其可显著抑制肿瘤细胞的生长。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (23)

1.一种融合蛋白，包含以下的蛋白：人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的人乳头瘤病毒E7抗原、病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白之间，通过化学键相连或相互偶联；所述的化学键是共价键或非共价键。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述的化学键是肽键。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从氨基端到羧基端依次包含：人乳头瘤病毒E7抗原，病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白。
5.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，在病毒衣壳蛋白和分子伴侣蛋白之间，还包括一连接肽，所述的连接肽上包含至少一个酶切位点。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的病毒衣壳蛋白是乙肝病毒核心抗原。
7.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的分子伴侣蛋白是选自分子伴侣蛋白家族的一种蛋白。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述的分子伴侣蛋白选自：热休克蛋白65，热休克蛋白60，热休克蛋白70，热休克蛋白90或热休克蛋白100。
9.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的人乳头瘤病毒E7抗原是：(a1)如SEQ ID NO：1中第1-98位所示氨基酸序列的蛋白，或由(a1)限定的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a1)限定的蛋白相同抗原性的由(a1)衍生的蛋白；或
所述的病毒衣壳蛋白是：(b1)如SEQ ID NO：1中第99-283位所示氨基酸序列的蛋白，或由(b1)限定的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(b1)限定的蛋白相同功能的由(b1)衍生的蛋白；或
所述的分子伴侣蛋白是：(c1)如SEQ ID NO：1中第284-823位所示氨基酸序列的蛋白，或由(c1)限定的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(c1)限定的蛋白相同功能的由(c1)衍生的蛋白。
10.权利要求1所述的融合蛋白的用途，用于制备具有免疫原性的大分子。
11.一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求1所述的融合蛋白。
12.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求11所述的核酸。
13.一种细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求12所述的载体或其基因组中整合有权利要求11所述的核酸分子。
14.一种具有免疫原性的大分子，其特征在于，所述的大分子是一种多分子聚合物，该聚合物主要由权利要求1所述的融合蛋白自我装配而成，其分子量超过1000KD。
15.如权利要求14所述的具有免疫原性的大分子，其特征在于，所述的大分子中还包含：至少一种免疫刺激物。
16.如权利要求15所述的具有免疫原性的大分子，其特征在于，所述的免疫刺激物与所述的具有免疫原性的大分子相偶联，或被包装入所述具有免疫原性的大分子；所述的免疫刺激物选自：双链RNA，或非甲基化的CpG-DNA。
17.一种制备权利要求14所述的具有免疫原性的大分子的方法，其特征在于，所述方法包括；
(1)培养权利要求13所述的细胞，从而表达权利要求1所述的融合蛋白；
(2)分离纯化(1)获得的融合蛋白，在一步或多步的分离纯化步骤中使用离液剂：和
(3)通过移除离液剂使(2)获得的融合蛋白自我装配成所述的具有免疫原性的大分子。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的离液剂选自：尿素或盐酸胍。
19.权利要求14所述的大分子的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗人乳头瘤病毒感染相关疾病的组合物。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述的疾病选自：肿瘤、宫颈上皮内瘤样病变、外生殖器疣。
21.一种具有免疫原性的组合物，其特征在于，所述的组合物包含：
(a)权利要求14-16任一所述的具有免疫原性的大分子；和
(b)药学上可接受的载体。
22.权利要求21所述的具有免疫原性的组合物的用途，其特征在于，用于预防或治疗人乳头瘤病毒感染相关疾病。
23.一种预防或治疗人乳头瘤病毒感染相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括：给予需要预防或治疗的对象有效量的权利要求14-16任一所述的具有免疫原性的大分子，或权利要求21所述的具有免疫原性的组合物。
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