BRPI0511479B1

BRPI0511479B1 - Molécula de ligação tendo atividade neutralizadora do vírus da raiva, imunoconjugado, molécula de ácido nucleico, vetor, método para produzir uma molécula de ligação, composição farmacêutica, seus usos e, kit

Info

Publication number: BRPI0511479B1
Application number: BRPI0511479-9A
Authority: BR
Inventors: Alexander Berthold Hendrix Bakker; Willem Egbert Marissen; Robert Arjen Kramer; Cornelis Adriaan De Kruif
Original assignee: Janssen Vaccines & Prevention B.V.
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2005-05-26
Publication date: 2019-01-29
Also published as: CA2568162A1; PT2314621E; AU2005250163B2; ATE501171T1; IL201970A; CN102212132A; KR20070044807A; IL179586A0; HRP20110320T1; NZ550366A; RS51847B; PT1749029E; EP2314620B1; HK1094705A1; EP2314620A1; DK1749029T3; EA200602210A1; CA2568162C; JP2008508859A; PL2314621T3

Description

“MOLÉCULA DE LIGAÇÃO TENDO ATIVIDADE NEUTRALIZADORA DO VÍRUS DA RAIVA, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, SEUS USOS E, KIT”

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção diz respeito a medicamento. Em particular a invenção diz respeito às moléculas de ligação que neutralizam o vírus da raiva. As moléculas de ligação são úteis na profilaxia na pós exposição à raiva.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A raiva é uma infecção viral com distribuição quase mundial que afeta principalmente animais selvagens e domésticos mas também envolve seres humanos, resultando em uma encefalite devastadora, quase invariável, fatal. Anualmente, mais do que 70.000 mortes humanas por acidente são estimadas e milhões de outras requerem tratamento pós exposição.

O vírus da raiva é um vírus de RNA na forma de projétil, envelopado, de filamento único classificado na família de rabdovírus e gênero Lyssavirus. O genoma do vírus da raiva codifica cinco proteínas virais: a RNA polimerase dependente de RNA (L); uma nucleoproteína (N); uma proteína fosforilada (P); uma proteína de matriz (M) localizadas no lado interno do envelope da proteína viral; e uma glicoproteína (G) de superfície

Petição 870180138204, de 05/10/2018, pág. 5/14 externa.

A proteína G (62 a 67 kDa) é uma glicoproteína tipo I composta de 505 aminoácidos que tem dois a quatro sítios de Nglicosilação potenciais, dos quais apenas um ou dois sào glicosilados dependendo das cepas virais. A proteína G forma as protrusões que cobrem a superfície externa do envelope de virion e é conhecida induzir anticorpos de neutralização viral.

A raiva pode ser tratada ou prevenida tanto pela imunização passiva quanto ativa. A profilaxia da raiva na pós exposição inclui o cuidado do ferimento local imediato e a administração das imunizações tanto passiva (imunoglobulinas anti-raiva) quanto ativas (vacinas).

Correntemente, as imunoglobulinas anti-raiva (RIG) são preparadas a partir de amostras séricas de seres humanos imunes ao vírus da raiva (BRIG) ou cavalos imunes ao vírus da raiva (ERIG). Uma desvantagem de ERIG assim como BRIG é que eles não estão disponíveis em quantidades suficientes e, no caso de HORAIG, são muito caros. Além disso, o uso de ERIG levaria a reações adversas tais como choque anafilático. A possibilidade de contaminação por patógenos conhecidos ou desconhecidos é um problema adicional associado com HORAIG. Para superar estas desvantagens foi sugerido usar anticorpos monoclonais capazes de neutralizar o vírus da raiva em profílaxia na pós exposição. Os anticorpos monoclonais de murino que neutralizam o vírus da raiva são conhecidos na técnica (ver Schumacher et al., 1989). Entretanto, o uso de anticorpos de murino in vivo é limitada devido a problemas associados com a administração de anticorpos de murino aos seres humanos, tais como meia vida sérica curta, uma incapacidade para deflagrar certas funções efetoras humanas e indução de uma resposta imune dramática não desejada contra o anticorpo de murino em um ser humano (a reação do “anticorpo anti-camundongo humano” (HAMA)).

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Recentemente, anticorpos monoclonais que neutralizam o vírus da raiva humanos foram descritos (ver Dietzschold et al., 1990, Champion et al., 2000 e Hanlon et al., 2001). Para que os anticorpos monoclonais anti-raiva humanos sejam tão eficazes quanto HORAIG em profilaxia na pós exposição, uma mistura de anticorpos monoclonais deve ser usada. Em uma tal mistura cada anticorpo deve ligar-se a um epítopo ou sítio diferente no vírus para prevenir o escape de variantes resistentes do vírus.

Correntemente, existe ainda uma necessidade significante quanto a novos anticorpos monoclonais que neutralizam o vírus da raiva humano tendo potencial profilático na pós exposição melhorado, particularmente anticorpos tendo especificidades de epítopo-reconhecimento diferentes. A presente invenção fornece tais anticorpos monoclonal humanos que oferecem o potencial para ser usado em misturas úteis em profilaxia na pós exposição de uma ampla faixa de vírus da raiva e variantes destes resistentes à neutralização.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a comparação das seqüências de aminoácido da cepa CVS-11 do vírus da raiva e vírus que escapam E57. As células infectadas com vírus foram colhidas 2 dias após a infecção e o RNA total foi isolado. O cDNA foi gerado e usado para o seqüenciamento de DNA. As regiões contendo mutações são mostradas e as mutações são indicadas em negrito. A Figura IA mostra a comparação das seqüências de nucleotídeo. Os números acima dos aminoácidos indicam números de aminoácidos da glicoproteína do vírus da raiva incluindo peptídeo de sinal. A Figura 1B mostra a comparação de seqüências de aminoácido. O desenho esquemático da glicoproteína do vírus da raiva é mostrado no topo. A caixa preta indica o peptídeo de sinal, enquanto a caixa cinza indica o domínio de transmembrana. As seqüências na Figura 1 também são representadas pelas SEQ ID Nos: 130 a 141.

A Figura 2 mostra a comparação das seqüências de aminoácido da cepa CVS-11 do vírus da raiva e vírus que escapam EJB. As células infectadas com vírus foram colhidas 2 dias após a infecção e o RNA total foi isolado. O cDNA foi gerado e usado para o seqüenciamento de DNA. As regiões contendo mutações são mostradas e as mutações são indicadas em negrito. A Figura 2A mostra a comparação das seqüências de nucleotídeo. Os números acima dos aminoácidos indicam os números de aminoácido da glicoproteína do vírus da raiva incluindo o peptídeo de sinal. A Figura 2B mostra a comparação de seqüências de aminoácido. O desenho esquemático da glicoproteína do vírus da raiva é mostrado no topo. A caixa preta indica o peptídeo de sinal, enquanto a caixa cinza indica o domínio de transmembrana. As seqüências na Figura 2 também são representadas pelas SEQ ID Nos: 142151.

A Figura 3 mostra o vetor PDV-006.

A Figura 4 mostra um ELISA de competição de scFvs antivírus da raiva e o anticorpo anti-vírus da raiva biotinilado chamado de CR-57. As placas de ELISA revestidas com a proteína G do vírus da raiva purificada foram incubadas com as respectivas scFvs antes da adição de CR-57bio (0,5 pg/ml). Subsequentemente, a ligação de CR-57bio foi monitorada na ausência e presença de scFvs.

A Figura 5 mostra um ELISA de competição da scFvs antivírus da raiva e do anticorpo anti-vírus da raiva chamado CR-57. As placas de ELISA revestidas com proteína G do vírus da raiva purificada foram incubadas com CR-57 (1 pg/ml) antes da adição de scFvs em excesso. Subsequentemente, a ligação de scFv foi monitorada na ausência e presença de CR-57.

A Figura 6 mostra um ensaio de ELISA de competição de IgGs da proteína G anti-vírus da raiva e do anticorpo anti-vírus da raiva chamado CR-57. A proteína G (cepa ERA) foi incubada com IgGs não rotuladas (mostradas no eixo X). A CR57 biotinilada (CR57bio) foi adicionada e deixada ligar à proteína G antes da visualização por meio de estreptavidina-HORAP. Os sinais de ELISA são mostrados apenas como porcentagem de ligação de CR57bio.

A Figura 7 mostra um ensaio de FACS de competição de IgGs da proteína G anti-vírus da raiva e o anticorpo anti-vírus da raiva chamado de CR-57. A proteína G (cepa ERA) que expressa as células PER.C6 foram incubadas com IgGs não rotuladas (mostradas no eixo X). A CR57 biotinilada (CR57bio) foi adicionada e deixada ligar à células que expressam a proteína G antes da visualização por meio de estreptavidina-PE. Os sinais de FACS são mostrados apenas como porcentagem da ligação de CR57bio.

A Figura 8 mostra a comparação das seqüências de aminoácido de CVS-11 e vírus que escapam E98. As células infectadas com vírus foram colhidas 2 dias após a infecção e o RNA total foi isolado. O cDNA foi gerado e usado para o seqüenciamento de DNA. A região contendo uma mutação de ponto é mostrada e a mutação é indicada em negrito. A Figura 8A mostra a comparação das seqüências de nucleotídeo. O número acima do nucleotídeo indica o nucleotídeo mutado (indicado em negrito) da matriz de leitura aberta da glicoproteína do vírus da raiva sem a seqüência de peptídeo de sinal. A Figura 8B mostra a comparação de seqüências de aminoácido. O número acima do aminoácido indica o aminoácido mutado (indicado em negrito) da glicoproteína do vírus da raiva sem a seqüência de peptídeo de sinal.

A Figura 9 mostra uma árvore filogenética dos vírus street da raiva 123 (seqüências da glicoproteína G do vírus da raiva 123, União de vizinho, método Kimura de 2 parâmetros, 500 reamostragens). O negrito indica vírus que abrigam a mutação N>D como observado nos vírus que escapam E98.

A Figura 10 mostra a neutralização de epítopos na glicoproteína da raiva. Um desenho esquemático da glicoproteína do vírus da raiva é mostrado representando os sítios antigênicos incluindo o novo epítopo CR57. O peptídeo de sinal (19 aminoácidos) e o domínio de transmembrana são indicados pelas caixas pretas. As pontes de dissulfeto são indicadas. A numeração de aminoácido é da proteína madura menos a seqüência de peptídeo de sinal.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Abaixo seguem as definições de termos como usados na invenção.

DEFINIÇÕES

Molécula de Ligação

Como aqui usado o termo “molécula de ligação” refere-se a uma imunoglobulina intacta incluindo anticorpos monoclonais, tais como anticorpos monoclonais quiméricos, humanizados ou humanos, ou a um domínio de ligação de antígeno e/ou variável que compreende o fragmento de uma imunoglobulina que compete com a imunoglobulina intacta quanto a ligação específica ao parceiro de ligação da imunoglobulina, por exemplo, o vírus da raiva ou um fragmento deste tal como por exemplo, a proteína G. Independente da estrutura, o fragmento de ligação de antígeno liga-se com o mesmo antígeno que é reconhecido pela imunoglobulina intacta. Um fragmento de ligação de antígeno pode compreender um peptídeo ou polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido de pelo menos 2 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 5 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 30 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 35 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 60 resíduos de amino contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 125 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácido contíguos, ou pelo menos 250 resíduos de aminoácido contíguos da seqüência de aminoácido da molécula de ligação.

O termo “molécula de ligação”, como aqui usado inclui todas 10 as classes e subclasses de imunoglobulina conhecidas na técnica. Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, as moléculas de ligação podem ser divididas nas cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e diversos destes podem ser ainda divididos em subclasses (isótipos), por exemplo, IgAl, IgA2, IgGl, 15 IgG2, IgG3 e IgG4.

Os fragmentos de ligação de antígeno incluem, inter alia, Fab, F(ab’), F(ab’)₂> Fv, dAb, Fd, fragmentos da região determinadora de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única bivalente, anticorpos de fago de cadeia única, diacorpos, 20 triacorpos, tetracorpos, (poli)peptídeos que contenham pelo menos um fragmento de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ligação de antígeno específica para o (poli)peptídeo, etc. Os fragmentos acima podem ser produzidos sinteticamente ou pela divagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas ou podem ser geneticamente engendrado pelas 25 técnicas de DNA recombinante. Os métodos de produção são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow e D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, que é aqui incorporada por referência. Uma molécula de ligação ou fragmento de ligação de antígeno destes podem ter um ou mais sítios de ligação. Se existe mais do que um sítio de ligação, os sítios de ligação podem ser idênticos a entre si ou eles podem ser diferentes.

A molécula de ligação pode ser uma molécula de ligação nu ou não conjugado mas também pode ser parte de um imunoconjugado. Uma molécula de ligação nua ou não conjugada é intencionada a referir-se a uma molécula de ligação que não é conjugada, operativamente ligada ou de outro modo física ou funcionalmente associada com uma porção efetora ou rótulo, tais como inter alia uma substância tóxica, uma substância radioativa, um lipossoma, uma enzima. Será entendido que as moléculas de ligação nuas ou não conjugadas não excluem moléculas de ligação que foram estabilizadas, multimerizadas, humanizadas ou de qualquer outro modo manipuladas, outras que não pela ligação de uma porção efetora ou rótulo. Consequentemente, todas as moléculas de ligação nuas e não conjugadas pós traducionalmente modificadas são aqui incluídas, incluindo onde as modificações são fabricadas no ambiente que produz a molécula de ligação natural, por uma célula que produz a molécula de ligação recombinante e são introduzidos, pela mão do homem depois da preparação da molécula de ligação inicial. Naturalmente, o termo molécula de ligação nua ou não conjugada não exclui a capacidade da molécula de ligação para formar associações funcionais com células efetoras e/ou moléculas depois da administração ao corpo, visto que algumas de tais interações são necessárias de modo a exercer um efeito biológico. A falta de grupo efetor ou rótulo associados é portanto aplicada em definição à molécula de ligação nua ou não conjugada in vitro, não in vivo.

Regiões determinadoras de complementaridade (CDR)

O termo “regiões determinadoras de complementaridade” como aqui usado significa seqüências dentro das regiões variáveis de moléculas de ligação, tais como imunoglobulinas, que usualmente contribuem em um grau amplo para o sítio de ligação de antígeno que é complementar na /G forma e distribuição de carga para o epítopo reconhecido no antígeno. As regiões de CDR podem ser específicas para os epítopos lineares, epítopos descontínuos, ou epítopos conformacionais de proteínas ou fragmentos de proteína, como presente na proteína na sua conformação nativa ou, em alguns casos, como presente nas proteínas como desnaturadas, por exemplo, pela solubilização em SDS. Os epítopos também podem consistir de modificações pós traducionais de proteínas.

Variante Funcional

O termo “variante funcional ”, como aqui usado, refere-se a uma molécula de ligação que compreende um nucleotídeo e/ou seqüência de aminoácido que é alterada por um ou mais nucleotídeos e/ou aminoácidos comparados com as seqüências de nucleotídeo e/ou aminoácido da molécula de ligação precursora e que é ainda capaz de competir quanto a ligação ao parceiro de ligação, por exemplo, o vírus da raiva ou um fragmento destes, com a molécula de ligação precursora. Em outras palavras, as modificações na seqüência de aminoácido e/ou nucleotídeo da molécula de ligação precursora na afeta ou altera significantemente as características de ligação da molécula de ligação codificada pela seqüência de nucleotídeo ou contendo a seqüência de aminoácido, isto é a molécula de ligação é ainda capaz de reconhecer e ligar o seu alvo. A variante funcional pode ter modificações de seqüência conservativas incluindo substituições, adições e deleções de nucleotídeo e aminoácido. Estas modificações podem ser introduzidas pelas técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada pela PCR aleatória e podem compreender nucleotídeos e aminoácidos naturais assim como não naturais.

As substituições de aminoácido conservativas incluem aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo propriedades estruturais ou químicas similares. As famílias dos resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica.

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Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais nào polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais betaramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano). Estará evidente ao técnico habilitado que outras classificações de famílias de resíduo de aminoácido do que aquela usada acima também podem ser utilizadas. Além disso, uma variante pode não ter substituições de aminoácido conservativas, por exemplo, substituição de um aminoácido com um resíduo de aminoácido tendo propriedades estruturais ou químicas diferentes. Variações similares menores também podem incluir deleções ou inserções, ou ambos. Orientação na determinação de quais resíduos de aminoácido podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem abolir a atividade imunológica pode ser encontrada usando programas de computador bem conhecidos na técnica.

Uma mutação em uma seqüência de nucleotídeo pode ser um alteração única feita em um local (uma mutação pontual), tal como mutações de transição ou transversão, ou altemativamente, nucleotídeos múltiplos podem ser inseridos, deletados ou mudados em um único local. Além disso, uma ou mais alterações podem ser feitas em qualquer número de locais dentro de uma seqüência de nucleotídeo. As mutações podem ser realizadas por qualquer método adequado conhecido na técnica.

Hospedeiro

O termo “hospedeiro”, como aqui usado, é intencionado a referir-se a um organismo ou uma célula em que um vetor tal como um vetor de clonagem ou um vetor de expressão foram introduzidos. O organismo ou célula pode ser procariótica ou eucariótica. Deve ser entendido que este termo /<?

é intencionado a referir-se nào apenas ao organismo ou célula objetos, mas também à progênie de um tal organismo ou célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie pode, de fato, não ser idêntica ao organismo ou célula precursora, mas são ainda incluídos dentro do escopo do termo “hospedeiro” como aqui usado.

Humano

O termo “humano”, quando aplicado às moléculas de ligação como aqui definido, refere-se às moléculas que são diretamente derivados de 10 um ser humano ou com base em uma seqüência humana. Quando uma molécula de ligação é derivada de ou com base cm uma seqüência humana e subsequentemente modificada, deve ser ainda considerada humana como usado por todo o relatório descritivo. Em outras palavras, o termo humano, quando aplicado às moléculas de ligação é intencionado a incluir moléculas 15 de ligação tendo regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana com base nas regiões variáveis ou constantes ou que não ocorrem em uma ser humano ou linfócito ou na forma modificada. Assim, as moléculas de ligação humanas podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas seqüências de imunoglobulina 20 da linha germinativa humana, compreendendo substituições e/ou deleções (por exemplo, mutações introduzidas por exemplo pela mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou pela mutação somática in vivo). “Com base em” como aqui usado refere-se à situação em que uma seqüência de ácido nucleico pode ser exatamente copiada a partir de um padrão, ou com 25 mutações menores, tais como pelos métodos de PCR propensos a erro, ou sinteticamente feitos emparelhando o padrão exatamente ou com modificações menores. As moléculas semissintéticas com base nas seqüências humanas também são consideradas ser humanas como aqui usado.

Anticorpo monoclonal

O termo “anticorpo monoclonal” como aqui usado refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única, isto é a estrutura primária, isto é tendo uma única seqüência de aminoácido. Um anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade de ligação e afinidade a um epítopo particular. Consequentemente, o termo “anticorpo monoclonal humano” refere-se a um anticorpo que apresenta uma única especificidade de ligação que têm regiões variáveis e constantes derivadas de ou com base em seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana ou derivadas de seqüências completamente sintéticas. O método de preparar o anticorpo monoclonal não c relevante.

Molécula de ácido nucleico

O termo “molécula de ácido nucleico” como usado na presente invenção refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos e inclui filamentos tanto de sentido quanto de anti-sentido de RNA, cDNA, DNA genômico e formas sintéticas e polímeros mistos dos acima. Um nucleotídeo refere-se a um ribonucleotídeo, desoxinucleotídeo ou uma forma modificada de cada tipo de nucleotídeo. O termo também inclui formas de filamento único e duplo de DNA. Além disso, um polinucleotídeo pode incluir cada um ou ambos os nucleotídeos que ocorre naturalmente e modificados ligados juntos pelas ligações de nucleotídeo que ocorre naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente. As moléculas de ácido nucleico podem ser quimicamente ou bioquimicamente modificadas ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivatizadas, como será facilmente avaliado por aqueles de habilidade na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, rótulos, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações intemucleotídicas tais como ligações não carregadas (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), porções pendentes (por exemplo, polipeptídeos), intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), queladores, alquiladores e ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo acima também é intencionado a incluir qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento único, de filamento duplo, parcialmente duplexado, triplex, na forma de grampo de cabelo, circular e na forma de cadeado. Também incluídos são moléculas sintéticas que imitam polinucleotídeos na sua capacidade para ligar-se a uma seqüência designada por intermédio de ligação de hidrogênio e outras interações químicas. Tais moléculas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aquelas em que as ligações peptídicas colocadas no lugar de ligações de fosfato na cadeia principal da molécula. Uma referência a uma seqüência de ácido nucleico abrange o seu complemento a menos que de outro modo especificado. Assim, uma referência a uma molécula de ácido nucleico tendo uma seqüência particular deve ser entendido abranger o seu filamento complementar, com a sua seqüência complementar. O filamento complementar também é útil, por exemplo, para a terapia de anti-sentido, sondas de hibridização e preparadores de PCR.

Excipiente farmaceuticamente aceitável

Por “excipiente farmaceuticamente aceitável” é intencionado qualquer substância inerte que seja combinada com uma molécula ativa tal como um medicamento, agente, ou molécula de ligação para preparar uma forma de dosagem adequada ou conveniente. O “excipiente farmaceuticamente aceitável” é um excipiente que não é tóxico, ou pelo menos do qual a toxicicidade é aceitável para o seu uso intencionado, aos receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e é compatível com outros ingredientes da formulação que compreende o medicamento, agente ou molécula de ligação.

Profilaxia pós exposição

A “profilaxia pós exposição” (PEP) é indicada para pessoas possivelmente expostas a um animal hidrófobo. Exposições possíveis incluem exposição à mordida (isto é qualquer penetração da pele pelos dentes) 5 incluindo mordidas de animal e exposição que não pela mordida. As exposições que não pela mordida incluem exposição a quantidades grandes de vírus da raiva aerossolizadas em laboratórios ou cavernas e receptores cirúrgicos de córneas transplantadas de pacientes que morreram de raiva. A contaminação de ferimentos abertos, abrasões, membranas mucósicas, ou 10 teoricamente, arranhões, com saliva ou outro material potencialmente infecciosos (tais como tecido neural) a partir de um animal hidrófobo também constitui uma exposição que não mordida. Outro contato por si só, tal como acariciar um animal hidrófobo e contato com sangue, urina, ou fezes de um animal hidrófobo, não constitui uma exposição e não é uma indicação para 15 profilaxia. PEP deve começar tão logo quanto possível depois de uma exposição. Se nenhuma exposição ocorreu a profilaxia pós exposição não é necessária. Em soma os regimes de profilaxia pós exposição, exceto para pessoas anteriormente imunizadas, as imunizações ativas e passivas devem ser usadas concorrentemente.

Ligar Especificamente

O termo “ligar especificamente”, como aqui usado, em referência à interação de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo e o seu parceiro de ligação, por exemplo, um antigeno, significa que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular, por exemplo, 25 um determinante ou epítopo antigênicos, no parceiro de ligação. Em outras palavras, o anticorpo preferencialmente liga ou reconhece o parceiro de ligação mesmo quando o parceiro de ligação está presente em uma mistura de outras moléculas ou organismos. A ligação pode ser mediada pelas interações covalentes ou não covalentes ou uma combinação de ambas. Já em outras

Λ palavras, ο termo “ligar especificamente” significa ligar imunoespecificamente a um antígeno ou um fragmento deste e não ligar imunoespecificamente a outros antígenos. Uma molécula de ligação que imunoliga-se especificamente a um antígeno pode se ligar a outros peptídeos ou polipeptídeos com afinidade mais baixa como determinado, por exemplo, pelos radioimunoensaios (RIA), os ensaios imunossorvente ligado à enzima (ELISA), BIACORE, ou outros ensaios conhecidos na técnica. As moléculas de ligação ou fragmentos destes que imunoligam especificamente a um antígeno podem ser reativas cruzadas com antígenos relacionados.

Preferivelmente, as moléculas de ligação ou fragmentos destas que imunoligam especificamente a um antígeno não reagem cruzado com outros antígenos.

Quantidade terapeuticamente eficaz

O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade da molécula de ligação como aqui definido que é eficaz para a profilaxia pós exposição à raiva.

Vetor

O termo “vetor” denota uma molécula de ácido nucleico em que uma segunda molécula de ácido nucleico pode ser inserida para introdução em um hospedeiro onde a mesma será replicada e em alguns casos expressada. Em outras palavras, um vetor é capaz de transportar uma molécula de ácido nucleico à qual foi ligado. Clonagem assim como vetores de expressão são considerados pelo termo “vetor”, como aqui usado. Vetores incluem, mas não são limitados a, plasmídeos, cosmídeos, cromossomas artificiais bacterianos (BAC) e cromossomas artificiais de levedura (YAC) e vetores derivados de bacteriófagos ou vírus vegetal ou animal (incluindo humano). Os vetores compreendem uma origem de replicação reconhecida pelo hospedeiro proposto e no caso de vetores de expressão, promotor e outras regiões reguladoras reconhecidas pelo hospedeiro. Um vetor contendo <Λ3 uma segunda molécula de ácido nucleico é introduzido em uma célula por exemplo pela transformação, transfecção, ou fazendo-se uso de mecanismos de entrada bacteriana ou viral. Outros modos de introduzir ácido nucleico em células são conhecidos, tais como eletroporação ou bombardeamento de partícula freqüentemente usados com células vegetais e outros. O método de introduzir ácido nucleico em células depende entre outras coisas do tipo de células e assim por diante. Isto não é crítico para a invenção. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em um hospedeiro no qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores tendo uma origem bacteriana de replicação pode replicar em bactérias). Outros vetores podem ser integrados no genoma de um hospedeiro na introdução no hospedeiro e deste modo são replicados junto com o genoma hospedeiro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção fornece moléculas de ligação capazes de ligar especificamente ao vírus da raiva e neutralizá-lo. Além disso, a invenção diz respeito às moléculas de ácido nucleico que codificam pelo menos a região de ligação destas moléculas de ligação. A invenção ainda fornece o uso das moléculas de ligação da invenção em profilaxia na pós exposição de um paciente em risco de desenvolver uma condição que resulta do vírus da raiva.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto a presente invenção abrange moléculas de ligação capazes de ligar especificamente ao vírus da raiva. Preferivelmente, as moléculas de ligação da invenção também tem atividade de neutralização do vírus da raiva. Preferivelmente, as moléculas de ligação da invenção são moléculas de ligação humanas. Altemativamente, elas também podem ser moléculas de ligação de outros animais. O vírus da raiva é parte do gênero Lyssavirus. No total, o gênero Lyssavirus inclui onze genótipos: vírus da raiva (genótipo 1), vírus do morcego Lagos (genótipo 2), vírus Mokola (genótipo 3), vírus Duvenhage (genótipo 4), lyssavirus do morcego europeu 1 (genótipo 5), lyssavirus do morcego europeu 2 (genótipo 6), lyssavirus do morcego australiano (genótipo 7), vírus Aravan (genótipo 8), vírus Khujand (genótipo 9), vírus Irkut (genótipo 10) e vírus do Oeste Caucasiano (genótipo 11). Além da ligação ao vírus da raiva, as moléculas de 5 ligação da invenção também podem ser capaz de ligação a outros genótipos do gênero Lyssavirus. Preferivelmente, as moléculas de ligação também podem ser capaz de neutralizar outros genótipos do gênero Lyssavirus. Além disso, as moléculas de ligação da invenção podem ser capazes de ligar-se ainda aos vírus e/ou neutralizá-los, outros que não Lyssaviruses, da família 10 rabdovírus. Esta família inclui os gêneros citorabdovírus, efemerovírus, lyssavirus, nucleorabdovírus, rabdovírus e vesiculovírus.

As moléculas de ligação podem ser capazes de ligar especificamente ao vírus da raiva na sua forma natural ou na sua forma inativada/atenuada. A inativação do vírus da raiva pode ser realizada pelo 15 tratamento inter alia com beta-propiolactona (BPL) (White e Chappel, 1982), aquecendo a 56° C por mais do que 30 minutos, irradiação gama, tratamento com acetiletilenimina ou etilenimina ou tratamento com ácido ascórbico e sulfato de cobre por 72 horas (Madhusudana et al., 2004). Os métodos de inativação viral geral bem conhecidos pelo técnico habilitado tais como inter 20 alia pasteurização (calor úmido), tratamento térmico seco, tratamento térmico com vapor, tratamento com pH baixo, tratamento com solvente orgânico/detergente, nanofiltração; irradiação com luz UV também podem ser usados. Preferivelmente, a inativação é realizada pelo tratamento com betapropiolactona (BPL). Os métodos para testar se o vírus da raiva ainda é 25 ineficaz ou parcial ou completamente inativado são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica e podem entre outros ser encontrados em Laboratory techniques in rabies, Editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan e H. Koprowski (1996), 4^a edição, Capítulo 36, World Health Organization, Geneva.

As moléculas de ligação também podem ser capaz de ligar especificamente a um ou mais fragmentos do vírus da raiva tais como inter alia uma preparação de uma ou mais proteínas e/ou (poli)peptídeos derivados do vírus da raiva ou uma célula transfectada com uma proteína e/ou (poli)peptídeo do vírus da raiva. Para os métodos de tratamento e/ou prevenção tais como métodos para a profilaxia pós exposição do vírus da raiva as moléculas de ligação são preferivelmente capazes de ligar especificamente às proteínas acessíveis na superfície do vírus da raiva tais como as proteínas M (ver Ameyama et al. 2003) ou G. Para propósitos de diagnóstico as moléculas de ligação humanas também podem ser capazes de ligar especifícamente às proteínas não presentes na superfície do vírus da raiva. A seqüência de aminoácido da superfície acessível e as proteínas internas de várias cepas conhecidas do vírus da raiva podem ser encontradas na base de dados EMBL e/ou outras bases de dados.

Preferivelmente, o fragmento pelo menos compreende um determinante antigênico reconhecido pelas moléculas de ligação humanas da invenção. Um “determinante antigênico” como aqui usado é uma porção, tal como um (poli)peptídeo, (glico)proteína do vírus da raiva, ou análogo ou fragmento destes, que é capaz de ligação a uma molécula de ligação humana da invenção com afinidade sufícientemente alta para formar um complexo de antígeno-molécula de ligação detectável.

As moléculas de ligação de acordo com a invenção podem ser moléculas de imunoglobulina intactas tais como anticorpos policlonais ou monoclonais, em particular anticorpos monoclonais humanos, ou as moléculas de ligação podem ser antígeno-fragmentos de ligação incluindo, mas não limitado a, Fab, F(ab’), F(ab’)₂, Fv, dAb, Fd, fragmentos da região determinadora de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única bivalentes, anticorpos de fago de cadeia única, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e (poli)peptídeos que contêm pelo menos um fragmento de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir ligação de antígeno específica ao vírus da raiva ou fragmento destes. As moléculas de ligação da invenção podem ser usadas na forma não isolada ou isolada. Além disso, as moléculas de ligação da invenção podem ser usadas sozinhas ou em uma mistura que compreende pelo menos uma molécula de ligação humana (ou variante ou fragmento destes). Em outras palavras, as moléculas de ligação podem ser usadas em combinação, por exemplo, como uma composição farmacêutica que compreenda duas ou mais moléculas de ligação, variantes ou fragmentos destas. Por exemplo, as moléculas de ligação tendo atividade neutralizadora do vírus da raiva podem ser combinadas em uma única terapia para se obter um efeito profilático, terapêutico ou de diagnóstico desejado.

Os vírus de RNA tais como o vírus da raiva fazem uso de sua própria RNA polimerase durante a replicação viral. Estas RNA polimerases tendem a ser propensas a erro. Isto leva à formação dos chamados quase espécie durante uma infecção viral. Cada quase espécie tem um genoma de RNA único, que pode resultar em diferenças na composição de aminoácido de proteínas virais. Se tais mutações ocorrem nas proteínas virais estruturais, o vírus pode potencialmente escapar do sistema imune do hospedeiro devido a uma mudança nos epítopos de célula T ou B. A probabilidade disto acontecer é maior quando os indivíduos são tratados com uma mistura de duas moléculas de ligação, tais como anticorpos monoclonais humanos, do que com uma mistura de anticorpo policlonal (HORAIG). Portanto, um pré requisito para uma mistura de dois anticorpos monoclonais humanos para o tratamento da raiva é que os dois anticorpos reconheçam epítopos que não se sobrepõem, não competidores no seu antígeno alvo, isto é a glicoproteína do vírus da raiva. A possibilidade da ocorrência de vírus da raiva que escapam é deste modo minimizada. Como uma conseqüência destes, as moléculas de ligação da invenção preferivelmente são capazes de reagir com epítopos diferentes, que não se sobrepõem, não competidores do vírus da raiva, tais como epítopos na proteína G do vírus da raiva. A mistura de moléculas de ligação pode ainda compreender pelo menos um outro agente terapêutico tal como um medicamento adequado para a profilaxia pós exposição à raiva.

Tipicamente, as moléculas de ligação de acordo com a invenção podem se ligar a seus parceiros de ligação, isto é o vírus da raiva ou fragmentos destes tais como as proteínas do vírus da raiva, com uma constante de afinidade (valor K_d) que é mais baixos do que 0,2*IO’⁴ M, 1,0*10'⁵ M, 1,0*IO’⁶ M, 1,0*10'⁷ M, preferivelmente mais baixos do que 1,0*10 M, mais preferivelmente mais baixos do que 1,0*10’ M, mais preferivelmente mais baixos do que 1,0*10'¹⁰ M, ainda mais preferivelmente mais baixos do que 1,0*10’ M e em particular mais baixo do que 1,0*IO’¹²

M. As constantes de afinidade podem variar para os isótipos de anticorpo. Por exemplo, a ligação de afinidade para um isótipo IgM refere-se a uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 1,0*10’⁷ M. As constantes de afinidade por exemplo, podem ser medidas usando a ressonância de plasma de superfície, isto é um fenômeno ótico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real pela detecção de alterações nas concentrações de proteína dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo usando o sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia).

As moléculas de ligação de acordo com a invenção podem se ligar ao vírus da raiva nas formas purificada/isolada ou não purificada/não isolada. As moléculas de ligação podem se ligar ao vírus da raiva na forma solúvel tal como por exemplo, em uma amostra ou podem se ligar ao vírus da raiva ligado a um portador ou substrato ou imóvel nestes, por exemplo, placas microtituladoras, membranas e pérolas, etc. Portadores ou substratos podem ser fabricados de vidro, plástico (por exemplo, poliestireno), polissacarídeos, náilon, nitrocelulose, ou teflon, etc. A superfície de tais suportes pode ser sólida ou porosa e de qualquer forma conveniente. Altemativamente, as moléculas de ligação também podem se ligar a fragmentos de vírus da raiva tais como proteínas ou (poli)peptídeos do vírus da raiva. Em uma forma de realização as moléculas de ligação são capazes de ligar especificamente à proteína G do vírus da raiva ou fragmento desta. As proteínas ou (poli)peptídeos do vírus da raiva podem estar na forma solúvel ou podem se ligar ao vírus da raiva ligado a um portador ou substrato ou imóvel nestes como descrito acima. Em uma outra forma de realização as células tranfectadas com a proteína G podem ser usadas como parceiro de ligação para as moléculas de ligação.

Em uma forma de realização preferida da invenção, as moléculas de ligação da invenção neutralizam a infectividade do vírus da raiva. Isto pode ser obtido impedindo-se a ligação do vírus da raiva aos seus receptores nas células hospedeiras, tais como inter alia o receptor de neurotrofina p75 de murino, a molécula de adesão de célula neural (CD56) e o receptor de acetilcolina, ou a inibição da liberação de RNA no citoplasma da célula ou prevenção da transcrição ou tradução do RNA. Em uma forma de realização específica, as moléculas de ligação da invenção impedem o vírus da raiva de infectar as células hospedeiras em pelo menos 99 %, pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, pelo menos 50 %, pelo menos 45 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 35 %, pelo menos 30 %, pelo menos 25 %, pelo menos 20 %, ou pelo menos 10 % em relação à infecção de células hospedeiras pelo vírus da raiva na ausência das ditas moléculas de ligação. A neutralização por exemplo, pode ser medida como descrito em Laboratory techniques in rabies, Editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan e H. Koprowski (1996), 4^a edição, Capítulos 15 a 17, World Health Organization, Geneva. Além disso, as moléculas de ligação humanas da invenção podem ser moléculas de ligação de fixação complemento capazes de auxiliar na lise de vírus da raiva envelopado. As moléculas de ligação humanas da invenção também poderíam atuar como opsoninas e aumentam a fagocitose do vírus da raiva pela promoção da sua captação por intermédio de receptores Fc ou C3b ou pela aglutinação do vírus da raiva para tomá-lo mais facilmente fagocitado.

Em uma forma de realização preferida, as moléculas de ligação de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma região de CDR3 que compreende a seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:

9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ

ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:

18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24. Em uma forma de realização a região de CDR3 é uma região de CDR3 de cadeia pesada.

Já em uma outra forma de realização, as moléculas de ligação de acordo com a invenção compreendem uma cadeia pesada variável que compreende essencialmente uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID

NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID

NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49. Em uma forma de realização preferida as moléculas de ligação de acordo com a invenção compreendem uma cadeia pesada variável compreendendo essencialmente uma seqüência de aminoácido que compreende os aminoácidos 1-119 da SEQ IDNO: 335.

Em uma outra forma de realização, as moléculas de ligação de acordo com a invenção compreendem uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 26 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 50, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 27 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 51, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 28 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 52, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 29 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 53, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 30 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 54, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 31 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 55, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 32 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 56, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 33 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 57, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 34 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 58, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 35 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 59, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 36 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 60, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 37 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 61, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 38 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 62, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 39 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 63, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 40 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 64, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 41 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 65, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 66, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 43 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 67, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 44 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 68, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 45 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 69, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 46 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 70, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 47 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 71, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 72, uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 49 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 73. Em uma forma de realização preferida as moléculas de &

ligação humanas de acordo com a invenção compreendem uma cadeia pesada variável compreendendo a seqüência de aminoácido que compreende os aminoácidos 1-119 da SEQ ID NO: 335 e uma cadeia leve variável compreendendo a seqüência de aminoácido que compreende os aminoácidos de 1-107 da SEQ ID NO: 337.

Em uma forma de realização preferida as moléculas de ligação tendo a atividade neutralizadora do vírus da raiva da invenção são administradas no formato IgG, preferivelmente no formato IgGl.

Um outro aspecto da invenção inclui variantes funcionais de moléculas de ligação como aqui definidas. As moléculas são consideradas como sendo variantes funcionais de uma molécula de ligação de acordo com a invenção, se as variantes são capazes de competir quanto a ligar-se especificamente ao vírus da raiva ou um fragmento destes com as moléculas de ligação precursoras. Em outras palavras, quando as variantes funcionais são ainda capazes de ligação ao vírus da raiva ou um fragmento deste. As variantes funcionais também devem ter ainda a atividade neutralizadora do vírus da raiva. As variantes funcionais incluem, mas não são limitadas aos derivados que são substancialmente similares na seqüência estrutural primária, mas que contêm por exemplo, modificações, químicas e/ou bioquímicas, in vitro ou in vivo que não são encontradas na molécula de ligação precursora. Tais modificações incluem inter alia acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação da ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilaçào, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada pelo RNA de transferência de aminoácidos para as proteínas tais como arginilação, ubiquitinação e outros.

Altemativamente, as variantes funcionais podem ser moléculas de ligação como definidas na presente invenção que compreendem uma seqüência de aminoácido contendo substituições, inserções, deleções ou combinações destas de um ou mais aminoácidos comparada com as seqüências de aminoácido das moléculas de ligação precursoras. Além disso, as variantes funcionais podem compreender truncagens da seqüência de 10 aminoácido em cada um ou ambos os términos amino ou carbóxi. Variantes funcionais de acordo com a invenção podem ter a mesma afinidade dc ligação ou diferente, mais alta ou mais baixa, comparada com a molécula de ligação precursora mas são ainda capazes de ligação ao vírus da raiva ou um fragmento destes e são ainda capazes de neutralizar o vírus da raiva. Por 15 exemplo, variantes funcionais de acordo com a invenção podem ter afinidades de ligação aumentadas ou diminuídas ao vírus da raiva ou um fragmento deste comparadas com as moléculas de ligação precursoras ou podem ter uma atividade neutralizadora mais alta ou mais baixa do vírus da raiva. Preferivelmente, as seqüências de aminoácido das regiões variáveis, 20 incluindo, mas não limitado às, regiões de estrutura, hiperregiões variáveis, em particular as regiões de CDR3, são modificadas. No geral, as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada compreendem três regiões hipervariáveis, que compreendem três CDRs e regiões mais conservadas, as chamadas regiões de estrutura (FRs). As regiões hipervariáveis compreendem 25 resíduos de aminoácido das CDRs e resíduos de aminoácido das alças hipervariáveis. As variantes funcionais intencionadas a cair dentro do escopo da presente invenção têm pelo menos cerca de 50 % a cerca de 99 %, preferivelmente pelo menos cerca de 60 % a cerca de 99 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 % a cerca de 99 %, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80 % a cerca de 99 %, o mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % a cerca de 99 %, em particular pelo menos cerca de 95 % a cerca de 99 % e em particular pelo menos cerca de 97 % a cerca de 99 % de homologia de seqüência de aminoácido com as moléculas de ligação precursoras como aqui definidas. Algoritmos de computador tais como inter alia Gap ou Bestfit conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica podem ser usados para alinhar otimamente seqüências de aminoácido a serem comparadas e para definir resíduos de aminoácido similares ou idênticos.

Em uma outra forma de realização, variantes funcionais podem ser produzidas quando a molécula de ligação precursora compreende um sítio de glicosilação na sua seqüência que resulta em glicosilação da molécula de ligação na expressão em células eucarióticas e por este motivo anulariam a ligação ao antígeno. A variante funcional produzida não mais contém o sítio de glicosilação, mas será capaz de ligação ao vírus da raiva e ainda terá atividade de neutralização.

Variantes funcionais podem ser obtidas alterando-se as moléculas de ligação precursoras ou partes destas pelos métodos da biologia molecular geral conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado à PCR propensa a erro, mutagênese direcionada a oligonucleotídeo e mutagênese direcionada ao sítio. Além disso, as variantes funcionais podem ter atividade de fixar complemento, ser capaz de ajudar ma lise do vírus da raiva envelopado e/ou atuar como opsoninas e aumentar a fagocitose do vírus da raiva pela promoção da sua captação por intermédio de receptores Fc ou Cab ou pela aglutinação do vírus da raiva para tomá-lo mais facilmente fagocitado.

Ainda em um outro aspecto, a invenção inclui imunoconjugados, isto é moléculas que compreendem pelo menos uma molécula de ligação ou variante funcional desta como aqui definido e que compreende ainda pelo menos um rótulo, tal como inter alia uma porçào/agente detectável. Também considerado na presente invenção são misturas de imunoconjugados de acordo com a invenção ou misturas de pelo menos um imunoconjugado de acordo com a invenção e uma outra molécula, tal como um agente terapêutico ou uma outra molécula de ligação ou imunoconjugado. Em uma outra forma de realização, os imunoconjugados da invenção podem compreender um ou mais rótulos. Estes rótulos podem ser os mesmos ou distintos um do outro e podem ser unidos/conjugado não covalentemente às moléculas de ligação. O(s) rótulo(s) também pode(m) ser unido(s)/conjugado(s) diretamente às moléculas de ligação através da ligação covalente, incluindo, mas não limitado às, ligações de dissulfeto, ligação de hidrogênio, ligação eletrostática, fusão recombinante e ligação conformacional. Altemativamente, o(s) rótulo(s) pode(m) ser unido(s)/conjugado(s) às moléculas de ligação por meio de um ou mais compostos de ligação. As técnicas para conjugar rótulos às moléculas de ligação são bem conhecidos pelo técnico habilitado.

Os rótulos dos imunoconjugados da presente invenção podem ser agentes terapêuticos, mas preferivelmente eles são porções/agentes detectáveis. Os imunoconjugados que compreendem um agente detectável podem ser usados para diagnóstico, por exemplo, para avaliar se um paciente foi infectado com o vírus da raiva ou monitorar o desenvolvimento ou progressão de uma infecção pelo vírus da raiva como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento. Entretanto, os mesmos também podem ser usados para outros propósitos de detecção e/ou analíticos e/ou de diagnóstico. As porções/agentes detectáveis incluem, mas não são limitados a, às enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais que emitem pósitron e íons metálicos paramagnéticos não radioativos.

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Os rótulos usados para rotular as moléculas de ligação para propósitos de detecção e/ou analíticos e/ou de diagnóstico dependem das técnicas de específica detecção/análise/diagnose e/ou métodos usados tais como inter alia o tingimento imunoistoquímico de amostras (tecido), detecção citométrica de fluxo, detecção citométrica de laser de varredura, imunoensaios fluorescentes, ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISA’s), radioimunoensaios (RJA’s), bioensaios (por exemplo, ensaios de neutralização), aplicações em Western blotting, etc. Para o tingimento imunoistoquímico de amostras de tecido, os rótulos preferidos são enzimas que catalisam a produção e deposição local de um produto detectável. As enzimas tipicamente conjugadas às moléculas de ligação para permitir a sua visualização imunoistoquímica são bem conhecidas e incluem, mas não são limitadas à acetilcolinoesterase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glicose oxidase, peroxidase de rábano e urease. Os substratos típicos para a produção e deposição de produtos visualmente detectáveis também são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Depois disso, os imunoconjugados da invenção podem ser rotulados usando ouro coloidal ou eles podem ser rotulados com radioisótopos, tais como ³³P, ³²P, ³⁵S, ³H e ^l25I. As moléculas de ligação da invenção podem ser ligadas aos radionuclídeos direta ou indiretamente por intermédio de um agente de quelação por métodos bem conhecidos na técnica.

Quando as moléculas de ligação da presente invenção são usadas para as detecções citométrica de fluxo, detecções citométrica de laser de varredura, ou imunoensaios fluorescentes, elas podem ser utilmente rotuladas com fluoróforos. Uma ampla variedade de fluoróforos úteis para a rotular fluorescentemente as moléculas de ligação da presente invenção são conhecidas pelo técnico habilitado. Quando as moléculas de ligação da presente invenção são usadas para a detecção secundária usando avidina rotulada, estreptavidina, captavidina ou neutravidina, as moléculas de ligação podem ser rotuladas com biotina para formar adequada complexos de grupo protético.

Quando os imunoconjugados da invenção são usados para o uso em diagnóstico in vivo, as moléculas de ligação também podem ser tomadas detectáveis pela conjugação por exemplo, a agentes de contraste de formação de imagem pela ressonância magnética (MRI), tais como o ácido gadolínio dietilenotriaminopentaacético, a agentes de contraste de ultrassom ou a agentes de contraste de raio X, ou pela rotulação radioisotópica.

Além disso, as moléculas de ligação, variantes funcionais destas ou imunoconjugados da invenção também podem ser ligados a suportes sólidos, que são particularmente úteis para os imunoensaios in vitro ou purificação do vírus da raiva ou um fragmento deste. Tais suportes sólidos seriam porosos ou não porosos, planares ou não planares e incluem, mas não são limitados a, suportes de vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, polistireno, cloreto de polivinila ou polipropileno. As moléculas de ligação humanas por exemplo também podem ser utilmente conjugadas a meios de filtração, tais como Sepharose ativada por NHS ou Sepharose ativada por CNBr para propósitos de cromatografia de imunoafinidade. Elas também podem ser utilmente ligadas a microesferas paramagnéticas, tipicamente pela interação de biotina-estreptavidina. As microesferas podem ser usadas para a isolação do vírus da raiva ou de um fragmento deste a partir de uma amostra contendo o vírus da raiva ou um fragmento destes. Como um outro exemplo, as moléculas de ligação humanas da presente invenção podem ser utilmente ligadas à superfície de uma placa microtituladora para ELISA.

As moléculas de ligação da presente invenção ou variantes funcionais destas podem ser fundidas para compor seqüências, tais como um peptídeo para facilitar a purificação. Os exemplos incluem, mas não são limitados ao rótulo de hexa-histidina, ao rótulo de hemaglutinina (HA), ao rótulo myc ou ao rótulo flag.

Altemativamente, um anticorpo pode ser conjugado a um segundo anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado. Em um outro aspecto as moléculas de ligação humanas da invenção podem ser conjugada/ligadas a um ou mais antígenos. Preferivelmente, estes antígenos são antígenos que são reconhecidos pelo sistema imune de um paciente ao qual o conjugado de molécula de ligação-antígeno é administrado. Os antígenos podem ser idênticos mas também podem diferir um do outro. Os métodos de conjugação para ligar os antígenos e moléculas de ligação são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados ao uso de agentes de reticulação. As moléculas de ligação humanas ligar-se-ão ao vírus da raiva e os antígenos ligados às moléculas de ligação humanas iniciarão um ataque de célula T poderoso sobre o conjugado que eventualmente levará à destruição do vírus da raiva.

Depois de produzir imunoconjugados quimicamente pela conjugação, direta ou indiretamente por intermédio, por exemplo, de um ligador, os imunoconjugados podem ser produzidos como proteínas de fusão que compreendam as moléculas de ligação humanas da invenção e um rótulo adequado. As proteínas de fusão podem ser produzidas pelos métodos conhecidos na técnica tais como, por exemplo, recombinantemente pela construção de moléculas de ácido nucleico que compreendem seqüências de nucleotídeo que codificam as moléculas de ligação humanas em armação com seqüências de nucleotídeo que codificam o(s) rótulo(s) adequado(s) e depois expressar as moléculas de ácido nucleico.

E um outro aspecto da presente invenção fornecer uma molécula de ácido nucleico que codifique pelo menos uma molécula de ligação ou variante funcional desta de acordo com a invenção. Tais moléculas de ácido nucleico podem ser usadas como intermediários para propósitos de clonagem, por exemplo, no processo de maturação por afinidade descrito acima. Em uma forma de realização preferida, as moléculas de ácido nucleico sào isoladas ou purificadas.

O técnico habilitado avaliará que as variantes funcionais destas moléculas de ácido nucleico também são intencionadas a serem uma parte da presente invenção. Variantes funcionais são sequências de ácido nucleico que podem ser diretamente traduzidas, usando o código genético padrão, para fornecer uma seqüência de aminoácido idêntica àquela traduzida das moléculas de ácido nucleico precursoras.

Preferivelmente, as moléculas de ácido nucleico codificam moléculas de ligação que compreendem uma região de CDR3, 10 preferivelmente uma região de CDR3 de cadeia pesada, que compreenda uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13,_,SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 15, SEQ ID NO: 16, SEQ. ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ

ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO:

24.

Ainda mais preferivelmente, as moléculas de ácido nucleico codificam moléculas de ligação humanas que compreendem uma cadeia 20 pesada variável compreendendo essencialmente uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, 25 SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49. Em uma forma de realização particularmente preferida as moléculas de ácido nucleico codificam moléculas de ligação que compreendem uma cadeia pesada variável compreendendo essencialmente uma seqüência de

4ο aminoácido que compreende os aminoácidos 1-119 da SEQ ID NO: 335.

Já em uma outra forma de realização, as moléculas de ácido nucleico codificam moléculas de ligação que compreendem uma cadeia pesada variável compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 26 e uma cadeia leve variável compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 50, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 27 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 51, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 28 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 52, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 29 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 53, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 30 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 54, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 31 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 55, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 32 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 56, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 33 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 57, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 34 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 58, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 35 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da

SEQ ID NO: 59, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 36 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 60, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de 5 aminoácido da SEQ ID NO: 37 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 61, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:

e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 62, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que 10 compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 39 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência dc aminoácido da SEQ ID NO: 63, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 40 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 64, ou elas codificam uma cadeia 15 pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:

e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da

SEQ ID NO: 65, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 66, ou 20 elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 43 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 67, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:

e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da 25 SEQ ID NO: 68, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 45 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 69, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 46 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 70, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 47 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 71, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 72, ou elas codificam uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 49 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 73. Em uma forma de realização preferida as moléculas de ácido nucleico codificam moléculas de ligação humanas que compreendem uma cadeia pesada variável compreendendo a seqüência de aminoácido que compreende os aminoácidos 1-119 da SEQ ID NO: 335 e uma cadeia leve variável que compreende a seqüência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 1-107 da SEQ ID NO: 337.

Ί5 Em uma específica forma de realização da invenção as moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada variável das moléculas de ligação da invenção compreendem essencialmente uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ

ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO:

83, SEQ,.ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID_, NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96 e SEQ ID NO: 97. Preferivelmente, as moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada variável das moléculas de ligação da invenção compreendem essencialmente uma seqüência de nucleotídeo que compreende os nucleotídeos 1-357 da SEQ ID NO: 334.

Já em uma outra forma de realização específica da presente invenção, as moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia leve variável das moléculas de ligação da invenção compreendem essencialmente uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106,

SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO:110,

SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO:114,

SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO:118,

SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 121. Preferivelmente, as moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia leve variável das 10 moléculas de ligação humanas da invenção compreendem essencialmente uma seqüência de nucleotídeo que compreende os nucleotídeos 1-321 da SEQ IDNO: 336.

É um outro aspecto da invenção fornecer vetores, isto é construções de ácido nucleico, que compreendam uma ou mais moléculas de 15 ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Os vetores podem ser derivados de plasmídeos tais como inter alia F, Rl, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti, etc; cosmídeos; fagos tais como lambda, lambdoid, Ml3, Mu, Pl, P22, Q_R, T-par, T-impar, T2, T4, T7, etc; vírus vegetal tal como inter alia o vírus mosaico da alfafa, bromovírus, capilovírus, carlavírus, carmovírus, caulivírus, 20 clostervírus, comovírus, criptovírus, cucumovírus, diantovírus, fabavírus, fijivírus, furovírus, geminivírus, hordeivírus, ilarvírus, luteovírus, maclovírus, marafivírus, necrovírus, nepovírus, fitorepvírus, rabdovírus vegetal, potexvírus, potivírus, sobemovírus, tenuivírus, tobamovírus, tobravírus, vírus que murcha o tomate manchado, tombusvírus, timovírus, etc; ou vírus de 25 animal tais como inter alia adenovirus, arenaviridae, baculoviridae, birnaviridae, bunyaviridae, calciviridae, cardiovírus, coronaviridae, corticoviridae, cystoviridae, vírus de Epstein-Barr, enterovírus, filoviridae, flaviviridae, vírus da febre aftosa, hepadnaviridae, víruses da hepatite, herpesviridae, vírus da imunodeficiência, vírus da influenza, inoviridae, iridoviridae, orthomyxoviridae, papovavírus, paramyxoviridae, parvoviridae, picornaviridae, vírus da poliomielite, polidnaviridae, poxviridae, reoviridae, retrovírus, rabdoviridae, rinovírus, vírus da floresta de Semliki, tetraviridae, togaviridae, toroviridae, vírus da vaccinia, vírus da estomatite vesicular, etc.

Os vetores podem ser usados para clonar e/ou para a expressão das moléculas de ligação humanas da invenção e poderíam ser usados ainda para propósitos de terapia de gene. Os vetores que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção operavelmente ligados a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que regulam a expressão também são 10 abrangidos pela presente invenção. A escolha do vetor é dependente dos procedimentos recombinantes seguidos e do hospedeiro usado. A introdução de vetores em células hospedeiras pode ser efetuada inter alia pela transfecção com fosfato de cálcio, infecção viral, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção por lipofectamina ou eletroporação. Os vetores Ί5 podem ser de replicação autônoma ou pode replicar junto com o cromossoma no qual eles foram integrados. Preferivelmente, os vetores contêm um ou mais marcadores de seleção. A escolha dos marcadores pode depender das células hospedeiras de escolha, embora isto não seja crítico para a invenção como é bem conhecido pelas pessoas habilitadas na técnica. Eles incluem, mas não 20 são limitadas à canamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gene da timidina cinase do vírus simples do Herpes (HSV-TK), gene da diidrofoliato reductase de camundongo (dhfr). Vetores que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de ligação humanas como descritos acima operavelmente ligados a uma ou mais 25 moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas ou peptídeos que podem ser usadas para isolar as moléculas de ligação também são abrangidas pela invenção. Estas proteínas ou peptídeos incluem, mas não são limitados a, glutationa-S-transferase, proteína de ligação de maltose, poliistidina de ligação metálica, proteína fluorescente verde, luciferase e beta-galactosidase.

Hospedeiros contendo uma ou mais cópias dos vetores mencionados acima sào um objetivo adicional da presente invenção. Preferivelmente, os hospedeiros são células hospedeiras. As células hospedeiras incluem, mas não são limitadas às células de mamífero, planta, 5 inseto, de origem fúngica ou bacteriana. As células bacterianas incluem, mas não são limitadas às células de bactérias Gram positivas tais como diversas espécies do gênero Bacillus, Streptomyces e Staphilococcus ou células de bactérias Gram negativas tais como diversas espécies dos gêneros Escherichia, tais como E. coli e Pseudomonas. No grupo de células fungicas 10 preferivelmente as células de levedura são usadas. A expressão em levedura pode ser obtida usando-sc cepas dc levedura tais como inter alia Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae e Hanserula polimorpha.

Além disso, as células de inseto tais como células de Drosófila e Sf9 podem ser usadas como células hospedeiras. Além do que, as células '15 hospedeiras podem ser células vegetais. Plantas transformadas (transgênicas) ou células vegetais são produzidas por métodos conhecidos, por exemplo, transferência de gene mediada por Agrobacteria, transformação de discos de folha, transformação de protoplasto pela transferência de DNA induzida pelo polietileno glicol, eletroporação, sonificação, microinjeção ou transferência de 20 gene balística. Adicionalmente, um sistema de expressão adequada pode ser um sistema de baculovírus. Os sistemas de expressão usando células de mamífero tais como células do Ovário do Hamster Chinês (CHO), células COS, células BHK ou células de melanoma de Bowes são preferidas na presente invenção. As células de mamífero fornecem proteínas expressadas 25 com modificações pós traducionais que são mais similares às moléculas naturais de origem mamífera. Visto que a presente invenção lida com moléculas que devam ser administradas a seres humanos, um sistema de expressão completamente humano seria particularmente preferido. Portanto, ainda mais preferivelmente, as células hospedeiras são células humanas. Os

4G exemplos de células humanas são inter alia células HeLa, 911, AT 1080, A549, 293 e HEK293T. As células de mamífero preferidas são células da retina humana tais como células 911 ou a linhagem de célula depositada na European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire 5 SP4 OJG, Grã Bretanha em 29 de fevereiro de 1996 sob número 96022940 e comercializada sob a marca PER.C6® (PER.C6 é uma marca registrada da Crucell Holland B.V.). Para os propósitos deste pedido “PER.C6” refere-se às células depositadas sob número 96022940 ou ancestrais, as passagens a montante ou a jusante assim como descendentes de ancestrais de células 10 depositadas, assim como derivadas de qualquer uma das precedentes.

Em formas de realização preferidas, as células produtoras humanas compreendem pelo menos uma parte funcional de uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma região El de adenovírus no formato expressível. Em formas de realização igualmente mais preferidas, as ditas 15 células hospedeiras são derivadas de uma retina humana e imortalizadas com ácidos nucleicos que compreendem seqüências El adenovirais, tais como a linhagem de célula depositada na European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Grã-Bretanha em 29 de fevereiro de 1996 sob número 96022940 e comercializada sob a marca 20 PER.C6®. A produção de proteínas recombinantes nas células hospedeiras podem ser realizadas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. O uso das células comercializadas sob a marca PER.C6® como uma plataforma de produção para proteínas de interesse foi descrito na WO 00/63403 a divulgação das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Um método de produzir uma molécula de ligação ou uma variante funcional de acordo com a invenção é uma parte adicional da invenção. O método compreende as etapas de a) cultivar um hospedeiro de acordo com a invenção sob condições condutivas à expressão da molécula de ligação ou variante funcional desta e b) opcionalmente, recuperar a molécula de ligação ou variante funcional desta expressadas. As moléculas de ligação ou variantes funcionais destas expressadas podem ser recuperadas do extrato isento de célula, mas preferivelmente elas são recuperadas do meio de cultura. Os métodos para recuperar proteínas, tais como moléculas de ligação, a partir 5 de extratos isentos de célula ou meio de cultura são bem conhecidos ao técnico habilitado na técnica. As moléculas de ligação ou variantes funcionais destas como obtenível pelo método descrito acima também são uma parte da presente invenção.

Altemativamente, a seguir da expressão em hospedeiros, tais 10 como células hospedeiras, as moléculas de ligação ou variantes funcionais destas da invenção podem ser produzidas sinteticamente pelos sintetizadores de peptídeo convencionais ou em sistemas de tradução isentos de célula usando ácido nucleico de R.NA derivado de moléculas de DNA de acordo com a invenção. As molécula de ligação ou variantes funcionais destas como 15 obtenível pelos métodos de acima produção sintéticos descritos ou sistemas de tradução isentos de célula também são uma parte da presente invenção.

Em uma outra forma de realização as moléculas de ligação ou variantes funcionais destas de acordo com a presente invenção podem ser geradas pelos mamíferos não humanos transgênicos, tais como por exemplo, 20 camundongo ou coelhos transgênicos, que expressam os genes da imunoglobulina humana. Preferivelmente, os mamíferos não humano transgênicos têm um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana que codifica toda ou uma porção das moléculas de ligação humanas como descrito acima. Os 25 mamíferos não humanos transgênicos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de vírus da raiva ou um fragmento deste. Os protocolos para imunizar mamíferos não humanos são bem estabelecidos na técnica. Ver Using Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory,

4?

Cold Spring Harbor, Nova Iorque e Current Protocols in Immunology, Editado por: J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., Nova Iorque, a divulgação das quais é aqui incorporada por referência.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de identificar moléculas de ligação tais como anticorpos monoclonais humanos ou fragmentos destes de acordo com a invenção ou moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção capazes de ligar especificamente ao vírus da raiva e compreende as etapas de a) contatar uma coleção de moléculas de 10 ligação na superfície de pacotes genéticos replicáveis com o vírus da raiva ou um fragmento deste sob condições condutivas à ligação, b) selecionar pelo menos uma vez quanto a ligação dos pacotes genéticos replicáveis ao vírus da raiva ou ao fragmento deste e c) separar e recuperar a ligação dos pacotes genéticos replicáveis ao vírus da raiva ou ao fragmento deste.

A etapa de seleção pode ser realizada na presença do vírus da raiva. O vírus da raiva pode ser isolado ou não isolado, por exemplo, presente no soro e/ou sangue de um indivíduo infectado. Em uma outra forma de realização o vírus da raiva é inativado. Altemativamente, a etapa de seleção pode ser realizada na presença de um fragmento do vírus da raiva tal como 20 uma parte extracelular do vírus da raiva, um ou mais (poli)peptídeos derivados do vírus da raiva tais como a proteína G, proteínas de fusão que compreendam estas proteínas ou (poli)peptídeos e outros. Em uma outra forma de realização as células transfectadas com a proteína G do vírus da raiva são usadas para procedimentos de seleção.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um método de obter uma molécula de ligação ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, em que o método compreende as etapas de a) realizar o método acima descrito de identificar moléculas de ligação, tais como anticorpos monoclonais humanos ou fragmentos destes de acordo com a invenção, ou moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção e b) isolar a partir dos pacotes genéticos replicáveis recuperados a molécula de ligação e/ou o ácido nucleico que codifica a molécula de ligação. Uma vez que um novo anticorpo monoclonal tenha sido estabelecido ou identificado com o método acima mencionado de identificar moléculas de ligação ou moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de ligação, o DNA que codifica a scFv ou Fab podem ser isolados a partir das bactérias ou pacotes genéticos replicáveis e combinados com técnicas biológicas moleculares padrão para fabricar construções que codificam scFvs bivalentes ou imunoglobulinas humanas completas de uma especificidade desejada (por exemplo, IgG, IgA ou IgM). Estas construções podem ser transfectadas em linhagens de célula adequadas e anticorpos monoclonais humanos completos podem ser produzidos (ver Huls et al., 1999; Boel et al., 2000).

Um pacote genético replicável como aqui usado pode ser procariótico ou eucariótico e inclui células, esporos, bactérias, vírus, (bacterio)fago e polissomas. Um pacote genético replicável preferido é um fago. As moléculas de ligação humanas, tais como por exemplo, Fv’s de cadeia única, são apresentadas no pacote genético replicável, isto é elas são ligadas a um grupo ou molécula localizados em uma superfície externa do pacote genético replicável. O pacote genético replicável é uma unidade triável que compreende uma molécula de ligação humana a ser triada ligada a uma molécula de ácido nucleico que codifica a molécula de ligação. A molécula de ácido nucleico deve ser replicável in vivo (por exemplo, como um vetor) ou in vitro (por exemplo, pela PCR, transcrição e tradução). A replicação in vivo pode ser autônoma (como para uma célula), com a ajuda de fatores hospedeiros (como para um vírus) ou com a assistência tanto do hospedeiro quanto do vírus auxiliar (como para um fagomídeo). Os pacotes genéticos replicáveis que apresentam uma coleção de moléculas de ligação humanas são formados pela introdução das moléculas de ácido nucleico que codificam

S) moléculas de ligação exógenas a serem apresentadas nos genomas dos pacotes genéticos replicáveis para formar proteínas de fusão com proteínas endógenas que são normalmente expressadas a partir da superfície externa dos pacotes genéticos replicáveis. A expressão das proteínas de fusão, transporte para a superfície externa e montagem resultam na apresentação de moléculas de ligação exógenas a partir da superfície externa dos pacotes genéticos replicáveis. Em um outro aspecto a invenção diz respeito a uma molécula de ligação humana capaz de ligar o vírus da raiva ou um fragmento deste e que é obtenível pelo método de identificação como descrito acima.

Ainda em um outro aspecto a invenção diz respeito a um método de identificar uma molécula dc ligação potencialmente tendo atividade de neutralização contra o vírus da raiva, em que o método compreende as etapas de (a) contatar uma coleção de moléculas de ligação na superfície de pacotes genéticos replicáveis com o vírus da raiva sob condições conducentes à ligação, (b) separar e recuperar moléculas de ligação que se ligam ao vírus da raiva das moléculas de ligação que não se ligam, (c) isolar pelo menos uma molécula de ligação recuperada, (d) verificar se a molécula de ligação isolada tem atividade de neutralização contra o vírus da raiva, em que o vírus da raiva na etapa a é inativado. O vírus da raiva inativado pode ser purificado antes de ser inativado. A purificação pode ser realizada por meio métodos de purificação bem conhecidos adequados para vírus tais como por exemplo, centrifugação através de uma almofada de glicerol. O vírus da raiva inativado na etapa a pode ser imobilizado a um material adequado antes do uso. Alternativamente, o vírus da raiva na etapa a pode ainda ser ativo. Em uma outra forma de realização alternativa um fragmento de um vírus da raiva, tal como um polipeptídeo de um vírus da raiva tal como a proteína G, é usado na etapa a. Já em uma outra forma de realização as células transfectadas com a proteína G do vírus da raiva são usados para selecionar molécula de ligação potencialmente tendo atividade de neutralização contra o vírus da raiva.

5/

Como aqui indicado, quando as células que expressam a proteína G do vírus da raiva foram incluídas no método de seleção o número de anticorpos de neutralização selecionado foi mais alto comparado aos métodos de seleção em que apenas a proteína G do vírus da raiva purificada e/ou vírus da raiva inativado foram usados.

Em uma outra forma de realização o método de identificar uma molécula de ligação potencialmente tendo a atividade de neutralização contra o vírus da raiva como descrito acima ainda compreende a etapa de separar e recuperar e opcionalmente isolar, moléculas de ligação humanas contendo um gene da linha germinativa 3-30 pesado variável. Uma pessoa habilitada na técnica pode identificar o gene da linha germinativa específico pelos métodos conhecidos na técnica tais como por exemplo, seqüenciamento de nucleotídeo. A etapa de separar e recuperar moléculas de ligação contendo um gene da linha germinativa 3-30 pesado variável pode ser realizada antes ou depois da etapa c. Como indicado abaixo a maioria dos anticorpos monoclonais humanos que neutralizam o vírus da raiva descobertos na presente invenção compreende este gene da linha germinativa VH específico.

A apresentação de métodos de fago para identificar e obter (neutralizar) moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos, são agora métodos bem estabelecidos conhecidos pelas pessoas habilitadas na técnica. Estes são por exemplo, descritos na Patente US Número 5.696.108; Burton e Barbas, 1994; de Kruif et al., 1995b; e Pahge Display: A Laboratory Manual. Editado por: CF Barbas, DR Burton, JK Scott e GJ Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. Todas estas referências são aqui incorporadas em sua totalidade.

Para a construção de bibliotecas de apresentação de fago, coleções de anticorpo monoclonal humano de genes da região variável de cadeia pesada e leve são expressadas na superfície de bacteriofago, preferivelmente bacteriofago fílamentoso, partícula, por exemplo no formato

Fv de cadeia única (scFv) ou no formato Fab (ver de Kruif et al., 1995b). Bibliotecas grandes de fagos que expressam fragmento de anticorpo tipicamente contém mais do que 1,0*10⁹ especificidades de anticorpo e podem ser montadas a partir de regiões V da imunoglobulina expressadas nos linfócitos B de indivíduos imunizados ou não imunizados. Em uma forma de realização específica da invenção a biblioteca de fago de moléculas de ligação humanas, preferivelmente biblioteca de fago scFv, é preparada a partir de RNA isolado de células obtidas a partir de um paciente que foi vacinado contra a raiva ou exposto a um vírus da raiva. O RNA pode ser isolado inter alia a partir da medula óssea ou sangue periférico, preferivelmente linfócitos do sangue periférico. O paciente pode ser um animal vacinado ou exposto ao vírus da raiva, mas é preferivelmente um paciente humano que foi vacinado ou foi exposto ao vírus da raiva. Preferivelmente o paciente humano foi vacinado. Uma coleção de moléculas de ligação humanas na superfície de pacotes genéticos replicáveis, tais como uma biblioteca de fago de scFv, como descrito acima é um outro aspecto da presente invenção.

Alternativamente, bibliotecas de apresentação de fago podem ser construídas a partir de regiões variáveis da imunoglobulina que foram parcialmente montadas in vitro para introduzir diversidade de anticorpo na biblioteca (bibliotecas semi-sintéticas). Por exemplo, as regiões variáveis montadas in vitro contêm trechos de DNA sinteticamente produzidos, randomizados ou parcialmente randomizados naquelas regiões das moléculas que são importantes para a especificidade de anticorpo, por exemplo, regiões CDR. Os anticorpos de fago específicos do vírus da raiva podem ser selecionados a partir de bibliotecas pela imobilização de antígenos alvo tais como antígenos do vírus da raiva em uma fase sólida e subsequentemente expondo os antígenos alvo a uma biblioteca de fago para permitir a ligação de fragmentos de anticorpo que expressam fagos específicos para o(s) antígeno(s) ligado(s) na fase sólida. Os fagos não ligados são removidos pela

Ó3 lavagem e os fagos ligados eluídos da fase sólida para a infecção de bactérias Escherichia coli (E. coli) e propagação subsequente. Múltiplas rodadas de seleção e propagação são usualmente requeridas para enriquecer suficientemente quanto a ligação de fago especificamente para o(s) antígeno(s) alvo. Se desejado, antes de expor a biblioteca de fago aos antígenos alvo a biblioteca de fago pode ser primeiro subtraída pela exposição da biblioteca de fago aos antígenos não alvo ligados a uma fase sólida. Os fagos também podem ser selecionados quanto a ligação aos antígenos complexos tais como misturas complexas de proteínas ou (poli)peptídeos do vírus da raiva, células hospedeiras que expressam uma ou mais proteínas do vírus da raiva ou (poli)peptídeos do vírus da raiva, ou o próprio vírus da raiva (inativado). Os anticorpos específicos de fago antigênicos podem ser selecionados da biblioteca pela incubação de uma fase sólida com uma preparação ligada nela de vírus da raiva inativado com a biblioteca de fago de anticorpo para deixar por exemplo a parte scFv ou Fab do fago se ligar à preparação de proteínas/polipeptídeos do vírus da raiva. Depois da incubação e diversas lavagens para remover fagos não ligados e frouxamente ligados, os fagos que tem ligado com sua parte scFv ou Fab para a preparação são eluídos e usados para infectar Escherichia coli para permitir a amplificação da nova especificidade. No geral, uma ou mais rodadas de seleção são requeridas para separar os fagos de interesse do excesso grande de fagos não ligados. Altemativamente, as proteínas ou (poli)peptídeos conhecida do vírus da raiva podem ser expressados em células hospedeiras e estas células podem ser usadas para a seleção de anticorpos específica de fago para as proteínas ou (poli)peptídeos. Um método de apresentação de fago usando estas células hospedeiras pode ser estendido e melhorado subtraindo-se aglutinantes não relevantes durante a triagem pela adição de um excesso de células hospedeiras que não compreendem nenhuma molécula alvo ou moléculas não alvo que são similares, mas não idênticas, ao alvo e deste modo realçam fortemente a possibilidade de descobrir moléculas de ligação relevantes (este processo é aludido como o processo MAbstract . MAbstract é uma marca registrada da Crucell Holland B.V., ver também a Patente US Número 6.265.150 que é aqui incorporada por referência).

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece composições que compreendem pelo menos uma molécula de ligação, pelo menos uma variante funcional ou fragmento destes, pelo menos um imunoconjugado de acordo com a invenção ou uma combinação destes. As composições podem ainda compreender inter alia moléculas estabilizadoras, tais como albumina ou polietileno glicol, ou sais. Preferivelmente, os sais usados são sais que retêm a atividade biológica desejada das moléculas de ligação humanas e não comunicam nenhum efeito toxicológico indesejado. Se necessário, as moléculas de ligação humanas da invenção podem ser revestidas em ou sobre um material para protegê-lo da ação de ácidos ou outras condições naturais ou não naturais que possam inativar as moléculas de ligação.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece composições que compreendem pelo menos uma molécula de ácido nucleico como definido na presente invenção. As composições podem compreender soluções aquosas tais como soluções aquosas contendo sais (por exemplo, NaCl ou sais como 20 descritos acima), detergentes (por exemplo, SDS) e/ou outros componentes adequados.

Além disso, a presente invenção diz respeito às composições farmacêuticas que compreendem pelo menos uma molécula de ligação n de acordo com a invenção, pelo menos uma variante funcional ou fragmento desta, pelo menos um imunoconjugado de acordo com a invenção, pelo menos uma composição de acordo com a invenção, ou combinações destes. A composição farmacêutica da invenção ainda compreende pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em uma forma de realização preferida a composição farmacêutica de acordo com a invenção compreende pelo menos uma molécula de ligação adicional, isto é a composição farmacêutica pode ser um coquetel/mistura de moléculas de ligação. A composição farmacêutica pode compreender pelo menos duas moléculas de ligação de acordo com a 5 invenção ou pelo menos uma molécula de ligação de acordo com a invenção e pelo menos um outra molécula de ligação anti-vírus da raiva. A dita outra molécula de ligação preferivelmente compreende uma região de CDR3 que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 25. A molécula de

ligação que compreende a região de CDR3 que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 25 pode ser um anticorpo monoclonal quimérico ou humanizado ou fragmento funcional deste, mas preferivelmente é um anticorpo monoclonal humano ou fragmento funcional destes. Em uma forma de realização, a molécula de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 273.

Em uma outra forma de realização, a molécula de ligação compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 275. Já em uma outra forma de realização a molécula de ligação compreende uma cadeia pesada e leve que compreende as seqüências de aminoácido da SEQ ID NO: 123 e SEQ ID NO: 125, respectivamente. As 20 moléculas de ligação na composição farmacêutica deve ser capaz de reagir com epítopos diferentes, não competidores do vírus da raiva. Os epítopos podem estar presentes na proteína G do vírus da raiva e podem ser epítopos diferentes, que não se sobrepõem. As moléculas de ligação devem ser de alta afinidade e devem ter uma especificidade ampla. Preferivelmente, elas 25 neutralizam muitas cepas de vírus da raiva fixas e street como possível. Ainda mais preferivelmente, elas também exibem atividade de neutralização contra outros genótipos do gênero Lyssavirus ou mesmo com outros vírus da família de rabdovírus, enquanto não exibem nenhuma reatividade cruzada com outros vírus ou proteínas celulares normais. Preferivelmente, a molécula de ligação é

capaz de neutralizar variantes de escape da outra molécula de ligação no coquetel.

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos duas moléculas de 5 ligação que neutralizam o vírus da raiva, preferivelmente moléculas de ligação (humanas) de acordo com a invenção, em que as moléculas de ligação são capazes de reagir com epítopos diferentes, que não competem do vírus da raiva. Em uma forma de realização a composição farmacêutica compreende

uma primeira molécula de ligação que neutraliza o vírus da raiva que é capaz de reagir com um epítopo localizado no sítio antigênico I da proteína G do vírus da raiva e uma segunda molécula de ligação que neutraliza o vírus da raiva que é capaz de reagir com um epítopo localizado no sítio antigênico III da proteína G do vírus da raiva. A estrutura antigênica da glicoproteína da raiva foi inicialmente definida por Lafon et al. (1983). Os sítios antigênicos 15 foram identificados usando um painel de mAbs de camundongo e suas respectivas variantes virais resistentes a mAb. Desde então, os sítios antigênicos foram mapeados pela identificação das mutações de aminoácido na glicoproteína de variantes resistentes a mAb (ver Seif et al., 1985; Prehaud et al., 1988; e Benmansour et al., 1991). a maioria de mAbs neutralizadores da raiva são direcionados contra o sítio antigênicos II (ver Benmansour et al.,

1991), que é um epítopo conformacional descontínuo que compreende de aminoácido 34-42 e aminoácido 198-200 (ver Prehaud et al., 1988). O sítio antigênico III é um epítopo conformacional contínuo no aminoácido 330-338 e abriga dois resíduos carregados, K330 e R333, que afetam a patogenicidade viral (ver Seif et al., 1985; Coulon et al., 1998; e Dietzschold et al., 1983). O sítio antigênicos I conformacional foi definido apenas por um mAb, 509-6 e localizado no aminoácido 231 (ver Benmansour et al., 1991; e Lafon et al.,

1983). O sítio antigênicos IV é conhecido por abrigar epítopos lineares que se sobrepõem (ver Tordo, 1996; Bunschoten et al., 1989; Luo et al., 1997; e Ni

et al., 1995). Benmansour et al. (1991) também descreveram a presença de um sítio menor localizado na posição 342-343, que é distinto do sítio antigênico III a despeito da proximidade imediata. O alinhamento do epítopo CR-57 com os epítopos de neutralização linear e conformacional 5 correntemente conhecido na glicoproteína da raiva (Figura 10) revelou que o epítopo CR-57 está localizado na mesma região como o sítio antigênico I conformacional, definido pela mAb 509-6 única. Com base nas seqüências de nucleotídeo e aminoácido da glicoproteína do vírus que escapam de CR04-

098, o epítopo reconhecido por este anticorpo parece estar localizado na mesma região como o sítio antigênico III conformacional contínuo.

Em uma forma de realização preferida a composição farmacêutica compreende uma primeira molécula de ligação que neutraliza o vírus da raiva que compreende pelo menos uma região CDR3, preferivelmente região CDR3 de cadeia pesada, que compreende a seqüência 15 de aminoácido da SEQ ID NO: 25 e uma segunda molécula de ligação que neutraliza o vírus da raiva que compreende pelo menos uma região CDR3, preferivelmente região CDR3 de cadeia pesada, que compreende a seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 4, SEQ ID

NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 22.

Mais preferivelmente, a segunda molécula de ligação que neutraliza o vírus da raiva compreende pelo menos uma região CDR3, preferivelmente região CDR3 de cadeia pesada, que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ

IDNO: 14.

Preferivelmente, a primeira molécula de ligação que neutraliza 25 o vírus da raiva compreende uma cadeia pesada e leve que compreende as seqüências de aminoácido da SEQ ID NO: 123 e SEQ ID NO: 125, respectivamente e a segunda molécula de ligação que neutraliza o vírus da raiva compreende uma cadeia pesada e leve que compreende as seqüências de aminoácido da SEQ ID NO: 335 e SEQ ID NO: 337, respectivamente.

Preferivelmente, a cadeia pesada e leve da primeira molécula de ligação que neutraliza o vírus da raiva são codificadas pelas SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 124, respectivamente e a cadeia pesada e leve da segunda molécula de ligação que neutraliza o vírus da raiva são codificadas pelas SEQ ID NO: 334 5 e SEQ ID NO: 336, respectivamente.

Uma composição farmacêutica que compreende duas moléculas de ligação, em que o pi das moléculas de ligação é divergente pode ter um problema quando da escolha de um tampão adequado que otimamente

estabiliza ambas as moléculas de ligação. Quando do ajuste do pH do tampão da composição tal que ele aumente a estabilidade de uma molécula de ligação, isto pode diminuir a estabilidade da outra molécula dc ligação. A diminuição da estabilidade ou ainda a instabilidade de uma molécula de ligação pode levar à sua precipitação ou agregação ou à degradação espontânea que resulta na perda da funcionalidade da molécula de ligação. Portanto, em um outro aspecto a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende pelo menos duas moléculas de ligação, preferivelmente moléculas de ligação humanas, em que as moléculas de ligação têm pontos isoelétricos (pi) que diferem menos do que cerca de 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, preferivelmente menos do que (e incluindo) 0,25 unidades pi um 20 do outro. O pi pode ser medido experimentalmente, por exemplo, por meio da focalização isoelétrica, ou ser calculado com base na seqüência de aminoácido das moléculas de ligação. Em uma forma de realização as moléculas de ligação são moléculas de ligação de acordo com a presente invenção e a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica de 25 acordo com a invenção. Preferivelmente, as moléculas de ligação são anticorpos monoclonais, por exemplo, anticorpos monoclonais humanos tais como anticorpos IgGl. Preferivelmente, as moléculas de ligação são capazes de ligação a e/ou neutralização de um agente infeccioso, por exemplo, um vírus, uma bactéria, uma levedura, um fungo ou um parasita. Em uma forma

de realização as moléculas de ligação são capazes de ligação a e/ou neutralização de um lyssavirus, por exemplo, o vírus da raiva. Em uma forma de realização específica ambas as moléculas de ligação têm um pl calculado que está na faixa entre 8,0 e 9,5, preferivelmente de 8,1 a 9,2, mais 5 preferivelmente de 8,2 a 8,5. Preferivelmente, as moléculas de ligação têm a região CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 25, respectivamente.

Em uma outra forma de realização a invenção fornece um

coquetel de duas ou mais moléculas de ligação humanas ou de outro animal, incluindo mas não limitado aos anticorpos, em que pelo menos uma molécula dc ligação é derivada de um fago de anticorpo ou outra técnica de apresentação de pacote replicável e pelo menos uma molécula de ligação é obtenível por uma técnica de hibridoma. Quando técnicas divergente são usadas, a seleção de moléculas de ligação tendo um pl compatível também é muito úteis de modo a obter uma composição em que cada molécula de ligação é suficientemente estável para armazenagem, manuseio e uso subsequente.

Em uma outra forma de realização as moléculas de ligação presentes na composição farmacêutica da invenção aumentam entre si a 20 atividade de neutralização, isto é elas atuam sinergisticamente quando combinadas. Em outras palavras, as composições farmacêuticas podem exibir atividade de neutralização do vírus da raiva e mesmo de lyssavirus sinergística. Como aqui usado, o termo “sinergístico” significa que o efeito combinado das moléculas de ligação quando usadas em combinação é maior 25 do que os seus efeitos aditivos quando usadas individualmente. As faixas e razões dos componentes das composições farmacêuticas da invenção devem ser determinadas com base nas suas potências individuais e testadas em ensaios de neutralização in vitro ou modelos de animal tais como hamsters.

Além disso, a composição farmacêutica de acordo com a

invenção pode compreender pelo menos um outro agente terapêutico, profilático e/ou de diagnóstico. Os ditos outros agentes terapêuticos e/ou profiláticos podem ser agentes anti-viral tais como ribavirina ou interferonalfa.

As moléculas de ligação ou composições farmacêuticas da invenção podem ser testadas em sistemas de modelo de animal adequados antes de usar em seres humanos. Tais sistemas de modelo de animal incluem, mas não são limitados a, camundongos, ratos, hamsters, macacos, etc.

Tipicamente, as composições farmacêuticas devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. As moléculas de ligação humanas, variantes ou fragmentos destas, imunoconjugados, moléculas de ácido nucleico ou composições da presente invenção podem estar na forma de pó para reconstituição no excipiente farmaceuticamente aceitável apropriado antes ou no momento da liberação. No caso de pós 15 estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada estéril destes.

Altemativamente, as moléculas de ligação, variante ou fragmentos destes, imunoconjugados, moléculas de ácido nucleico ou composições da presente invenção podem estar em solução e o excipiente farmaceuticamente aceitável apropriado pode ser adicionado e/ou misturado antes ou no momento da liberação fornecendo uma forma de injetável de 25 dosagem unitária. Preferivelmente, o excipiente farmaceuticamente aceitável usado na presente invenção é adequado para concentração de medicamento alta, pode manter a fluidez apropriada e, se necessário, pode retardar a absorção.

A escolha da via ótima de administração das composições

Gf farmacêuticas será influenciada por diversos fatores incluindo as propriedades físico-químicas das moléculas ativas dentro das composições, a urgência da situação clínica e a relação das concentrações de plasma das moléculas ativas para o efeito terapêutico desejado. Por exemplo, se necessário, as moléculas de ligação humanas da invenção podem ser preparadas com portadores que as protegerão contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de liberação microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis

inter alia podem ser usados, tais como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poli-glicólico, colágeno, poli-ortoésteres e ácido poli-lático.

Além disso, pode ser necessário revestir as moléculas de ligação humanas com, ou co-administrar as moléculas de ligação com, um material ou composto que impeçam a inativação das moléculas de ligação humanas. Por exemplo, as moléculas de ligação humanas podem ser administradas a um 15 paciente em um portador apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente.

As vias de administração no geral podem ser divididas em duas categorias principais, a administração oral e a parenteral. A administração preferida das moléculas de ligação humanas e das composições 20 farmacêuticas da invenção é dentro e ao redor do ferimento e intramuscularmente na região glútea. As formulações das moléculas de ligação humanas e das composições farmacêuticas são dependentes das vias de administração.

Em um outro aspecto, as moléculas de ligação, variantes funcionais, imunoconjugados, composições, ou composições farmacêuticas da invenção podem ser usados como um medicamento. Assim, um método de tratamento e/ou prevenção de uma infecção por lyssavirus usando as moléculas de ligação humanas, variantes funcionais, imunoconjugados, composições, ou composições farmacêuticas da invenção é uma outra parte da

presente invenção. O lyssavirus pode ser um vírus de qualquer um dos genótipos conhecidos, mas é preferivelmente o vírus da raiva. As moléculas ou composições mencionadas acima podem ser usadas na profilaxia na pós exposição à raiva.

As moléculas ou composições mencionados acima podem ser utilizadas em conjunção com outras moléculas úteis no diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento do vírus da raiva. Estas podem ser usadas in vitro, ex vivo ou in vivo. Por exemplo, as moléculas de ligação humanas, variantes funcionais,

imunoconjugados ou composições farmacêuticas da invenção podem ser coadministrados com uma vacina contra a raiva. Alternativamente, a vacina também pode ser administrada antes ou depois da administração das moléculas ou composições da invenção. A administração das moléculas ou composições da invenção com uma vacina é adequada para a profilaxia na pós exposição. As vacinas contra a raiva incluem, mas não são limitadas à vacina '15 de célula de embrião de pintainho purificada (PCEC) (RabAvert), vacina de célula diplóide humana (HDCV; vacina Imovax) ou vacina contra a raiva adsorvida (RVA).

As moléculas são tipicamente formuladas nas composições e composições farmacêuticas da invenção em uma quantidade eficaz 20 terapeuticamente ou diagnosticamente. Os regimes podem ser ajustados para fornecer a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Uma faixa de dosagem adequada pode ser por exemplo, de 0,1 a 100 IU/kg de peso corporal, preferivelmente de 1,0 a 50 IU/kg de peso corporal e mais preferivelmente de 10 a 30 IU/kg de peso corporal, tal como 20 IU/kg de peso 25 corporal.

Preferivelmente, um único bolo das moléculas de ligação ou composições farmacêuticas da invenção são administradas. As moléculas e composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são preferivelmente estéreis. Os métodos para tornar estas moléculas e

composições estéreis são bem conhecidos na técnica. O regime de dosagem de profilaxia na pós exposição é a administração de cinco doses de vacina contra a raiva intramuscularmente no músculo deltóide nos dias 0, 3, 7, 14 e dias depois da exposição em indivíduos não anteriormente imunizados contra o vírus da raiva. As moléculas de ligação humanas ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção devem ser administradas dentro e ao redor dos ferimentos no dia 0 ou de outro modo tão logo quanto possível

depois da exposição, com o volume remanescente dado intramuscularmente em um local distante da vacina. Os indivíduos não vacinados são advertidos para serem administrados com moléculas de ligação humanas antivírus da raiva, mas está claro ao técnico habilitado que os indivíduos vacinados em necessidade de tal tratamento também podem ser administrados com as moléculas de ligação humanas anti-vírus da raiva.

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito ao uso de moléculas de ligação ou variantes funcionais destas, imunoconjugados de acordo com a invenção, moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção, composições ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção na preparação de um medicamento para o diagnóstico, profilaxia, tratamento, ou combinação destes, de uma condição que resulte de uma infecção por um lyssavirus. O lyssavirus pode ser um vírus de qualquer um dos genótipos conhecidos mas é preferivelmente o vírus da raiva. Preferivelmente as moléculas mencionadas acima são usadas na preparação de um medicamento para a profilaxia na pós exposição à raiva.

Em seguida a isto, kits que compreendem pelo menos uma molécula de ligação de acordo com a invenção, pelo menos uma variante funcional desta de acordo com a invenção, pelo menos um imunoconjugado de acordo com a invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, pelo menos uma composição de acordo com a invenção, pelo menos uma composição farmacêutica de acordo com a

invenção, pelo menos um vetor de acordo com a invenção, pelo menos um hospedeiro de acordo com a invenção ou uma combinação destes também são uma parte da presente invenção. Opcionalmente, os componentes descritos acima dos kits da invenção são embalados em recipientes adequados e

rotulados para o diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento das condições indicadas. Os componentes mencionados acima podem ser armazenados em recipientes de dose unitária ou múltipla, por exemplo, ampolas seladas, frascos, garrafas, seringas e tubos de teste, como uma solução aquosa, preferivelmente estéril, ou como uma formulação liofilizada, preferivelmente estéril, para reconstituição. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico e podem ter um orifício de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica), o kit pode compreender ainda mais recipientes que 15 compreendam um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. A mesma pode ainda incluir outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, meio de cultura para um ou mais dos hospedeiros 20 adequados. Associados com os kits pode-se ter instruções habitualmente incluídos em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, profiláticos ou de diagnóstico, que contenha infonnação a cerca por exemplo das indicações, uso, dosagem, fabricação, administração, contraindicações e/ou advertências com respeito ao uso de tais produtos terapêuticos, profiláticos ou de diagnóstico.

Correntemente, os produtos HORAIG são usados para a profilaxia na pós exposição da raiva. Uma dose de adulto de HORAIG de 1500 IU (75 kg por indivíduo, 20 IU/kg) e apenas disponível em um volume de 10 ml. Produtos HORAIG mais concentrados não são possíveis visto que a ¢76dose de 10 ml correntemente obtenível contém de 1 a 1,5 grama de IgG total. Em vista disso os produtos HORAIG correntes têm duas desvantagens. Primeiramente, freqüentemente não é anatomicamente praticável administra a dose completa recomendada dentro e em torno de ferimentos de mordida e em segundo lugar a administração da dose de volume corrente de HORAIG está associada com dor significante. A presente invenção dá uma solução destas desvantagens visto que a mesma fornece uma composição farmacêutica que compreende uma dose adulta completa em um volume de aproximadamente 2 ml ou menos, se desejável. Uma tal composição farmacêutica pode compreender por exemplo duas moléculas de ligação capazes de neutralizar o vírus da raiva, preferivelmente CR57 e CR04-098. A composição farmacêutica ainda compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável e tem um volume em tomo de 2 ml. Mais é também possível, mas menos desejável em vista da dor associada com volumes de injeção maior. Menos do que 2 ml também é possível. A composição farmacêutica compreende a dose adulta completa (em IU) necessária para a profilaxia bem sucedida na pós exposição. Em uma forma de realização a composição farmacêutica é armazenada em frascos de 10 ml tais como por exemplo, um frasco pronto para o uso de 10 ml (vidro tipo I) com uma tampa. Fomecendo-se um frasco de 10 ml a opção é dada para diluir a composição farmacêutica para um volume mais alto no caso de um indivíduo apresentar uma área de superfície de ferimento grande. A invenção também fornece um kit que compreende pelo menos um recipiente (tal como um frasco) que compreende a composição farmacêutica. O kit pode ainda compreender um segundo recipiente que mantém um diluente adequado para diluir a composição farmacêutica para um volume mais alto. Os diluentes adequados incluem, mas não são limitados ao excipiente farmaceuticamente aceitável da composição farmacêutica e uma solução salina.

Além disso, o kit pode compreender instruções para diluir a

CG composição farmacêutica e/ou instruções para a administração da composição farmacêutica, se diluída ou não.

A invenção ainda diz respeito a um método de detectar um vírus da raiva em uma amostra, em que o método compreende as etapas de a) contatar uma amostra com uma quantidade eficaz para diagnóstico de uma molécula de ligação, uma variante funcional ou um imunoconjugado de acordo com a invenção e b) determinar se a molécula de ligação, variante funcional ou imunoconjugado liga-se especificamente a uma molécula da amostra. A amostra pode ser uma amostra biológica incluindo, mas não limitado a sangue, soro, tecido ou outro material biológico de pacientes (potencialmente) infectados. Os pacientes (potenciaimente) infectados podem ser pacientes humanos, mas também animais que são suspeitos como portadores do vírus da raiva podem ser testados quanto a presença de vírus da raiva usando as moléculas de ligação humanas, variantes funcionais ou imunoconjugados da invenção. A amostra pode ser primeiro manipulada para tomá-la mais adequada para o método de detecção. Manipulação significa inter alia tratar a amostra suspeita de conter e/ou contendo vírus da raiva em um tal modo que o vírus da raiva desintegrar-se-á em componentes antigênicos tais como proteínas, (poli)peptídeos ou outros fragmentos antigênicos. Preferivelmente, as moléculas de ligação, variantes funcionais ou imunoconjugados da invenção são contatados com a amostra sob condições que permitam que a formação de um complexo imunológico entre as moléculas de ligação humanas e vírus da raiva ou componentes antigênicos destes que podem estar presente na amostra. A formação de um complexo imunológico, se algum, indicando a presença de vírus da raiva na amostra, é depois detectada e medida por meio adequado. Tais métodos incluem, inter alia, imunoensaios de ligação homogênea e heterogênea, tais como radioimunoensaios (RIA), ELISA, imunofluorescência, imunoistoquímica, FACS, BIACORE e análises de Western blot.

σ

Além disso, as moléculas de ligação da invenção podem ser usadas para identificar epítopos de proteínas do vírus da raiva tais como a proteína G. Os epítopos podem ser lineares, mas também estruturais e/ou conformacionais. Em uma forma de realização, a ligação de moléculas de ligação da invenção a uma série de peptídeos que se sobrepõem, tais como peptídeos 15-mer, de uma proteína do vírus da raiva tal como a proteína G do vírus da raiva pode ser analisada por meio da análise PEPSCAN (ver inter alia WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al. 1996). A ligação de moléculas de ligação humanas a cada peptídeo pode ser testada em uma imuno ensaio ligado a enzima (ELISA) com base em PEPSCAN. Em uma outra forma de realização, uma biblioteca de peptídeo aleatória que compreende peptídeos de proteínas do vírus da raiva pode ser tríada quanto aos peptídeos capazes de ligação às moléculas de ligação humanas da invenção. Nos ensaios acima o uso de moléculas de ligação humanas que neutralizam o vírus da raiva pode identificar um ou mais epítopos de neutralização. Os peptídeos/epítopos encontrados podem ser usados como vacinas e para o diagnóstico da raiva.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de triar uma molécula de ligação ou uma variante funcional de uma molécula de ligação para a ligação específica a um epítopo diferente, preferivelmente que não se sobrepõem de vírus da raiva como o epítopo ligado por uma molécula de ligação ou variante funcional da invenção, em que o método compreende as etapas de a) contatar uma molécula de ligação ou uma variante funcional a ser triada, uma molécula de ligação ou variante funcional da invenção e vírus da raiva ou um fragmento deste (tal como por exemplo, a proteína G do vírus da raiva), b) medir se a molécula de ligação ou variante funcional a ser triada é capaz de competir para ligar-se especificamente ao vírus da raiva ou fragmento deste com a molécula de ligação ou variante funcional da invenção. Se nenhuma competição é medida as moléculas de ligação ou variantes funcionais a serem tríadas ligam-se a um epítopo diferente. Em uma forma de realização específica do método de triagem acima, as moléculas de ligação humanas ou variantes funcionais destas podem ser triadas para identificar moléculas de ligação humanas ou variantes funcionais capazes de ligação a 5 um epítopo diferente do que o epítopo reconhecido pela molécula de ligação que compreende a região de CDR3 que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 25. Preferivelmente, os epítopos são os que não se sobrepõem ou não competidores. Está claro para a pessoa habilitada que o método de triagem acima também pode ser usado para identificar moléculas 10 de ligação ou variantes funcionais destes capazes de ligação ao mesmo epítopo. Em uma outra etapa pode ser determinado se as moléculas de ligação triadas que não são capazes de competir quanto à ligação de modo específico ao vírus da raiva ou fragmento destes têm atividade de neutralização. Também pode ser determinado se as moléculas de ligação triadas que são 15 capazes de competir quanto a ligação de modo específico ao vírus da raiva ou fragmento destes têm atividade de neutralização. As moléculas de ligação neutralizadoras anti-vírus da raiva ou variantes funcionais destas descobertas no método de triagem são uma outra parte da presente invenção. No método de triagem “ligar especificamente ao mesmo epítopo” também considera a 20 ligação específica substancial ou essencialmente ao mesmo epítopo como o epítopo ligado pelas moléculas de ligação humanas da invenção. A capacidade para bloquear, ou competir com, a ligação das moléculas de ligação humanas da invenção ao vírus da raiva tipicamente indica que uma molécula de ligação a ser triada se liga a um epítopo ou sítio de ligação no 25 vírus da raiva que estruturalmente sobrepõem com o sítio de ligação no vírus da raiva que é imunoespecificamente reconhecido pelas moléculas de ligação da invenção. Altemativamente, isto pode indicar que uma molécula de ligação a ser triada se liga a um epítopo ou sítio de ligação que é suficientemente próximo ao sítio de ligação imunoespecificamente reconhecido pelas

moléculas de ligação da invenção para inibir estericamente ou de outro modo a ligação das moléculas de ligação da invenção ao vírus da raiva ou a um fragmento deste.

No geral, a inibição competitiva é medida por meio de um ensaio, em que uma composição de antigeno, isto é uma composição que compreende vírus da raiva ou fragmentos (tais como proteínas G) deste, é misturada com as moléculas de ligação de referência e as moléculas de ligação a serem triadas. Em uma forma de realização a molécula de ligação de referência pode ser uma das moléculas de ligação humanas da invenção e a 10 molécula de ligação a ser triada pode ser uma outra molécula de ligação humana da invenção. Em uma outra forma de realização a molécula de ligação de referência pode ser a molécula de ligação que compreende a região CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 25 e a molécula de ligação a ser triada pode ser uma das moléculas de ligação 15 humanas da invenção. Já em uma outra forma de realização a molécula de ligação de referência pode ser de uma das moléculas de ligação humanas da invenção e a molécula de ligação a ser triada pode ser a molécula de ligação que compreende a região de CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 25. Usualmente, as moléculas de ligação a serem 20 triadas estão presentes em excesso. Os protocolos com base nos ELISAs são adequados para o uso em tais estudos de competição simples. Em certas formas de realização, pode-se pré misturar as moléculas de ligação de referência com quantidades variáveis das moléculas de ligação a serem triadas (por exemplo, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 ou 1:100) 25 por um período de tempo antes de aplicar à composição de antigeno. Em outras formas de realização, as moléculas de ligação de referência e as quantidades variáveis de moléculas de ligação a serem triadas podem ser simplesmente misturadas durante a exposição à composição de antigeno. Em qualquer evento, usando-se anticorpos secundários de espécie ou isótipo uma pessoa será capaz de detectar apenas as moléculas de ligação de referência ligadas, a ligação da qual será reduzida pela presença de uma molécula de ligação a ser tríada que reconhece substancialmente o mesmo epítopo. Na condução de um estudo de competição da molécula de ligação entre uma molécula de ligação de referência e qualquer molécula de ligação a ser triada (independente da espécie ou isótipo), pode-se primeiro rotular a molécula de ligação de referência com um rótulo detectável, tal como, por exemplo, biotina, um rótulo enzimático, um radioativo ou outro rótulo para possibilitar a identificação subsequente. Nestes casos, poder-se-ia pré misturar ou incubar as moléculas de ligação de referência rotuladas com as moléculas de ligação a serem triadas em várias proporções (por exemplo, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70 1:80, 1:90 ou 1:100) e (opcionalmente depois de um período adequado de tempo) depois de ensaiar a reatividade das moléculas de ligação de referência rotuladas e comparar estas com um valor de controle em que nenhuma molécula de ligação potencialmente competidora foi incluída na incubação. O ensaio pode ser mais uma vez qualquer um de uma faixa de ensaios imunológicos com base na hibridização de anticorpo e as moléculas de ligação de referência podem ser detectadas por meio de detectar seu rótulo, por exemplo, usando estreptavidina no caso de moléculas de ligação de referência biotiniladas ou usando um substrato cromogênico em conexão com um rótulo enzimático (tal como substrato de 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) com enzima de peroxidase) ou simplesmente detectando-se um rótulo radioativo. Uma molécula de ligação a ser triada que se liga ao mesmo epítopo como a molécula de ligação de referência será capaz de competir eficazmente quanto a ligação e assim significantemente reduzirá a ligação da molécula de ligação de referência, como evidenciado por uma redução no rótulo ligado. A ligação das moléculas de ligação diferentes dos epítopos não competidores não mostrarão nenhuma redução. A reatividade da molécula de ligação de referência (rotulada) na ausência de uma molécula de ligação

7/ completamente irrelevante seria o valor de controle alto. O valor de controle baixo seria obtido incubando-se a molécula de ligação de referência rotulada com moléculas de ligação de referência não rotuladas exatamente do mesmo tipo, quando a competição ocorrería e reduziría a ligação da molécula de ligação de referência rotulada. Em um ensaio de teste, uma redução signifícante na reatividade da molécula de ligação de referência rotulada na presença de uma molécula de ligação a ser tríada é indicativo de uma molécula de ligação que reconhece o mesmo epítopo, isto é, uma que “reage cruzado” com a molécula de ligação de referência rotulada. Se nenhuma redução é mostrada, a molécula de ligação pode ligar-se a um epítopo não competidor diferente.

As moléculas de ligação identificadas por estes ensaios de competição (“moléculas de ligação competitivas”) incluem, mas não são limitadas a, anticorpos, fragmentos de anticorpo e outros agentes de ligação que se ligam a um epítopo ou sítio de ligação ligados pela molécula de ligação de referência assim como anticorpos, fragmentos de anticorpo e outros agentes de ligação que se ligam a um epítopo ou sítio de ligação suficientemente próximos a um epítopo ligado pela molécula de ligação de referência para que a ligação competitiva entre as moléculas de ligação a serem tríadas e a molécula de ligação de referência ocorra. Preferivelmente, as moléculas de ligação competitivas da invenção, quando presentes em excesso, inibirão a ligação específica de uma molécula de ligação de referência a uma espécie alvo selecionada em pelo menos 10 %, preferivelmente em pelo menos 25 %, mais preferivelmente em pelo menos 50 % e o mais preferivelmente em pelo menos 75 % a 90 % ou mesmo maior. A identificação de uma ou mais moléculas de ligação competitivas que se ligam em torno de, substancialmente, essencialmente ou ao mesmo epítopo como as moléculas de ligação da invenção é uma questão técnica direta. Visto que a identificação de moléculas de ligação competitivas é determinada em comparação a um molécula de ligação de referência, será entendido que de fato determinar o epítopo ao qual a molécula de ligação de referência e a molécula de ligação competitiva se ligam não é de nenhum modo requerido de modo a identificar uma molécula de ligação competitiva que se liga à mesma ou substancialmente ao mesmo epítopo como a molécula de ligação de referência. Altemativamente, as moléculas de ligação que ligam a epítopos não competidores diferentes identificados por estes ensaios de competição também podem incluir, mas não são limitados a, anticorpos, fragmentos de anticorpo e outros agentes de ligação.

Em um outro aspecto a invenção fornece um método de identificar uma molécula de ligação potencialmente tendo atividade de neutralização contra um agente infeccioso que causa doença em um ser vivo ou uma molécula de ácido nucleico que codifica uma ligação; a molécula potencialmente tendo atividade de neutralização contra um agente infeccioso que causa doença em um ser vivo, em que o método compreende as etapas de

a) contatar uma coleção de moléculas de ligação na superfície de pacotes genéticos replicáveis com pelo menos uma célula que expressa uma proteína do agente infeccioso que causa doença em um ser vivo na sua superfície sob condições conducentes à ligação, b) separar e recuperar as moléculas de ligação que se ligam à célula que expressa uma proteína do agente infeccioso que causa doença em um ser vivo na sua superfície de moléculas de ligação que não se ligam à dita célula, c) isolar pelo menos uma molécula de ligação recuperada, d) verificar se a molécula de ligação isolada tem atividade de neutralização contra o agente infeccioso que causa doença em um ser vivo. A célula que expressa uma proteína do agente infeccioso que causa doença em um ser vivo na sua superfície pode ser uma célula transfectada com a proteína. Uma pessoa habilitada na técnica está ciente de que os antígenos do agente infeccioso outro que não as proteínas também podem ser usados com sucesso no método. Em uma forma de realização específica a célula é uma célula PER.C6®. Entretanto, outras linhagens de célula (El-imortalizadas) também poderíam ser usadas para expressar as proteínas tais como as células BHK, CHO, NSO, HEK293, ou 911. Em uma forma de realização a molécula de ligação é humana. O agente infeccioso pode ser um vírus, uma bactéria, uma levedura, um fungo ou um parasita. Em uma forma de realização a proteína é uma proteína normalmente expressada na superfície do agente infeccioso ou compreende pelo menos uma parte de uma proteína que é acessível à superfície. Em uma forma de realização específica a coleção de moléculas de ligação na superfície de pacotes genéticos replicáveis é subtraída/contrasselecionada com as células usadas para a expressão da proteína do agente infeccioso, isto é as células são idênticas às células usadas na etapa a com a condição de que elas não expressem a proteína do agente infeccioso na sua superfície. As células usadas para a subtração/contrasseleção podem ser células não transfectadas. Altemativamente, as células podem ser transfectadas com uma proteína ou parte (extracelular) desta que seja similar e/ou altamente homóloga na seqüência ou estrutura com a respectiva proteína do agente infeccioso e/ou que é derivada de um agente infeccioso da mesma família ou mesmo gênero.

Um outro aspecto da invenção diz respeito a uma molécula de ligação como aqui definida tendo a atividade neutralizadora do vírus da raiva, em que a molécula de ligação humana compreende pelo menos uma região CDR3 de cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido compreendendo a SEQ ID NO: 25 e ainda em que a molécula de ligação humana tem uma atividade neutralizadora do vírus da raiva de pelo menos 2500 IU/mg de proteína.

Mais preferivelmente, a dita molécula de ligação humana tem uma atividade neutralizadora do vírus da raiva de pelo menos 2800 IU/mg de proteína, pelo menos 3000 IU/mg de proteína, pelo menos 3200 IU/mg de proteína, pelo menos 3400 IU/mg de proteína, pelo menos 3600 IU/mg de

proteína, pelo menos 3800 IU/mg de proteína, pelo menos 4000 IU/mgde proteína, pelo menos 4200 IU/mg de proteína, pelo menos 4400 IU/mgde proteína, pelo menos 4600 IU/mg de proteína, pelo menos 4800 IU/mgde proteína, pelo menos 5000 IU/mg de proteína, pelo menos 5200 IU/mgde proteína, pelo menos 5400 IU/mg de proteína. A atividade de neutralização da molécula de ligação foi medida por um ensaio de neutralização in vitro (RFFIT modificado (teste de inibição de foco fluorescente rápido)). O ensaio é descrito em detalhes na seção de exemplo abaixo.

Em uma forma de realização a molécula de ligação 10 compreende uma cadeia pesada variável que compreende a seqüência de aminoácido compreendendo a SEQ ID NO: 273. Em uma outra forma de realização a molécula de ligação compreende uma cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido compreendendo a SEQ ID NO: 123. A cadeia leve variável da molécula de ligação pode compreender a seqüência ’15 de aminoácido que compreende a SEQ ID NO: 275. A cadeia leve da molécula de ligação pode compreender a seqüência de aminoácido que compreende a SEQ ID NO: 125.

Uma molécula de ácido nucleico que codifica as moléculas de ligação como descrito acima também é uma parte da presente invenção. 20 Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico compreende a seqüência de nucleotídeo que compreende a SEQ ID NO: 122. Além disso, a molécula de ácido nucleico também pode compreender a seqüência de nucleotídeo que compreende a SEQ ID NO: 124. Um vetor que compreende as moléculas de ácido nucleico e uma célula hospedeira que compreende um tal vetor também 25 são aqui fornecidos. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula de mamífero tal como uma célula humana. Os exemplos de células adequadas para a produção de moléculas de ligação humanas são inter alia as células HeLa, 911, ΑΊΊ080, A549, 293 e HEK293T. as células de mamífero preferidas são as células da retina humana tais como as células 911 ou a linhagem de célula depositada na European Colection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Grã Bretanha em 29 de Fevereiro de 1996 sob o número 96022940 e comercializada sob a marca PER.C6® (PER.C6 é uma marca registrada da Crucell Holland B.V.). Para os 5 propósitos deste pedido “PER.C6” refere-se às células depositadas sob o número 96022940 ou ancestrais, passagens a montante ou a jusante assim como descendentes dos ancestrais de células depositadas, assim como derivados de qualquer uma das precedentes.

EXEMPLOS

Para ilustrar a invenção, os seguintes exemplos são fornecidos.

Os exemplos não são intencionados a limitar o escopo da invenção de nenhum modo.

Exemplo 1

Reconhecimento de epítopo de anticorpos anti-raiva humanos '15 CR-57 e CR-JB

Para verificar se os anticorpos monoclonais humanos chamados CR-57 e CR-JB reconhecem epítopos que não se sobrepõem, não competidores, vírus que escapam dos anticorpos monoclonais humanos chamados CR-57 e CR-JB foram gerados. CR-57 e CR-JB foram gerados 20 essencialmente como descrito (ver Jones et al., 2003), por intermédio da introdução das regiões codificadoras de cadeia pesada e leve variáveis dos genes de anticorpo correspondentes em um único vetor de expressão IgGl humano chamado pcDNA3002(Neo). Os vetores resultantes pgSO57Cll e pgSOJBCll foram usados para a expressão transitória em células da 25 linhagem de célula depositada na European Colection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Grã Bretanha em 29 de Fevereiro de 1996 sob o número 96022940 e comercializada sob a marca PER.C6®. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido das cadeias pesadas e leves destes anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 122 a 129, respectivamente. As diluições em série (0,5 ml) da cepa CVS-11 do vírus da raiva (diluições variando de 10’ a 10' ) foram incubadas com uma quantidade constante (~4 IU/ml) de anticorpo CR-57 ou CR-JB (0,5 ml) por 1 hora a 37° C/5 % de CO2 antes da adição aos reservatórios contendo células de neuroblastoma de camundongo (células MNA) ou células BSR (linhagem de célula equivalente à Renal de Hamster Bebê). Depois de 3 dias de seleção na presença de anticorpo monoclonal humano CR-57 ou CR-JB, o meio (1 ml) contendo vírus potencial que escapam foi colhido e armazenado a 4^o C até uso mais adiante. Subsequentemente, as células foram fixadas em acetona por 20 minutos a 4^o C e tingido durante a noite a 37° C/5 % de CO₂ com um anticorpo conjugado N-FITC anti-raiva (Ccntocor). O número de focos por reservatório foram contados pela imunofluorescência e o meio de reservatórios contendo de um a seis focos foi escolhido para a amplificação de vírus. Todos os vírus E57 que escapam foram gerados a partir de 1 único foco com a exceção de E57B1 (3 focos). Os vírus que escapam EJB foram isolados de 1 foco (EJB3F), 3 focos (EJB2B, 4 focos (EJB2C), 5 focos (EJB2E, 2F), ou 6 focos (EJB2D), respectivamente. Cada vírus de escape foi primeiro amplificado em uma escala pequena em células BSR ou MNA dependendo das suas características de crescimento. Estes lotes virais pequenos foram depois usados para amplificar ainda mais o vírus em uma escala grande em células MNA ou BSR. O vírus amplificado foi depois titulado em células MNA para determinar o título de cada lote viral de escape assim como a diluição ótima do vírus de escape (dando 80 a 100 % de infecção depois de 24 horas) para o uso em um ensaio de neutralização viral.

Os ensaios de RFFIT modificados (teste de inibição de foco fluorescente rápido) foram realizados para examinar a proteção cruzada de E57 (o vírus que escapa de CR-57) e EJB (o vírus que escapa de CR-JB) com CR-JB e CR-57, respectivamente. Portanto, CR-57 ou CR-JB foram diluídos pelas diluições triplas em série partindo com uma diluição. O vírus da raiva

V7 (cepa CVS-11) foi adicionada a cada diluição em uma concentração que dá 80 a 100 % de infecção. A mistura Vírus/IgG foi incubada por 1 hora a 37° C/5 % de CO₂ antes da adição às células MNA. 24 horas após a infecção (a 34° C/5 % de CO₂) as células foram fixadas com acetona por 20 minutos a 4^o C e tingido por no mínimo 3 horas com um anticorpo N-FITC anti-vírus da raiva conjugado (Centocor). Os reservatórios foram depois analisados quanto à infecção pelo vírus da raiva sob um microscópio de fluorescência para determinar a diluição de ponto final em 50 %. Esta é a diluição na qual a infecção viral é bloqueada em 50 % neste ensaio. Para calcular a potência, um padrão internacional (Rabies Immune Globulin Lot R3, Material de referência do laboratório da Standards and Testing DMPQ/CBER/FDA) foi incluído em cada RFFIT modificado. A diluição de ponto final em 50 % deste padrão corresponde com uma potência de 2 IU/ml. A potência de neutralização dos anticorpos monoclonais humanos únicos CR-57 e CR-JB assim como a ‘ 15 combinação destes anticorpos foram testados.

Os víruses de EJB não foram mais neutralizados por CR-JB ou CR-57 (ver a Tabela 1), sugerindo que ambos anticorpos ligaram-se a e induziram mudanças de aminoácido em regiões similares da glicoproteína do vírus da raiva. Os vírus E57 não foram mais neutralizados pelo CR-57, ao 20 passo que 4 dos 6 vírus E57 foram ainda neutralizados por CRJB, embora com uma potência mais baixa (ver a Tabela 1). Uma mistura dos anticorpos CR-57 e CR-JB (em uma relação de IU/mg de 1:1) deu resultados similares como observados com os anticorpos únicos (dados não mostrados).

Para identificar mutações possíveis na glicoproteína do vírus da raiva a seqüência de nucleotídeo da matriz de leitura aberta (ORF) da glicoproteína de cada um dos vírus que escapam EJB e E57 foi determinada. O RNA viral de cada um dos vírus que escapam e CVS-11 foram isolados a partir de células MNA infectadas pelo vírus e convertido em cDNA pela RTPCR padrão. Subsequentemente, o cDNA foi usado para o seqüenciamento de nucleotídeo das ORFs da glicoproteína do vírus da raiva de modo a identificar mutações.

Tanto o vírus E57 quanto o EJB que escapam mostraram mutações na mesma região da glicoproteína (ver as Figuras 1 e 2, 5 respectivamente; ver quanto a todas as seqüências descritas nas Figuras 1 e 2 SEQ ID NOs: 130 a 151). Isto indica que ambos os anticorpos reconhecem os epítopos que se sobrepõem. A partir do acima pode ser concluído que a combinação de CR-57 e CR-JB em um coquetel não impede o escape de variantes resistentes à neutralização e não é portanto uma preparação de 10 imunoglobulina ideal para a profilaxia pós exposição da raiva.

Exemplo 2

Construção de uma biblioteca de apresentação de fago ScFv usando linfócitos de sangue periférico de doadores vacinados contra a raiva.

De quatro pacientes humanos vacinados contra a raiva 50 ml '15 de sangue foi tirado a partir de um veia uma semana depois do último reforço.

Os linfócitos de sangue periférico (PBL) foram isolados a partir destas amostras de sangue usando fracionamento de densidade de célula Ficoll. O soro do sangue foi recolhido e congelado a -20° C. A presença de anticorpos anti-raiva nos soros foi testada positivo usando um tingimento FACS nas 20 células 293T transfectadas com glicoproteína do vírus da raiva. O RNA total foi preparado a partir de PBL usando separação de fase orgânica (TRIZOL ) e precipitação com etanol subsequente. O RNA obtido foi dissolvido em água ultrapura tratada com DEPC e a concentração foi determinada pela medição na OD 260 nm. Depois disso, o RNA foi diluído a uma concentração de 100 25 ng/μΐ. Em seguida, 1 pg de RNA foi convertido em cDNA como segue: A 10 μΐ de RNA total, 13 μΐ de água ultrapura tratada com DEPC e 1 μΐ de hexâmeros aleatórios (500 ng/μΐ) foram adicionados e a mistura obtida foi aquecida a 65° C por 5 minutos e rapidamente esfriada em gelo úmido.

Depois, 8 μΐ de tampão de Primeiro-Filamento 5X, 2 μΐ de dNTP (10 mM de

7?

cada), 2 μΐ de DTT (0,1 M), 2 μΐ de inibidor de Rnase (40 U/μΙ) e 2 μΐ de transcriptase reversa MMLV Superscript® III (200 U/μΙ) foram adicionados à mistura, incubados na temperatura ambiente por 5 minutos e incubadas por 1 hora a 50° C. A reação foi terminada pela inativação térmica, isto é incubando-se a mistura por 15 minutos a 75° C.

Os produtos de cDNA obtidos foram diluídos a um volume final de 200 μΐ com água ultrapura tratada com DEPC. A OD 260 nm de uma solução diluída 50 vezes (em 10 mM de tampão Tris) da diluição dos produtos de cDNA obtidos deram um valor de 0,1.

Para cada doador 5 a 10 μΐ dos produtos de cDNA diluídos foram usados como padrão para a amplificação pela PCR da família de seqüências de cadeia pesada gama e cadeias leves capa ou lambda da imunoglobulina usando iniciadores de oligonucleotídeo específicos (ver as Tabelas de 2 a 7). As misturas da reação de PCR contiveram, além dos produtos de cDNA diluídos, 25 pmol de iniciador de sentido e 25 pmol de iniciador de anti-sentido em um volume final de 50 μΐ de Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), 50 mM de KC1, 2,5 mM de MgCl?, 250 μΜ de dNTPs e 1,25 unidades de Taq polimerase. Em um ciclador térmico de tampa aquecida tendo uma temperatura de 96° C, as misturas obtidas foram rapidamente fundidas por 2 minutos, seguidas pelos 30 ciclos de: 30 segundos a 96° C, 30 segundos a 60° C e 60 segundos a 72° C.

Em uma primeira rodada de amplificação, cada um dos dezessete iniciadores de sentido da região variável de cadeia leve (onze para a cadeia leve lambda (ver a Tabela 2) e seis para a cadeia leve capa (ver a 25 Tabela 3) foram combinados com um iniciador de anti-sentido que reconhece a C-capa chamada HuCk 5’-ACACTCTCCCCTGTTGAAGC TCTT-3’ (ver a SEQ ID NO: 152) ou região constante C-lambda HuCX2 5’TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3’ (ver a SEQ ID NO: 153) e HuCX7 5’-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3’ (ver a SEQ ID NO: 154) (os iniciadores de anti-sentido HuCX2 e HuCX7 foram misturados até a equimolaridade antes do uso), rendimento 4 vezes 17 produtos de cerca de 600 pares de base. Estes produtos foram purificados em um gel de agarose a 2 % e isolado do gel usando colunas de extração em gel Qiagen. 1/10 de cada um dos produtos isolados foi usado em uma reação de PCR idêntica como descrito acima usando os mesmos dezessete iniciadores de sentido, por meio dos quais cada iniciador de sentido da cadeia leve lambda foi combinado com um dos três iniciadores de anti-sentido específicos da região Jlambda e cada iniciador de sentido da cadeia leve capa foi combinada com um dos cinco iniciadores de anti-sentido específicos da região Jcapa. Os iniciadores usados na segunda amplificação foram estendidos com sítios de restrição (ver a Tabela 4) para possibilitar a clonagem direcionada na apresentação do vetor de fago PDV-006 (ver a Figura 3 e SEQ ID NO: 155). Isto resultou em 4 vezes 63 produtos de aproximadamente 350 pares de base que foram reunidos a um total de 10 frações. Este número de frações foi escolhido para manter a distribuição natural das famílias de cadeia leve diferentes dentro da biblioteca e não super ou infra representa certas famílias. O número de alelos dentro de uma família foi usado para determinar a porcentagem de representação dentro de uma biblioteca (ver a Tabela 5). Na etapa seguinte, 2,5 pg de fração reunida e 100 pg de vetor PDV-006 foram digeridos com Sall e Notl e purificados a partir do gel. Depois disso, uma ligação foi realizada durante a noite a 16° C como segue. A 500 ng de vetor PDV-006 70 ng da fração reunida foram adicionados em um volume total de 50 μΐ de mistura de ligação contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de MgCl₂, 10 mM de DTT, 1 mM de ATP, 25 pg/ml de BSA e 2,5 μΐ de T4 DNA Ligase (400 U/μΙ). Este procedimento foi seguido para cada fração reunida. As misturas de ligação foram purificadas pelo fenol/clorofórmio, seguido por uma extração em clorofórmio e precipitação em etanol, métodos bem conhecidos ao técnico habilitado. O DNA obtido foi dissolvido em 50 μΐ de água ultrapura e por mistura de ligação duas vezes alíquotas de 2,5 μΐ foram eletroporados em 40 μΐ de bactérias E. colli competente em TG1 de acordo com o protocolo do fabricante (Stratagene). Os transformantes foram cultivadas durante a noite a 37° C em um total de 30 placas (três placas por fração reunida; dimensões da placa: 240 mm x 240 mm) contendo 2TY ágar suplementado com 50 pg/ml de ampicilina e 4,5 % de glicose. Uma (sub)biblioteca de regiões variáveis de cadeia leve foi obtida raspando-se os transformantes das placas de ágar. Esta (sub)biblioteca foi diretamente usada para a preparação de DNA plasmídicos usando um kit de preparação QIAFilter MAXI da Qiagen .

Para cada doador as seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina foram amplificadas a partir das mesmas preparações de cDNA em um procedimento de PCR de duas rodadas similares e parâmetros de reação idênticas como descrito acima para as regiões de cadeia leve com a condição de que os iniciadores representados nas Tabelas 6 e 7 foram usados. A primeira amplificação foi realizada usando um conjunto de nove iniciadores direcionados a sentido (ver a Tabela 6; que abrange todas as famílias de regiões variáveis de cadeia pesada) cada uma combinada com um iniciador de anti-sentido da região constante específica de IgG chamado HuCIgG 5’-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3’ (SEQ ID NO: 156) produzindo quatro vezes nove produtos de cerca de 650 pares de base. Estes produtos foram purificados em um gel de agarose a 2 % e isolados a partir do gel usando colunas de extração em gel Qiagen. 1/10 de cada um dos produtos isolados foi usado em uma reação de PCR idêntica como descrito acima usando os mesmos nove iniciadores de sentido, por meio do qual cada iniciador de sentido de cadeia pesada foi combinado com um dos quatro iniciadores de anti-sentido específicos da região JH. Os iniciadores usados na segunda rodada foram estendidos com sítios de restrição (ver a Tabela 7) para possibilitar a clonagem direcionada no vetor da (sub)biblioteca de cadeia leve. Isto resultou por doador em 36 produtos de aproximadamente 350 pares de base. Estes produtos foram reunidos para cada doador por iniciador de sentido (VH) usado em nove frações. Os produtos obtidos foram purificados usando colunas de Purificação pela PCR Qiagen. Em seguida, as frações foram digeridas com Sfll e Xhol e ligados no vetor da (sub)biblioteca de cadeia 5 leve, que foi cortado com as mesmas enzimas de restrição, usando o mesmo procedimento de ligação e volumes como descritos acima para a (sub)biblioteca de cadeia leve. Alternativamente, as frações foram digeridas com Ncol e Xhol e ligadas no vetor de cadeia leve, que foi cortado com as mesmas enzimas de restrição, usando o mesmo procedimento de ligação e 10 volumes como descrito acima para a (sub)biblioteca de cadeia leve. A purificação de ligação e transformação subsequente da biblioteca definitiva resultante também foi realizada como descrito acima para a (sub)biblioteca de cadeia leve e neste ponto as misturas de ligação de cada doador foram combinadas por reunião de VH. Os transformantes foram cultivados em 27 '15 placas (três placas por fração reunida; dimensões de placa: 240 mm x 240 mm) contendo 2TY ágar suplementado com 50 pg/ml de ampicilina e 4,5 % de glicose. Todas as bactérias foram colhidas em meio de cultura 2TY contendo 50 pg/ml de ampicilina e 4,5 % de glicose, misturado com glicerol a 15 % (v/v) e congelado em alíquotas de 1,5 ml a -80° C. O resgate e seleção 20 de cada biblioteca foram realizados como descrito abaixo.

Exemplo 3

Seleção de fragmentos Fv de cadeia única que carregam fagos que reconhecem especificamente a glicoproteína do vírus da raiva Fragmentos de anticorpo foram selecionados usando bibliotecas de apresentação de fago de anticorpo, a tecnologia da apresentação <g.

de fago geral e a tecnologia MAbstract , essencialmente como descritas na Patente US Número 6.265.150 e na WO 98/15833 (ambas as quais são aqui incorporadas por referência). As bibliotecas de fago de anticorpo usadas foram duas bibliotecas de fago de scFv semi-sintéticas diferentes (JK1994 e

WT2000) e as bibliotecas de fago de scFv imunes (RAB-03-G01 e RAB-04G01) preparadas como descrito no Exemplo 2 acima. A primeira biblioteca de fago de scFv semi-sintética (JK.1994) foi descrita em de Kruif et al. (1995b), a segunda (WT2000) foi construída essencialmente como descrito em de Kruif et al. (1995b). Em resumo, a biblioteca tem um formato semi-sintético por meio do qual a variação foi incorporada nos genes V da cadeia pesada e leve usando oligonucleotídeos degerados que incorporam variação dentro das regiões de CDR. Apenas os genes da cadeia pesada VH3 foram usados, em combinação com os genes da cadeia leve capa e lambda. CDR1 e CDR3 da cadeia pesada e CDR3 da cadeia leve foram recriados sinteticamente em um método com base em PCR similar como descrito em de Kruif et al. (1995b). Os genes da região V assim criados foram clonados seqüencialmente no formato de scFv em um vetor fagomídeo e amplificados para gerar um biblioteca de fago como descrito antes. Além disso, os métodos e fagos auxiliares como descritos na WO 02/103012 (incorporada aqui por referência) foram usados na presente invenção. Para identificar anticorpos de fago que reconhece a glicoproteína do vírus da raiva, experimentos de seleção de fago foram realizados usando o vírus da raiva integral (a cepa Pitman-Moore do vírus da raiva) inativado pelo tratamento com betapropiolactona, glicoproteína do vírus da raiva purificada (a cepa ERA do vírus da raiva), e/ou células transfectadas que expressam a proteína G do vírus da raiva (a cepa ERA do vírus da raiva).

A proteína G foi purificada a partir da cepa ERA do vírus da raiva como segue. A uma solução de vírus, 1/10 volume de octil-betaglicopiranosídeo a 10 % foi adicionada e suavemente misturada. Em uma incubação de 30 minutos a 4^o C a amostra viral foi centrifugada (36.000 rpm, 4^o C) em um rotor SW51. O sobrenadante foi coletado e dialisado durante a noite a 4^o C contra Tris/EDTA 0,1 M. Subsequentemente, a glicoproteína foi coletada da câmara de diálise, aliquotada e armazenada a -80° C até uso <?/ futuro. A concentração de proteína foi determinada pela OD 280 nm e a integridade da proteína G foi analisada pelo SDS-PAGE.

O vírus da raiva integral inativado ou a proteína G do vírus da raiva foram diluídos em solução salina tamponada com fosfato (PBS), 2 a 3 ml foram adicionados a Tubos MaxiSorp Nunc-Imuno (Nunc) e incubados durante a noite a 4^o C em uma roda rotativa. Uma alíquota de uma biblioteca de fago (500 μΐ, aproximadamente 10¹³ cfu, amplificada usando o fago auxiliar CT (ver a WO 02/103012)) foi bloqueada em tampão de bloqueio (2 % de Protifar em PBS) por 1 a 2 horas na temperatura ambiente. A biblioteca de fago bloqueada foi adicionada ao imunotubo (pré incubada com ou sem CR-57 scFv para bloquear o epítopo reconhecido por CR-57), incubada por 2 horas na temperatura ambiente e lavada com tampão de lavagem (0,1 % de Tween-20 (Serva) em PBS) para remover os fagos não ligados. Os fagos ligados foram depois eluídos do antígeno pela incubação por 10 minutos na temperatura ambiente com 1 ml de Glicina-HCl 50 mM pH 2,2. Subsequentemente, os fagos eluídos foram misturados com 0,5 ml de TrisHC1 1 M pH 7,5 para neutralizar o pH. Esta mistura foi usada para infectar 5 ml de uma cultura de E. coli XLl-Blue que foi cultivada a 37° C a uma OD

600 nm de aproximadamente 0,3. Os fagos foram deixados infectar as bactérias XLl-Blue por 30 minutos a 37° C. Depois, a mistura foi centrifugada por 10 minutos, a 3200*g na temperatura ambiente e a pelota bacteriana foi recolocada em suspensão em 0,5 ml de meio de extrato de levedura 2-tripton (2TY). A suspensão bacteriana obtida foi dividida em duas placas de 2TY ágar placas suplementadas com tetraciclina, ampicilina e glicose. Depois da incubação durante a noite das placas a 37° C, as colônias foram raspadas das placas e usadas para preparar uma biblioteca de fago enriquecida, essencialmente como descrito por De Kruif et al. (1995a) e WO 02/103012. Em resumo, as bactérias raspadas foram usadas para inocular meio 2TY contendo ampicilina, tetraciclina e glicose e cultivadas a uma

Í5 temperatura de 37° C a uma OD 600 nm de -0,3. Os fagos auxiliares CT foram adicionados e deixados infectar as bactérias depois que o meio foi mudado para 2TY contendo ampicilina, tetraciclina e canamicina. A incubação foi continuada durante a noite a 30° C. No dia seguinte, as bactérias foram removidas do meio 2TY pela centrifugação depois que os fagos no meio foram precipitados usando polietileno glicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, os fagos foram dissolvidos em 2 ml de PBS com 1 % de albumina sérica bovina (BSA), esterilizados em filtro e usados para a rodada seguinte de seleção.

As seleções de fago também foram realizadas com células transfectadas da glicoproteína do vírus da raiva. As células usadas foram células da linhagem de célula depositada na European Colection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Grã Bretanha em 29 de Fevereiro de 1996 sob o número 96022940 e comercializada sob a '15 marca PER.C6®. Estas são a seguir aludidas como células PER.C6®. Aqui, a biblioteca de fago bloqueada (2 ml) foi primeiro adicionada a 1* 10 de células subtratoras (em DMEM/10 % FBS) e incubadas por 1 hora a 4^o C em uma roda rotativa. As células subtratoras foram células PER.C6 que expressaram o ecto domínio da glicoproteína do Vírus da Estomatite Vesicular (VSV) na sua superfície fundida à transmembrana e ao domínio citoplásmico do vírus da raiva. Com esta etapa de subtração, os fagos que reconhece a glicoproteína de VSV ou antígenos específicos para as células PER.C6® foram removidos da biblioteca de fago. A mistura de fago/célula foi centrifugada (5 minutos a 4^o C a 500xg) para remover os fagos ligados à célula e o sobrenadante foi adicionado a um novo tubo contendo 3 ml de 1 * 10⁷ células subtratoras. A etapa de subtração foi repetida duas vezes com o respectivo sobrenadante. Subsequentemente, os fagos subtraídos foram incubados por 1,5 hora a 4^o C em uma roda rotativa com as células transfectadas que expressam a glicoproteína do vírus da raiva (as células PER.C6® (3*10⁶ células)). Antes <fC disto, as células transfectadas foram pré incubadas com ou sem CR-57 scFv para bloquear o epítopo reconhecido pelo CR-57. Depois da incubação, as células foram lavadas cinco vezes com 1 ml de DMEM/10 % de FBS (para cada lavagem, as células foram recolocadas em suspensão e transferidas a novo tubo), os fagos foram eluídos e processados como descrito acima.

Tipicamente, duas rodadas de seleções foram realizadas antes da isolação de anticorpos de fago individuais. Depois da segunda rodada de seleção, colônias de E. coli individuais foram usadas para preparar anticorpos de fago monoclonais. Essencialmente, as colônias individuais foram cultivadas até a fase log em formato de placa de 96 reservatórios e infectadas com fagos auxiliares VCSM13 depois do que a produção de anticorpo de fago foi deixada prosseguir durante a noite. Os anticorpos de fago produzidos foram precipitados com PEG/NaCl e esterilizados em filtro e testados no ELISA quanto a ligação tanto ao vírus da raiva integral inativado quanto à proteína G do vírus da raiva purificada. A partir da seleção um painel grande de anticorpos de fago foi obtido que demonstrou a ligação tanto ao vírus da raiva integral inativado quanto à proteína G do vírus da raiva (ver exemplo abaixo). Duas estratégias de seleção foram seguidas com as bibliotecas imune descritas acima. Na primeira estratégia 736 anticorpos de fago foram selecionados depois de duas rodadas de seleção usando na primeira e segunda rodadas de seleção vírus inativado ou proteína G purificada. Na segundo estratégia 736 anticorpos de fago foram selecionados depois de duas rodadas de seleção usando na primeira rodada de seleção a proteína G recombinante expressada na superfície celular e na segunda rodada de seleção vírus inativado ou proteína G purificada. O número de anticorpos de fago únicos obtidos pela primeira estratégia foi 97, enquanto a segundo estratégia produziu 70 destes únicos. Os 97 anticorpos de fago únicos encontrados por meio da primeira estratégia deram origem a 18 anticorpos de neutralização e os 70 clones únicos identificados por meio da segunda estratégia produziram &

anticorpos de neutralização. Isto claramente demonstra que as seleções que incluíram as células tranfectadas da glicoproteína do vírus da raiva, isto é a W proteína G recombinante expressada na superfície celular, como antígeno pareceu produzir mais anticorpos de neutralização comparado com as seleções usando apenas proteína G purificada e/ou vírus inativado.

Exemplo 4

Validação dos anticorpos de fago de cadeia única específicos da glicoproteína do vírus da raiva.

Os anticorpos de fago de cadeia única selecionados que foram obtidos nos cenários descritos acima, foram validados no ELISA quanto a especificidade, isto é ligação à proteína G do vírus da raiva, purificados como descrito acima. Adicionalmente, os anticorpos de fago de cadeia única também foram testados quanto a ligação a FBS a 5 %. Para este propósito, a to proteína G do vírus da raiva ou a preparação de FBS a 5 % foram revestidas * ‘15 em placas de ELISA Maxisorp®. Depois do revestimento, as placas foram bloqueadas em PBS/1 % de Protifar por 1 hora na temperatura ambiente. Os anticorpos de fago de cadeia única selecionados foram incubados por 15 minutos em um volume igual de PBS/1 % de Protifar para obter anticorpos de fago bloqueados. As placas foram esvaziadas e os anticorpos de fago bloqueados foram adicionados aos reservatórios. A incubação foi deixada continuar por uma hora, as placas foram lavadas em PBS contendo 0,1 % de Tween-20 e os anticorpos de fago ligados foram detectados (usando medição de OD 492 nm) usando um anticorpo anti-M13 conjugado à peroxidase. Como um controle, o procedimento foi realizado simultaneamente não usando nenhum anticorpo de fago de cadeia única, um anticorpo de fago de cadeia única de controle negativo direcionado contra CD8 (SC02-007) ou um anticorpo de fago de cadeia única de controle positivo direcionado contra a glicoproteína do vírus da raiva (scFv S057). Como mostrado na Tabela 8, os anticorpos de fago selecionados chamados SC04-001, SC04-004, SC04-008, ??

SC04010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04104, SC04-108,

SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04144, SC04-146 e SC04164 apresentaram ligação à proteína G do vírus da raiva purificada imobilizada, enquanto nenhuma ligação ao FBS foi observada. Resultados idênticos foram obtidos no ELISA usado o vírus da raiva integral inativado preparado como descrito acima (dados não mostrado).

Exemplo 5

Caracterização de scFvs específicos do vírus da raiva

A partir do anticorpo de fago de cadeia única específico selecionado (scFv), clones de DNA plasmídeo foram obtidos e as seqüências de nucleotídeo foram determinadas de acordo com as técnicas padrão. As seqüências de nucleotídeo das scFvs (incluindo sítios de restrição para clonagem) chamadas SC04-001, SC04-004, SC04-008, SC04010, SC04-018,

SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04040, SC04-060, SC04-073,

SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04144, SC04-146 e SC04-164 são mostradas na SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO:163,

SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO:171,

SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO:179,

SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO:187,

SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO:195,

SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 e SEQ ID NO: 203, respectivamente. As seqüências de aminoácido das scFvs chamadas SC0425 001, SC04-004, SC04-008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026,

SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04-146 e SC04-164 são mostradas na SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO:

166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ IDNO:

174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ IDNO:

182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ IDNO:

190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ IDNO:

198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202 e SEQ ID NO: 204, respectivamente.

A identidade dos genes VH e VL (ver Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, Winter G. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering 10 (1997)) e as composições de CDR3 de cadeia pesada dos scFvs que ligam especificamente a proteína G do vírus da raiva são representadas na Tabela 9.

Exemplo 6

Neutralização in vitro do vírus da raiva pelos scFvs específicos do vírus da raiva (RFFIT modificado)

Ί 5 De modo a determinar se os scFvs selecionados foram capazes de bloquear a infecção do vírus da raiva, ensaios de neutralização in vitro (RFFIT modificado) foram realizados. As preparações de scFv foram diluídas em diluições de três vezes em série partindo com uma diluição 1:5. O vírus da raiva (cepa CVS-11) foi adicionado a cada diluição em uma concentração que 20 dá 80 a 100 % de infecção. A mistura de vírus/scFv foi incubada por 1 hora a 37° C/5 % de CO₂ antes da adição às células MNA. 24 horas após a infecção (a 34° C/5 % de CO₂) as células foram fixadas com acetona por 20 minutos a 4^o C e tingido no mínimo de 3 horas com um anticorpo NFITC anti-raiva conjugado (Centocor). As células foram depois analisadas quanto à infecção 25 pelo vírus da raiva sob um microscópio de fluorescência para determinar a diluição de ponto final em 50 %. Isto é a diluição na qual a infecção viral é bloqueada em 50 % neste ensaio (ver o Exemplo 1). Diversos scFvs foram identificados que apresentaram atividade de neutralização contra o vírus da raiva (ver a Tabela 10).

, Adicionalmente, foi investigado por meio do ensaio de neutralização in vitro (RFFIT modificado) como descrito acima, se os scFvs selecionados foram capazes de neutralizar o vírus E57 que escapam como preparado no Exemplo 1 (E57A2, E57A3, E57B1, E57B2, E57B3 e E57C3).

Diversas scFvs foram identificadas que apresentaram atividade de neutralização contra os vírus E57 que escapam (ver as Tabelas 1 IA e 11B).

Exemplo 7

ELISA de competição da proteína G do vírus da raiva com scFvs

Para identificar anticorpos que se ligam a epítopos que não se sobrepõem, não competidores, um ELISA de competição da glicoproteína da raiva foi realizado. As placas Nunc-Imuno® Maxisorp F96 (Nunc) foram revestidas durante a noite a 4^o C com uma diluição 1:1000 de glicoproteína do vírus da raiva purificada (1 mg/ml; a cepa ERA do vírus da raiva) em PBS (50 -15 μΐ). A proteína não revestida foi retirada por lavagem antes que os reservatórios foram bloqueados com 100 μΐ de PBS/1 % de Protifar por 1 hora na temperatura ambiente. Subsequentemente, a solução de bloqueio foi descartada e 50 μΐ dos scFvs anti-vírus da raiva não purificados em PBS/1 % de Protifar (2x diluído) foi adicionado. Os reservatórios foram lavados cinco 20 vezes com 100 μΐ de PBS/0,05 % de Tween-20. Depois, 50 μΐ de IgG competidora anti-vírus da raiva biotinilada, CR-57bio, foram adicionados a cada reservatório, incubados por 5 minutos na temperatura ambiente e os reservatórios foram lavados cinco vezes com 100 μΐ de PBS/0,05 % de Tween-20. Para detectar a ligação de CR-57bio, 50 μΐ de uma diluição 1:2000 de estreptavidina-anticorpo HORAP (Becton Dickinson) foi adicionado aos reservatórios e incubados por 1 hora na temperatura ambiente. Os reservatórios foram lavados mais uma vez como acima e o ELISA foi ainda 7 desenvolvido pela adição de 100 μΐ de reagentes OPD (Sigma). A reação foi interrompida pela adição de 50 μΐ de H2SO4 1 M antes de medir a OD a 492

7/ , nm.

O sinal obtido com CR-57bio sozinho pôde ser reduzido aos níveis de fundo quando co-incubados com scFv SO57, isto é a forma scFv de CR-57 (para seqüência de nucleotídeo e aminoácido de 5057 ver as SEQ ID 5 NOs: 205 e 206, respectivamente) ou scFv SOJB, isto é a forma scFv de CRJB (para seqüências de nucleotídeo e aminoácido de SOJB ver as SEQ ID NOs: 312 e 313, respectivamente). Isto indica que as scFvs 5057 e SOJB competem com a interação de CR-57bio para a glicoproteína do vírus da raiva pela ligação ao mesmo epítopo ou a um epítopo que se sobrepõem como CRIO 57bio, respectivamente. Ao contrário, um scFv irrelevante chamado SCO2007, isto é uma ligação de scFv a CD8, não competiu pela ligação. Os scFvs anti-vírus da raiva chamados SC04-004, SC04010, SC04-024, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04103, SC04-104, SC04-120, SC04-125, SC04-127, SC04-140, SC04144 e SC04-146 também não competiram com • 15 CR-57bio, indicando que estas scFvs se ligam a um epítopo diferente do epítopo reconhecido por CR-57 (ver a Figura 4).

Resultados similares foram obtidos com os seguintes experimentos. Primeiro, o anticorpo CR-57 do vírus da raiva foi adicionado aos reservatórios revestidos com a proteína G do vírus da raiva. Em seguida, 20 os scFvs competidores foram adicionados. Nesta configuração os scFvs antivírus da raiva foram detectados com anti-VSV-HORAP em virtude da presença de um rótulo VSV nas seqüências de aminoácido de scFv (ver a Figura 5).

Exemplo 8

Construção de moléculas de imunoglobulina completamente humana (anticorpos anti-vírus da raiva monoclonais humanos) das Fv’s de cadeia única anti-vírus da raiva selecionados

As regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos scFvs chamadas SC04-001, SC04-008, SC04-018, SC04-040 e SC04-126 foram %

. amplificadas pela PCR usando oligonucleotídeos para anexar sítios de restrição e/ou seqüências para a expressão nos vetores de expressão de IgG pSyn-CO3-HCy 1 (ver a SEQ ID No: 277) e pSyn004-CX (ver a SEQ ID No: 278), respectivamente. Os genes V_H e V_L foram amplificados usando os oligonucleotídeos como mostrado na Tabela 12 e 13, respectivamente e os produtos de PCR foram clonados nos vetores pSyn-CO3-HCy 1 e pSyn-004CX, respectivamente.

As regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos scFvs chamadas SC04-004, SC04-010, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04038,

SC04-060, S004-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04104, S004-108,

SC04-120, SC04-125, SC04-140, SC04-144, SC04-146 e SC04-164 também foram amplificadas com FOR usando oligonucleotídeos para anexar sítios de restrição e/ou seqüências para expressar nos vetores de expressão de IgG pSyn-CO3-HCil e pSyn-005-Cx (ver a SEQ ID No: 279), respectivamente. Os •15 genes Vh e V_L foram amplificados usando os oligonucleotídeos como dados na Tabela 12 e 13, respectivamente e os produtos de PCR foram clonados nos vetores pSyn-CO3-HCil e pSyn-CO5-Ck, respectivamente. Os oligonucleotídeos são planejados tal que eles corrigem quaisquer desvios da seqüência da linha germinativa que tenham sido introduzidos durante a construção da biblioteca, devido ao conjunto limitado de oligonucleotídeos que foram usados para amplificar o repertório grande de genes de anticorpo. As seqüências de nucleotídeo para todas as construções foram verificadas de acordo com técnicas padrão conhecidas pelo técnico habilitado.

As construções de expressão resultantes pgGl04-001C03, pgG104-008C03, pgG104-018C03, pgG104-040C03 e pgG104-126C03 que codificam as cadeias pesadas da IgGI anti-vírus da raiva humanas em combinação com a construção pSyn-004-VX relevante que codifica a cadeia leve correspondente foram transitoriamente expressadas em células 293T e os sobrenadantes contendo anticorpos IgGI foram obtidos. As construções de

expressão pgG104-004C03, pgG104-010C03, pgGl 04-021C03, pgG104026C03, pgGl 04-031C03, pgG104-038C03, pgG104-060C03, pgG104073C03, pgG104-097C03, pgG104-098C03, pgG104-103C03, pgG104104C03, pgG104-108C03, pgG104-120C03, pgG104-125C03, pgG1045 140C03, pgG104-144C03, pgG104-146C03 e pgG104-164C03 que codifica as cadeias pesadas de IgGl anti-vírus da raiva humanas em combinação com a construção pSyn-CO5-Vx relevante que codifica a cadeia leve correspondente foram transitoriamente expressadas em células 293T e os sobrenadantes contendo anticorpos IgGI foram obtidos.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido das cadeias pesada e leve dos anticorpos chamadas CR04-001, CR04-004, CR04-008, 0R04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04-038, CR04-040, CR04060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 e CR04•15 164 foram determinadas de acordo com técnicas padrão. Subsequentemente, os anticorpos monoclonais humanos recombinantes foram purificados em uma coluna de proteína A seguido por uma troca em tampão em uma coluna de dessalinização usando métodos de purificação padrão usado no geral para imunoglobulinas (ver por exemplo, a WO 00/63403 que é aqui incorporada por referência).

Adicionalmente, para CR04-098, um vetor de expressão de IgGI humano único chamado pgG104-098C10 foi gerado como descrito acima para os vetores pgSO57Cl 1 e pgSOJBCl 1 que codificam CR-57 e CRJB, respectivamente (ver o Exemplo 1). As seqüências de nucleotídeo e aminoácido das cadeias pesada e leve de anticorpo CR04-098 codificadas pelo vetor pgG104-098C10 são mostradas na SEQ ID NO: 334 a 337, respectivamente. Os vetores pgSO57Cll (ver o Exemplo 1) e pgGl 04098C10 foram usados para a expressão estável de CR-57 e CR04-098, respectivamente, em células da linhagem de célula depositada na European <7/

Colection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG,

Grã Bretanha em 29 de Fevereiro de 1996 sob o número 96022940 e comercializado sob a marca PER.C6®. O CR-57 e CR04-098 estavelmente produzido têm um ponto isoelétrico calculado de 8,22 e 8,46, respectivamente. Os pontos isoelétricos experimentalmente observados estão entre 8,1 e 8,3 para CR-57 e 9,0 e 9,2 para CR04-098. Os anticorpos monoclonais humanos recombinantes foram purificados como descrito acima. A menos que de outro modo estabelecido, para CR04-001, CR04-004, CR04008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04-038,

CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 e CR04-164 uso foi feito de anticorpos monoclonais humanos recombinantes transitoriamente expressados pelos dois sistema de vetor como descrito acima e para uso de CR57 foi feito de anticorpo monoclonal humano recombinante transitoriamente expressado por um sistema de vetor como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 9

ELISA de competição da proteína G do vírus da raiva com

IgGs

Para averiguar se as IgGs da proteína G anti-vírus da raiva monoclonais humanas se ligam a epítopos que não se sobrepõem, não competidores, experimentos de competição são realizados. Reservatórios revestidos com a proteína G do vírus da raiva são incubados com concentrações crescentes (0 a 50 pg/ml) de IgG da proteína G anti-vírus da raiva não rotulada por 1 hora na temperatura ambiente. Depois, 50 μΐ de uma

IgG anti-vírus da raiva biotinilada diferente (1 pg/ml) são adicionados a cada reservatório, incubados por 5 minutos na temperatura ambiente e imediatamente lavadas cinco vezes com 100 μΐ de PBS/0,05 % de Tween20. Subsequentemente, os reservatórios são incubados por 1 hora na temperatura ambiente com 50 μΐ de uma diluição 1:2000 de estreptavidina-HORAP (Becton Dickinson), lavados e desenvolvidos como descrito acima. Uma diminuição no sinal com concentração crescente de IgG não rotulada indica que os dois anticorpos são competidores entre si e reconhecem o mesmo epítopo ou epítopos que se sobrepõem.

Altemativamente, reservatórios revestidos com a proteína G do vírus da raiva (cepa ERA) foram incubados com 50 pg/ml de IgG da proteína G anti-vírus da raiva na rotulada por 1 hora na temperatura ambiente. Depois, 50 μΐ de CR57 biotinilada (0,5 a 5 μg/ml; em níveis subsaturados) foram adicionados a cada reservatório. As etapas adicionais foram realizadas como descrito acima. Os sinais obtidos foram comparados com os sinais obtidos apenas com CR57 biotinilada (ver a Figura 6; nenhum competidor). A partir da Figura 6 pode ser deduzido que o sinal não seria reduzido com o anticorpo chamado CR02-428 que serviu como um controle negativo. Ao contrário, a competição com CR57 não rotulado (controle positivo) ou CR-JB reduziu o sinal aos níveis de fundo. A partir da Figura 6 pode ser deduzido ainda que nenhuma das IgGs da proteína G anti-vírus da raiva competiram significantemente com CR-57, que está de acordo com os dados de competição de scFv como descrito no Exemplo 7.

Além disso, os experimentos de competição foram realizados na proteína G do vírus da raiva (cepa ERA) transfectada com células PER.C6 por meio da citometria de fluxo. As células transfectadas foram incubadas com 20 μΙ de IgG da proteína G anti-vírus da raiva não rotulado (50 μg/ml) por 20 minutos a 4^o C. Depois da lavagem das células com PBS contendo 1 % de BSA, 20 μΐ de CR57 biotinilado (0,5 a 5 μg/ml; em níveis subsaturados) foram adicionados a cada reservatório, incubados por 5 minutos a 4^o C e imediatamente lavados duas vezes com 100 μΐ de PBS contendo 1 % de BSA. Subsequentemente, os reservatórios foram incubados por 15 minutos a 4^o C com 20 μΐ de uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE (Caltag), lavados e desenvolvidos como descrito acima. O sinal obtido com CR57 biotinilado não pôde ser reduzido significantemente com o anticorpo de controle negativo CR02-428 (ver a Figura 7). Ao contrário, a competição com CR57 não rotulado (controle positivo) ou CR-JB reduziu o sinal aos níveis de fundo.

Nenhuma das IgGs da proteína G anti-vírus da raiva competiu significantemente com CR-57, com a exceção de CR04-126 que reduziu o sinal a aproximadamente 30 % (ver a Figura 7). O último não competiu no ELISA (ver a Figura 6). Isto pode ser causado pela diferença no modo em que a glicoproteína é apresentada ao anticorpo em experimentos FACS comparado aos experimentos de ELISA. A ligação de CR04-126 seria mais dependente da conformação da glicoproteína, resultando no efeito competitivo observado com CR04-I26 no ensaio de competição com base em FACS e não no ensaio de competição com base no ELISA. Adicionalmente, CR04-008 e CR04-010 reduziram o sinal em aproximadamente 50 % (ver a -15 Figura 7) no ensaio de competição com base em FACS indicando que o mesmo poderia competir com CR57. Para CR04-010 isto entretanto não foi confirmado pelos dados de competição de scFv ou no ensaio de competição com base em ELISA. Para as outras IgGs, os dados de FACS estavam de acordo com os respectivos dados de ELISA tanto dos scFvs e quanto das

IgGs.

Exemplo 10

Efeitos aditivos/sinergísticos de IgGs anti-raiva na neutralização in vitro do vírus da raiva (RFFIT modificado)

De modo a determinar se as IgGs da proteína G anti-vírus da raiva têm efeitos aditivos ou sinergísticos na neutralização do vírus da raiva, combinações diferentes das IgGs são testadas. Primeiro, a potência (em IU/mg) de cada anticorpo individual é determinada em um RFFIT modificado (ver o Exemplo 1). Depois, as combinações de anticorpo são preparadas com base em quantidades iguais de IU/mg e testadas no RFFIT modificado. As τι potências de cada combinação de anticorpo podem ser determinadas e comparadas com as potências esperadas. Se a potência da combinação de anticorpo é igual à soma das potências de cada anticorpo individual presente na combinação, os anticorpos têm um efeito aditivo. Se a potência da combinação de anticorpo é mais alta, os anticorpos têm um efeito sinergístico na neutralização do vírus da raiva.

Altemativamente, efeitos aditivos ou sinergísticos podem ser determinados pelo seguinte experimento. Primeiro, a potência dos anticorpos a ser testado, por exemplo, CR-57 e CR04-098, é determinada em um RFFIT padrão (ver Laboratory techniques in rabies, Editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan e H. Koprowski (1996), 4^a edição, Capítulo 15, World Health Organization, Geneva). Depois, os anticorpos são misturados em uma razão de 1:1 com base no IU/ml. Esta mistura de anticorpo, junto com os anticorpos individuais na mesma concentração, é testada em seis experimentos de RFFIT

-15 independentes para determinar o ponto final de neutralização a 50 %. Subsequentemente, o índice de combinação (Cl) é determinado para a mistura de anticorpo usando a formula Cl = (Cl/Cxl) + (C2/Cx2) + (ClC2/CxlCx2) como descrito por Chou et al. (1984). Cl e C2 são as quantidades (em pg) de anticorpo monoclonal 1 e anticorpo monoclonal 2 que levam a neutralização de 50 % quando usados em combinação e Cxl e Cx2 são as quantidades (em pg) de anticorpo monoclonal 1 e anticorpo monoclonal 2 que levam a 50 % de neutralização quando usados sozinhos. Cl = 1, indica um efeito aditivo, Cl < 1 indica um efeito sinergístico e Cl > 1 indica um efeito antagonístico dos anticorpos monoclonais.

Exemplo 11

Identificação de epítopos reconhecidos pelos anticorpos antivírus da raiva recombinantes humanos pelo PEPSCAN-ELISA

Os peptídeos lineares e em alça/cíclicos de 15-mer foram sintetizados a partir do domínio extracelular da proteína G do vírus da raiva

7?

cepa ERA (ver a SEQ ID NO: 207 para a seqüência de aminoácido completa da glicoproteína G do vírus da raiva cepa ERA, o domínio extracelular consiste dos aminoácidos 20 a 458; a id de proteína da glicoproteína do vírus da raiva cepa ERA na base de dados EMBL é J02293) e triados usando cartões mini-PEPSCAN no formato de cartão de crédito (formatos/cartão de

455 peptídeos) como descrito anteriormente (Slootstra et al., 1996; WO 93/09872). Todos os peptídeos foram acetilados no término amino. Em todos os peptídeos em alça a posição 2 e posição 14 foram substituídas por uma cisteína (acetil-XCXXXXXXXXXXXCX-minicartão). Se outras cisteínas além das cisteínas na posição 2 e posição 14 estavam presentes em um peptídeo preparado, as outras cisteínas foram substituídas por uma alanina. Os peptídeos em alça foram sintetizados usando a química de Fmoc padrão e desprotegidos usando ácido trifluórico com descontaminantes. Subsequentemente, os peptídeos desprotegidos foram reagidos nos cartões -15 com uma solução 0,5 mM de l,3-bis(bromometil)benzeno em bicarbonato de amônio (20 mM, pH 7,9/acetonitrila (1:1 (v/v)). Os cartões foram suavemente agitados na solução por 30 a 60 minutos, enquanto completamente cobertos na solução. Finalmente, os cartões foram lavados extensivamente com excesso de H₂O e sonificados em tampão de rompimento contendo 1 % de

SDS/0,1 % de beta-mercaptoetanol em PBS (pH 7,2) a 70° C por 30 minutos, seguido pela sonificação em H₂O por outros 45 minutos. Os anticorpos monoclonais humanos foram preparados como descrito acima. A ligação destes anticorpos a cada peptídeo linear e em alça foi testado em um imuno ensaio ligado a enzima com base em PEPSCAN (ELISA). Os cartões de polipropileno no formato de cartão de crédito de 455 reservatórios, contendo os peptídeos covalentemente ligados, foram incubados com os anticorpos (10 pg/ml; diluídos em solução de bloqueio, que conteve 5 % de soro de cavalo (v/v) e 5 % de ovalbumina (p/v)) (4^o C, durante a noite). Depois da lavagem, os peptídeos foram incubados com anticorpo anti-humano peroxidase

9?

(diluição 1/1000) (1 hora, 25° C) e subsequentemente, depois da lavagem o substrato da peroxidase o sulfonato de 2,2’-azino-di-3-etilbenztiazolina (ABTS) e 2 μΐ/ml de H₂O₂ a 3 % foi adicionado. Os controles (para linear e em alça) foram incubados apenas com anti-anticorpo humano peroxidase.

Depois de 1 hora o desenvolvimento de cor foi medido. O desenvolvimento de cor do ELISA foi quantificado com uma câmara de CCD e um sistema de processamento de imagem. A configuração consistiu de uma câmara de CCD e uma lente de 55 mm (Sony CCD Video Camera XC-77RR, lentes Nikon micro-nikkor 55 mm f/2.8), um adaptador de câmara (Sony Camera adaptor

DC-77RR) e o pacote Optimas da Image Processing Software, versão 6.5 (Media Cybemetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.). Optimas rodou em um sistema de computador pentium II.

Os anticorpos monoclonais da proteína G anti-vírus da raiva b humanos foram testados quanto a ligação aos peptídeos lineares e em 15 alça/cíclicos de 15-mer sintetizados como descrito acima. Um peptídeo é considerado relevantemente ligar a um anticorpo quando os valores OD são iguais a ou mais alto do que duas vezes o valor OD médio de todos os peptídeos (por anticorpo). Ver a Tabela 14 quanto aos resultados da ligação dos anticorpos monoclonais humanos chamados CR57, CRJB e CR04-010 20 aos peptídeos lineares do domínio extracelular da glicoproteína G do vírus da raiva cepa ERA. As regiões que mostram a ligação significante aos respectivos anticorpos são salientados em cinza (ver a Tabela 14).

O anticorpo CR57 ligado aos peptídeos lineares tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 25 SLKGACKLKLCGVLG (SEQ ID NO: 314), LKGACKLKLCGVLGL (SEQ

ID NO: 315), KGACKLKLCGVLGLR (SEQ ID NO: 316),

GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO: 317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO: 318), CKLKLCGVLGLRLMD (SEQ ID NO: 319),

KLKLCGVLGLRLMDG (SEQ ID NO: 320), LKLCGVLGLRLMDGT (SEQ ΐω

ID NO: 321) e KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 322) (ver a Tabela

14). Os peptídeos tendo as seqüências de aminoácido GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO: 317), ACKLKLCVLGLRLM (SEQ ID NO: 318) têm um valor OD que é mais baixos do que duas vezes o valor médio. Não obstante estes peptídeos foram reivindicados, porque eles estão na proximidade imediata de uma região de peptídeos antigênicos reconhecidos pelo anticorpo CR57. A ligação foi mais proeminente ao peptídeo com a seqüência de aminoácido KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 322).

O anticorpo CR04-010 ligado aos peptídeos lineares tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de GFGKAYTIFNKTLME (SEQ ID NO: 323), FGKAYT1FNKTLMEA (SEQ ID NO: 324), GKAYTIFNKTLMEAD (SEQ ID NO: 325),

KAYTIFNKTLMEADA (SEQ ID NO: 326), AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO: 327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO: 328),

-15 TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO: 329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ

ID NO: 330) e FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 331). O peptídeos tendo as seqüências de aminoácido AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO: 327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO: 328) têm um valor OD que é mais baixo do que duas vezes o valor médio. Não obstante estes peptídeos foram reivindicados, porque eles estão na proximidade imediata de uma região de peptídeos antigênicos reconhecidos pelo anticorpo CR04-010. A ligação foi mais proeminente aos peptídeos com a seqüência de aminoácido TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO: 329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO: 330) e FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 331).

CRJB e os anticorpos chamados CR04-040, CR04-098 e

CR04-103 (dados não mostrados) não reconhece uma região de peptídeos antigênicos lineares.

Qualquer um dos peptídeos acima ou partes destes representam bons candidatos de um epítopo neutralizador de vírus da raiva e fíOJ poderíam formar a base para uma vacina ou para incitar anticorpos de neutralização para tratar e/ou prevenir uma infecção pelo vírus da raiva.

SLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 332) e GFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 333) são regiões particularmente interessantes da glicoproteína com base na sua reatividade alta no PEPSCAN.

A partir dos dados de PEPSCAN acima pode ser deduzido ainda que os anticorpos monoclonais humanos chamados CR57 e CR04-010 se ligam a regiões diferentes da proteína G do vírus da raiva indicando que eles reconhecem epítopos não competidores.

Exemplo 12

Determinação da potência neutralizadora das IgGs de proteína G anti-raiva usando um ensaio de neutralização in vitro (RFFIT modificado).

A potência neutralizadora de cada um dos anticorpos • 15 monoclonais humanos produzidos foi determinado em um RFFIT modificado como descrito no Exemplo 1. Dezesseis IgGs neutralizaram a cepa CVS-11 da raiva com uma potência mais alta do que 1000 IU/mg, ao passo que apenas duas IgGs tiveram uma potência mais baixa do que 2 IU/mg (ver as Tabela 15). Oito dos dezesseis anticorpos superam o CR-57 transitoriamente produzido com respeito à potência, sugerindo uma eficiência mais alta na profilaxia na pós exposição ao vírus da raiva do que CR-57. A potência de CR-57 transitoriamente produzido foi aproximadamente 3800 IU/mg de proteína (ver as Tabelas 1 e 15), ao passo que CR-57 estavelmente produzido apresentou uma potência de 5400 IU/mg de proteína (dados não apresentados). De maneira interessante, a maioria dos anticorpos monoclonais humanos neutralizadores identificados contiveram um gene da linha germinativa 3-30 pesado variável (ver Tabela 9).

Com base na afinidade dos anticorpos quanto ao vírus da raiva (dados não mostrados) e ponto final de diluição a 100 % dos anticorpos em

Ο um ensaio de RFFIT modificado (dados não mostrados), um painel de seis IgGs únicos, isto é CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104 e CR04-144, foram escolhidos para desenvolvimento adicional. Dentro deste painel, o anticorpo CR04-098 foi particularmente interessante visto que ele apresentou a potência mais alta, isto é aproximadamente 7300 IU/mg de proteína (ver a Tabela 15). Uma potência similar também foi descoberta para CR04-098 estavelmente produzido (dados não mostrados).

Exemplo 13

Neutralização in vitro de vírus E57 que escapam pelas IgGs anti-vírus da raiva

Para caracterizar ainda mais os novos anticorpos anti-raiva monoclonais humanos a atividade de neutralização das IgGs contra os vírus E57 que escapam foi testada em um RFFIT modificado como descrito acima. A maioria das IgGs anti-vírus da raiva tiveram boa atividade de neutralização - 15 contra todos os seis vírus E57 que escapam (ver a Tabela 16). Ao contrário, CR04-008, CR04-018 e CR04-126 não neutralizam os vírus 6/6, 2/6 e 3/6 E57 que escapam, respectivamente. Nenhuma neutralização significa que nenhum ponto final a 50 % foi atingido em uma diluição de anticorpo de 1:100. CR04-021, CR04-108, CR04-120, CR04-125 e CR04-164 mostraram uma diminuição significante na atividade de neutralização contra vários vírus que escapam. Isto sugere que o epítopo destes anticorpos foi afetado direta ou indiretamente na glicoproteína do vírus de escape E57. Com base no descrito acima diversas IgGs anti-vírus da raiva podem ser compatíveis com CR-57 em um coquetel anti-raiva para a profilaxia no tratamento pós exposição. Em particular, o painel de seis IgGs únicas como identificadas acima, isto é os anticorpos CR04-010, CR04-040, CR04098, CR04-103, CR04-104 e CR04144, apresentaram boa potência de neutralização contra os vírus E57 que escapam sugerindo que o(s) epítopo(s) reconhecido(s) por estes anticorpos não foi/foram afetados pelas mutações de aminoácido induzidas por CR-57. O /03 anticorpo CR04-098 pareceu o mais promissor visto que ele teve uma potência mais alta do que 3000 IU/mg para cada um dos vírus que escapam.

Exemplo 14

Reconhecimento de epítopo de anticorpos anti-raiva CR-57 e

CR04098

Para confirmar que os anticorpos monoclonais humanos chamados CR-57 e CR04-098 reconhecem epítopos que não se sobrepõem, não competidores, os vírus que escapam do anticorpo monoclonal humano chamado CR04-098 foram gerados essencialmente como descrito para os vírus que escapam de CR57 (ver o Exemplo 1). Em resumo, o número de focos por reservatório foi classificado pela imunofluorescência e os meios de reservatórios contendo preferivelmente um foco foram escolhidos para a amplificação de vírus. Todos os vírus E98 que escapam foram gerados a partir . de 1 único foco com a exceção de E98-2 (2 focos) e E98-4 (4 focos). Um « •15 vírus foi definido como uma variante de escape se o índice de neutralização foi <2,5 logs. O índice de neutralização foi determinado subtraindo-se o número de partícula viral infecciosa/ml produzida em culturas de célula BSR infectadas com vírus mais anticorpo monoclonal (~ 4 IU/ml) do número de partícula viral infecciosa/ml produzida em culturas de célula BSR ou MNA infectadas com o vírus sozinho ([log das unidades que forma foco/ml de vírus na ausência de anticorpo monoclonal menos log de ffu/ml de vírus na presença de anticorpo monoclonal]). Um índice mais baixo do que 2,5 logs foi considerado como evidência de escape.

Para investigar ainda mais que CR04-098 se liga a um epítopo diferente que não se sobrepõem, não competidor comparado com CR-57, CR57 foi testado contra o vírus E98 que escapa em um ensaio RFFIT modificado como descrito acima. Como mostrado na Tabela 17, CR-57 teve boa atividade de neutralização contra todos os cinco vírus E98 que escapam. Adicionalmente, os anticorpos CR04-010 e CR04-144 foram testados quanto

HCM a atividade de neutralização contra o vírus E98 que escapam. Ambos os anticorpos não neutralizaram o vírus E98 que escapam (dados não mostrados) sugerindo que o epítopo reconhecido por ambos os anticorpos é direta ou indiretamente afetado pela mutação do aminoácido induzida pelo anticorpo

CR04-098. Os anticorpos CR04-018 e CR04-1.26 foram testados quanto a atividade de neutralização contra apenas um dos vírus E98 que escapam, isto é E984. CR04-018 foi capaz de neutralizar o vírus de escape, enquanto CR04126 apenas teve uma potência de neutralização fraca contra o vírus de escape. Isto sugere que o epítopo reconhecido pelo CR04-018 não é afetado pela mutação induzida pelo anticorpo CR04-098. Adicionalmente, os anticorpos CR04-010, CR04-038, CR04-040, CR04-073, CR04-103, CR04-104, CR04108, CR04-120, CR04-125, CR04-164 não neutralizam E98-4 sugerindo que eles reconhecem o mesmo epítopo como CR04-098 (dados não mostrados).

Para identificar mutações possíveis na glicoproteína da raiva de cada um dos vírus E98 que escapam, a seqüência de nucleotídeo da matriz de leitura aberta (ORF) da glicoproteína foi determinada como descrito antes para os vírus E57 e EJB que escapam. Todos os vírus E98 que escapam mostraram a mutação N para D na posição de aminoácido 336 da glicoproteína da raiva (ver a Figura 8). Esta região da glicoproteína foi definida como os sítios antigênicos III compreendendo dos aminoácidos 330 a

338 (numeração sem peptídeo de sinal). Ao contrário, CR-57 reconheceu um epítopo localizado nos aminoácidos 226 a 231 (numeração sem peptídeo de sinal), que se sobrepõem com o sítio antigênico I. Além da mutação N336D o vírus de escape E98 chamado E98-5 mostrou a mutação H para Q na posição de aminoácido 354 (mudança de códon de CAT para CAG) da glicoproteína da raiva (dados não mostrados).

Além disso, a análise de pepscan da ligação de CR57 aos peptídeos que abrigam um epítopo CR57 mutado (como observados no vírus E57 que escapam) não mostram que a interação de CR57 foi abolido (dados não mostrados). Surpreendentemente, CR04-098 foi ainda capaz de ligação à glicoproteína mutada (que compreende a mutação N336D) expressada em células PER.C6®, como medida pela citometria de fluxo (dados não mostrados), embora os vírus contendo esta mutação não foram mais 5 neutralizados.

Além disso, os estudos de mapeamento de epítopo e estudos de classificação de afinidade foram realizadas usando a análise de ressonância de plasma de superfície usando um sistema analítico BIAcore3000®. A glicoproteína da raiva purificada (cepa ERA) foi imobilizada como um 10 ligando em um chip sensor (Fc) de 4 canais de fluxo CM5 grau de pesquisa (Biacore AB, Suécia) usando a ligação de amina. A classificação da ligação foi realizada a 2,5° C com HBS-EP (Biacore AB, Suécia) como tampão de condução. 50 μΐ de cada anticorpo foram injetados em uma taxa de fluxo constante de 20 μΐ/min. Depois, o tampão de condução foi aplicado por 750 15 segundos seguido pela regeneração do chip CM5 com 5 μΐ de NaOH 2 M, 5 μΐ de HCI 45 mM e 5 μΐ de NaOH 2 mM. Os sinais de ressonância expressados como unidades de ressonância (RU) foram plotados como uma função do tempo e o aumento e a diminuição em RU como uma medida da associação e dissociação, respectivamente, foram determinados e usados para 20 a classificação dos anticorpos. Os valores de K.D reais para CR57 e CR04-098 como determinado pela análise de ressonância de plasma de superfície foram 2,4 nM e 4,5 nM, respectivamente. Os estudos de mapeamento de epítopo ainda confirmou que CR57 e CR04098 se ligam a epítopos diferentes na glicoproteína contra a raiva. A injeção de CR57 resultou em uma resposta de 25 58 RU (dados não mostrados). Depois da injeção de CR04-098 um aumento adicional no nível de resposta (24 RU) foi obtido, sugerindo que os sítios de ligação para CR04-098 não foram ocupados (dados não mostrados). Resultados similares foram observados quando a ordem reversa foi aplicada mostrando que cada anticorpo atingiu níveis de RU similares independente da toG ordem de injeção (dados não mostrados). Estes resultados ainda demonstram que CR57 e CR04-098 podem ligar-se simultaneamente e reconhecer epítopos diferentes na glicoproteína do vírus da raiva.

Além de tudo, os dados acima confirmam ainda que os anticorpos CR-57 e CR04-098 reconhecem epítopos distintos que não se sobrepõem, isto é epítopos nos sítios I e III antigênicos, respectivamente. Os dados estão em boa concordância com os dados de competição de ELISA/FACS indicando que CR-57 e CR04-098 não competem para a ligação a ERA G e a boa atividade de neutralização de anticorpo CR04-098 contra todos os vírus E57 que escapam. Com base nestes resultados e no fato de que a exposição in vitro de vírus da raiva à combinação de CR57 e CR04098 (seleção na presença de 4 IU/ml de cada anticorpo) não produziu vírus que escapam (dados não mostrados), foi concluído que os anticorpos CR-57 e CR04-098 reconhecem epítopos que não se sobrepõem, não competidores e podem ser vantajosamente usados em um coquetel de anticorpo anti-vírus da raiva para o tratamento de profilaxia na pós exposição.

Exemplo 15

Avaliação da conservação do epítopo reconhecido pelo CR57 e CR04-090

A região de ligação mínima de CR-57 (aminoácidos KLCGVL dentro da SEQ ID NO: 332, a região da glicoproteína de vírus da raiva reconhecida pelo CR57 como determinado por meio da tecnologia de PEPSCAN e varredura de alanina) foi alinhada com seqüências de nucleotídeo de 229 isolados do vírus da raiva genótipo 1 para avaliar a conservação do epítopo (ver a Tabela 18). O conjunto de amostra conteve isolados humanos, isolados de morcego e isolados de caninos ou de animais domésticos mais provavelmente mordidos pelos caninos hidrófobos. A análise de freqüência dos aminoácidos em cada posição dentro da região de ligação mínima revelou que os resíduos críticos que constituem o epítopo foram

100 /ύ>7 altamente conservados. A lisina na posição um foi conservada em 99,6 % dos isolados, enquanto apenas em 1/229 isolados uma mutação K>R conservativa foi observada. As posições dois e três (L e C) foram completamente conservadas. Acredita-se que o resíduo de cisteína central esteja estruturalmente envolvido na dobra da glicoproteína e seja conservado entre todos os lyssaviruses (ver Badrane e Tordo, 2001). A glicina na posição quatro foi conservada em 98,7 % dos isolados, enquanto em 3/229 dos isolados as mutações com respeito aos aminoácidos carregados (G>R em 1/229; G>E em 2/229) foram observadas. A quinta posição também foi conservada com a exceção de um isolado onde uma mutação V>I conservativa foi observada. Na sexta posição, que não é um resíduo crítico como determinado por uma varredura de substituição de alanina, heterogeneidade significante foi observada nos isolados streef. L em 70,7 %, P em 26,7 % e S em 2,6 % das cepas, respectivamente. Quando juntos, aproximadamente 99 por cento dos vírus da raiva que podem ser encontrados são prognosticados ser reconhecidos pelo anticorpo CR-57.

123 destes 229 isolados virais foram analisados quanto a presença de mutações tanto no epítopo CR-57 quanto no CR04-098. Nenhum destes 123 vírus street não conteve mutações em ambos os epítopos. A mutação N>D como observada nos vírus E98 que escapam estava presente em apenas cinco isolados virais. Estes vírus foram geograficamente distintos e r

isolados de animais na África (ver a Figura 9 quanto a árvore filogenética; os cinco isolados virais, isto é AF325483, AF325482, AF325481, AF325480 e AF325485, são indicados em negrito). A análise filogenética de seqüências de glicoproteína revelaram que os vírus da raiva com epítopos CR57 mutados são apenas distantemente relacionados com os vírus da raiva que portam um epítopo CR04-098 mutados. Portanto, a probabilidade de encontrar um vírus da raiva resistente à neutralização por um coquetel de CR-57 e CR04-098 é virtualmente ausente.

/02

101

Tabela I: Potência de Neutralização de CR-57 e CR-JB contra vírus do tipo selvagem e que escapam.

Vírus	potência CR-57 (IU/mg)	potência CR-JB (IU/mg)	Vírus	potência CR-57 (IU/mg)	potência CR-JB (IU/mg)
CVS-11	3797	605	cvs-ii	3797	605

Ε57Ά2	0	<0.2	EJB2B	0.004	0.6
E57A3	0	419	EJB2C	<0.004	2
E57B1	0	93	EJB2D	<0.004	3
E57B2	0	<0.3	EJB2E	<0.2	<0.3
E57B3	0	419	EJB2F	<0.06	3
E57C3	0	31	EJB3F	<0.04	0.06

/0?

102

Tabela 2: Iniciadores da região variável da cadeia lambda humana (sentido).

Nome do Iniciador	Seqüência de nucleotídeo do iniciador	SEQ ID NO
HuVXIA	5' -CAGTCTGTGCTGACT CAGCCACC-3'	SEQ ID NO:208
HuVXlB	5'-CAGTCTGTGYTGACG CAGCCGCC-3'	SEQ ID NO:209
HuVÀlC	5'-CAGTCTGTCGTGACG CAGCCGCC-3'	SEQ ID NO:210
HuVÀ2	5'-CARTCTGCCCTGACT CAGCCT-3'	SEQ ID NO:211
HuVA3A	5'-TCCTATGWGCTGACT CAGCCACC-3'	SEQ ID NO:212
HUVX3B	5'-TCTTCTGAGCTGACT CAGGACCC-3'	SEQ ID NO:213
HuVA4	5'-CACGTTATACTGACT CAACCGCC-3'	SEQ ID NO:214
HuVX5	5'-CAGGCTGTGCTGACT CAGCCGTC-3'	SEQ ID NO:215
HuVA6	5'-AATTTTATGCTGACT CAGCCCCA-3'	SEQ ID NO:216
HUVX7/8	5'-CAGRCTGTGGTGACY CAGGAGCC-3'	SEQ ID NO:217
HUVX9	5'-CWGCCTGTGCTGACT CAGCCMCC-3'	SEQ ID NO:218

no

103

Tabela 3: Iniciadores da regiào variável de cadeia capa humana (sentido).

Nome do Iniciador	Seqüência de nucleotídeo do iniciador	SEQ ID NO
HuVkIB	5'-GACATCCAGWTGACCC AGTCTCC-3'	SEQ ID NO:219
HuVk2	5'-GATGTTGTGATGACT CAGTCTCC-3'	SEQ ID NO:220
HuVk3	5'-GAAATTGTGWTGACR CAGTCTCC-3'	SEQ ID NO:221
HuVk4	5'-GATATTGTGATGACC CACACTCC-3'	SEQ ID NO:222
HuVk5	5'-GAAACGACACTCACG CAGTCTCC-3'	SEQ ID NO:223
HuVk6	5'-GAAATTGTGCTGACTC AGTCTCC-3'	SEQ ID NO:224

104

Tabela 4: Iniciadores da região variável de cadeia capa humano estendidos com sítios de restrição Sall (sentido), iniciadores da região J da cadeia capa humana estendida com sítios de restrição Notl (antisentido), iniciadores da região variável de cadeia lambda humana estendida 5 com sítios de restrição Sall (sentido) e iniciadores da região J da cadeia lambda humana estendido com sítios de restrição Notl (anti-sentido).

Nome do Iniciador	Seqüência de nucleotídeo do iniciador	SEQ ID NO
HuVKlB-SalI	5' -TGAGCACACAGGTCG ACGGACATCCAGWTGACC CAGTCTCC-3'	SEQ ID NO:225
HuVK2-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCG ACGGATGTTGTGATGACT CAGTCTCC-3'	SEQ ID NO:226
HuVK3B-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCG ACGGAAATTGTGWTGACR CAGTCTCC-3'	SEQ ID NO:227
HuVK4B-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCG ACGGATATTGTGATGACC CACACTCC-3'	SEQ ID NO:228
HuVK5-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCGACG GAAACGACACTCACGCAGTCT CC-3'	SEQ ID NO:229
HuVK6-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCG ACGGAAATTGTGCTGACT CAGTCTCC-3'	SEQ ID NO:230
HuJKl-Notl	5'-GAGTCATTCTCGACTTGC GGCCGCACGTTTGATTTCCAC CTTGGTCCC-3'	SEQ ID NO:231
HuJx2-NotI	5'-GAGTCATTCTCGACT	SEQ ID NO:232

H-Z,

105

	TGCGGCCGCACGTTTGAT CTCCAGCTTGGTCCC-3'
HuJK3-NotI	5'-GAGTCATTCTCGACTTGC GGCCGCACGTTTGATATCCAC TTTGGTCCC-3'	SEQ ID NO:233
HuJx4-NotI	5'-GAGTCATTCTCGACT TGCGGCCGCACGTTTGAT CTCCACCTTGGTCCC-3'	SEQ ID NO:234
HuJx5-NotI	5'-GAGTCATTCTCGACTTGC GGCCGCACGTTTAATCTCCAG TCGTGTCCC-3'.	SEQ ID NO:235
HuVÀlA-SalI	5’-TGAGCACACAGGTCGACG CAGTCTGTGCTGACTCAGCCA CC-3'	SEQ ID NO:236
HuVÀlB-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCGACG CAGTCTGTGYTGACGCAGCCG CC-3'	SEQ ID NO:237
HuVAlC-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCGACG CAGTCTGTCGTGACGCAGCCG CC-3'	SEQ ID NO:238
HuVÀ2-SalI	5' -TGAGCACACAGGTCGACG CARTCTGCCCTGACTCAGCCT- 3'	SEQ ID NO:239
HuVA3A-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCGACG TCCTATGWGCTGACTCAGCCA CC-3'	SEQ ID NO:240
HuVÀ3B-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCGACG TCTTCTGAGCTGACTCAGGAC CC-3'	SEQ ID NO:241
HuVÀ4-SalI	5' -TGAGCACACAGGTCGACG CACGTTATACTGACTCAACCG	SEQ ID NO:242

106

	CC-3'
HuVÀ5-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCGACG CAGGCTGTGCTGACTCAGCCG TC-3'	SEQ ID NO:243
HuVXÉ-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCGACG AATTTTATGCTGACTCAGCCC CA-3'	SEQ ID NO:244
HuVX7/8-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCGACG CAGRCTGTGGTGACYCAGGAG CC-3'	SEQ ID NO:245
HuVX9-SalI	5'-TGAGCACACAGGTCGACG CWGCCTGTGCTGACTCAGCCM CC-3'	SEQ ID NO:246
HuJÀl-Notl	5'-GAGTCATTCTCGACTTGC GGCCGCACCTAGGACGGTGAC CTTGGTCCC-3'	SEQ ID NO:247
HuJX2/3-NotI	5'-GAGTCATTCTCGACTTGC GGCCGCACCTAGGACGGTCAG CTTGGTCCC-3'	SEQ ID NO:248 y
HuJX4/5-NotI	5'-GAGTCATTCTCGACTTGC GGCCGCACYTAAAACGGTGAG CTGGGTCCC-3'	SEQ ID NO:249

Tabela 5: Distribuição dos produtos de cadeia leve diferente nas 10 frações.

107

Produtos da cadeia leve	Número de alelos	Número de fração	Alelos/fração
VklB/Jkl-5	19	1 and 2	9.5
Vk2/Jkl-5	9	3	9
Vk3B/Jkl-5	7	4	7
Vk4B/Jkl-5	1
Vk5/Jkl-5	1	5	5
Vk6/Jkl-5	3
VÀ1A/J11-3
VA1B/J11-3	5	6	5
VÀlC/Jll-3		•
VX2/J11-3	5	7	5
VA3A/J11-3	9	8	9
VX3B/J11-3
VA4/J11-3	3
VX5/J11-3	1”	9	5
VA6/J11-3	1
Và7/8/J11-3	3	10	6
VA9/J11-3	3

Tabela 6: Iniciadores da região variável de cadeia pesada de IgG humana (sentido).

108

Nome do Iniciador	Seqüência de nucleoúdeo do iniciador	SEQ ID NO
HUVH1B/7A	5' -CAGRTGCAGCTGGTG CARTCTGG-3'	SEQ ID NO:250
HuVHlC	5'-SAGGTCCAGCTGGTR CAGTCTGG-3'	SEQ ID NO:251
HUVH2B	5' -SAGGTGCAGCTGGTG GAGTCTGG-3^Z	SEQ ID NO:252
HUVH3B	5 ' -SAGGTGCAGCTGGTG GAGTCTGG-3 ’	SEQ ID NO:253
HuVH3C	5'-GAGGTGCAGCTGGTG GAGWCYGG-3'	SEQ ID NO:254
HuVH4B	5' -CAGGTGCAGCTACAG CAGTGGGG-3'	SEQ ID NO:255
HuVH4C	5' -CAGSTGCAGCTGCAG GAGTCSGG-3'	SEQ ID NO:256
HuVH5B	5·-GARGTGCAGCTGGTG CAGTCTGG-3'	SEQ ID NO:257
HuVH6A	5 · -CAGGTACAGCTGCAG CAGTCAGG-3'	SEQ ID NO:258

Tabela 7: Iniciadores da região variável de cadeia pesada da IgG humana estendidos com sítios de restrição Sfil/Ncol (sentido) e iniciadores da região J da cadeia pesada da IgG humana estendida com sítios de restrição Xhol/BstEII (anti-sentido).

109

Nome do Iniciador	Seqüência de nucleotídeo do iniciador	SEQ ID NO
HuVHlB/7A-SfiI	5’-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGRTGCAGCTGGTGCAR TCTGG-3'	SEQ ID NO:259
HuVHIC-Sfil	5’-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC SAGGTCCAGCTGGTRCAG TCTGG-3'	SEQ ID NO:260
HuVH2B-SfiI	5'-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGRTCACCTTGAAGGAG TCTGG-3’	SEQ ID NO:261
HuVH3B-SfiI	5'-GTCCTCGCAACTGCGGCC CAGCCGGCCATGGCCSAGGTG CAGCTGGTGGAGTCTGG-3'	SEQ ID NO:262
HuVH3C-SfiI	5'-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGGAG WCYGG-3’	SEQ ID NO:263
HuVH4B-SfiI	5’-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTACAGCAG TGGGG-3’	SEQ ID NO:264
HuVH4C-SfÍI	5'-GTCCTCGCAACTGCGGCC CAGCCGGCCATGGCCCAGSTG	SEQ ID NO:265

7/7

110

	CAGCTGCAGGAGTCSGG-3’
HuVH5B-SfiI	5 ’ -GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC GARGTGCAGCTGGTGCAG TCTGG-3'	SEQ ID NO:266
HuVH6A-SfiI	5 ’ -GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTACAGCTGCAGCAG TCAGG-3’	SEQ ID NO:267
HuJHl/2-XhoI	5'-GAGTCATTCTCGACTCGA GACGGTGACCAGGGTGCC-3'	SEQ ID NO:268
HuJH3-XhoI	5'-GAGTCATTCTCGACT CGAGACGGTGACCATTGT CCC-3'	SEQ ID NO:269
HuJH4/5-XhoI	5'-GAGTCATTCTCGACT CGAGACGGTGACCAGGGT TCC-3'	SEQ ID NO:270
HuJH6-XhoI	5'-GAGTCATTCTCGACTCGA GACGGTGACCGTGGTCCC-3'	> SEQ ID NO:271

Tabela 8: Ligação de anticorpos de fago de cadeia única (scFv) à proteína G do vírus da raiva (cepa ERA) e a FBS como medida pelo ELISA.

111

Nome do anticorpo de fago	Proteína G do vírus da raiva (OD492nm)	FBS (OD492nm)
SC04-001	0.828	0.053
SC04-004	0.550	0.054
SC04-008	0.582	0.058
SC04-010	0.915	0.043
SC04-018	0.247	0.052
SC04-021	0.278	0.052
SC04-026	0.212	0.054
SC04-031	0.721	0.065
SC04-038	0.653	0.061
SC04-040	0.740	0.053
SC04-060	0.923	0.056
SC04-073	0.657	0.054
SCÜ4-097	0.835	0.056
SC04-098	0.798	0.060
SC04-103	0.606	0.059
SC04-104	0.566	0.063
SC04-108	0.363	0.052
SC04-120	0.571	0.052
SC04-125	0.735	0.049
SC04-126	0.232	0.051
SC04-140	0.865	0.057
SC04-144	0.775	0.054
SC04-146	0.484	0.057
SC04-164	0.547	0.057
control (SO57)	0.650	0.055
control (02-007)	0.063	0.052

controle /(9

112

Tabela 9: Dados das Fv’s de cadeia única capazes de ligação à proteína G do vírus da raiva.

Nome scFv (libr.)	SEQ ID NO: da seqüência de nucleotídeo	SEQ ID NO: da seqüência de aminoácido	HCDR3 (SEQ ID Ν0;)	local - V_B	local -Vj,
sc04-001 (JK1994)	157	158	GLYGELFDY (SEQ ID NO:1)	3-20 (DP32)	V13 (31 - V2-13)
sc04-004 (WT2000)	159	160	DYLYPTTDFDY (SEQ ID N0:2)	3-23 (DP47)	Vkl (012/02 DPK9)
sc04-008 (RAB-03G01)	161	162	MGFTGTYFDY (SEQ ID NO:3)	2-70 (DP28)	V13 (3h - V2-14)
SC04-010 (RAB-03G01)	163	164	DGLDLTGTIQPFGY (SEQ ID NO:4)	3-30 (DP49)	Vkl (Lll - DPK3)
SC04-018 (RAB-03G01)	165	166	VSVTTGAFNI (SEQ ID NO:5)	4-04 (DP70)	Vil (lc - VI—16)
SC04-021 (RAB-03G01)	167	168	GSVLGDAFDI (SEQ ID NO:6)	3-30 (DP49)	Vkl (L8)
SC04-026 (RAB-03G01)	169	170	TSNWNYLDRFDP (SEQ ID N0:7)	5-51 (DP73)	Vkll (Al9/03 DPK15)
sc04-031 (RAB-03G01)	171	172	GSVLGDAFDI (SEQ ID NO:8)	3-30 (DP49)	Vkl (L5 - DPK5)
sc04-038 (RÀB-03G01)	173	174	GSVLGDAFDI (SEQ ID NO:9)	3-30 (DP49)	Vkl (L5 - DPK5)
sc04-040 (RAB-03G01)	175	176	GSKVGDFDY (SEQ ID NO:10)	3-30 (DP49)	V13 (3h - V2-14)
sc04-060 (RAB-04G01)	177	178	EKEKYSDRSGYSYY YYYMDV (SEQ ID NO:11)	4-59 (DP71)	Vkl (012/02 DPK9)
SC04-073 (RAB-04G01)	179	180	DGLDLTGTIQPFGY (SEQ ID NO:12)	3-30 (DP49)	Vkl (L12)
sc04-097 (RAB-04G01)	181	182	TASNLGRGGMDV (SEQ ID NO:13)	3-23 (DP47)	Vkl (L8)
SC04-098 (RAB-04G01)	183	184	VAVAGTHFDY (SEQ ID NO:14)	3-30 (DP49)	Vkl (A30)
sc04-103 (RAB-04G01)	185	186	VAVAGESFDS (SEQ ID NO:15)	3-30 (DP49)	Vkl (L5 - DPK5)

113

3C04-104 (RAB-04G01)	187	188	IWVTALDAFDI (SEQ ID NO:16)	3-30 (DP49)	Vkl (L12)
SC04-108 (RAB-04G01)	189	190	FMIVADDAFDI (SEQ ID NO:17)	3-30 (DP49)	Vkl (LI)
SC04-120 (RAB-04G01)	191	192	GGKTGEFDY (SEQ ID NO:18)	3-30 (DP49)	Vkl (L8)
SC04-125 (RAB-04G01)	193	194	IATAGTGFDY (SEQ ID NO:19)	3-30 (DP49)	Vkl (L8)
SC04-126 (RAB-04G01)	195	196	MGFTGTYFDY (SEQ ID NO:20)	2-70 (DP28)	V13 (3h - V2-14)
sc04-140 (RAB-04G01)	197	198	VTNPGDAFDI (SEQ ID NO:21)	3-30 (DP49)	Vkl (L4/18a)
sc04-144 (RAB-04GO1)	199	200	GGKTGEFDY (SEQ ID NO:22)	3-30 (DP49)	Vkl (L8)
SC04-146 (RAB-04GO1)	201	202	GGKTGEFDY (SEQ ID NO:23)	3-30 (DP49)	VklII (L2 - DPK21)
SC04-164 (RAB-04G01)	203	204	GSVLGDAFDI (SEQ ID NO:24)	3-30 (DP49)	Vkl (LI9 - DPK6)
SO57	205	206	ENLDNSGTYYYFSG WFDP (SEQ ID NO:25)	1-69 (DP10)	V12 (2e - VI-3)
SOJB	312	313	RQHISSFPWFDS (SEQ ID NO:276)	2-05	V13 (3h - V2-14)

Tabela 10: Dados de ensaio quanto a atividade neutralizadora do vírus da raiva de scFvs.

114

Nome scFv	Diluição do ponto final em 50 %	Diluição do ponto final em 50 % WHO padrão (2 IU/ml)	Potência (Iü/ml)
SC04-001	270	405	1.3
SC04-004	3645	405	18
SC04-008	>10935	405	>54
SC04-010	810	405	4
SC04-018	15	405	0.1
SC04-021	270	405	1.3
SC04-026	45	270	0.3
SC04-031	90	270	0.7
SC04-038	270	270	2
SC04-040	45	270	0.3
SC04-060	30	270	0.2
SC04-073	405	270	3
SC04-097	30	270	0.2
SC04-098	1215	270	9
SC04-103	45	270	0.3
SC04-104	135	270	1
SC04-108	135	270	1
SC04-120	810	270	6
SC04-125	405	270	3
SC04-126	10	270	0.1
SC04-140	135	270	1
SC04-144	810	270	6
SC04-146	405	270	3
SC04-164	45	270	0.3

Tabela 11A: Dados de ensaio para medir a atividade de neutralização de scFvs para os vírus E57 que escapam E57A2, E57A3 e E57B1.

115

Nome scFv	E57A2	E57A3	E57B1
	1*	2*	3*	1*	2*	3*	1*	2*	3*
SC04-001	10	90	0.2	10	90	0.2	30	45	1.3
SC04-004	810	90	18.0	1215	90	27.0	810	45	36.0
SC04-008	10	90	0.2	15	90	0.3	270	45	12.0
SC04-010	270	90	6.0	270	90	6.0	270	45	12.0
SC04-018	5	90	0.1	15	90	0.3	15	45	0.7
SC04-021	10	90	0.2	30	90	0.7	10	90	0.2
SC04-026	<5	90	0.0	<5	45	0.0	<5	90	0.0
SC04-031	10	90	0.2	30	90	0.7	10	90	0.2
SC04-038	90	90	2.0	90	90	2.0	45	90	1.0
SC04-040	15	90	0.3	5	90	0.1	5	90	0.1
SC04-060	5	90	0.1	5	90	0.1	<5	90	0.0
SC04-073	135	90	3.0	90	30	6.0	30	30	2.0
SC04-097	<5	90	0.0	<5	90	0.0	<5	90	0.0
SC04-098	810	90	18.0	270	30	18.0	270	30	18.0
SC04-103	<5	90	0.0	10	90	0.2	5	90	0.1
SC04-104	90	90	2.0	30	30	2.0	30	30	2.0
SC04-108	15	90	0.3	<5	90	0.0	<5	90	0.0
SC04-120	45	90	1.0	30	30	2.0	10	30	0.7
SC04-125	135	90	3.0	135	30	9.0	90	30	6.0
SC04-126	<5	90	0.0	<5	45	0.0	<5	90	0.0
SC04-140	30	45	1.3	90	30	6.0	45	90	1.0
SC04-144	270	45	12.0	270	30	18.0	135	90	3.0
SC04-146	90	45	4.0	90	30	6.0	90	90	2.0
SC04-164	15	45	0.7	30	30	2.0	15	90	0.3

1* é diluição de ponto final em 50 %

2* é diluição de ponto final em 50 % WHO padrão (2 IU/ml)

3* é Potência (IU/ml)

Tabela 11B: Dados de ensaio para medir a atividade de neutralização de scFvs para os vírus E57 que escapam E57B2, E57B3 e E57C3.

116 ibò

Nome scFv	E57B2	E57B3	E57C3
	1*	2*	3*	1*	2*	3*	1*	2*	3*
SC04-001	30	45	1.3	90	270	0.7	5	90	0.1
SC04-004	5	45	0.2	2430	270	18.0	270	90	6.0
SC04-008	5	45	0.2	45	270	0.3	10	90	0.2
SC04-010	45	45	2.0	405	270	3.0	270	90	6.0
SC04-018	15	45	0.7	15	270	0.1	30	90	0.7
SC04-021	10	90	0.2	30	270	0.2	10	90	0.2
SC04-026	<5	45	0.0	<5	45	0.0	<5	30	0.0
SC04-031	10	90	0.2	30	270	0.2	30	90	0.7
SC04-038	30	90	0.7	90	270	0.7	90	90	2.0
SC04-040	5	90	0.1	15	135	0.2	10	90	0.2
SC04-060	<5	90	0.0	10	135	0.1	5	90	0.1
SC04-073	30	90	0.7	90	270	0.7	90	90	2.0
SC04-097	<5	90	0.0	<5	135	0.0	<5	90	0.0
SC04—098	90	90	2.0	810	270	6.0	270	90	6.0
SC04-103	<5	90	0.0	10	135	0.1	10	90	0.2
SC04-104	45	90	1.0	45	270	0.3	90	90	2.0
SC04-108	10	90	0.2	<5	135	0.0	15	90	0.3
SC04-120	15	90	0.3	45	270	0.3	30	90	0.7
SC04-125	90	90	2.0	270	270	2.0	270	90	6.0
SC04-126	<5	45	0.0	<5	45	0.0	<5	30	0.0
SC04-140	30	90	0.7	90	90	2.0	270	90	6.0
SC04-144	90	90	2.0	270	90	6.0	405	90	9.0
SC04-146	30	90	0.7	90	90	2.0	90	90	2.0
SC04-164	15	90	0.3	15	90	0.3	30	90	0.7

* é diluição de ponto final em 50 %

2* é diluição de ponto final em 50 % WHO padrão (2 IU/ml)

3* é Potência (IU/ml)

Tabela 12: Oligonucleotídeos usados para a amplificação pela

PCR de genes Vh.

117

Nome e seqüência de nucleotídeo	Gene Vh	SEQ ID NO:
5H-B: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagct ggtggagtctg	SC04-001	280
5H-C: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagct ggtggagtctgg	SC04-021 SC04-031 SC04-125 SC04-164	281
5H-C-longo: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagct ggtggagtctgggg	SC04-010 SC04-038 SC04-040 SC04-073 SC04-098 SC04-103 SC04-104 5004-108 SC04-120 SC04-140 SC04-144 SC04-146	282
5H-F: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagct gcaggagtccggccc	SC04-018 SC04-060	283
5H-H: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagct ggtgcagt ctgg	SC04-026	284
5H-I: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagct gctggagtctgg	SC04-004 SC04-097	285

118

5H-M: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgacctt gaaggagtctgg	SC04-008 SC04-126	286
sy3H-A: gcccttggtgctagcgctggagacggtcaccaggg tgccctggcccc	SC04-001 SC04-004 SC04-008 SC04-010 SC04-026 SC04-040 SC04-073 SC04-098 SC04-120 SC04-125 SC04-126 SC04-144 SC04-146	287
sy3H-C: gcccttggtgctagcgctggagacggtcacggtgg tgccctggcccc	SC04-097	288
3y3H-C-long: gcccttggtgctagcgctggagacggtcacggtgg tgcccttgccccagacgtc	SC04-060	289
sy3H-D: gcccttggtgctagcgctggacacggtcaccatgg tgccctggcccc	SC04-018 SC04-021 SC04-031 SC04-038 SC04-104 SC04-108 SC04-140 SC04-164	290
sy3H-E:	SC04-103	291

gcccttggtgctagcgctggacacggtcaccaggg tgccccggcccc

Tabela 13: Oligonucleotídeos usados para a amplificação pela PCR de genes V_L.

119

Nome e seqüência de nucleotídeo	V_L gene	SEQ ID NO:
3L-B: ttttccttagcggccgcgactcacctaggacggtc agcttggtc	SC04-001	292
5K-B: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagat gacccagtc	SC04-031 SC04-060 SC04-073 SC04-098 SC04-103 SC04-104 SC04-108 SC04-164	293
5K-C: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagat gacccagtctccatcctccc	SC04-004	294
5K-G: acctgtctcgagttttccatggctgacatcgtgat gacccagtctcc	SC04-026	295
5K-K: acctgtctcgagttttccatggctgccatccagat gacccagtctcc	SC04-010	296
5K-M: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagct gacccagtc	SC04-021 SC04-097 SC04-120 SC04-125 SC04-144	297
5K-N: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagat gactcagtc	SC04-038	298

120

5Κ-Ο: acctgtctcgagttttccatggctgccatccagct gacccagtc	SC04-140	299
5K-Q: acctgtctcgagttttccatggctgagatcgtgat gactcagtc	SC04-146	300
5L-E: acctgtctcgagttttccatggcttcctacgtgct gactcagccg	SC04-008	301
5L-F: acctgtctcgagttttccatggctcagtccgtgct gactcagcc	SCO4-O18	302
5L-G: acctgtctcgagttttccatggcttcctacgtgct gactcagcc	SC04-040 SC04-126	303
sy3K-F: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccacct tggtccc	SC04-004 SC04-010 SC04-021 SC04-031 SC04-098 SC04-104 SC04-125 SC04-140 SC04-144 SC04-164	304
sy3K-I: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccagcc gtgtccc	SC04-038 SC04-097 SC04-103 SC04-108 SC04-146	305
sy3K-J:	SC04-026	306

121

gctgggggcggccacggtccgcttgatctccagct tggtccc	SC04-060 SC04-073
sy3K-K: gctgggggcggccacggtccgcttgatgtccacct tggtccc	SC04-120	307
sy3L-A: ccagcacggtaagcttcagcacggtcaccttggtg ccagttcc	SC04-018 SC04-126	308
sy3L-C: ccagcacggtaagcttcagcacggtcagcttggtg cctccgcc	SC04-040	309
sy3L-D: ccagcacggtaagcttcaacacggtcagctgggtc cc	SC04-008	310
sy5L-A: acctgtctcgagttttccatggcttcctccgagct gacccaggaccctgctg	SC04-001	311

Tabela 14: Ligação dos anticorpos monoclonais humanos

CR57, CRJB e CR04-010 (10 pg/ml) aos peptídeos lineares do domínio extracelular de glicoproteína G da cepa ERA do vírus da raiva.

122

seqüência de aminoácido do peptídeo linear	CR57	CRJB	CR04-010
KFPIYTILDKLGPWS	71	97	1
FPIYTILDKLGPWSP	42	105	39
PIYTILDKLGPWSPI	36	89	87
IYTILDKLGPWSPID	44	97	104
YTILDKLGPWSPIDI	48	114	91
TILDKLGPWSPIDIH	76	96	88
ILDKLGPWSPIDIHH	54	104	69
LDKLGPWSPIDIHHL	55	99	107
DKLGPWSPIDIHHLS	62	103	93
KLGPWSPIDIHHLSC	72	105	45
LGPWSPIDIHHLSCP	69	112	19
GPWSPIDIHHLSCPN	68	114	33
PWSPIDIHHLSCPNN	62	104	47
WSPIDIHHLSCPNNL	80	106	11
SPIDIHHLSCPNNLV	74	85	1
PIDIHHLSCPNNLW	46	93	90
IDIHHLSCPNNLWE	69	102	55
DIHHLSCPNNLWED	38	96	78
IHHLSCPNNLWEDE	37	85	113
HHLS CPNNLWEDEG	56	76	117
HLSCPNNLWEDEGC	65	119	111
LSC PNNLWEDEGCT	69	117	127
SCPNNLWEDEGCTN	83	114	91
CPNNLWEDEGCTNL	77	97	49
PNNLWEDEGCTNLS	78	107	97
MNLWEDEGCTNLSG	72	99	97
NLWEDEGCTNLSGF	75	119	55
LWEDEGCTNLSGFS	76	103	52
WEDEGCTNLSGFSY	73	107	91
VEDEGCTNLSGFSYM	74	103	31
EDEGCTNLSGFSYME	54	90	7
DEGCTNLSGFSYMEL	1	23	1
EGCTNLSGFSYMELK	51	114	129
GCTNLSGFSYMELKV	55	114	118
CTNLSGFSYMELKVG	47	110	137
TNLSGFSYMELKVGY	43	106	161
NLSGFSYMELKVGYI	61	115	170
LSGFSYMELKVGYIL	71	132	169

123 !όθ

SGFSYMELKVGYILA	79	132	161
GFSYMELKVGYILAI	65	111	141
FSYMELKVGYILAIK	89	112	192
SYMELKVGYILAIKM	65	123	152
YMELKVGYILAIKMN	78	114	150
MELKVGYILAIKMNG	76	141	107
ELKVGYILAIKMNGF	87	132	76
LKVGYILAIKMNGFT	78	112	118
KVGYILAIKMNGFTC	78	118	68
VGYILAIKMNGFTCT	77	93	1
GYILAIKMNGFTCTG	75	90	1
YILAIKMNGFTCTGV	47	107	107
ILAIKMNGFTCTGW	79	103	104
LAIKMNGFTCTGWT	68	130	159
AIKMNGFTCTGWTE	47	103	152
IKMNGFTCTGWTEA	68	108	138
KMNGFTCTGWTEAE	76	104	133
MNGFTCTGWTEAEN	69	99	148
NGFTCTGWTEAENY	69	101	138
GFTCTGWTEAENYT	71	86	129
FTCTGWTEAENYTN	83	125	154
TCTGWTEAEN Y TNF	92	112	129
CTGWTEAENYTNFV	76	123	150
TGWTEAENYTNFVG	85	110	154
GWTEAENYTNFVGY	86	111	110
WTEAENYTNFVGYV	87	106	114
VTEAENYTNFVGYVT	79	90	73
TEAENYTNFVGYVTT	68	84	8
EAENYTNFVGYVTTT	69	117	142
AENYTNFVGYVTTTF	66	106	110
ENYTNFVGYVTTTFK	44	112	183
NYTNFVGYVTTTFKR	49	114	174
YTNFVGYVTTTFKRK	51	104	138
rNFVGYVTTTFKRKH	71	125	165
NFVGYVTTTFKRKHF	65	107	154
FVGYVTTTFKRKHFR	70	111	152
VGYVTTTFKRKHFRP	75	113	155
GYVTTTFKRKHFRPT	70	123	160
YVTTTFKRKHFRPTP	85	106	160
VTTTFKRKHFRPTPD	79	105	119
TTTFKRKHFRPTPDA	80	108	137
TTFKRKHFRPTPDAC	74	99	110
TFKRKHFRPTPDACR	96	111	108
FKRKHFRPTPDACRA	64	92	62
KRKHFRPTPDACRAA	65	93	1
RKHFRPTPDACRAAY	64	107	99

131

124

KHFRPTPDACRAAYN	73	112	124
HFRPTPDACRAAYNW	46	113	118
FRPTPDACRAAYNWK	43	112	148
RPTPDACRAAYNWKM	77	101	129
PTPDACRAAYNWKMA	99	125	143
TPDACRAAYNWKMAG	92	132	160
PDACRAAYNWKMAGD	61	124	147
DACRAAYNWKMAGDP	84	113	136
ACRAAYNWKMAGDPR	82	116	138
CRAAYNWKMAGDPRY	87	118	137
RAAYNWKMAGDPRYE	90	130	120
AAYNWKMAGDPRYEE	68	106	120
AYNWKMAGDPRYEES	96	94	77
YNWKMAGDPRYEESL	83	118	116
NWKMAGDPRYEESLH	58	101	69
WKMAGDPRYEESLHN	69	101	1
KMAGDPRYEESLHNP	62	102	84
MAGDPRYEESLHNPY	64	116	112
AGDPRYEESLHNPYP	40	101	125
GDPRYEESLHNPYPD	36	98	123
DPRYEESLHNPYPDY	57	110	118
PRYEESLHNPYPDYR	73	115	129
RYEESLHNPYPDYRW	69	112	125
YEESLHNPYPDYRWL	58	106	120
EESLHNPYPDYRWLR	76	123	141
ESLHNPYPDYRWLRT	92	132	125
SLHNPYPDYRWLRTV	78	111	137
LHNPYPDYRWLRTVK	79	106	142
HNPYPDYRWLRTVKT	86	108	146
NPYPDYRWLRTVKTT	85	102	151
PYPDYRWLRTVKTTK	65	93	103
YPDYRWLRTVKTTKE	72	97	97
PDYRWLRTVKTTKES	76	85	27
DYRWLRTVKTTKESL	54	111	105
YRWLRTVKTTKESLV	46	117	125
RWLRTVKTTKESLVI	40	110	120
WLRTVKTTKESLVII	41	104	125
LRTVKTTKESLVIIS	65	104	161
RTVKTTKESLVIISP	82	120	150
TVKTTKESLVIISPS	76	116	150
VKTTKESLVIISPSV	71	120	154
KTTKESLVIISPSVA	101	112	147
TTKESLVIISPSVAD	78	121	141
TKESLVIISPSVADL	86	112	132
KESLVIISPSVADLD	86	117	111
ESLVIISPSVADLDP	88	125	143

125

SLVIISPSVADLDPY	68	105	125
LVIISPSVADLDPYD	85	107	93
VIISPSVADLDPYDR	59	98	50
IISPSVADLDPYDRS	83	125	14
ISPSVADLDPYDRSL	50	119	91
SPSVADLDPYDRSLH	59	114	118
PSVADLDPYDRSLHS	44	114	118
SVADLDPYDRSLHSR	49	106	129
VADLDPYDRSLHSRV	71	113	141
ADLDPYDRSLHSRVF	70	121	141
DLDPYDRSLHSRVFP	111	152	127
LDPYDRSLHSRVFPS	99	142	106
DPYDRSLHSRVFPSG	90	120	134
PYDRSLHSRVFPSGK	86	120	130
YDRSLHSRVFPSGKC	364	818	127
DRSLHSRVFPSGKCS	98	142	141
IRSLHSRVFPSGKCSG	87	141	156
SLHSRVFPSGKCSGV	69	111	141
LHSRVFPSGKCSGVA	78	114	129
HSRVFPSGKCSGVAV	97	118	111
SRVFPSGKCSGVAVS	100	125	24
RVFPSGKCSGVAVSS	69	110	106
VFPSGKCSGVAVSST	74	114	142
FPSGKCSGVAVSSTY	64	134	146
PSGKCSGVAVSSTYC	56	112	132
SGKCSGVAVSSTYCS	64	121	120
GKCSGVAVSSTYCST	92	143	145
KCSGVAVSSTYCSTN	88	130	130
CSGVAVSSTYCSTNH	110	165	143
SGVAVSSTYCSTNHD	79	110	115
GVAVSSTYCSTNHDY	79	114	108
VAVSSTYCSTNHDYT	85	114	118
AVSSTYCSTNHDYTI	71	105	102
VSSTYCSTNHDYTIW	78	107	121
SSTYCSTNHDYTIWM	76	107	121
STYCSTNHDYTIWMP	86	99	119
TYCSTNHDYTIWMPE	96	107	74
YCSTNHDYTIWMPEN	47	92	29
CSTNHDYTIWMPENP	52	106	86
STNHDYTIWMPENPR	60	112	107
TNHDYTIWMPENPRL	69	129	119
NHDYTIWMPENPRLG	71	119	130
HDYTIWMPENPRLGM	82	125	123
DYTIWMPENPRLGMS	93	127	123
YTIWMPENPRLGMSC	97	132	143
TIWMPENPRLGMSCD	69	106	134

/30

126

IWMPENPRLGMSCDI	98	110	101
WMPENPRLGMSCDIF	88	113	120
MPENPRLGMSCDIFT	105	121	143
PENPRLGMSCDIFTN	83	111	104
ENPRLGMSCDIFTNS	71	118	111
NPRLGMSCDIFTNSR	90	113	138
PRLGMSCDIFTNSRG	72	112	105
RLGMSCDIFTNSRGK	88	106	113
LGMSCDIFTNSRGKR	76	110	114
GMSCDIFTNSRGKRA	54	120	101
4SCDIFTNSRGKRAS	46	110	106
SCDIFTNSRGKRASK	44	111	98
CDIFTNSRGKRASKG	42	104	117
DIFTNSRGKRASKGS	70	107	111
IFTNSRGKRASKGSE	77	125	87
FTNSRGKRASKGSET	83	111	119
TNSRGKRASKGSETC	68	108	110
NSRGKRASKGSETCG	92	100	119
SRGKRASKGSETCGF	64	93	90
RGKRASKGSETCGFV	75	104	115
GKRASKGSETCGFVD	92	124	118
KRASKGSETCGFVDE	92	106	129
RASKGSETCGFVDER	86	110	134
ASKGSETCGFVDERG	97	108	103
SKGSETCGFVDERGL	92	102	76
KGSETCGFVDERGLY	90	97	44
GSETCGFVDERGLYK	57	115	92
SETCGFVDERGLYKS	33	116	86
ETCGFVDERGLYKSL	64	120	138
TCGFVDERGLYKSLK	47	120	125
CGFVDERGLYKSLKG	72	115	120
GFVDERGLYKSLKGA	84	120	129
FVDERGLYKSLKGAC	86	121	124
VDERGLYKSLKGACK	50	108	110
DERGLYKS LKGACKL	90	119	54
ERGLYKSLKGACKLK	90	118	106
RGLYKSLKGACKLKL	90	121	121
GLYKSLKGACKLKLC	94	129	92
LYKSLKGACKLKLCG	93	136	141
YKSLKGACKLKLCGV	80	112	110
KSLKGACKLKLCGVL	129	113	110
SLKGACKLKLCGVLG	W&	111	124
LKGACKLKLCGVLGL		90	23
KGACKLKLCGVLGLR		111	100
GACKLKLCGVLGLRL	essa	134	129
ACKLKLCGVLGLRLM		117	142

127

13V

CKLKLCGVLGLRLMD		111	147
KLKLCGVLGLRLMDG		120	114
LKLCGVLGLRLMDGT		145	148
KLCGVLGLRLMDGTW		132	86
LCGVLGLRLMDGTWV	83	138	129
CGVLGLRLMDGTWVA	99	117	104
jGVLGLRLMDGTWVAM	89	148	117
VLGLRLMDGTWVAMQ	90	141	127
LGLRLMDGTWVAMQT	102	115	97
GLRLMDGTWVAMQTS	104	138	120
LRLMDGTWVAMQT SN	103	114	118
RLMDGTWVAMQTSNE	100	113	130
LMDGTWVAMQTSNET	96	106	106
MDGTWVAMQTSNETK	97	97	110
DGTWVAMQTSNETKW	69	114	92
GTWVAMQTSNETKWC	58	113	82
TWVAMQTSNETKWCP	78	118	107
WVAMQTSNETKWCPP	50	114	116
VAMQTSNETKWCPPD	86	104	151
AMQTSNETKWCPPDQ	104	114	128
MQTSNETKWCPPDQL	104	132	125
QTSNETKWCPPDQLV	92	120	155
TSNETKWCPPDQLVN	97	111	90
SNETKWCPPDQLVNL	99	129	110
netkwcppdqlvnlh	90	128	107
ETKWCPPDQLVNLHD	105	120	118
TKWCPPDQLVNLHDF	85	125	125
KWCPPDQLVNLHDFR	89	113	121
jwCPPDQLVNLHDFRS	101	119	99
CPPDQLVNLHDFRSD	93	137	127
PPDQLVNLHDFRS DE	107	120	56
PDQLVNLHDFRSDEI	35	106	63
DQLVNLHDFRS DEIE	54	117	97
QLVNLHDFRSDEIEH	60	113	106
LVNLHDFRSDEIEHL	47	104	100
VNLHDFRSDEIEHLV	83	129	98
NLHDFRS DE IEHLW	83	113	110
LHDFRSDEIEHLWE	93	115	121
HDFRSDEIEHLWEE	69	107	150
DFRSDEIEHLWEEL	99	103	110
FRSDEIEHLWEELV	86	114	116
RSDEIEHLWEELVR	100	138	104
SDEIEHLWEELVRK	101	117	118
DE IEHLWEELVRKR	94	123	143
EIEHLWEELVRKRE	82	113	121
IEHLWEELVRKREE	90	129	118

128

EHLWEELVRKREEC	82	114	106
HLWEELVRKREECL	82	123	46
LWEELVRKREECLD	64	100	79
WEELVRKREECLDA	62	108	97
VEELVRKREECLDAL	58	111	101
EELVRKREECLDALE	69	112	123
ELVRKREECLDALES	82	113	117
LVRKREECLDALESI	86	130	124
VRKREECLDALESIM	58	181	151
RKREECLDALESIMT	73	110	137
KREECLDALESIMTT	102	113	97
REECLDALESIMTTK	94	110	106
EECLDALESIMTTKS	82	120	133
ECLDALESIMTTKSV	91	112	125
CLDALESIMTTKSVS	101	146	155
LDALESIMTTKSVSF	97	116	152
DALESIMTTKSVSFR	104	120	188
ALESIMTTKSVSFRR	97	132	137
LESIMTTKSVSFRRL	48	114	130
ESIMTTKSVSFRRLS	62	111	114
SIMTTKSVSFRRLSH	54	130	97
IMTTKSVSFRRLSHL	43	101	111
MTTKSVSFRRLSHLR	59	116	125
TTKSVSFRRLSHLRK	66	118	111
TKSVS FRRLSHLRKL	83	125	123
KSVSFRRLSHLRKLV	108	124	129
SVSFRRLSHLRKLVP	64	123	117
VSFRRLSHLRKLVPG	90	111	105
SFRRLSHLRKLVPGF	92	110	96
FRRLSHLRKLVPGFG	90	108	111
RRLSHLRKLVPGFGK	92	143	118
RLSHLRKLVPGFGKA	93	123	148
LSHLRKLVPGFGKAY	96	139	150
SHLRKLVPGFGKAYT	113	132	132
HLRKLVPGFGKAYTI	99	111	102
LRKLVPGFGKAYTIF	83	118	82
RKLVPGFGKAYTIFN	47	115	86
ECLVPGFGKAYTIFNK	47	114	123
LVPGFGKAYTIFNKT	54	112	139
VPGFGKAYTIFNKTL	58	114	138
PGFGKAYTIFNKTLM	78	113	157
GFGKAYTIFNKTLME	78	123	BãS
FGKAYTIFNKTLMEA	90	151
GKAYTIFNKTLMEAD	76	127
KAYTIFNKTLMEADA	101	123
AYTIFNKTLMEADAH	86	121	£9$

129

YTIFNKTLMEADAHY	104	147
TIFNKTLMEADAHYK	107	123	.wa
IFNKTLMEADAHYKS	100	118
FNKTLMEADAHYKSV	111	141
NKTLMEADAHYKSVR	104	116	141
KTLMEADAHYKSVRT	91	98	123
TLMEADAHYKSVRTW	100	114	90
LMEADAHYKSVRTWN	73	107	97
pEADAHYKSVRTWNE	62	129	83
EADAHYKSVRTWNEI	58	97	106
ADAH YKSVRTWNEIL	56	100	100
DAHYKSVRTWNEILP	59	121	112
AHYKSVRTWNEILPS	112	160	125
HYKSVRTWNEILPSK	80	130	123
YKSVRTWNEILPSKG	66	137	116
KSVRTWNEILPSKGC	115	125	114
SVRTWNEILPSKGCL	106	138	118
VRTWNEILPSKGCLR	90	124	133
RTWNEILPSKGCLRV	120	127	120
TWNEILPSKGCLRVG	97	146	127
WNEILPSKGCLRVGG	102	136	117
NEILPSKGCLRVGGR	104	130	163
EILPSKGCLRVGGRC	104	112	128
ILPSKGCLRVGGRCH	79	113	107
LPSKGCLRVGGRCHP	77	119	100
PSKGCLRVGGRCHPH	69	138	91
SKGCLRVGGRCHPHV	72	121	103
KGCLRVGGRCHPHVN	68	130	115
GCLRVGGRCHPHVNG	85	125	123
CLRVGGRCHPHVNGV	102	132	134
LRVGGRCHPHVNGVF	104	143	133
RVGGRCHPHVNGVFF	86	143	99
VGGRCHPHVNGVFFN	120	136	120
GGRCHPHVNGVFFNG	86	119	119
GRCHPHVNGVFFNGI	117	113	117
RCHPHVNGVFFNGII	98	141	143
CHPHVNGVFFNGIIL	97	150	151
HPHVNGVFFNGIILG	104	138	164
PHVNGVFFNGIILGP	93	173	146
HVNGVFFNGIILGPD	97	123	114
VNGVFFNGIILGPDG	68	116	85
NGVFFNGIILGPDGN	66	117	97
GVFFNGIILGPDGNV	58	116	100
VFFNGIILGPDGNVL	55	132	108
FFNGIILGPDGNVLI	92	143	105
FNGIILGPDGNVLIP	61	139	130

130

[NGIILGPDGNVLIPE	102	146	141
GIILGPDGNVLIPEM	107	132	123
IILGPDGNVLIPEMQ	85	118	93
ILGPDGNVLIPEMQS	125	134	119
LGPDGNVLIPEMQSS	100	134	150
GPDGNVLIPEMQSSL	86	154	157
PDGNVLIPEMQSSLL	87	129	139
DGNVLIPEMQSSLLQ	123	134	169
GNVLIPEMQSSLLQQ	96	120	168
NVLIPEMQSSLLQQH	72	120	150
VLIPEMQSSLLQQHM	92	104	142
LIPEMQSSLLQQHME	89	111	85
IPEMQSSLLQQHMEL	89	128	129
PEMQSSLLQQHMELL	62	133	93
EMQSSLLQQHMELLE	58	129	142
MQSSLLQQHMELLES	65	113	117
QSSLLQQHMELLES S	82	114	132
SSLLQQHMELLESSV	90	128	132
SLLQQHMELLESSVI	124	163	133
LLQQHMELLESSVIP	78	111	121
LQQHMELLESSVIPL	106	134	128
QQHMELLES SVIPLV	103	134	133
QHMELLESSVIPLVH	98	146	139
HMELLESSVIPLVHP	110	129	134
MELLES SVIPLVHPL	90	125	152
ELLESSVIPLVHPLA	90	133	155
LLESSVIPLVHPLAD	72	117	118
LESSVIPLVHPLADP	90	128	128
ESSVIPLVHPLADPS	104	138	143
SSVIPLVHPLADPST	73	104	93
SVIPLVHPLADPSTV	72	137	107
VIPLVHPLADPSTVF	69	141	123
IPLVHPLADPSTVFK	96	156	188
PLVHPLADPSTVFKD	93	112	138
LVHPLADPSTVFKDG	164	174	188
VHPLADPSTVFKDGD	98	138	125
HPLADPSTVFKDGDE	74	141	117
PLADPSTVFKDGDEA	99	125	90
LADPSTVFKDGDEAE	68	116	113
ADPSTVFKDGDEAED	147	152	110
DPSTVFKDGDEAEDF	98	147	137
PSTVFKDGDEAEDFV	104	143	141
STVFKDGDEAEDFVE	104	120	125
rVFKDGDEAEDFVEV	107	124	96
VFKDGDEAEDFVEVH	100	106	93
FKDGDEAEDFVEVHL	65	76	119

131

KDGDEAEDFVEVHLP	72	93	76
DGDEAEDFVEVHLPD	85	123	91
GDEAEDFVEVHLPDV	46	124	113
DEAEDFVEVHLPDVH	68	136	123
EAE DFVEVHLPDVHN	76	117	114
AEDFVEVHLPDVHNQ	123	138	123
EDFVEVHLPDVHNQV	90	141	123
DFVEVHLPDVHNQVS	96	141	118
FVEVHLPDVHNQVSG	92	143	102
VEVHLPDVHNQVS GV	106	141	123
EVHLPDVHNQVSGVD	91	150	139
VHLPDVHNQVSGVDL	110	114	137
HLPDVHNQVSGVDLG	104	150	129
LPDVHNQVSGVDLGL	104	154	154
PDVHNQVSGVDLGLP	106	129	115
DVHNQVSGVDLGL PN	117	133	113
VHNQVSGVDLGLPNW	100	119	38
HNQVSGVDLGLPNWG	76	106	38
NQVS GVDLGLPNWGK	78	138	98
Média	91.9	119.5	130.9
Desvio padrão	157.9	37.6	169.8

132

Tabela 15: Potências de neutralização de proteína G de IgGs do vírus da raiva.

Nome da IgG	IU/mg
CR04-001	89
CR04-004	5
CR04-008	1176
CR04-010	3000
CR04-018	1604
CR04-021	1500
CR04-026	<2
CR04-031	272
CR04-038	2330
CR04-040	3041
CR04-060	89
CR04-073	6116
CR04-097	<1
CR04-098	7317
CR04-103	3303
CR04-104	4871
CR04-108	4871
CR04-120	4938
CR04-125	4718
CR04-126	2655
CR04-140	478
CR04-144	6250
CR04-146	ND
CR04-164	4724
CR57	3800
CRJB	605

ND = não determinado mo

133

Tabela 16: Potências de neutralização da proteína G de IgGs anti-vírus da raiva contra os vírus que escapam E57.

Nome da IgG	E57A2 (IU/mg)	E57A3 (IU/mg)	E57B1 (IU/mg)	E57B2 (IU/mg)	Ξ57Β3 (IU/mg)	E57C3 (IU/mg)
CR04-008	0*	0	0	0	0	0
CR04-010	8127	1355	5418	1355	2709	4064
CR04-018	1604	0	1604	0	59	535
CR04-021	450	2	150	8	50	50
CR04-038	9437	1573	9437	1049	6291	1573
CR04-040	8209	2736	24628	1368	5473	912
CR04-073	8256	1835	11008	1835	3669	1835
CR04-098	9878	3293	9878	3293	3293	3293
CR04-103	8917	2972	17835	2972	5945	2972
CR04-104	3288	2192	6576	2192	4384	1096
CR04-108	3288	731	4384	731	2192	731
CR04-120	1111	14	741	82	247	41
CR04-125	708	39	236	79	157	79
CR04-126	88	0	18	0	18	0
CR04-144	5625	2813	11250	2813	5625	1875
CR04-164	4252	472	4252	472	945	709

* 0 indica nenhum ponto final em 50 % em uma diluição de 1:100 do anticorpo

Tabela 17. Potência de neutralização de CR-57 contra os vírus que escapam E98.

	E98-2 (IU/mg)	E98-4 (IU/mg)	E98-5 (IU/mg)	E98-6 (IU/mg)	E98-7 (IU/mg)
CR-57	2813	8438	4219	2813	8438
CR04-098	0*	0	0	0	0

* Zero indica nenhum ponto final a 50 % em uma diluição de 1:1000 do anticorpo.

Tabela 18: Ocorrência dos resíduos de aminoácido na região de ligação mínima de CR57 dentro do genótipo 1 dos vírus da raiva.

134

Tipo selvagem	K	L	c	G	V	L
	K (99.6%)*	L (100%)	c (100%)	G (98.7%)	V (99.6%)	L (70.7%)
	R (0.4%)			E (0.9%)	I (0.4%)	P (26.7%)
				R (0.4%)		S (2.6%)

* A porcentagem de ocorrência de cada aminoácido é mostrada dentro de 229 isolados do vírus da raiva.

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16: 253-256.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação tendo atividade neutralizadora do vírus da raiva, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63, e em que um ou mais aminoácidos são alterados comparados à SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 63, e sendo capaz de competir quanto a ligar-se especificamente ao vírus da raiva ou um fragmento deste com a molécula de ligação compreendendo SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 63, e ainda possuindo uma atividade neutralizadora do vírus da raiva.
2. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação é humana.
3. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação é uma IgG.
4. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, e compreende ainda pelo menos um rótulo.
5. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3.
6. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 5.
7. Método para produzir uma molécula de ligação como

Petição 870180138204, de 05/10/2018, pág. 6/14 definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

a) cultivar uma célula hospedeira que compreende pelo menos um vetor como definido na reivindicação 6 sob condições conducentes à expressão da molécula de ligação e opcionalmente,

b) recuperar a molécula de ligação expressada.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, e compreende ainda pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação adicional compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 273 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 275.
10. Molécula de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, imunoconjugado de acordo com a reivindicação 4, ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caractcrizadaío) pelo fato de ser para o uso como um medicamento.
11. Molécula de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, imunoconjugado de acordo com a reivindicação 4, ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caractcrizadaío) pelo fato de ser para o uso no diagnóstico, profilaxia, tratamento, ou combinação destes, da raiva.

Petição 870180138204, de 05/10/2018, pág. 7/14
12. Uso de uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, imunoconjugado como definido na reivindicação 4, ou composição farmacêutica como definida na reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para

5 o diagnóstico, profilaxia, tratamento, ou combinação destes, da raiva.
13. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, um imunoconjugado como definido na reivindicação 4, ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 8 ou 9, ou uma

10 combinação destes.