CN112899310B - 基于t7rna聚合酶的正链rna病毒快速拯救系统及其构建方法和应用 - Google Patents

基于t7rna聚合酶的正链rna病毒快速拯救系统及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统及其构建方法和应用，主要涉及基因工程技术领域。所述系统包括：能够高效表达T7RNA聚合酶的哺乳动物细胞系、包含T7启动子及以EV71为例的RNA病毒全基因组cDNA感染性克隆，所用载体与表达T7RNA聚合酶的细胞高效匹配。相较于基于体外转录的RNA病毒拯救系统，本发明能够简单、高效地拯救出感染性正链RNA病毒，以EV71为例，所产生病毒能够连续传代，与亲本病毒具有一致的生物学特性。

Description

基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统及其构建方法 和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统及其构建方法和应用。
背景技术
T7 RNA聚合酶(T7pol)，是一种高度特异性识别T7启动子序列的DNA依赖的5′→3′RNA聚合酶。由于T7pol启动转录效率较强且具有严格的启动子识别特异性，所以基于T7pol的病毒拯救系统应用非常广泛。
肠道病毒EV71(Enterovirus 71，EV71)为非包膜的正链RNA病毒，是小RNA病毒(Picornaviridae)家族中肠病毒属成员。该病毒感染主要引起婴幼儿手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)，还可能导致神经系统并发症，甚至死亡。EV71病毒基因组全长约为7.4kb，可作为mRNA编码一个小的上游蛋白和一个大的多聚蛋白。而多聚蛋白最终会被加工形成四个结构蛋白(VP1-VP4)和七个非结构病毒蛋白(2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D)。尽管2015年EV71灭活病毒疫苗已获得中国许可。但截至目前，针对EV71病毒的特效药物仍未被发现，关于EV71病毒的致病机制仍需科研人员进行更深入的研究。
病毒基因组的遗传操作和感染性病毒的拯救能够给研究者带来诸多便利。因此近十年来，国内外有多个实验室曾对EV71 cDNA感染性克隆进行构建。但通常在完成病毒cDNA克隆的构建后，病毒的拯救还需要对cDNA进行线性化，并进一步在体外用RNA聚合酶转录，然后将纯化的高质量RNA转染到细胞中，才可能获得具有感染性的病毒。这些步骤不仅较为繁琐，还存在多种限制因素，导致病毒拯救不容易成功。如感染性克隆的线性化需要匹配合适的酶切位点，并且通常需要大量的感染性克隆质粒，而长链基因组感染性克隆的构建常常会使得质粒的拷贝数降低，从而影响高浓度的感染性克隆质粒的获取。除此之外，线性化后的cDNA进行体外转录所获得的RNA完整性也是影响拯救病毒实验成功的关键因素。
发明内容
针对目前的正链RNA病毒拯救系统在构建及病毒拯救的过程中存在的缺陷和问题，本发明的目的在于提供了一种以EV71肠道病毒作为模型，基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统及其构建方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于T7 RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统，包括：能够表达T7 RNA聚合酶(T7pol)的哺乳动物细胞系、包含T7启动子及有正链RNA病毒核酸序列的感染性克隆；
所述感染性克隆在病毒核酸序列的5'端上游含T7启动子；
所述正链RNA病毒包括但不限于EV71肠道病毒。
优选的，其中所述哺乳动物细胞系为慢病毒整合介导表达T7pol的HEK293FT/T7pol细胞系，或通过转染含T7pol基因表达质粒的HEK293FT细胞。
优选的，其中所述感染性克隆的质粒骨架为pcDNA3.1+，且所述pcDNA3.1+的结构中不含有CMV启动子。
优选的，其中所述哺乳动物细胞系为整合慢病毒载体并介导T7 RNA聚合酶T7pol表达的细胞系、或瞬时转染含T7 RNA聚合酶T7pol基因质粒后表达T7 RNA聚合酶T7pol的细胞系。
优选的，其中所述慢病毒载体的质粒骨架为真核表达载体pCDH-CMV-EF1-puro，所述真核表达载体pCDH-CMV-EF1-puro的结构中含有SV40ori复制起始元件。
优选的，其中所述哺乳动物细胞系整合有SV40的T抗原；所述哺乳动物细胞系包括HEK293FT或COS7细胞。
本发明还提供了一种基于T7 RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统的构建方法，包括以下步骤：
能够表达T7 RNA聚合酶的哺乳动物细胞系的构建；
包含T7启动子及正链RNA病毒核酸序列的感染性克隆的构建。
优选的，其中所述能够表达T7 RNA聚合酶的哺乳动物细胞系的构建包括以下步骤：
a将T7pol基因与易于检测表达的5’端融合蛋白标签3Flags定向插入到真核表达载体pCDH-CMV-EF1-puro的CMV启动子下游，从而得到含有T7pol、融合蛋白标签3Flags、嘌呤霉素抗性基因的双顺反子慢病毒载体pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro；
b将双顺反子慢病毒载体pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G按4:3:1的质量比例混合后，转染到HEK293FT中，得到pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro慢病毒；
c用pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro慢病毒感染HEK293FT细胞，再通过含嘌呤霉素的培养基进行筛选，得到整合有T7pol基因的稳定细胞HEK293FT/T7pol；所述含嘌呤霉素的培养基中嘌呤霉素的含量为10μg/ml。
优选的，包含T7启动子及正链RNA病毒核酸序列的感染性克隆的构建包括以下步骤：
a用EV71病毒株以MOI为1.0进行RD细胞感染，在90％的细胞出现明显病变后，收集细胞，提取感染细胞的总RNA；
b利用逆转录试剂盒和寡核苷酸(dT)18在42℃将提取的细胞总RNA进行转录50min；通过Mlu I和Xba I两个酶切位点切除pcDNA3.1载体上的CMV启动子；
c通过降落PCR扩增EV71全长基因组，纯化扩增获得的EV71基因组PCR产物，并克隆到已切除CMV启动子的pcDNA3.1质粒中；
d构建的感染性克隆pcDNA3.1-ΔCMV-T7-EV71-poly(dT)30进行测序和纯化。
本发明提供了利用上述的基于T7 RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统拯救EV71肠道病毒的两种拯救方法：
其一，基于稳定表达T7pol的细胞系HEK293FT/T7pol，包括以下步骤：将含有EV71肠道病毒全长基因组的感染性克隆pcDNA3.1-ΔCMV-T7-EV71-poly(dT)30，与作为转染效率指示剂的绿色荧光质粒PCDH-GFP混合后，转染至HEK293FT/T7pol细胞中，在含5％(v/v)CO2的37℃培养箱中进行细胞培养，当90％的细胞出现明显病变后收集培养上清中的病毒和细胞。
其二，通过瞬时转染含有T7pol基因的质粒，以及EV71肠道病毒感染性克隆，完成病毒拯救。包括以下步骤：将感染性克隆pcDNA3.1-ΔCMV-T7-EV71-poly(dT)30与含有T7RNA聚合酶、嘌呤霉素基因的质粒pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro混合，并将绿色荧光蛋白表达质粒pCDH-CMV-EF1-GFP作为转染效率指示剂，共同转染至HEK293FT细胞中，在含5％(v/v)CO2的37℃培养箱中进行细胞培养，当90％的细胞出现明显细胞病变后收集病毒、细胞。
优选的，其中所述感染性克隆pcDNA3.1-ΔCMV-T7-EV71-poly(dT)30、表达T7 RNA聚合酶的质粒pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro、绿色荧光蛋白表达质粒pCDH-CMV-EF1-GFP三者的质量比例为5：5：1。
优选的，其中所述细胞病变包括细胞变圆、皱缩，逐渐脱落甚至裂解成碎片。
优选的，其中所述转染的方法包括脂质体转染或非脂质体转染。
优选的，转染时感染性克隆pcDNA3.1-ΔCMV-T7-EV71-poly(dT)30用量应不低于500ng/106个细胞，与质粒PCDH-GFP的混合质量比例为(5-10)：1。
在本发明的技术方案中，细胞表达的T7pol能够识别感染性克隆上的T7启动子，起始下游病毒基因的转录和表达，从而完成肠道病毒EV71的拯救。
本发明相比于现有技术至少具有以下有益效果：
本发明提供的基于T7pol的正链RNA病毒快速拯救系统，能够在成功拯救肠道病毒EV71的前提下，避免了常规体外转录系统拯救病毒的操作繁琐、不稳定、且试剂昂贵，还避免了使用多种辅助质粒进行病毒拯救的繁琐，本发明的拯救系统操作简便，拯救效率高效且稳定；
本发明提供的基于T7pol的正链RNA病毒快速拯救系统获得的肠道病毒EV71与亲本病毒具有高度一致性。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1是本发明实施例基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统拯救病毒的流程图；
图2是本发明实施例中pcDNA3.1-△CMV-T7-EV71-poly(dT)30质粒构建示意图；
图3是本发明实施例中EV71肠道病毒全基因组PCR扩增产物的电泳结果，其中M为10kb DNAMarker；泳道1为病毒基因组PCR扩增产物；
图4是本发明实施例中pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro质粒示意图；
图5是本发明实施例中病毒拯救过程转染后24h、48h、72h，细胞株HEK293FT/T7pol、瞬时转染pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro质粒后的HEK293FT细胞中T7pol的表达水平的Western Blot测定；
图6是本发明实施例中定量测定通过方法一与方法二分别于24h、48h、72h所拯救病毒的滴度及其差异比较；
图7是本发明实施例中方法一与方法二拯救病毒过程中细胞形态及其GFP表达水平的变化；
图8是本发明实施例中分别感染拯救病毒后，SH-SY5Y和RD细胞的细胞形态；
图9是本发明实施例中免疫荧光鉴定EV71拯救病毒的感染细胞结果；
图10是本发明实施例中噬斑分析以及定量PCR(qPCR)测定RD细胞感染拯救病毒后4-24h，细胞上清液中的病毒滴度变化，以及细胞中病毒RNA基因组拷贝数的结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统及其构建方法和应用其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征或特点可由任何合适形式组合。
以下材料或试剂，如非特别说明，均为市购。
实施例：本实施例提供了一种基于T7 RNA聚合酶的肠道病毒EV71拯救系统的建立方法
本实施例首先通过构建表达T7 RNA聚合酶的哺乳动物细胞系HEK293FT，以及包含T7启动子的EV71感染性克隆。然后将EV71感染性克隆转染T7 RNA聚合酶表达细胞，获得拯救的感染性病毒(参见图1)。
材料与方法：
病毒株：从患有HFMD的患者中分离出临床EV71株(GenBank No.HQ891927)。
细胞系：人胚肾细胞HEK293FT由实验室保存；横纹肌肉瘤细胞系(Rhabdomyosarcoma，RD)购自中国科学院细胞库；人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购自中国科学院细胞库。
质粒：pCDH-CMV-EF1α-puro购自System Bioscience(CD510B-1)公司；包含T7聚合酶基因1(T7pol)的质粒(pAR3126)来自厦门大学程通教授的惠赠。
培养基：DEME/High Glucose培养基，购自Corning公司。
主要试剂：胎牛血清(FBS)购自Biological Industries公司；抗EV71 VP1的小鼠单克隆抗体购自Abnova公司；无缝克隆试剂盒购自近岸蛋白质科技有限公司；转染试剂lipofectammine2000购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒SuperScriptTM IIReverseTranscriptase购自Invitrogen公司；PCR高保真酶iProofTM high-fidelity购自Bio-Rad公司。
1.EV71 cDNA克隆的构建
本发明拟在pcDNA3.1+质粒基础上，构建含有T7启动子及EV71全基因组的感染性克隆(参见图2)。首先，用临床EV71病毒株以MOI为1.0进行RD细胞感染，并置于37℃培养箱中孵育2h，感染期间每隔30min轻柔摇晃混匀。在37℃继续培养已感染的细胞16h。用Trizol试剂提取感染细胞的总RNA。然后利用逆转录试剂盒和寡核苷酸(dT)18在42℃将提取的细胞总RNA进行转录50min。使用高保真DNA聚合酶和特异性引物，通过降落PCR扩增EV71全长基因组。其中正向引物包括一个T7启动子，反向引物具有一个Mul I限制性酶切位点，并含有poly(dT)30。引物具体序列如下所示：
T7-F：5′-ggtaatacgactcactatagggttaaaacagcctgtgggttgc-3′(SEQ ID NO.1)；
Mlu I-R：5′-ggatctacgcgttttttttttttttttttttttttttttttgct-3′(SEQ IDNO.2)；
本发明在EV71全基因组PCR扩增中的程序，温度条件为98℃预变性30s；然后在46℃下进行2个退火循环(98℃持续5s，46℃持续20s，72℃持续210s)；接着按照68-63.5℃进行10个退火循环(98℃持续5s，在68-63.5℃持续20s(-0.5℃/循环)，72℃持续210s)；并继续进行15个63℃的退火循环(98℃持续5s，63℃持续20s，72℃持续210s)；最后以72℃延伸5min；得到EV71全基因组PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳鉴定(参见图3)。
电泳结果显示，EV71全基因组PCR产物的条带明亮，其条带位置在7kb左右，与本实验所使用的亲代EV71病毒株基因组大小相近。进一步纯化扩增获得的EV71基因组PCR产物，并克隆到pcDNA3.1质粒中，其中CMV启动子先前已通过Mlu I和Xba I限制性酶切除。对EV71的感染性克隆pcDNA3.1-ΔCMV-T7-EV71-poly(dT)30进行测序和纯化。
2.构建稳定表达T7pol的细胞系HEK293FT/T7pol
2.1构建含有T7pol的慢病毒载体
本发明以含有T7pol基因的质粒pAR3126作为模板，用含有pCDH-CMV-EF1-puro载体序列及T7pol基因序列的无缝克隆引物PCR扩增获得T7pol基因；无缝克隆引物具体序列如下：
pCDH-T7pol-F:5′-gattctagagctagcgaattcatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactgg-3′(SEQ ID NO.3)
pCDH-T7-R：5′-agatccttcgcggccgcggatccttacgcgaacgcgaagtccga-3′(SEQ IDNO.4)
本发明在扩增T7pol中PCR扩增条件为：首先以98℃预变性5min，然后按照60℃-55℃进行降落式扩增10个循环(98℃持续30s，60℃(-0.5℃)持续40s，72℃持续1min)；接着再以55℃扩增20个循环(98℃持续30s，55℃持续40s，72℃持续1min)；最后以72℃进行延伸7min。
2.2融合标签蛋白的T7pol表达质粒构建
本发明在已获得pCDH-CMV-T7pol-EF1-puro慢病毒载体基础上，构建了5’-端融合标签蛋白基因的T7pol基因(SEQ ID NO.5,序列较长，见附后)的表达质粒，以便于T7pol表达水平的检测。构建步骤主要如下：通过限制性酶切位点EcoR I和Xba I将3个Flag标签蛋白的基因序列定向插入到双顺反子pCDH-CMV-T7pol-EF1-puro的T7pol基因的5’端，从而得到融合标签蛋白基因、T7 RNA聚合酶基因以及嘌呤霉素基因的质粒pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro(参见图4)。3个标签蛋白具体序列如下所示：
3Flags-sequence：
5′-atggattacaaggatgacgacgataaggactataaggacgatgatgacaaggactacaaagatgatgacgataaagataaagcggaattctc-3′.(SEQ ID NO.6)
无缝克隆引物具体序列如下：
pCDH-3Flag-F：acctccatagaagattctagaatggattacaaggatgacgacga(SEQ IDNO.7)
3Flag-T7pol-R：cagttcgatgtcagagaattccgctttatctttatcgtcat(SEQ ID NO.8)
本发明扩增3个标签蛋白基因序列的PCR扩增条件为：首先以94℃预变性5min，然后按照60℃-55℃进行降落式扩增10个循环(94℃持续30s，60℃(-0.5℃)持续30s，72℃持续30s)；接着再以55℃扩增20个循环(94℃持续30s，55℃持续40s，72℃持续30s)；最后以72℃进行延伸7min。
2.3稳定表达T7聚合酶的细胞系HEK293FT/T7pol的构建、筛选和鉴定
本发明将pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro质粒与psPAX2的包装质粒(Addgene#12260)和pMD2.G的包膜质粒(Addgene#12259)按4:3:1的质量比例混合后，共转染到HEK293FT中，得到含有pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro载体的慢病毒；然后用慢病毒感染HEK293FT细胞，并使用含有10.0μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基筛选出整合有T7pol基因的稳定细胞HEK293FT/T7pol。收集部分细胞，进行RNA聚合酶表达情况鉴定。
3.本实施例提供两种拯救肠道病毒EV71的方法
3.1 EV71肠道病毒的拯救方法一：
将HEK293FT/T7pol细胞接种于六孔板，然后置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，细胞长至70％-80％单层时，通过lipofectamine 2000将EV71感染性克隆pcDNA3.1-ΔCMV-T7-EV71-poly(dT)30以1μg/孔转染到HEK293FT/T7pol细胞中，同时共转染pCDH-CMV-EF1-GFP质粒作为转染效率指示剂(200ng/孔)，分别在转染后48、72和96小时，收集培养上清液、细胞。
3.2 EV71肠道病毒的拯救方法二：
本发明所描述的EV71肠道病毒的两种拯救方法的共同点在于转染过程中，细胞都能够表达、提供T7pol以供拯救病毒所需。两者的不同点在于细胞是否为稳定表达T7pol的细胞系。
方法二主要步骤包括：将HEK293FT细胞接种于六孔板，然后置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，当细胞长至70％-80％时，通过lipofectamine 2000将EV71感染性克隆pcDNA3.1-ΔCMV-T7-EV71-poly(dT)30与T7pol表达质粒pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro共转染(两种质粒均为1μg/孔)，同时以pCDH-CMV-EF1-GFP质粒作为转染效率指示剂(200ng/孔)，然后分别在转染后48、72和96h，收集培养上清液、细胞。
pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro质粒的使用浓度不低于500ng/106个细胞，为了比较两种拯救方法的效率差异，方法二转染过程中所使用的EV71感染性克隆质粒的用量与方法一相同，均为1μg/孔。
4.细胞表达T7pol的测定
用含有PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的细胞裂解液(PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂与细胞裂解液的稀释比例为1:100)处理上述收集的细胞，置于冰上充分裂解后，进行离心收取上清中的蛋白，并利用BCA方法对总蛋白进行定量。待定量完成后取等量的蛋白进行免疫印迹方法检测。
免疫印迹结果显示，通过慢病毒感染及嘌呤霉素筛选所构建的细胞株HEK293FT/T7pol，与瞬时转染pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro质粒的HEK293FT细胞都能够表达T7pol。不同的是，随着病毒拯救时间的延长以及拯救病毒量的上升，HEK293FT细胞中T7RNA聚合酶的表达含量会降低，而HEK293FT/T7pol细胞中T7 RNA聚合酶的表达水平没有明显变化(参见图5)。
5.拯救病毒的特征鉴定
5.1.通过噬斑分析测定病毒滴度
培养并传代RD细胞，将RD细胞以1×106细胞/孔的密度接种在六孔板中，然后置于含5％(v/v)CO2的37℃培养箱中进行细胞培养，当贴壁细胞面积达到培养瓶的95％-100％时，用不含血清的DMEM培养基以10倍梯度稀释通过方法一与方法二分别拯救的病毒样品，并取稀释后的病毒液按照0.5mL/106个细胞感染细胞，于37℃培养箱中孵育2h，感染期间每隔30min轻柔摇晃混匀。吸弃病毒上清后，用含有0.25％(w/v)低熔点琼脂糖、2％(w/v)胎牛血清的培养基覆盖细胞，置于含5％(v/v)CO2的37℃培养箱中继续培养72h；然后用0.1％(w/v)结晶紫染色，计数噬斑以定量病毒滴度。
优选的，感染细胞时病毒上清滴度为20-200PFU/mL，用此滴度范围区间内的病毒感染细胞进行噬斑分析测定实验时，噬斑形成的数量更易于计数定量。
病毒定量结果表明，在感染性克隆转染后的24h、48h、72h，HEK293FT细胞与HEK293FT/T7pol细胞拯救的病毒滴度存在明显差异，HEK293FT细胞拯救的病毒滴度显著低于HEK293FT/T7pol细胞拯救的病毒滴度。这说明利用转染方式表达T7RNA聚合酶的HEK293FT细胞拯救的感染性病毒滴度的效率显著低于稳定表达T7RNA聚合酶的HEK293FT/T7pol细胞(参见图6)。同时，细胞病变出现的时间早晚，与相应细胞拯救病毒的效率相对应。并且，感染性克隆的转染和病毒的拯救能明显抑制绿色荧光蛋白GFP的表达(参见图7)。
5.2.拯救病毒感染细胞后细胞形态和免疫荧光鉴定
培养并传代RD和SH-SY5Y细胞，用上述拯救的EV71病毒以MOI＝10感染细胞，在显微镜下观察病毒感染细胞后的形态特征变化。
拯救病毒感染后，SH-SY5Y和RD细胞均显示出明显的CPE(参见图8)，细胞形态与亲代病毒感染的结果相似。
培养并传代RD细胞，用上述拯救的EV71病毒以MOI＝10感染，并在感染8h后(8hpi)用4％(v/v)的甲醛固定细胞；依次用针对EV71 VP1的单克隆抗体、荧光标记二抗(山羊抗小鼠IgG-Dye-light 594)和DAPI染色。
结果显示，EV71拯救病毒感染细胞显示出明显的信号(参见图9)。
5.3.拯救病毒的增殖曲线测定
培养并传代RD，将RD细胞以2×106/瓶的浓度接种在细胞培养瓶(T25)中，然后置于含5％(v/v)CO2的37℃培养箱中进行细胞培养16h。分别将拯救病毒和亲本病毒以MOI＝10感染。于感染后4h、8h、12h、16h、24h收集病毒感染后细胞及培养上清，通过实时定量PCR(qPCR)检测细胞中病毒RNA基因组的拷贝数，并通过噬斑分析测定细胞培养上清液中病毒滴度的变化，具体步骤可见上述内容。结果表明，对于培养上清中病毒滴度和细胞内病毒RNA基因组，拯救病毒具有与其亲代病毒相似的增殖曲线(参见图10)。这些结果表明，拯救病毒具有与亲代病毒相似的特征。
本发明的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实施例中，并未详细示出公知的方法、结构和技术，以便不模糊对本说明书的理解。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统及其构建方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtaatacga ctcactatag ggttaaaaca gcctgtgggt tgc 43
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatctacgc gttttttttt tttttttttt tttttttttt tgct 44
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gattctagag ctagcgaatt catgaacacg attaacatcg ctaagaacga cttctctgac 60
atcgaactgg 70
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agatccttcg cggccgcgga tccttacgcg aacgcgaagt ccga 44
<210> 5
<211> 2709
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg atgatgacaa ggactacaaa 60
gatgatgacg ataaagataa agcggaattc tctgacatcg aactggctgc tatcccgttc 120
aacactctgg ctgaccatta cggtgagcgt ttagctcgcg aacagttggc ccttgagcat 180
gagtcttacg agatgggtga agcacgcttc cgcaagatgt ttgagcgtca acttaaagct 240
ggtgaggttg cggataacgc tgccgccaag cctctcatca ctaccctact ccctaagatg 300
attgcacgca tcaacgactg gtttgaggaa gtgaaagcta agcgcggcaa gcgcccgaca 360
gccttccagt tcctgcaaga aatcaagccg gaagccgtag cgtacatcac cattaagacc 420
actctggctt gcctaaccag tgctgacaat acaaccgttc aggctgtagc aagcgcaatc 480
ggtcgggcca ttgaggacga ggctcgcttc ggtcgtatcc gtgaccttga agctaagcac 540
ttcaagaaaa acgttgagga acaactcaac aagcgcgtag ggcacgtcta caagaaagca 600
tttatgcaag ttgtcgaggc tgacatgctc tctaagggtc tactcggtgg cgaggcgtgg 660
tcttcgtggc ataaggaaga ctctattcat gtaggagtac gctgcatcga gatgctcatt 720
gagtcaaccg gaatggttag cttacaccgc caaaatgctg gcgtagtagg tcaagactct 780
gagactatcg aactcgcacc tgaatacgct gaggctatcg caacccgtgc aggtgcgctg 840
gctggcatct ctccgatgtt ccaaccttgc gtagttcctc ctaagccgtg gactggcatt 900
actggtggtg gctattgggc taacggtcgt cgtcctctgg cgctggtgcg tactcacagt 960
aagaaagcac tgatgcgcta cgaagacgtt tacatgcctg aggtgtacaa agcgattaac 1020
attgcgcaaa acaccgcatg gaaaatcaac aagaaagtcc tagcggtcgc caacgtaatc 1080
accaagtgga agcattgtcc ggtcgaggac atccctgcga ttgagcgtga agaactcccg 1140
atgaaaccgg aagacatcga catgaatcct gaggctctca ccgcgtggaa acgtgctgcc 1200
gctgctgtgt accgcaagga caaggctcgc aagtctcgcc gtatcagcct tgagttcatg 1260
cttgagcaag ccaataagtt tgctaaccat aaggccatct ggttccctta caacatggac 1320
tggcgcggtc gtgtttacgc tgtgtcaatg ttcaacccgc aaggtaacga tatgaccaaa 1380
ggactgctta cgctggcgaa aggtaaacca atcggtaagg aaggttacta ctggctgaaa 1440
atccacggtg caaactgtgc gggtgtcgat aaggttccgt tccctgagcg catcaagttc 1500
attgaggaaa accacgagaa catcatggct tgcgctaagt ctccactgga gaacacttgg 1560
tgggctgagc aagattctcc gttctgcttc cttgcgttct gctttgagta cgctggggta 1620
cagcaccacg gcctgagcta taactgctcc cttccgctgg cgtttgacgg gtcttgctct 1680
ggcatccagc acttctccgc gatgctccga gatgaggtag gtggtcgcgc ggttaacttg 1740
cttcctagtg aaaccgttca ggacatctac gggattgttg ctaagaaagt caacgagatt 1800
ctacaagcag acgcaatcaa tgggaccgat aacgaagtag ttaccgtgac cgatgagaac 1860
actggtgaaa tctctgagaa agtcaagctg ggcactaagg cactggctgg tcaatggctg 1920
gcttacggtg ttactcgcag tgtgactaag cgttcagtca tgacgctggc ttacgggtcc 1980
aaagagttcg gcttccgtca acaagtgctg gaagatacca ttcagccagc tattgattcc 2040
ggcaagggtc tgatgttcac tcagccgaat caggctgctg gatacatggc taagctgatt 2100
tgggaatctg tgagcgtgac ggtggtagct gcggttgaag caatgaactg gcttaagtct 2160
gctgctaagc tgctggctgc tgaggtcaaa gataagaaga ctggagagat tcttcgcaag 2220
cgttgcgctg tgcattgggt aactcctgat ggtttccctg tgtggcagga atacaagaag 2280
cctattcaga cgcgcttgaa cctgatgttc ctcggtcagt tccgcttaca gcctaccatt 2340
aacaccaaca aagatagcga gattgatgca cacaaacagg agtctggtat cgctcctaac 2400
tttgtacaca gccaagacgg tagccacctt cgtaagactg tagtgtgggc acacgagaag 2460
tacggaatcg aatcttttgc actgattcac gactccttcg gtaccattcc ggctgacgct 2520
gcgaacctgt tcaaagcagt gcgcgaaact atggttgaca catatgagtc ttgtgatgta 2580
ctggctgatt tctacgacca gttcgctgac cagttgcacg agtctcaatt ggacaaaatg 2640
ccagcacttc cggctaaagg taacttgaac ctccgtgaca tcttagagtc ggacttcgcg 2700
ttcgcgtaa 2709
<210> 6
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg atgatgacaa ggactacaaa 60
gatgatgacg ataaagataa agcggaattc tc 92
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acctccatag aagattctag aatggattac aaggatgacg acga 44
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagttcgatg tcagagaatt ccgctttatc tttatcgtca t 41

Claims (5)

1.一种基于T7 RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统，其特征在于，它包括：能够表达T7pol的哺乳动物细胞系、包含T7启动子及正链RNA病毒核酸序列的感染性克隆；
所述哺乳动物细胞系为整合慢病毒载体并介导T7pol表达的细胞系，该细胞系整合有SV40的T抗原，该细胞系包括HEK293FT或COS7细胞；所述慢病毒载体的质粒骨架为真核表达载体pCDH-CMV-EF1-puro，所述真核表达载体pCDH-CMV-EF1-puro的结构中含有SV40ori复制起始元件，并且T7pol的5’-端融合3个Flag表达标签；
所述感染性克隆在病毒核酸序列的5 '端上游含T7启动子；所述正链RNA病毒包括EV71肠道病毒。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述感染性克隆的质粒骨架为pcDNA3.1+，且所述pcDNA3.1+质粒结构中不含有CMV启动子。
3.一种权利要求1-2任一项所述的基于T7 RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
能够表达T7pol的哺乳动物细胞系的构建；
包含T7启动子及正链RNA病毒核酸序列的感染性克隆的构建。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述能够表达T7 RNA聚合酶的哺乳动物细胞系的构建包括以下步骤：
a将T7pol基因与易于检测表达的5’端融合蛋白标签3Flags定向插入到真核表达载体pCDH-CMV-EF1-puro的CMV启动子下游，从而得到含有T7pol、融合蛋白标签3Flags、嘌呤霉素抗性基因的双顺反子慢病毒载体pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro；
b将双顺反子慢病毒载体pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro、慢病毒包装质粒psPAX2和慢病毒包膜质粒pMD2.G按4:3:1的质量比例混合后，转染到HEK293FT中，得到整合有pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro基因的慢病毒；
c将整合有pCDH-CMV-3Flags-T7pol-EF1-puro基因的慢病毒感染HEK293FT细胞，再通过含嘌呤霉素的培养基进行筛选，得到整合有T7pol基因的稳定细胞HEK293FT/T7pol。
5.一种利用权利要求1-2任一项所述的基于T7 RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统拯救肠道病毒 EV71的方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有肠道病毒 EV71全长基因组的感染性克隆pcDNA3.1-∆CMV-T7-EV71-poly(dT)30，以及与作为转染效率指示剂的绿色荧光蛋白表达质粒pCDH-CMV-EF1-GFP混合后，转染至HEK293FT/T7pol细胞中，在含5％（v/v）CO2的37℃培养箱中进行细胞培养，当90％的细胞出现明显病变后收集病毒。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517317A (zh) * 2011-12-23 2012-06-27 中国科学院武汉病毒研究所 带有标签的肠道病毒71型全长感染性克隆的制备方法及应用

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衣壳蛋白VP0关键氨基酸位点对EV71病毒组装和侵入的影响极其机制研究;曹家铭;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 基础科学辑》;20200815;第20页第2段，第25页第2段，第32页第2段-第33页第2段、图3.3 *

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