CN101487062B - 同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒 - Google Patents
同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101487062B CN101487062B CN2008101974852A CN200810197485A CN101487062B CN 101487062 B CN101487062 B CN 101487062B CN 2008101974852 A CN2008101974852 A CN 2008101974852A CN 200810197485 A CN200810197485 A CN 200810197485A CN 101487062 B CN101487062 B CN 101487062B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- hepatitis
- aids
- sequence
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title claims abstract description 12
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 title claims description 22
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 title abstract description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title description 10
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 claims abstract description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims abstract description 24
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 47
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 47
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 36
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 13
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 13
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 8
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 claims description 6
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 4
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical group OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 claims description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 39
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 39
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 49
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 49
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 9
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 7
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 3
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000001216 nucleic acid method Methods 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 1
- 102100038108 Arylamine N-acetyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710124345 Arylamine N-acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100004280 Caenorhabditis elegans best-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 210000004914 menses Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 208000002040 neurosyphilis Diseases 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 101150055096 polA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012913 prioritisation Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒，涉及一种基因诊断试剂盒。本发明包括：1)病原体浓缩液和DNA、RNA核酸同步提取液；2)含有四种病原体检测序列的阳性质粒，四种病原体分别是乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体；3)一步法单管单酶多项联合检测的TaqMan PCR扩增体系。本发明同步实时检测；整个流程时间短，能效高；操作简单，封闭性检测，避免了可能的污染和人为误差；灵敏度高；适用于大规模高通量的血液筛查，如血液中心和生物制品生产企业开展核酸筛查，也可适用于大容量高效率的临床核酸检验。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因诊断试剂盒，具体涉及一种灵敏度高、特异性强、适合于常规血液安全核酸筛查的同步提取和同步实时检测肝炎(包括乙型肝炎和丙型肝炎)、艾滋病毒以及梅毒螺旋体核酸的试剂盒。
背景技术
艾滋病、丙型肝炎、乙型肝炎以及梅毒都是通过血液传播的重大传染性疾病，输血一直是上述疾病的主要传播途径之一。我国第一例临床报道的艾滋病病人就是通过输入不健康血液制品感染艾滋病毒的。世界卫生组织最新统计显示，全球每年有近百万人因输入不健康血液或血液制品感染艾滋病、病毒型肝炎等传染病；每年新增的艾滋病病毒携带者中，有5％至10％是经输血或血液制品感染。由于目前尚没有针对艾滋病和慢性乙型肝炎和丙型肝炎的有效根治手段，梅毒虽然在感染早期能够通过抗生素治疗，但若诊断不及时也会造成神经梅毒等器质性病变，因而预防这几种重大传染性疾病的传播显得非常重要。
卫生部和国家药品监督管理局要求单采浆站和生物制品企业必须依据《血液制品管理条例》、《单采血浆站基本标准》、《药品生产质量管理规范》和《中国生物制品规程》采集原料血浆和生产血液制品。原料血浆必须经两种不同的ELISA试剂初检、复检抗-HIV、抗-HCV、HBsAg、梅毒和ALT合格后，方可用于生产。也就是说，为保障血液安全，必须进行艾滋、丙肝、乙肝病毒以及梅毒螺旋体四种病原的检测。因为艾滋病、丙型肝炎、乙型肝炎以及梅毒都是通过血液传播的重大传染性疾病，输血一直是上述疾病的主要传染途径之一。我国是临床用血大国，据国家卫生行政部门初步统计，2007年全国各主要血站采集的血液样本超过800多万份，为2百多万病人提供了输血治疗。另外我国每年血液制品(如人血白蛋白，静注丙种球蛋白等)生产所需的人血浆在3000吨，约需采集500多万人份的人血浆，血源的质量安全至关重要。但到目前为止，国内仍主要通过酶联免疫法产品来进行血液的筛查。免疫学诊断法尽管随着第三代单克隆诊断抗体的出现，提高了检测的灵敏度，并在一定程度上减少了血源传播病毒性疾病的机率；但由于受免疫学诊断方法的限制，依然不能完全杜绝阳性病毒血样(血浆)的漏检，其主要原因在于：免疫学诊断主要依赖抗原/抗体的免疫反应，而病毒感染机体后，机体产生可供检出的抗体滴度需要一段相对较长的时间；另外，由于个体免疫应答的不同，其中有少数感染者感染病毒后机体所产生的抗体滴度很低，很难用免疫学方法检测出来，甚至有些人无免疫应答反应，不产生抗体。因此，免疫学诊断方法不能检测出处于“窗口期”和新近感染病毒的献血员，势必造成漏检。因而无法确保用血的安全，每年各地都会发生相当数量因输血和使用血液制品而导致感染的病例，血液安全的快速确认检测是避免这几种重大传染性疾病的经血液传播的行之有效的手段，但由于目前使用血液安全检测技术有一定缺陷，存在较大的漏检隐患，必须研究新的先进的血液安全替代检测方法。
国外研究证实，采用核酸检测方法(NAT)后，HBV、HCV、HIV病毒的窗口期较抗体检测分别提前9天、25天和14天。目前欧美血液制品生产企业已普遍采用NAT筛查血浆，WHO生物标准化委员会也有专门会议讨论并认定NAT在血液和血液制品病毒安全性检测方面的使用，迄今为止正式通过美国FDA认证可用于血液筛检的试剂仅有2种，即Roche COBAS AmpliScreen HBV/HCV/HIV和Chiron Procleix TMAHIV21/HCV检测系统，FDA评判这些试剂是否能用于血液筛检的标准之一为：必须对50cp/ml的病毒核酸的检出率＞95％。然而，尽管NAT方法在保障血液安全方面的优势显而易见，到目前为止，国内还没有推广和普及该项技术。并且，国外的情况并不完全适用于国内，国外的NAT方法针对的病源主要是HIV、HBV、HCV三种病毒，这三种病毒是影响国外血液安全的最大祸患；国内的情况是除了这三种病毒外，必须进行梅毒检测，因为随着改革开放和国内性观念的变化，梅毒的发病率呈上升趋势，也是影响血液安全的罪魁祸首。目前，尽管国外已研制和开发了针对三种病毒的NAT方法和试剂，也有企业正在报批相关产品，但国内外都还没有针对这四种病原体核酸同步定量检测的技术和产品。因此，开展血液安全高通量的多重(四重)PCR核酸检测方法(MNAT)对有效防止输血感染、保障血液安全有着十分重要和实际的意义。本发明及其产品的推广应用将会极大地提供我国血液安全检测的技术水平，从传染源头上减少和控制艾滋、肝炎等重大传染病的传播，必将产生无可估量的经济和社会效益。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒(简称本试剂盒)。
本发明的目的是这样实现的：
本试剂盒是一种多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括：
1)病原体浓缩液和DNA、RNA核酸同步提取液
所述的病原体浓缩液是基于有机絮凝沉淀原理使用浓度为20％PEG6000的生理盐水溶液对病原体进行浓缩；
所述的DNA、RNA同步提取液由终浓度为4mol/L异硫氰酸胍，0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.1mmol/L β巯基乙醇，25mmol/L柠檬酸钠，0.20g/L糖原组成，其优点是既避免了漏检又不会干扰后续的荧光定量PCR检测，以此作为对《以Taq酶对DNA和RNA病原进行同步PCR检测的方法》专利技术(专利号ZL01133528.9)中血清中提取病原体核酸方法的补充。
2)含有四种病原体检测序列的阳性质粒
四种病原体包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体。阳性质粒含有这四种病原体PCR检测扩增片段的所有序列，其构建方法如下：
a)利用T载体pTA-2构建分别含有四种病原体扩增片段的质粒(pT～HBV，pT-HCV，pT-HIV，pT-TP)；乙型肝炎病毒标准阳性模板pT-HBV包含Pre-S基因的94个碱基对的核苷酸，丙型肝炎病毒标准阳性模板pT-HCV包含5’UTR序列的98个碱基对的核苷酸，艾滋病毒标准阳性模板pT-HIV包含gag基因的139个碱基对的核苷酸，梅毒螺旋体标准阳性模板pT-TP包含poly A基因的136个碱基对的核苷酸；
乙型肝炎病毒标准阳性模板pT-HBV包含的Pre-S基因的94个碱基对的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)：
GCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCT；
丙型肝炎病毒标准阳性模板pT-HCV包含的5’UTR序列的98个碱基对的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.8)：
CCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATG；
艾滋病毒标准阳性模板pT-HIV包含的gag基因的139个碱基对的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.12)：
TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAATACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGC；
梅毒螺旋体标准阳性模板pT-TP包含的poly A基因的136个碱基对的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.16)：
TGCGTGACGATGTACCATGTGTTTTTTCGCTCGAAGATTCCTGTTGTATTCCGCTCGATGTAACGTCTGCTGCACGTATTTTTGTGCGAGAAGGATTGCATGCGCTTGCACAACAATATCGTGCTTGTGTGCAAGA；
b)利用pTA-2(见附图1)多克隆位点两边最接近连接的扩增片段处都含有EcoR I酶切位点，利用EcoR I酶单酶切回收得到分别含有四段酶切片段的小片段；
c)将含有HIV、HCV、HBV和TP的小片段两两之间进行酶连(HIV与HCV，HBV与TP)，再分别以IR，：5’-GCA GCT TCC TCA TTG ATG GTC TC-3’(SEQ.ID.NO.17)和CR：5’-CCT GGC AAT TCC GGT GTA CTC-3’(SEQ.ID.NO.18)，BF：5’-GCG GCG TTT TAT CAT CTT CCT C-3’(SEQ.ID.NO.19)和TR：5’-TCT TGC ACA CAA GCA CGA TAT TG-3’(SEQ.ID.NO.20)为正反向引物，用上海申能博彩公司的Taq plus DNA聚合酶(高保真，扩增产物带有A尾)分别对HIV&HCV，HBV&TP小片段的酶连产物进行特异性PCR扩增(分别用引物IR&CR和BF&TR)放大并分别进行回收；
d)将回收的片段分别与pTA-2载体进行连接，测序并将形成的质粒分别转化到大肠杆菌Top 10细胞中；
e)利用pTA-2载体多克隆位点仅仅含有一个Pst I酶酶切位点且紧挨其中一个EcoR I酶切位点，对两种分别含有两种病原体扩增片段的质粒进行Pst I单酶切，并对形成的直链DNA片段进行回收；
f)将这两段DNA片段进行连接，根据测序结果分别以BF&IR为正方向引物，用上海申能博彩公司的Taq plus DNA聚合酶(高保真，扩增产物带有A尾)对酶连产物进行特异性扩增放大并分别进行回收；
g)将回收的片段与T载体PTA-2进行连接，测序，即得到含四种病原体PCR检测扩增片段的所有序列的阳性质粒pT-multy(序列见附图2)。因为每段病原体检测扩增片段两边都是EcoR I酶切位点，故在使用前很容易被NEB的EcoR
I快速酶(浓度为20，000U/ml室温或者37℃下5分钟)进行单酶切切成分别含有一种病原体扩增序列的小片段(因带有酶切位点，其长度又大于扩增片段)，不但更贴切实际应用时的模板形态，也避免了质粒作为标准品时容易形成气溶胶而引起的实验室大面积假阳性污染现象。
3)一步法单管单酶多项联合检测的TaqMan PCR扩增体系
一步法单管单酶多项联合检测的TaqMan PCR扩增体系基于TaqMan探针和Taq酶自身具有逆转录活性的DNA和RNA核酸同步扩增的方法，其特点是使用单管的单酶体系试剂，多项检测的项目既含DNA，又含RNA，既有病毒也有螺旋体，所选用的抗污染体系为经典的UNG-dUTP系统，主要适用于血液筛查，。所使用基于专利《以Taq酶对DNA和RNA病原进行同步PCR检测的方法》(专利号ZL
01133528.9)的技术，不需要逆转录酶，无专门的逆转录过程。常规检测RNA病原体时候都是使用逆转录酶和热启动DNA酶的双酶体系，而逆转录酶不耐热，RT温度最优为45-55℃，而在此温度下，常规的基因工程制备的UNG(如目前市售的绝大多数的UNG)具有降解逆转录出来的含U的DNA(称为U-DNA)，故同步检测DNA和RNA病原体核酸时不能使用抗污染的UNG-dUTP经典系统。我们发明的一个突出特点就是无需专门的逆转录酶和逆转录过程，故可以如同普通的DNA病原体检测荧光定量试剂盒一样使用抗污染的UNG-dUTP经典系统。经检索国内有一家公司使用双酶单管RT-PCR体系引入抗污染方案并且能成功用于多项对灵敏度有要求的同步检测(既有DNA又有RNA)，但使用的是不耐热的UNG，因其市场使用率不高，价格相对昂贵。而使用单酶体系(比如日本罗氏公司关于自动化多项Z05酶单酶单管RT-PCR TaqMan体系用于血筛的初步应用报道)，不但价格昂贵，且一般单酶体系为公司专利所有，难以推广应用。现有的双酶和单酶体系不是价格昂贵就是生产和使用步骤繁琐，使用本发明的方法不但可以降低试剂盒的成本还能简化生产的步骤。本发明的同步多项检测试剂最突出的优点在于该检测试剂的优秀的灵敏度和其特异性及在中国甚至亚太出现的各亚型的覆盖率(在NCBI上对迄今为止所有中国源的病原体序列进行比对，选取检测的探针序列与95％以上的病原体核酸序列完全匹配)并且不同亚型扩增效率近似等效。
所述引物：查看有关艾滋、丙肝乙肝病毒和梅毒病原体国内外文献，确定以gag基因作为艾滋病毒的荧光定量PCR检测靶点，IF：5’-TCA GCC CAG AAGTAA TAC CCA TG-3’(SEQ.ID.NO.21)，IR：5’-GCA GCT TCC TCA TTG ATG GTCTC-3’(SEQ.ID.NO.17)。5’UTR序列作为丙肝病毒的荧光定量PCR检测靶点，CF：5’-CAT GGC GTT AGT ATG AGT GTC G-3’(SEQ.ID.NO.22)，CR：5’-CCTGGC AAT TCC GGT GTA CTC-3’(SEQ.ID.NO.18)。Pre-S基因作为乙肝病毒的荧光定量PCR检测靶点，BF：5’-GCG GCG TTT TAT CAT CTT CCT C-3’(SEQ.ID.NO.19)，BR：5’-AGG ACA AAC GGG CAA CAT ACC-3’(SEQ.ID.NO.23)。以polA基因作为梅毒(TP)的荧光定量PCR检测靶点，TF：5’-TGC GTG ACG ATG TAC CAT GTG-3’(SEQ.ID.NO.24)，TR：5’-TCT TGCACA CAA GCA CGA TAT TG-3’(SEQ.ID.NO.20)。
所述探针为TaqMan探针，分别由不同的荧光基因标记或相同的荧光基因标记，但是至少用于校正加样误差内标的荧光基团不能同于检测探针的荧光基团(若使用Bio-Rad公司的Bio-rad chromo4四通道实时定量PCR仪以及升级产品或者CFX96TM Real-Time PCR Detection System具有独特的开放性加样误差校正技术，不依赖于用于校正加样误差内标的荧光基团，避免人为加样误差，保证定量结果的准确性，可以考虑省略作为内标的荧光基团，但不推崇)，而优选的TaqMan探针为3端为非荧光淬灭基团的TaqMan探针，如BHQ或者Eclipse等。本发明中采用的探针序列为：HIV探针为：5’JOE(VIC/CY-3)-AGC ATT ATCAGA AGG AGC CAC CCC ACA AG-Eclipse3’(SEQ.ID.NO.25)；HCV探针为：5’FAM-CCG GTT CCG CAG ACC ACT ATG GCT-Eclipse3’(SEQ.ID.NO.26)；HBV探针为：5’TAMARA-CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTT CTT GTT GG-Eclipse3’(SEQ.ID.NO.27)；梅毒(TP)探针为：5’CY-5-TCG CTC GAA GAT TCC TGT TGTATT CCG CT-Eclipse3’(SEQ.ID.NO.28)，内标校正基团选用的是ROX。上述探针标记的发光基团参考的是ABI 7500荧光定量PCR仪的荧光检测通道，由于使用不同型号的仪器所标记的探针发光基团可以进行微调。如果不需要确定所检测的样品中含有具体哪一种病原体核酸，而是仅仅依据有无对样品进行合格不合格鉴定，可以对4种病原体的探针标记相同的发光基团。
荧光定量PCR反应液包含：20.0mmol/L MgSO4的10×buffer，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体正反向引物分别是10μmol/L，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体的荧光探针分别是10μmol/L，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs mix和无菌双蒸水组成。
综上所述，本发明在于提出一种测定HBV，HCV，HIV病毒以及梅毒螺旋体核酸的试剂盒，包括同步提取HBV，HCV，HIV病毒以及梅毒螺旋体核酸的浓缩和提取试剂，其中含有病原体浓缩液、异硫氰酸胍一步法DNA、RNA同步提取液，和HBV，HCV，HIV病毒以及梅毒螺旋体核酸扩增试剂，其中含有荧光定量反应液、探针、Taq酶、阳性对照等。匹配仪器可使用美国ABI公司的ABI7500荧光定量PCR仪、Bio-Rad公司的Bio-rad chromo4四通道实时定量PCR仪或CFX96TMReal-Time PCR Detection System、Roche的LightCycler 480及以上级别定量PCR仪等，但不局限于这些。本试剂盒优秀的品质很大程度上取决于所选用的HBV，HCV，HIV病毒以及梅毒螺旋体的引物和TaqMan探针序列。因此，本试剂盒所公布的引物、探针、阳性质粒中含四种病原体PCR检测扩增片段的序列以及起互补序列毫无疑问应当受到所申请要求的权利保护之内。
本试剂盒的工作原理：
本发明提供的同步扩增检测肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋体核酸的荧光定量PCR试剂盒中，有标记了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3’端非荧光淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化且本底低。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’端到3’端外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋体的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模板数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
在本发明提供的同步扩增检测乙型、丙型肝炎、艾滋病毒及梅毒螺旋体核酸的荧光定量PCR试剂盒中，针对乙型、丙型肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋体检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg2+浓度、退火温度等的优化，并将荧光定量PCR技术和定量检测系统相结合，将其用于乙型、丙型肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋体同步定量检测。通过优化方案，反复试验，建立了同步检测乙型、丙型肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋体荧光定量PCR方法，并研制出同步检测肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋体荧光定量PCR试剂盒，可以满足快速同步诊断乙型、丙型肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋体的要求。
本试剂盒需配合荧光定量PCR仪使用。
本试剂盒的使用方法包括下列步骤：
a)对浓度为1010拷贝/μl标准阳性模板进行10倍的系列稀释，制备阳性标准品，用紫外分光光度计测定A260对标准品定量；
b)用DNA、RNA同步提取的方法或者基于专利《以Taq酶对DNA和RNA病原进行同步PCR检测的方法》(专利号ZL 01133528.9)中血清中提取病原体核酸方法从待测标本中提取核酸；
c)分别取b)步中的核酸和同样量的系列稀释的a)步中的两种阳性标准品加入到含有Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量PCR仪进行PCR检测；
d)通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。
本试剂盒的功能：
我国艾滋病毒携带者超过100万人，乙肝病毒携带者1.2亿人、丙肝病毒携带者4000万人。由于目前尚没有针对艾滋病和慢性乙型肝炎和丙型肝炎的有效根治手段，预防这几种重大传染性疾病的传播显得非常重要。梅毒在感染早期虽然能够治疗，但由于早期症状较轻，不易发现，目前一般情况下，很少人主动进行梅毒检测，到了晚期造成器质性损伤特别是神经损伤后很难治愈和恢复。由于这几种重大传染源都是经血传播，故血液安全的快速确认检测是避免这几种重大传染性疾病的经血液传播的行之有效的手段。本试剂盒是血液安全检测领域的升级产品，可对乙型、丙型肝炎、艾滋病毒及梅毒螺旋体进行同步定量检测，可检出标本中极微量的核酸，在病毒感染后数天即能检出，大大缩短“窗口期”，尽管从理论上并不能完全消除感染“窗口期”，但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低，可以有效地预防经输血传播病毒性疾病，使输血传播疾病的危险性降到最低。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1、病毒和螺旋体两种病原体，DNA、RNA两种核酸同步提取，同步实时检测，并且提供了一种浓缩液，可以富集体液中的病毒；
2、整个流程时间短，能效高，96个测试仅仅3个小时就快速完成并报告可信度极高的结果；
3、操作简单，封闭性检测，避免了可能的污染和人为误差；
4、灵敏度高(每个体系最低检测限达到1拷贝)；
5、适用于大规模高通量的血液筛查，如血液中心和生物制品生产企业开展核酸筛查，也可适用于大容量高效率的临床核酸检验。
本试剂盒用途验证：
美国罗氏分子系统公司开发出商业化检测外周血单核细胞，血浆，或其它体液中数种病毒的检测及量化的分析方法Roche COBAS AmpliScreen HBV/HCV/HIV，与核酸提取仪联用其灵敏度可以达到检测被处理样品中1～100个靶DNA或RNA分子，而本试剂盒在基于长期工作积累和拥有发明专利基础上，其灵敏度达到了每ml样品20个靶DNA或RNA分子，重复性达到95％，且没有运用核酸提取仪。试剂盒中四种检测探针和引物都可以单独组成针对一种病原体(HCV，HIV，HBV，TP)的检测试剂盒，组装成四重荧光定量试剂盒后分别检测四种病原体(100人份单独血样)，比单一检测试剂盒检测时检测20拷贝/ml时的Ct值分别延后1.67，0.85，0.92和1.08。
附图说明
图1是pTA2 Vector序列信息；
图2是标准阳性模板中连接进pTA2 Vector载体的序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)：D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南：吕鸿声，科学出版社，1982，或按照制造厂商所建议的条件。
一、实施例1：试剂盒组成与配制
1、病原体浓缩液与DNA、RNA同步提取液
为自己配制，病原体浓缩液：PEG6000体积分数为20％的生理盐水溶液。DNA、RNA同步提取液：终浓度为4mol/L异硫氰酸胍，体积分数为0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.1mmol/L β巯基乙醇，25mmol/L柠檬酸钠，0.20g/L糖原。
2、荧光PCR反应液
.20.0mmol/L MgSO4的10×buffer，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体正反向引物分别是10μmol/L，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体的荧光探针分别是10μmol/L，25mmol/L
MgCl2，10mmol/L dNTPs mix和无菌双蒸水组成。
3、标准阳性模板贮存液
浓度为1010拷贝/μl标准阳性模板pT-multy在使用前很用NEB的EcoR I快速酶(室温下5分钟)酶切成分别含有一种病原体扩增序列的小片段，再进行10倍系列稀释；或者将pT-HBV，pT-HCV，pT-HIV以及pT-TP直接分别进行10倍系列稀释。
4、阴性质控标准品：为无菌双蒸水
二、实施例2：使用试剂盒同步检测乙型、丙型肝炎、艾滋病毒及梅毒螺旋体
1、将100μl体液标本放入1.5ml离心管中，加入等体积的病原体浓缩液充分震荡摇匀，10000g离心15min，沉淀直接加50μlDNA、RNA同步提取液充分混匀，37℃或室温放置15min；再加入100ul-20℃预冷的异丙醇，4℃沉淀15min，10000g离心15min，弃去上清；往沉淀中加500ul 75％乙醇，颠倒数次以洗涤残存异丙醇，13000rpm离心15min，轻轻倒去上清；3000rpm离心10sec，将管壁残存液体甩到底部，用微量枪头吸干，室温干燥2-3min(不可过分干燥，防止下一步核酸不溶解)；加入40ul DEPC水(加入DEPC的纯水高压后的水即为DEPC水)，轻轻混匀溶解核酸。3000g离心5sec，冰上保存，使用时取20ul(最好2小时内使用，以免核酸特别是RNA降解)
2、将阳性标准模板质pT-multy用NEB公司的EcoR I快速内切酶处理后(酶切体系所用双蒸水必须是DEPC处理过的)快速加热到90℃灭活内切酶的活力，再进行10倍系列稀释到108拷贝/μl，107拷贝/μl，106拷贝/μl，105拷贝/μl，104拷贝/μl，103拷贝/μl，102拷贝/μl，101拷贝/μl，100拷贝/μl。或者将pT-HBV，pT-HCV，pT-HIV以及pT-TP分别进行10倍系列稀释到108拷贝/μl，107拷贝/μl，106拷贝/μl，105拷贝/μl，104拷贝/μl，103拷贝/μl，102拷贝/μl，101拷贝/μl，100拷贝/μl。
3、分别取荧光定量PCR反应液各30μl，取第a)步提取的核酸20μl和第b)步稀释的阳性标准模板1μl以及19μl双蒸水，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，对应于样品其浓度分别是2×108拷贝/ml，2×108拷贝/ml，2×107拷贝/ml，2×106拷贝/ml，2×105拷贝/ml，2×104拷贝/ml，2×103拷贝/ml，2×102拷贝/ml，20拷贝/ml在荧光定量PCR仪上平行做PCR检测。循环条件为：94℃预变性3min，58℃退火3min，65℃延伸15min(Taq DNA聚合酶逆转录活性最大)；循环过程使用两步法94℃ 30s，58℃ 1min，45个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，同步检测FAM，JOE，TAMARA，CY-5以及用于校正加样误差的荧光基团ROX。
循环结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数，结果为：HBV、TP、HCV、HIV在2×105拷贝/ml，2×104拷贝/ml，2×103拷贝/ml，2×102拷贝/ml和20拷贝/ml的模板浓度时平均Ct值分别是：
28.16，31.29，34.75，38.03，41.21；27.21，31.12，34.51，37.91，41.03；
28.25，30.71，34.12，37.52，40.60；26.97，31.16，34.51，37.74，41.27；阴性对照为0；
反复重复试验三次，得到的Ct值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。
从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需约2.5个小时就能完成，大大缩短了时间。
试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程，一次可检测32-384个
(由定量仪器型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。
序列表
<110>武汉大学
<120>同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒
<140>200810197485.2
<141>2008-10-31
<160>28
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
GCGGCGTTTTATCATCTTCCTC
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
AGGACAAACGGGCAACATACC
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<221>探针
<400>
CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGG
<210>4
<211>94
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)
<400>
GCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCT 60
TCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCT 94
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
TCAGCCCAGAAGTAATACCCATG
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
CCTGGCAATTCCGGTGTACTC
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<221>探针
<400>
CCGGTTCCGCAGACCACTATGGCT
<210>8
<211>98
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)
<400>
CCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGG 60
GGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATG 98
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
CATGGCGTTAGTATGAGTGTCG
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
GCAGCTTCCTCATTGATGGTCTC
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<221>探针
<400>
AGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAG
<210>12
<211>139
<212>DNA
<213>艾滋病毒(human immunodeficiency virus，HIV)
<400>
TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATT 60
TAAATACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGA 120
CCATCAATGAGGAAGCTGC 139
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
TGCGTGACGATGTACCATGTG
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
TCTTGCACACAAGCACGATATTG
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<221>探针
<400>
TCGCTCGAAGATTCCTGTTGTATTCCGCT
<210>16
<211>136
<212>DNA
<213>梅毒螺旋体(treponema pallidum，TP)
<400>
TGCGTGACGATGTACCATGTGTTTTTTCGCTCGAAGATTCCTGTTGTATTCCGCTCGATG 60
TAACGTCTGCTGCACGTATTTTTGTGCGAGAAGGATTGCATGCGCTTGCACAACAATATC 120
GTGCTTGTGTGCAAGA 136
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
GCAGCTTCCTCATTGATGGTCTC
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
CCTGGCAATTCCGGTGTACTC
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
GCGGCGTTTTATCATCTTCCTC
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
TCTTGCACACAAGCACGATATTG
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
TCAGCCCAGAAGTAATACCCATG
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
CATGGCGTTAGTATGAGTGTCG
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
AGGACAAACGGGCAACATACC
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
TGCGTGACGATGTACCATGTG
<210>25
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
AGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAG
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
CCGGTTCCGCAGACCACTATGGCT
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
AGGACAAACGGGCAACATACC
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<221>引物
<400>
TCGCTCGAAGATTCCTGTTGTATTCCGCT
136
Claims (1)
1.一种同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：
1)病原体浓缩液和DNA、RNA核酸同步提取液
所述的病原体浓缩液是由终浓度为20％的PEG6000的生理盐水溶液组成；所述的DNA、RNA同步提取液由终浓度为4mol/L异硫氰酸胍，0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.1mmol/Lβ巯基乙醇，25mmol/L柠檬酸钠，0.20g/L糖原组成；
2)分别含有四种病原体检测序列的阳性质粒，四种病原体分别是乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体；
乙型肝炎病毒标准阳性模板pT-HBV包含的Pre-S基因的94个碱基对的核苷酸序列如列表中NO.4：
GCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCT；
丙型肝炎病毒标准阳性模板pT-HCV包含的5’UTR序列的98个碱基对的核苷酸序列如列表中NO.8：
CCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATG；
艾滋病毒标准阳性模板pT-HIV包含的gag基因的139个碱基对的核苷酸序列如列表中NO.12：
TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAATACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGC；
梅毒螺旋体标准阳性模板pT-TP包含的poly A基因的136个碱基对的核苷酸序列如列表中NO.16：
TGCGTGACGATGTACCATGTGTTTTTTCGCTCGAAGATTCCTGTTGTATTCCGCTCGATGTAACGTCTGCTGCACGTATTTTTGTGCGAGAAGGATTGCATGCGCTTGCACAACAATATCGTGCTTGTGTGCAAGA；
3)同时含有四种病原体检测序列的阳性质粒，四种病原体分别是乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体；
同时含有乙型肝炎病毒的高度保守基因-Pre-S基因的94个碱基对片段如列表中NO.4，丙型肝炎病毒的高度保守基因-5′UTR基因的98个碱基对的核苷酸片段如列表中NO.8，艾滋病毒的的高度保守基因-gag基因139个碱基对的核苷酸片段如列表中NO.12和梅毒螺旋体的高度保守基因-poly A基因136个碱基对的核苷酸片段如列表中NO.16；
该阳性模板序列见图2；
4)一步法单管单酶多项联合检测的TaqMan PCR扩增体系，由含有20.0mmol/L MgSO4的10×buffer，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体正反向引物分别是10μmol/L，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体的荧光探针分别是10μmol/L，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPsmix和无菌双蒸水组成，其中引物和荧光探针如下：
①乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒正向引物如序列表中NO.1所示5′-GCGGCGTTTTATCATCTTCCTC-3′，
乙型肝炎病毒反向引物如序列表中NO.2所示5′-AGGACAAACGGGCAACATACC-3′；
乙型肝炎病毒荧光探针序列如序列表中NO.3所示5′-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGG-3′；
荧光探针5′端标记报告荧光基团TAMRA，3′端标记不发光的淬灭基团Eclipse标记，标准阳性模板是含有乙型肝炎病毒的Pre-S基因的94个碱基对的核苷酸片段构成的pTA-2载体，该载体在大肠杆菌Top10中增殖；
②丙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒正向引物如序列表中NO.5所示5′-CATGGCGTTAGTATGAGTGTCG-3′，
丙型肝炎病毒反向引物如序列表中NO.6所示5′-CCTGGCAATTCCGGTGTACTC-3′；
丙型肝炎病毒荧光探针序列如序列表中NO.7所示5′-CCGGTTCCGCAGACCACTATGGCT-3′；
荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团Eclipse标记，标准阳性模板是含有丙型肝炎病毒的5’UTR序列的98个碱基对的核苷酸片段构成的pTA-2载体，该载体在大肠杆菌Top10中增殖；
③艾滋病毒
艾滋病毒正向引物如序列表中NO.9所示5′-TCAGCCCAGAAGTAATACCCATG-3′，
艾滋病毒反向引物如序列表中NO.10所示5′-GCAGCTTCCTCATTGATGGTCTC-3′；
艾滋病毒荧光探针序列如序列表中NO.11所示5′-AGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAG-3′；
荧光探针5′端标记报告荧光基团JOE/VIC/Cy-3，3′端标记不发光的淬灭基团Eclipse标记，标准阳性模板是含有艾滋病毒的gag基因139个碱基对的核苷酸片段构成的pTA-2载体，该载体在大肠杆菌Top10中增殖；
④梅毒螺旋体
梅毒螺旋体正向引物如序列表中NO.13所示5′-TGCGTGACGATGTACCATGTG-3′，
梅毒螺旋体反向引物如序列表中NO.14所示5′-TCTTGCACACAAGCACGATATTG-3′；
梅毒螺旋体荧光探针序列如序列表中NO.15所示5′-TCGCT CGAAG ATTCCTGTTG TATTC CGCT-3′；
荧光探针5′端标记报告荧光基团Cy-5，3′端标记不发光的淬灭基团Eclipse标记，标准阳性模板是含有梅毒螺旋体的poly A基因136个碱基对的核苷酸片段构成的pTA-2载体，该载体在大肠杆菌Top10中增殖。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008101974852A CN101487062B (zh) | 2008-10-31 | 2008-10-31 | 同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008101974852A CN101487062B (zh) | 2008-10-31 | 2008-10-31 | 同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101487062A CN101487062A (zh) | 2009-07-22 |
| CN101487062B true CN101487062B (zh) | 2013-11-27 |
Family
ID=40890122
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008101974852A Active CN101487062B (zh) | 2008-10-31 | 2008-10-31 | 同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101487062B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107287348A (zh) * | 2017-06-19 | 2017-10-24 | 广州和实生物技术有限公司 | 一种血筛三项多色单管检测试剂盒 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101886140B (zh) * | 2010-07-06 | 2012-09-05 | 上海市血液中心 | 针对病毒性肝炎病原体的多重pcr检测试剂盒及其制备和应用 |
| CN102277418A (zh) * | 2011-01-26 | 2011-12-14 | 宁波基内生物技术有限公司 | 一种用于检测梅毒螺旋体的引物、试剂盒及方法 |
| CN102212618B (zh) * | 2011-05-22 | 2013-02-27 | 浙江大学 | 四重荧光定量pcr检测试剂盒及用途 |
| CN102634453A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-08-15 | 厦门大学附属中山医院 | 梅毒螺旋体bmp基因FQ-PCR检测试剂盒及其制备 |
| CN102634452A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-08-15 | 厦门大学附属中山医院 | 梅毒螺旋体tpn47基因fq-pcr检测试剂盒及其制备 |
| CN102634451A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-08-15 | 厦门大学附属中山医院 | 梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒及其制备 |
| US20170044631A1 (en) * | 2014-04-14 | 2017-02-16 | The Unite States of America, as represented by the Secretary, Dept. of Health and Human Services | Methods for rapid detection and identification of viral nucleic acids |
| JP6685138B2 (ja) * | 2016-01-27 | 2020-04-22 | シスメックス株式会社 | 核酸増幅の精度管理方法、精度管理用試薬およびその試薬キット |
| CN105624311A (zh) * | 2016-03-08 | 2016-06-01 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 单管中多重靶核酸的实时荧光pcr检测方法及其试剂盒 |
| CN106834542B (zh) * | 2017-02-17 | 2020-04-14 | 东莞市儿童医院 | 一种同步扩增检测hcmv、hsv1、hsv2和b19的引物、探针、试剂盒及方法 |
| CN109777891A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-05-21 | 上海邦耀生物科技有限公司 | 一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合和检测方法 |
| CN114375342A (zh) * | 2019-07-30 | 2022-04-19 | 东洋纺株式会社 | 经改良的病毒检测方法 |
| CN111206116A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-05-29 | 武汉尚码生物科技有限公司 | 一种人四种传染病的快速检测方法、液相芯片及试剂盒 |
| CN113234866B (zh) * | 2021-06-30 | 2023-11-14 | 上海君远生物科技有限公司 | 一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒及其检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1346893A (zh) * | 2001-09-30 | 2002-05-01 | 武汉大学 | 以Taq酶对DNA和RNA病原进行同步PCR检测的方法 |
| CN1405322A (zh) * | 2001-08-09 | 2003-03-26 | 上海博华基因芯片技术有限公司 | 一种对丙肝、乙肝、爱滋和梅毒病毒进行共检的基因芯片及其检测方法 |
| CN1405564A (zh) * | 2001-08-17 | 2003-03-26 | 上海数康生物科技有限公司 | 用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法 |
| CN1940087A (zh) * | 2006-08-18 | 2007-04-04 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种同步扩增检测肝炎及艾滋病毒核酸的方法及试剂盒 |
-
2008
- 2008-10-31 CN CN2008101974852A patent/CN101487062B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1405322A (zh) * | 2001-08-09 | 2003-03-26 | 上海博华基因芯片技术有限公司 | 一种对丙肝、乙肝、爱滋和梅毒病毒进行共检的基因芯片及其检测方法 |
| CN1405564A (zh) * | 2001-08-17 | 2003-03-26 | 上海数康生物科技有限公司 | 用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法 |
| CN1346893A (zh) * | 2001-09-30 | 2002-05-01 | 武汉大学 | 以Taq酶对DNA和RNA病原进行同步PCR检测的方法 |
| CN1940087A (zh) * | 2006-08-18 | 2007-04-04 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种同步扩增检测肝炎及艾滋病毒核酸的方法及试剂盒 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107287348A (zh) * | 2017-06-19 | 2017-10-24 | 广州和实生物技术有限公司 | 一种血筛三项多色单管检测试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101487062A (zh) | 2009-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101487062B (zh) | 同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒 | |
| Afzal et al. | Absence of detectable measles virus genome sequence in blood of autistic children who have had their MMR vaccination during the routine childhood immunization schedule of UK | |
| CN109609689B (zh) | 用于检测肠道病毒的核酸试剂、试剂盒及系统 | |
| CN101886138A (zh) | 肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光rt-pcr联合检测方法及其试剂盒 | |
| WO2018035860A1 (zh) | 同时检测及定量分析四种血源性病毒的多重Taqman探针qPCR的试剂盒及方法 | |
| CN101017140A (zh) | 人肠道病毒(ev)荧光定量pcr检测技术 | |
| CN102559930A (zh) | 一种荧光定量rt-pcr检测丙型肝炎病毒的试剂盒 | |
| CN109576397A (zh) | 一种人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒 | |
| Saad et al. | Prevalence of occult hepatitis C in Egyptian patients with non alcoholic fatty liver disease | |
| CN107529559A (zh) | 一种手足口病病毒的多重荧光pcr检测试剂盒、及应用 | |
| CN109439777A (zh) | 梅毒螺旋体(tp)-pcr荧光检测试剂盒 | |
| CN101871013B (zh) | 检测水痘-带状疱疹病毒的试剂盒 | |
| CN103045756A (zh) | 一种荧光定量rt-pcr检测人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒 | |
| CN103966356A (zh) | 人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN104846116B (zh) | 检测人类免疫缺陷病毒1型的pcr引物组、探针及其试剂盒和检测方法 | |
| CN102719566A (zh) | 检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒 | |
| Jongen et al. | Polymyositis and dermatomyositis: no persistence of enterovirus or encephalomyocarditis virus RNA in muscle. | |
| CN102108420B (zh) | 一种检测登革1型病毒的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN109321683A (zh) | 一种a型塞尼卡病毒检测引物、试剂盒、病毒检测方法和应用 | |
| CN114085929A (zh) | 一种用于检测非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株的试剂盒 | |
| Ikomey et al. | Observed HIV drug resistance associated mutations amongst naïve immunocompetent children in Yaoundé, Cameroon | |
| CN103131797A (zh) | 一种博卡病毒实时荧光pcr检测试剂盒及其应用 | |
| US20100255459A1 (en) | Control for virus detection assays based on reverse-transcription polymerase chain reaction | |
| Hazazi et al. | Hepatitis C Virus Genotyping in Saudi Population | |
| US20160289778A1 (en) | Hcv genotyping algorithm |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: WUHAN ZHENFU PHARMACEUTICAL CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: WUHAN UNIVERSITY Effective date: 20140729 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 430072 WUHAN, HUBEI PROVINCE TO: 430074 WUHAN, HUBEI PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20140729 Address after: 430074 No. 166, hi tech Avenue, East Lake Development Zone, Hubei, Wuhan Patentee after: WUHAN ZHENFU PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 430072 Hubei city of Wuhan province Wuchang Luojiashan Patentee before: Wuhan University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240108 Address after: Buildings 1, 2, and 4, Phase I of Donghu High tech Smart City, No. 216 Jianshe Avenue, Gedian Development Zone, Ezhou City, Hubei Province, 436070 Patentee after: Hubei Zhen Fu Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: No. 166 Gaoxin Avenue, Donghu Development Zone, Wuhan, Hubei Province, 430074 Patentee before: WUHAN ZHENFU PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |