CN114375342A - 经改良的病毒检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供利用单酶体系一步式RT‑PCR法从未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样中检测RNA病毒的存在的手段。在一个实施方式中，本发明提供一种用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法，其特征在于，包括以下工序：(1)制备混合液的工序，将事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样、与包含分子量为5～500kDa的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT‑PCR反应液混合而制备混合液；以及，(2)将反应容器密闭后实施一步式RT‑PCR反应的工序。本发明的特征还在于，使用包含属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT‑PCR反应液。

Description

经改良的病毒检测方法
技术领域
本发明涉及基于核酸扩增的RNA病毒检测方法。更具体而言，涉及通过将事先未实施离心分离操作且包含不溶物质的试样、与单酶体系的实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的反应液混合来检测RNA病毒。本发明的方法例如能够检测粪便试样、血液试样、环境擦拭试样等中的RNA病毒。本发明还能用于生命科学研究、临床诊断、食品卫生检测、环境检测等。
背景技术
核酸扩增法是将几个拷贝数的靶核酸扩增至可视化水平、即数亿拷贝以上的技术，其不仅用于生命科学研究领域，还广泛用于基因诊断、临床检测之类的医疗领域或者食品、环境中的微生物检测等。代表性的核酸扩增法为聚合酶链式反应(PCR：PolymeraseChain Reaction)。PCR是通过重复如下循环来扩增试样中的靶核酸的方法，所述循环是将如下3个步骤作为1次循环：(1)基于热处理的DNA变性(由双链DNA分解为单链DNA)、(2)引物与模板单链DNA退火、(3)使用了DNA聚合酶的上述引物的延伸。也有时在相同温度下以2步来进行退火和延伸。
对RNA进行分析时，作为该PCR的前半部分，实施将模板RNA转换为cDNA的逆转录(Reverse Transcription；RT)。将其称为RT-PCR。该RT-PCR大致分为如下三种：(1)非连续地实施RT、PCR的两步式RT-PCR；(2)利用一种酶连续地实施RT、PCR的单酶体系一步式RT-PCR；(3)利用逆转录酶和DNA聚合酶这2种酶，连续地实施RT、PCR的双酶体系一步式RT-PCR。
RT-PCR中，由于在基因检测和病毒检测中处理能力高、避免反应过程中开关反应容器所致的污染而优选一步式RT-PCR。双酶体系一步式RT-PCR中，使用逆转录酶和DNA聚合酶，即至少2种酶。另一方面，单酶体系一步式RT-PCR中，利用Tth DNA聚合酶等兼具逆转录活性的DNA聚合酶。然而，DNA聚合酶的逆转录酶活性通常低于源自逆转录病毒的逆转录酶的逆转录效率，因此认为双酶体系一步式RT-PCR比单酶体系RT-PCR的灵敏度高(非专利文献1)。因此，一般认为：与双酶体系RT-PCR相比，单酶体系一步式RT-PCR难以实现高灵敏度化。
作为病毒检测的代表例，可列举出作为致病性RNA病毒之一的诺如病毒。诺如病毒是成为急性胃肠炎的原因的单链RNA病毒。感染力强且会引起集体食物中毒、集体感染，因此是在公共卫生方面关注度较高的病毒。诺如病毒分为基因组I(GI)和基因组II(GII)这两个基因组。在诺如病毒的病原体检测中，尚未建立组织培养法，开发出了电子显微镜法、基于ELISA的免疫学抗原检测法、或利用了核酸扩增技术的病毒基因检测法。其中，在日本，基于厚生劳动省药物食品局安全部监视安全课的通知(食安监1105001号)的RT-PCR法作为法定方法已经普及。
作为感染诺如病毒的原因，主要是由饮用被诺如病毒污染的食品而引起的，但借助人的手的感染较多，因此对于烹饪施设、医疗现场、老人护理设施和保育园等要求定期进行粪便检测。大量烹饪设施卫生管理手册中追加了下述内容：在烹饪人员等的粪便检测中，包括每月1次以上或根据需要在作为诺如病毒的流行期的10月至3月进行诺如病毒的检测。这是由于有很多人(健康携带者)虽感染了病毒但没有症状，这些人可能在不知不觉中使感染扩散。进而，有腹泻、呕吐等症状的烹饪人员去医疗机构就诊并明确感染了诺如病毒的情况下，期望采取下述的适当处置：实施实时PCR等高灵敏度检测，在确认不再带有诺如病毒之前，限制直接接触食品的烹饪作业等。
诺如病毒具有衣壳结构，所述衣壳结构是将病毒RNA基因组封入由约30nm的衣壳蛋白组成的正二十面体的内部的结构。衣壳结构对于由胃酸所致的失活、胆汁酸的表面活性作用等具有抗性，因此病毒在消化道等严酷的环境中也能存活。通常的表面活性剂、以70％乙醇为代表的病毒灭活剂无法破坏该衣壳结构，病毒的感染能力得以维持。为了破坏衣壳结构，需要至少85℃以上、1分钟以上的严酷条件下的热处理(非专利文献2)。
以往，按照如下方式从粪便试样中检测诺如病毒，即，例如制作粪便的10％悬浮液，使用市售的病毒RNA提取试剂盒从离心上清液中提取RNA并进行纯化，使用该RNA提取液进行诺如病毒的检测(食安监1105001号)。然而，对于在短时间内检测大量的待检体而言，该RNA提取作业很繁杂。
因此，近些年获知了如下方法：通过包括加热处理在内的预处理将粪便试样中的诺如病毒的衣壳破坏，将病毒RNA已露出的处理液供于RT-PCR，由此检测病毒的有无(专利文献1)。该方法中，在试样中添加预处理液后施加热处理，由此，能够在不实施预先从粪便试样、擦拭检测的浓缩试样中分离RNA的情况下破坏病毒衣壳并检测病毒RNA的有无。进而，已知如下方法：为了将直至病毒RNA检测为止的作业简化，不进行加热处理，仅将粪便试样添加至预处理液中而使病毒RNA露出，将处理液供于RT-PCR，由此进一步有效地检测病毒的有无(非专利文献3)。
此时，由于省略了RNA的提取，从而会带入粪便试样所含的多糖类等PCR反应抑制物质。已对PCR反应液进行了钻研，以减少它们的影响。具报道：通过使用在镁存在下具有抗污染性的rTth DNA聚合酶，可改善在检测对便试样加标的DNA时的PCR抑制(非专利文献4)。专利文献1记载的方法中，使用上述rTth DNA聚合酶，并利用抗污染性得到增强的双酶体系一步式RT-PCR系统。
然而，据称双酶体系一步式RT-PCR中使用的逆转录病毒来源的逆转录酶在耐热性方面明显劣于嗜热菌来源的DNA聚合酶(非专利文献5)。因此，双酶体系一步式RT-PCR中，无法对包含逆转录酶的反应液以高温来实施用于破坏病毒的热处理。因此，不能将未处理的试样直接添加至RT-PCR反应液中、并利用热处理将病毒的衣壳结构破坏来检测RNA。
专利文献1、非专利文献3记载的方法中，为了避免逆转录酶的失活，对实施了预处理的试样添加RT-PCR反应液。该方法中，需要进行在试样中加入预处理液并实施热处理的作业、以及之后的重新添加RT-PCR反应液的作业这2个步骤，破坏病毒衣壳的预处理步骤要花费不少的功夫和劳力。另外，这些文献所具体实施的方法中，作为供于RT-PCR的试样，将粪便试样制成例如10％悬浮液后，预先进行离心分离，并使用回收的上清液。这样的粪便试样的悬浮液的制备和离心分离的作业尤其在测定大量待检体的现场要花费时间和劳力。
特别是，粪便待检体包含大量不溶性固体物，因此若将未实施离心分离的10％粪便悬浮液、此状态下的粪便试样直接添加至RT-PCR反应液中，则大量不溶物质被带入反应液中，反应液浊度增高。此外，通过实时PCR仪进行测定时，若使用这样的包含大量不溶物质的高浊度的RT-PCR反应液，则反应液中的不溶物质会引起光的散射或吸收、自身荧光的影响等，导致通过RT-PCR的结果而得到的荧光波长的强度的大幅降低，导致灵敏度显著降低。
因此，需要在将事先未进行离心分离处理而包含杂质等不溶物质的试样(所谓的粗样品)直接添加至RT-PCR反应液而进行RT-PCR时抑制不溶物质的影响、迅速且简便的病毒RNA的检测方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2018-000138号公报
非专利文献
非专利文献1：BioTechniques，第25卷，1998年、第230-234页
非专利文献2：食品卫生学杂志、第46卷、2005年、第235-245页
非专利文献3：食品微生物学会刊、第35卷、2018年、第193-198页
非专利文献4：J.Clin.Microbiol.，第38卷、2000年、第4463-4470页非专利文献5：Nucleic Acids Research，第37卷、2009年、第473-481页
附图说明
图1是示出试验例4中包含粪便试样来源的不溶物质的各浊度(Abs/μL)的RT-PCR反应液中的诺如病毒的检测结果的图。
图2是示出试验例6中直接添加了粪便试样的条件下的诺如病毒检测结果的图。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，即使在使用事先未进行试样的离心分离操作的、包含不溶物质的试样的情况下，通过单酶体系一步式RT-PCR也能够以足够的灵敏度检测病毒RNA的有无。
用于解决问题的方案
本发明人等鉴于上述情况而进行了深入研究，结果发现：在将事先未通过离心分离操作进行不溶物质的去除的、包含不溶物质的试样与单酶体系的一步式RT-PCR反应液混合后直接进行一步式RT-PCR时，通过使特定的多肽共存和/或使用特定的耐热性DNA聚合酶，从而能够以高灵敏度检测病毒RNA。以往，在RT-PCR反应液中混有大量不溶物质而成为浊度较高的反应液时，反应液中包含的不溶物质产生光的散射、吸收、自身荧光所致的影响等，在利用实时PCR机测定时能够检测的荧光强度大幅降低，导致灵敏度显著降低。然而，非常意外地发现：若在RT-PCR反应液中添加特定的多肽和/或使用特定的耐热性DNA聚合酶，则可以得到足能检测的强烈的荧光强度，能够克服检测灵敏度的降低。其结果，发现：将可能包含不溶物质的粪便试样添加至RT-PCR反应液中，将反应容器密闭后，在用于RT-PCR的温度循环中进行反应，仅此就能够直接检测病毒RNA，从而完成了本发明。
代表性的本发明如下所述。
[项目1]一种用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法，其特征在于，包括以下工序：
(1)制备混合液的工序，将事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样、与包含分子量为5～500kDa的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT-PCR反应液混合而制备混合液；以及，
(2)将反应容器密闭后实施一步式RT-PCR反应的工序。
[项目2]根据项目1所述的方法，其中，上述混合液中的不溶物质的浊度在OD660下为0.01Abs/μL以上。
[项目3]根据项目1或2所述的方法，其中，上述单酶体系一步式RT-PCR反应液中包含的分子量为5～500kDa的多肽包括选自由牛血清白蛋白、明胶、封闭肽片段(以下BPF)及丝胶蛋白组成的组中的至少1种。
[项目4]根据项目1至3中任一项所述的方法，其中，上述混合液以该混合液中最终浓度计包含选自由0.5mg/mL以上的牛血清白蛋白、5mg/mL以上的明胶、5mg/mL以上的封闭肽片段即BPF、及5mg/mL以上的丝胶蛋白组成的组中的至少1种作为上述分子量为5～500kDa的多肽。
[项目5]根据项目1至4中任一项所述的方法，其中，上述工序(1)中使用的包含不溶物质的试样是未进行核酸的分离处理也未进行加热处理的试样。
[项目6]项目1至5中任一项所述的方法，其特征在于，上述工序(1)和(2)在同一容器中进行。
[项目7]项目1至6中任一项所述的方法，其特征在于，上述工序(2)中，在将反应容器密闭后在一次都不打开/关闭盖子的情况下实施一步式RT-PCR反应。
[项目8]根据项目1至7中任一项所述的方法，其中，上述工序(2)中包括在循环反应之前和/或循环反应中实施热处理的操作，以将病毒破碎而使病毒内的核酸露出和/或在核酸扩增反应中活化热启动酶。
[项目9]根据项目1至8中任一项所述的方法，其中，上述试样为血液试样、粪便试样和/或擦拭检测试样。
[项目10]根据项目1至9中任一项所述的方法，其中，上述试样为悬浮于水、生理盐水或缓冲液的悬浮液。
[项目11]根据项目1至10中任一项所述的方法，其中，上述不溶物质源自血液试样、粪便试样和/或擦拭检测试样。
[项目12]根据项目1至11中任一项所述的方法，其中，上述病毒是不具有包膜的RNA病毒。
[项目13]根据项目1至12中任一项所述的方法，其中，不具有包膜的RNA病毒为呼肠孤病毒科病毒或杯状病毒科病毒。
[项目14]根据项目13所述的方法，其中，呼肠孤病毒科病毒为轮状病毒。
[项目15]根据项目13所述的方法，其中，杯状病毒科病毒为诺如病毒。
[项目16]根据项目15所述的方法，其特征在于，能够判断诺如病毒是GI型还是GII型。
[项目17]根据项目1至16中任一项所述的方法，其特征在于，上述耐热性DNA聚合酶为属于家族A的DNA聚合酶。
[项目18]根据项目1至17中任一项所述的方法，其特征在于，上述耐热性DNA聚合酶为选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少1种。
[项目19]根据项目1至18中任一项所述的方法，其中，上述单酶体系一步式RT-PCR反应液还包含1mM以上的2价阳离子。
[项目20]一种用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法，其特征在于，包括以下工序：
(1)制备混合液的工序，将事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样、与包含属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT-PCR反应液混合而制备混合液；以及
(2)将反应容器密闭后实施一步式RT-PCR反应的工序。
[项目21]根据项目20所述的方法，其特征在于，上述属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶是选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少一种具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
[项目22]根据项目21所述的方法，其中，上述突变体由与Tth聚合酶(序列号10)或Hawk Z05聚合酶(序列号11)的氨基酸序列显示出90％以上的同一性的氨基酸序列组成，且显示出逆转录活性和耐热性DNA聚合酶活性。
[项目23]根据项目21或22所述的方法，其中，上述突变体由在Tth聚合酶(序列号10)或Hawk Z05聚合酶(序列号11)的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸的缺失、置换和/或添加的氨基酸序列组成，且显示出逆转录活性和耐热性DNA聚合酶活性。
[项目24]一种用于利用单酶体系一步式RT-PCR反应从事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样中进行RNA病毒的检测的组合物，其特征在于，含有分子量为5～500kDa的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
[项目25]根据项目24所述的组合物，其中，上述组合物与上述试样的混合液中的不溶物质的浊度在OD660下为0.01Abs/μL以上。
[项目26]根据项目24或25所述的组合物，其中，上述单酶体系一步式RT-PCR反应液中包含的分子量为5～500kDa的多肽包括选自由牛血清白蛋白、明胶、封闭肽片段(以下BPF)及丝胶蛋白组成的组中的至少1种。
[项目27]根据项目24至26中任一项所述的组合物，其中，上述组合物与上述试样的混合液以如下方式制备、配混：以该混合液中最终浓度计包含选自由0.5mg/mL以上的牛血清白蛋白、5mg/mL以上的明胶、5mg/mL以上的封闭肽片段即BPF、及5mg/mL以上的丝胶蛋白组成的组中的至少1种作为上述分子量为5～500kDa的多肽。
[项目28]根据项目24至27中任一项所述的组合物，其中，上述包含不溶物质的试样是未进行核酸的分离处理也未进行加热处理的试样。
[项目29]根据项目24至28中任一项所述的组合物，其特征在于，上述耐热性DNA聚合酶为属于家族A的DNA聚合酶。
[项目30]根据项目24至29中任一项所述的组合物，其特征在于，上述耐热性DNA聚合酶为选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少1种。
[项目31]根据项目24至30中任一项所述的组合物，其中，上述单酶体系一步式RT-PCR反应液还包含1mM以上的2价阳离子。
[项目32]根据项目24至31中任一项所述的组合物，其中，病毒是不具有包膜的RNA病毒。
[项目33]根据项目32中任一项所述的组合物，其中，不具有包膜的RNA病毒为呼肠孤病毒科病毒或杯状病毒科病毒。
[项目34]根据项目33所述的组合物，其中，呼肠孤病毒科病毒为轮状病毒。
[项目35]根据项目33所述的组合物，其中，杯状病毒科病毒为诺如病毒。
[项目36]根据项目24至35中任一项所述的组合物，其特征在于，能够判断诺如病毒是GI型还是GII型。
[项目37]一种用于利用单酶体系一步式RT-PCR反应从事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样中进行RNA病毒的检测的组合物，其特征在于，含有属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
[项目38]根据项目37所述的组合物，其特征在于，上述属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶是选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少一种具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
[项目39]根据项目38所述的组合物，其中，上述突变体由与Tth聚合酶(序列号10)或Hawk Z05聚合酶(序列号11)的氨基酸序列显示出90％以上的同一性的氨基酸序列组成，且显示出逆转录活性和耐热性DNA聚合酶活性。
[项目40]根据项目38或39所述的组合物，其中，上述突变体由在Tth聚合酶(序列号10)或Hawk Z05聚合酶(序列号11)的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸的缺失、置换和/或添加的氨基酸序列组成，且显示出逆转录活性和耐热性DNA聚合酶活性。
[项目41]一种用于在事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样中检测RNA病毒的存在的试剂盒，其包含项目24至40中任一项所述的组合物。
发明的效果
根据本发明，不需要通过离心分离作业来去除试样中的不溶物质，将该试样添加至一步式RT-PCR反应液中后，能够直接利用一步式RT-PCR反应来检测病毒RNA。进而，在本发明的一个实施方式中，也可以进行包括热处理步骤的RT-PCR。因此，在特定的实施方式中，本发明在检测包含不溶物质的试样中是否存在病毒、特别是难以破碎病毒的非包膜病毒方面也是有用的。进而，由于可省略包括通过离心分离来去除不溶物质的工序在内的预处理工序，使检测业务进一步高效化，因此能够增加即使感染病毒也没有症状的被检者的检测量，对于感染症预防也有较大帮助。另外，由于省略预处理工序而也能够省略反应容器盖子的打开关闭作业。其结果，也能够减少其它的造成样品污染的风险。由此，也能够抑制假阳性发生风险，能够进一步提高检测业务的精度。
具体实施方式
以下，示出本发明的实施方式对本发明进行进一步详细说明，但本发明不受这些实施方式限定。
本发明的一实施方式为用于检测是否存在RNA病毒的方法，其为试样中的诺如病毒等RNA病毒的检测，所述方法包括如下操作：在不预先对试样进行离心分离来去除不溶物质的情况下，将包含特定的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT-PCR试剂、或包含特定的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT-PCR试剂与包含不溶物质的试样混合并进行RT-PCR反应。此处，RNA病毒可以是非包膜RNA病毒，进而，也可以是RNA被保持于较硬的衣壳结构中的RNA病毒。
在一个实施方式中，本发明的用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法的特征在于，至少包括以下工序。
(1)制备混合液的工序，将事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样、与包含分子量为5～500kDa的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT-PCR反应液混合而制备混合液；以及
(2)将反应容器密闭后实施一步式RT-PCR反应的工序。
在进一步的实施方式中，本发明的用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法的特征在于，至少包括以下工序。
(1)制备混合液的工序，将事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样、与包含属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT-PCR反应液混合而制备混合液；以及
(2)将反应容器密闭后实施一步式RT-PCR反应的工序。
在这些实施方式中，上述工序(1)中的制备混合液的工序例如可以通过如下方式进行：在事先未通过离心分离操作去除不溶物质的试样中添加包含分子量为5～500kDa的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT-PCR反应液或者包含属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT-PCR反应液。上述工序(1)和(2)优选在同一容器中进行。即，在工序(1)和(2)之间，优选不将混合液的全部或一部分转移到其它容器中。进而，工序(2)中，优选在将反应容器密闭后不进行反应容器盖子的打开关闭。另外，上述工序(1)中使用的包含不溶物质的试样可以是事先悬浮于水或缓冲液等中的悬浮液，也可以将粪便试样等试样直接添加至一步式RT-PCR反应液中。
本发明中的检测对象是RNA病毒，没有特别限定。尤其是不具有源自双层脂质膜的包膜的非包膜性的RNA病毒。作为这样的非包膜RNA病毒，可列举出星状病毒科病毒(例如，星状病毒)；杯状病毒科病毒(例如，札幌病毒、诺如病毒)；小核糖核酸病毒科病毒(例如，甲型肝炎病毒、埃可病毒、肠病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)；肝炎病毒科病毒(例如，戊型肝炎病毒)；呼肠孤病毒科病毒(例如，轮状病毒)等，没有限定，但优选用于检测杯状病毒科病毒和呼肠孤病毒科病毒，更优选用于检测诺如病毒、札幌病毒、轮状病毒，进一步优选用于检测诺如病毒、轮状病毒，特别是用于检测诺如病毒。大多数非包膜病毒可能因粪口感染等而感染消化道，RNA被保持于对胃酸所致的失活、胆汁酸的表面活性作用等具有抗性的坚固的衣壳结构中。
已知诺如病毒大致是按GI型诺如病毒和GII型诺如病毒的基因型分类的。此外，从推测感染途径等收集流行病学数据的观点出发，期望对GI型诺如病毒和GII型诺如病毒加以区分。本发明的RNA病毒检测法不仅能够确认是否存在诺如病毒，而且还能够辨别(鉴别)所感染的诺如病毒是GI型还是GII型，在这方面是非常有利的。
作为本发明中使用的试样，例如可列举出粪便(排泄便、直肠便)、呕吐物、唾液等，但没有限定，可以用于源自生物体的所有试样，特别是对于源自粪便(排泄便、直肠便)的检测是有用的。本发明的特征之一在于不需要将这些试样供于离心分离工序以去除不溶物质。上述试样可以直接供于检测，或为了减少杂质对反应的影响、获得更稳定的检测结果，也可以是将上述试样悬浮于水、生理盐水或缓冲液中的试样。作为上述缓冲液，没有特别限定，可列举出HANKS缓冲液、Tris缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸)缓冲液等。
在特定的优选实施方式中，本发明中使用的试样也可以是不仅事先未实施离心分离工序、而且例如事先未实施使用市售的RNA纯化试剂盒等从试样中分离RNA的操作和/或事先进行加热处理使RNA从病毒结构中露出的操作的试样。本发明的方法中，即使是省略了这种事先的RNA分离及加热处理的试样，也可以在一步式RT-PCR反应的循环反应之前和/或循环反应中包括热处理而使RNA从病毒结构中露出，并供于RT-PCR反应。由此通过使用事先未进行核酸的分离处理及加热处理的试样，从而不仅能够更简便地以短时间检测病毒RNA，而且能够减少由于试样的损失、残留而污染其它样品的危险性。特别是在以粪便作为试样的对大量待检体进行处理那样的检测中，该效果变得显著。
作为本发明中的另一方式的试样，为擦拭检测试样。为了阐明污染途径、把握设施环境等的污染状況，擦拭检测是有用的。本发明中，擦拭检测没有特别限定，是指例如用棉棒等擦拭相关区域、设备等，溶出至水、缓冲液中，用聚乙二醇(PEG)沉淀等进行浓缩的试样。作为具体的擦拭检测的要点，可示例出“擦拭待检体的诺如病毒检测法的改良”(http：//idsc.nih.go.jp/iasr/32/382/dj3824.html)等，但没有特别限定，广泛包括基于此的方法。作为擦拭位置的例子，可列举出案板、厨刀、毛巾、餐具等烹饪设备类、冰箱的把手、洗手间、浴室的门把手、卫生间、厨房、洗手间、浴室等的水龙头、烹饪者的手、手指、浴室、洗手间、洗脸池、扶手、客厅等设施等。另外，尽管不是擦拭检测，但作为环境检测，还能用于污水试样的浓缩试样。由于这些检测试样包含大量检测场所的污垢、灰尘，因此对于可能包含不溶物质的试样增强了抗污染性的本方法对这些检测是有利的。
上述工序(1)中，供于RT-PCR的试样可能包含的不溶物质可列举出源自粪便(排泄便、直肠便)、呕吐物、唾液、血液、擦拭检测试样的不溶物质，但没有限定。例如，可以是源自生物体的不溶物质(包括来自生物体的分泌物、排泄物等)、源自环境检测试样的不溶物质等测定RT-PCR反应时可能对荧光强度产生影响的任意的不溶物质。尤其对来自包含粪便(排泄便、直肠便)所含的不溶物质的试样的检测是有用的。利用本发明的方法能够测定的不溶物质的浊度根据检测试样、所期望的效果的程度等而不同，例如可以列举出，在OD660下RT-PCR反应液的浊度为0.01Abs/μL以上的情况等。当然，随着浊度增高，检测灵敏度受到影响的可能性增高，例如，RT-PCR反应液的由不溶物质引起的浊度在OD660下为0.1Abs/μL以上、进而可以是0.5Abs/μL以上、进而0.8Abs/μL以上、进而1.0Abs/μL以上、进而2.0Abs/μL以上、例如3Abs/μL以上时，根据本发明能够进行高灵敏度的检测，是适合的。RT-PCR反应液的由不溶物质引起的浊度的上限值只要发挥本发明的效果就没有特别限定，作为一个例子，可以设为5.0Abs/μL以下，优选设为4.0Abs/μL以下，例如设为3Abs/μL以下。
在进行悬浮于水或缓冲液中的试样的离心分离操作时，需要离心分离机等装置，且也伴有反应容器的打开关闭作业，因此也成为作业繁杂化且延长作业时间的原因。通过简化作业现场的作业、迅速地实施检测，从而可预防进一步的感染扩散。此外，在打开关闭带有含病毒待检体的反应容器时，存在病毒和源自病毒的RNA发生飞散的风险。病毒的飞散对作业者的安全和健康造成威胁，同时意味着检测作业环境的污染。飞散的RNA病毒在工作场所发生气溶胶化，因此同时检测的其它样品的污染风险成为问题。因此，使用不具有盖子的打开关闭工序的RT-PCR来检测是否存在病毒的方法具有超过工作简化的意义。
在一个实施方式中，本发明的用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法的特征之一在于，在单酶体系一步式RT-PCR反应中共存有分子量为5～500kDa的多肽。如此通过共存有相对高分子的多肽，从而即使是在RT-PCR反应液中存在大量不溶物质的浊度较高的反应液中，也能够高灵敏度地检测病毒RNA。
本发明中使用的上述多肽只要分子量为5～500kDa就没有特别限定，优选为6～400kDa。本说明书中，示出分子量时，只要未明确为其它含义，则是指使用SDS-PAGE而确定的值。利用SDS-PAGE的分子量测定可以使用本领域中通常的方法和装置并利用市售的分子量标志物等来进行。例如，“分子量50kDa”是指：在用SDS-PAGE测定分子量时，处于本领域技术人员判断在通常50kDa的位置具有条带的范围内的情况。另外，本发明中使用的多肽也可以是上述分子量范围内的多肽的混合物。
在一个实施方式中，本发明中使用的上述多肽只要发挥本发明的效果就没有特别限定，是多个氨基酸通过肽键连接而形成的蛋白质。另外，本发明中使用的多肽只要具有由氨基酸连接而成的多肽结构，就也可以是例如通过热变性等而解开了三维结构那样的热变性多肽(例如，明胶)等。具体而言，作为本发明中可以使用的多肽，例如可以使用白蛋白(例如，牛血清白蛋白、乳清蛋白、人血清白蛋白、鸡蛋来源白蛋白)、明胶(例如，鱼明胶、猪明胶)、丝胶蛋白、酪蛋白、丝心蛋白等天然来源蛋白质(天然来源多肽)；封闭肽片段(Blocking peptide fragment，以下也称为BPF)、胶原蛋白水解物、聚胨、酵母提取物、牛肉提取物等通过合成/分解等而人工制造的多肽等。从可发挥更优异的本发明的效果这样的观点出发，本发明中使用的多肽优选为牛血清白蛋白、明胶、封闭肽片段(以下BPF)和/或丝胶蛋白。从即使少量也可以发挥较高的效果这样的观点出发，更优选使用牛血清白蛋白、明胶(尤其是鱼明胶)是适合的。这些多肽可以仅使用1种，还可以组合使用2种以上。另外，这些多肽可以通过从自然中提取、合成等手段而制备，另外也可以适宜地使用市售品。
本发明中，上述多肽的用量只要发挥本发明的效果就没有特别限定，例如，在混合有包含上述不溶物质的试样和单酶体系一步式RT-PCR反应液的混合液中，可以以最终浓度为0.0001～200mg/mL的量、优选为0.01～150mg/mL、更优选为0.1～130mg/mL、进一步优选为0.5～100mg/mL来使用。为了发挥更优异的效果，优选的量根据所使用的多肽的种类、所期望的效果的程度等而可能发生变动，但例如可以示例出以下那样的用量：
·使用牛血清白蛋白的情况：以RT-PCR反应液中最终浓度计，例如为0.5mg/mL以上，优选为1mg/mL以上，更优选为2mg/mL以上，进一步优选为3mg/mL以上。上限值没有特别限定，例如可以设为10mg/mL以下。
·使用明胶的情况：以RT-PCR反应液中最终浓度计，例如为0.1mg/mL以上，优选为1mg/mL以上，更优选为5mg/mL以上，进一步优选为7.5mg/mL以上，进而更优选为15mg/mL以上。上限值没有特别限定，例如，可以设为50mg/mL以下，或30mg/ml以下。
·使用丝胶蛋白的情况：以RT-PCR反应液中最终浓度计，例如为1mg/mL以上，优选为5mg/mL以上，更优选为10mg/mL以上，进一步优选为20mg/mL以上，进而更优选为50mg/mL以上。上限值没有特别限定，例如，可以设为100mg/mL以下。
·使用BPF的情况：以RT-PCR反应液中最终浓度计，例如为1mg/mL以上，优选为5mg/mL以上，更优选为10mg/mL以上，进一步优选为20mg/mL以上，进而更优选为30mg/mL以上。上限值没有特别限定，例如，可以设为50mg/mL以下。
上述工序(2)中的RT-PCR循环由1.热处理、2.逆转录反应、3.PCR这3个步骤构成。在各步骤的前后还可以包括用于活化热启动酶的热处理工序。1的热处理工序中，包括将病毒破碎而使病毒内的核酸露出和/或在核酸扩增反应中活化热启动酶的工序。通过包括这些热处理工序，从而能使RNA从病毒的衣壳结构中露出(溶出)。上述热处理工序的温度和时间为60℃以上且1秒以上即可，优选为70℃、30秒以上，更优选为80℃、30秒以上，特别优选为85℃、30秒以上。2的逆转录反应的温度取决于耐热性DNA聚合酶的逆转录活性和引物和探针的Tm值，至少为25℃以上即可。更优选为37℃以上。3的PCR中，包括[1]基于热处理的DNA变性(由双链DNA分解为单链DNA)、[2]引物与模板单链DNA退火、[3]使用了DNA聚合酶的上述引物的延伸这3个步骤即可，[2]和[3]可以在同一温度下实施，并作为2个步骤。为了迅速地实施RT-PCR，期望将上述RT-PCR反应中使用的热循环仪设定为上述[2]和[3]的步骤的延伸时间为合计15秒以下、更优选为10秒以下的测定程序。需要说明的是，本说明书中“PCR的延伸时间”是指热循环仪中的设定温度。
添加至上述混合液中的一步式RT-PCR溶液的特征在于，包含具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。具有逆转录活性的DNA聚合酶是指兼备将RNA转换为cDNA的能力及扩增DNA的能力的DNA聚合酶。另外，耐热性是指：即使在70℃下实施1分钟以上的热处理，酶活性也不会降低一半以上。来源没有特别限定，可列举出Taq、Tth，Bst，Bca，KOD，Pfu，Pwo、Tbr，Tfi，Tfl，Tma，Tne、Vent，DEEPVENT、它们的突变体。作为一直以来具有逆转录活性的DNA聚合酶，可列举出栖热水生菌(Thermus aquaticus)来源的DNA聚合酶(Taq)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8来源的DNA聚合酶(Tth)、栖热菌属细菌Z05来源的DNA聚合酶(Z05)、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)来源的DNA聚合酶(Tma)、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)来源的DNA聚合酶(Bca)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)来源的DNA聚合酶(Bst)等，也可以是它们的未丧失逆转录活性和耐热性DNA聚合酶活性的突变体。另外，已知具有逆转录活性的作为小笠原岛热球菌(Thermococcus kodakaraensis)来源的DNA聚合酶(KOD)的突变体的耐热性DNA聚合酶(例如，逆转录异种聚合酶，RTX：reverse transcription xenopolymerase)，本发明中只要是这样的兼具逆转录酶活性的耐热性DNA聚合酶就没有限定。特别优选列举出属于家族A的DNA聚合酶，优选列举出选自由Taq、Tth、Z05和它们的突变体组成的组中的具有逆转录活性的DNA聚合酶。尤其优选为选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少1种。
在特定的实施方式中，本发明的用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法的特征之一在于，在单酶体系一步式RT-PCR反应中，使用属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶作为DNA聚合酶。如此通过使用特定的耐热性DNA聚合酶，从而即使是在RT-PCR反应液中存在大量不溶物质的浊度较高的反应液中也能够高灵敏度地检测病毒RNA。作为PCR中使用的DNA聚合酶，一直以来已知源自嗜热菌的属于家族A的DNA聚合酶(也称为polI型)、源自超嗜热古细菌的属于家族B的DNA聚合酶(也称为α型)等。其中属于家族A的DNA聚合酶通常容易受到PCR抑制物质的影响，认为难以从未纯化样品中进行扩增。然而，本发明中，基于如下意料不到的结果：通过使用容易受到这种抑制物质的影响的属于家族A且具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶来进行单酶体系一步式RT-PCR反应，从而对于未进行离心分离操作且包含大量不溶物质等杂质的试样也能够高灵敏度地检测RNA病毒。
具体而言，作为本发明中可以使用的属于家族A的具有逆转录活性的耐热性聚合酶，没有特别限定，例如可列举出嗜热栖热菌HB8来源的DNA聚合酶(Tth聚合酶)、栖热菌属细菌Z05来源的DNA聚合酶(Hawk Z05聚合酶)、海栖热袍菌来源的DNA聚合酶(Tma聚合酶)、热坚芽孢杆菌来源的DNA聚合酶(Bca聚合酶)、嗜热脂肪芽胞杆菌来源的DNA聚合酶(Bst聚合酶)等，也可以是它们的未丧失逆转录活性和耐热性DNA聚合酶活性的突变体。优选列举出选自由Tth、Z05和它们的突变体组成的组中的具有逆转录活性的DNA聚合酶。尤其优选为选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少1种，通过使用这些，从而即使在使用包含大量不溶物质的试样的情况下，也能够进行更高灵敏度的RNA病毒的检测。将这样的可以特别适宜地用于本发明的Tth聚合酶的氨基酸序列(序列号10)和HawkZ05聚合酶的氨基酸序列(序列号11)示于序列表。本发明中，也可以适宜地使用基于这些氨基酸序列的、在不丧失效果的范围内改变了一部分氨基酸的突变型DNA聚合酶(DNA聚合酶突变体)。
本说明书中，具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的突变体是指：与作为其来源的野生型DNA聚合酶的氨基酸序列具有例如85％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、尤其优选为99％以上的序列同一性、且与野生型DNA聚合酶同样地具有将RNA转换为cDNA的活性和扩增DNA的活性的突变体。此处，作为计算氨基酸序列的同一性的方法，可以利用本领域中公知的任意手段来进行。例如，可以使用市售的或能够通过远程通信线路(因特网)而利用的解析工具来计算，作为一个例子，通过使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的同源性算法BLAST(局部序列排比检索基本工具)http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中缺省(初始设定)的参数，能够计算出氨基酸序列的同一性。另外，本发明中可以使用的突变体可以是：作为由在作为其来源的野生型DNA聚合酶的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加(以下也将这些统称为“突变”)了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽的、并且与野生型DNA聚合酶同样地具有将RNA转换为cDNA的活性和扩增DNA的活性的突变体。此处1个或多个例如可以是1～80个、优选为1～40个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个，没有特别限定。
在特定的实施方式中，单酶体系一步式RT-PCR反应液中包含的上述耐热性DNA聚合酶的总量只要发挥本发明的效果就没有特别限定，作为一个例子，至少为4.2ng/μL以上即可，优选为5.0ng/μL以上，更优选为5.8ng/μL以上。尤其优选为8.3ng/μL以上。单酶体系一步式RT-PCR反应液中包含的上述耐热性DNA聚合酶的总量的上限没有特别限定，作为一个例子，可以设为20ng/μL以下，即使为16.7ng/μL以下也可以充分获得本发明的效果。聚合酶的量是利用布拉福德(Bradford)法或Nanodrop(Thermo Fisher公司)进行定量而得到的值，可以根据安全数据表(SDS)进行估算。包含BSA等蛋白质时，期望利用后者的方法进行计算。
就本发明中使用的一步式RT-PCR反应液而言，为了提高非特异性反应抑制效果，优选通过组合使用抗DNA聚合酶抗体或通过化学修饰将热不稳定封闭基团引入DNA聚合酶中，从而能够在实施一步式RT-PCR反应之前抑制DNA聚合酶的酶活性、应用于热启动PCR。
本发明中使用的一步式RT-PCR反应液中除了耐热性DNA聚合酶之外可以包含缓冲剂、适当的盐、镁盐或锰盐、脱氧核苷三磷酸、对应于检测对象的病毒RNA的检测对象区域的引物对、以及根据需要的添加剂。
作为本发明中使用的缓冲剂，没有特别限定，可列举出Tris、三(羟甲基)甲基甘氨酸、双-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Bis-Tricine)、羟乙基甘氨酸(Bicine)等。用硫酸、盐酸、乙酸、磷酸等将pH调节为6～9、更优选调节为pH7～9。另外，作为所添加的缓冲剂的浓度，以10～200mM、更优选以20～150mM来使用。此时，为了设为适于反应的离子条件，可加入盐溶液。作为盐溶液，可列举出氯化钾、乙酸钾、硫酸钾、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵等。
作为本发明中使用的dNTP，可加入dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.1～0.5mM，最常见的是加入0.2mM左右。通过代替dTTP和/或部分使用dUTP，还可以预防交叉污染。在预防交叉污染的情况下，优选包含尿嘧啶-N-糖苷酶(Uracil-N-glycosylase(UNG))。
进而，本发明中，单酶体系一步式RT-PCT反应液中优选包含2价阳离子。如此通过包含2价阳离子，从而能够更稳定地获得高抗污染性、进行高灵敏度的检测。作为2价阳离子，没有特别限定，可以列举出镁离子、锰离子、钙离子、铜离子、铁离子、镍离子、锌离子等。优选地，作为2价阳离子，优选包含镁离子、锰离子。本发明中，单酶体系一步式RT-PCR反应液中添加镁离子、锰离子等的情况，可以添加镁、锰，也可以添加它们的盐。作为镁或其盐，可示例出镁、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁等，作为锰或其盐，可示例出锰、氯化锰、硫酸锰、乙酸锰等。这些镁、锰或它们的盐优选在RT-PCR反应液中加入1～10mM左右。本发明的RNA病毒检测方法中，从容易稳定地获得高灵敏度这样的观点出发，优选包含锰或其盐。在特定的实施方式中，RT-PCR反应液中优选包含1mM以上的锰或其盐，优选包含1.5mM以上的锰或其盐，更优选包含2.0mM以上的锰或其盐。
进而，作为一步式RT-PCR反应液中包含的添加剂，可以包含选自由具有氨基酸中的氨基上添加有3个甲基的结构的季铵盐(以下称为“甜菜碱样季铵盐”)、白蛋白(例如，牛血清白蛋白等)、丝胶蛋白、BPF、甘油、二醇、明胶(例如，鱼明胶、猪明胶等)和表面活性剂组成的组中的至少1种。其中，优选含有白蛋白和/或明胶，优选含有白蛋白和明胶这两者，尤其优选含有鱼明胶和/或猪明胶、以及牛血清白蛋白。例如在依据常规方法用SDS-PAGE对于这些进行测定时，可以是分子量为约1～1000kDa(作为一个例子，约5～500kDa)的白蛋白、明胶，但没有特别限定。
作为上述一步式RT-PCR反应液中包含的表面活性剂，可列举出TritonX-100、TritonX-114、Tween20，诺乃洗涤剂P40、Briji35、Briji58、SDS、CHAPS、CHAPSO、Emulgen420等，但没有特别限定。RT-PCR反应液中的上述表面活性剂的浓度也没有特别限定，优选为0.0001％以上，更优选为0.002％以上，进一步优选为0.005％以上，能够进行良好的检测。上限没有特别限定，作为一个例子，可以设为0.1％以下。
作为上述一步式RT-PCR反应液中包含的甜菜碱样季铵盐，可列举出甜菜碱(三甲基甘氨酸)、肉碱等，但没有特别限定。甜菜碱结构是在分子内具有稳定的正、负这两种电荷的化合物，显示出表面活性剂那样的性质，认为会引起病毒结构的不稳定化。进而，已知促进DNA聚合酶的核酸扩增。优选的上述甜菜碱样季铵盐浓度为0.1M～2M、更优选为0.2M～1.2M。
进而，还可以与该技术领域中已知促进RT-PCR的物质组合来使用。本发明中有用的促进物质例如可列举出甘油、多元醇、蛋白酶抑制剂、单链结合蛋白(SSB)、T4噬菌体基因32编码蛋白质、tRNA、含硫或乙酸的化合物类、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、三亚甲基二醇、甲酰胺、乙酰胺、四氢嘧啶、海藻糖、葡聚糖、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，四甲基氯化铵(TMAC)、四甲基氢氧化铵(TMAH)、乙酸四甲铵(TMAA)、聚乙二醇等，但不限定于这些。进而为了减少反应抑制，还可以包含乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPTA)那样的螯合剂。
作为本发明中使用的引物对，可列举出一个引物与另一个引物的DNA延伸产物彼此互补的2种一对引物。另外，作为另一方式，也可列举出包含2对以上的上述引物的所谓多重PCR。进而，在靶核酸包含亚型的情况下，还可以包含简并引物。在通过本发明检测作为不具有包膜的RNA病毒之一的诺如病毒时，作为引物对的例子，就诺如病毒检测用的引物而言，可列举出厚生劳动省药物食品局安全部监视安全课的通知(食安监1105001号)记载的引物(序列号1～5)，但不限定于此。上述记载的引物中，通过序列号1、2检测诺如病毒G1型，通过序列号3～5检测诺如病毒G2型。作为检测对象的引物浓度，没有特别限定，相对于RT-PCR反应液整体，优选正向引物的浓度为0.1μM以上且3μM以下，且上述反向引物的浓度为0.1μM以上且3μM以下。更优选正向引物的浓度为0.1μM以上且2μM以下，且上述反向引物的浓度为0.5μM以上且2μM以下。
本发明中，作为另一方式，进而是包含至少1种经标记的杂交探针或双链DNA结合荧光化合物的检测方法。由此，可以通过荧光信号的监测来监视扩增产物的分析而并非通过通常的电泳，可减少解析劳力。进而，无需打开反应容器，能够减少污染的风险。也可以通过用不同的荧光色素标记对应于病毒的亚型的各杂交探针，来识别病毒的亚型。
作为双链DNA结合荧光化合物，例如可列举出SYBR(注册商标)Green I，SYBR(注册商标)Gold、SYTO-9、SYTP-13、SYTO-82(Life Technologies)，EvaGreen(注册商标；Biotium)、LCGreen(Idaho)、LightCycler(注册商标)480ResoLight(Roche AppliedScience)等。
作为本发明中使用的杂交探针，例如可列举出TaqMan水解探针(美国专利第5,210,015号公报、美国专利第5,538,848号公报、美国专利第5,487,972号公报、美国专利第5,804,375号公报)、分子信标(美国专利第5,118,801号公报)、FRET杂交探针(国际公开第97/46707号小册子，国际公开第97/46712号小册子，国际公开第97/46714号小册子)等。作为诺如病毒检测用的探针的碱基序列，可列举出厚生劳动省药物食品局安全部监视安全课的通知(食安监1105001号)记载的序列(序列号6～9)，但不限定于此。上述记载的探针序列中，通过序列号6或7检测诺如病毒G1型，通过序列号8或9检测诺如病毒G2型。进而，在靶核酸包含亚型的情况下，还可以包含简并序列。作为荧光标记探针的浓度，优选0.01μM以上且1.0μM以下。更优选为0.013μM以上且0.75μM以下，进一步优选为0.02μM以上且0.5μM以下。
本发明的另一方式为用于利用单酶体系一步式RT-PCR反应从事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样中进行RNA病毒的检测的检测用试剂盒或组合物，其特征在于，是试样中的病毒RNA的检测用试剂盒或组合物，且含有分子量为5～500kDa的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
该实施方式中使用的、分子量为5～500kDa的多肽的种类和量、具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的种类和量、引物或探针的种类和量、成为检测对象的RNA病毒等可以与上述的RNA检测方法中详述的那些同样。本发明的检测用试剂盒例如可以包括用于说明本发明的使用方法的使用说明书等。例如，本发明的检测用试剂盒可以以如下方式提供：将分子量为5～500kDa的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶封入相同的容器中或封入不同的容器并例如梱包成一个包装体，并包含关于该试剂盒的使用方法的信息。
本发明的另一方式是用于利用单酶体系一步式RT-PCR反应从事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样中进行RNA病毒的检测的检测用试剂盒或组合物，其特征在于，为试样中的病毒RNA的检测用试剂盒或组合物，且含有属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
该实施方式中使用的、属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的种类和量、引物或探针的种类和量、成为检测对象的RNA病毒等可以与上述的RNA检测方法中详述的那些同样。本发明的检测用试剂盒例如可以包括用于说明本发明的使用方法的使用说明书等。例如，本发明的检测用试剂盒可以以如下方式提供：将属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶和其它成分放入相同的容器中或封入不同的容器并例如梱包成一个包装体，并包含关于该试剂盒的使用方法的信息。
[实施例]
以下通过实施例对本发明进行具体地说明。当然，本发明不受下述实施例限定。
试验例1.粪便悬浮液的制备
(1)试样的制备
将诺如病毒阴性的人粪便待检体以成为50％(重量％)的方式悬浮于灭菌水中。用水将该悬浮液稀释200倍。
(2)浊度(OD660)的测定
测定了稀释至200倍的粪便悬浮液的OD660。将测定结果乘以稀释倍率而确定了制备的粪便悬浮液的浊度。
(3)结果
确认了制备的粪便悬浮液的浊度为41.8Abs。利用粪便悬浮液进行的、之后的研究中，使用该粪便悬浮液。
试验例2.包含不溶物质的试样的一步式RT-PCR
(1-1)诺如病毒液的制备
作为诺如病毒的样品，利用了作为诺如病毒待检体的Norovirus GI和GII阳性对照(ZeptoMetrix、intact)。每一个反应添加相当于250、50、10拷贝的G1型和G2型诺如病毒的各待检体。
(1-2)粪便悬浮液的添加
将试验例1中制备的诺如病毒阴性的粪便悬浮液以RT-PCR反应液的浊度OD660为0、0.1、1.0Abs/μL的方式添加至以下的反应液中。
(2)反应液
将以下所示的组成的反应液作为基本组成，在单酶体系一步式RT-PCR中，检测了反应液中的诺如病毒。
反应液
(rTaq DNA聚合酶10xBuffer(东洋纺)所附品)
10x引物液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
10x探针液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
0.2mM sNTPs Mixture(东洋纺)
2mM Mn(OAc)2(东洋纺)
4.2ng/μl rTth DNA聚合酶(东洋纺)
0.01μg/μl抗Tth抗体
将上述各试剂混合，以最终液量为49μL的方式制备了RT-PCR反应液。各添加1μL粪便悬浮液以使RT-PCR反应液的浊度达到以下条件，制成50μL反应体系并实施RT-PCR。
条件1 0Abs/μL
条件2 0.1Abs/μL
条件3 1Abs/μL
使用BioRad制CFX96WELL DEEP并通过以下的温度循环对其实施了实时PCR反应。在52℃、40次循环的延伸步骤中进行荧光值的读取。
90℃ 1分钟(热处理条件)
58℃ 5分钟(逆转录条件)
95℃ 1秒-52℃ 10秒 10次循环(PCR)
95℃ 1秒-52℃ 10秒 40次循环(PCR-荧光读取)
(4)结果
在添加了粪便悬浮液的条件下，诺如病毒的检测灵敏度降低。在条件2下未能确认到作为低拷贝的10拷贝的检出，在条件3下也无法确认内部标准(IC)的检出。
[表1]
Ct值(底纹:未检出)
Figure BDA0003494065640000251
试验例3.一步式RT-PCR中的添加剂的研究1
(1-1)诺如病毒液的制备
作为诺如病毒的样品，利用了作为诺如病毒待检体的Norovirus GI和GII阳性对照(ZeptoMetrix、intact)。每一个反应添加相当于250、50拷贝的G1型和G2型诺如病毒的各待检体。
(1-2)粪便悬浮液的添加
将试验例1中制备的诺如病毒阴性的粪便悬浮液以RT-PCR反应液的浊度OD660为1.0Abs/μL的方式添加至以下的反应液中。
(2)反应液
将以下所示的组成的反应液作为基本组成，在单酶体系一步式RT-PCR中，检测了反应液中的诺如病毒。使用的反应液(rTaqDNA聚合酶10xBuffer(东洋纺))的组成为100mMTris-HCl(pH8.3)、500mM KCl。
反应液
(rTaq DNA聚合酶10xBuffer(东洋纺)所附品)
10x引物液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
10x探针液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
0.2mM sNTPs Mixture(东洋纺)
2mM Mn(OAc)2(东洋纺)
4.2ng/μl rTth DNA聚合酶(东洋纺)
0.01μg/μl抗Tth抗体
将上述各试剂混合，以包括以下的添加剂在内最终液量为49μL的方式制备了RT-PCR反应液。将粪便悬浮液在RT-PCR反应液中各添加1μL，使得最终浓度达到以下条件，包括以下的添加剂在内制成50μL反应体系并实施RT-PCR。
(3)添加剂
以表2记载的最终浓度将以下的添加剂添加至RT-PCR反应液中。
·牛血清白蛋白(以下BSA)(分子量：约60kDa、NACALAI TESQUE)
·鱼明胶(分子量：约20～25kDa、默克)
·封闭肽片段(以下BPF)(分子量：约22kDa、东洋纺)
·丝胶蛋白(分子量：约65～400kDa、默克)
·猪明胶(分子量：约50～100kDa、默克)
[表2]
Figure BDA0003494065640000271
使用BioRad制CFX96WELL DEEP并通过以下的温度循环对其实施了实时PCR反应。在52℃、40次循环的延伸步骤中进行荧光值的读取。
90℃ 1分钟(热处理条件)
58℃ 5分钟(逆转录条件)
95℃ 1秒-52℃ 10秒 10次循环(PCR)
95℃ 1秒-52℃ 10秒 40次循环(PCR-荧光读取)
(4)结果
在未添加添加剂的条件1(NTC)下，粪便悬浮液的浊度为1.0Abs/μL的条件下无法检测G1和G2的诺如病毒，而通过实施各添加剂的添加，分别确认到检测灵敏度的改善效果。BPF和丝胶蛋白在10mg/mL以上时能够检测低拷贝待检体(50拷贝/反应)，而BSA在1mg/mL以上时可观察到效果，确认了在低浓度下具有效果。另外，猪明胶为15mg/mL以上时具有同样的效果，而鱼明胶在5mg/mL以上时确认了同样的效果。
[表3]
Ct值(底纹是未检出)
Figure BDA0003494065640000281
试验例4.一步式RT-PCR中的添加剂的研究2
(1-1)诺如病毒液的制备
作为诺如病毒的样品，利用了作为诺如病毒待检体的Norovirus GI和GII阳性对照(ZeptoMetrix、intact)。每一个反应添加相当于250、50拷贝的G1型和G2型诺如病毒的各待检体。
(1-2)粪便悬浮液的添加
将试验例1中制备的诺如病毒阴性的粪便悬浮液以RT-PCR反应液的浊度OD660为1.0Abs/μL的方式添加至以下的反应液中。
(2)反应液
将以下所示的组成的反应液作为基本组成，在单酶体系一步式RT-PCR中，检测了反应液中的诺如病毒。使用的反应液(rTaqDNA聚合酶10xBuffer(东洋纺))的组成为100mMTris-HCl(pH8.3)、500mM KCl。
反应液
(rTaq DNA聚合酶10xBuffer(东洋纺)所附品)
10x引物液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
10x探针液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
0.2mM sNTPs Mixture(东洋纺)
2mM Mn(OAc)2(东洋纺)
4.2ng/μl rTth DNA聚合酶(东洋纺)
0.01μg/μl抗Tth抗体
将上述各试剂混合，以包括以下的添加剂在内最终液量为49μL的方式制备了RT-PCR反应液。将粪便悬浮液在RT-PCR反应液中各添加1μL，以使最终浓度达到以下条件，包括以下的添加剂在内制成50μL反应体系并实施RT-PCR。
(3)添加剂
以以下的表4记载的最终浓度将BSA(分子量：约60kDa)和鱼明胶(分子量：约20～25kDa)添加至RT-PCR反应液中。
[表4]
Figure BDA0003494065640000291
使用BioRad制CFX96WELL DEEP并通过以下的温度循环对其实施了实时PCR反应。在52℃、40次循环的延伸步骤中进行荧光值的读取。
90℃ 1分钟(热处理条件)
58℃ 5分钟(逆转录条件)
95℃ 1秒-52℃ 10秒 10次循环(PCR)
95℃ 1秒-52℃ 10秒 40次循环(PCR-荧光读取)
(4)结果
在作为未添加BSA和鱼明胶的条件1下，G1和G2的诺如病毒均无法检测。相对于此，同时添加了BSA 1mg/mL以上和鱼明胶00005mg/mL以上的条件下，确认了反应性得到改善，即使在存在1Abs/μL的不溶物质的情况下，G1、G2均能够检测至10拷贝/反应。
[表5]
Ct值(底纹是未检出
Figure BDA0003494065640000301
试验例4.不溶物质的浊度的研究(利用了TthDNA聚合酶的不溶物质浓度带来的抑 制效果的研究)
(1-1)诺如病毒液的制备
作为诺如病毒的样品，利用了作为诺如病毒待检体的Norovirus GI和GII阳性对照(ZeptoMetrix、intact)。每一个反应添加相当于250、50、10拷贝的G1型和G2型诺如病毒的各待检体。
(1-2)粪便悬浮液的添加
将试验例1中制备的诺如病毒阴性的粪便悬浮液以RT-PCR反应液的浊度OD660为以下的条件的方式添加至反应液中。
条件1 0Abs/μL
条件2 0.1Abs/μL
条件3 0.5Abs/μL
条件4 1.0Abs/μL
条件5 3.0Abs/μL
条件6 5.0Abs/μL
(2)反应液
将以下所示的组成的反应液作为基本组成，在单酶体系一步式RT-PCR中，检测了反应液中的诺如病毒。本试验例中使用的rTth DNA聚合酶是属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
反应液
(rTaq DNA聚合酶10xBuffer(东洋纺)所附品)
10x引物液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
10x探针液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
0.2mM sNTPs Mixture(东洋纺)
2mM Mn(OAc)2(东洋纺)
4.2ng/μl rTth DNA聚合酶(东洋纺)
0.01μg/μl抗Tth抗体
3mg/ml BSA(分子量：约60kDa)
5mg/mL鱼明胶(分子量：约20～25kDa)
将上述各试剂混合，以最终液量为49μL的方式制备了RT-PCR反应液。将粪便悬浮液以浊度为以下的条件的方式各添加1μL在RT-PCR反应液中，包括以下的添加剂在内制成50μL反应体系并实施RT-PCR。
(3)结果
粪便悬浮液的不溶物质的浊度为1Abs/μL为止的情况，确认了诺如病毒G1、G2均检测至10拷贝。另外，3Abs/μL下，仅G1确认检测至10拷贝，G2确认检测至50拷贝。浊度5Abs/μL以上时确认了荧光强度显著降低，G1、G2均无法检测。
[表6]
Ct值(底纹是未检出)
Figure BDA0003494065640000321
试验例5.使用了耐热性DNA聚合酶突变体的一步式RT-PCR
(1-1)诺如病毒液的制备
作为诺如病毒的样品，利用了作为诺如病毒待检体的Norovirus GI和GII阳性对照(ZeptoMetrix、intact)。每一个反应添加相当于250拷贝的G1型和G2型诺如病毒的各待检体。
(1-2)粪便悬浮液的添加
将试验例1中制备的诺如病毒阴性的粪便悬浮液以RT-PCR反应液的浊度OD660为1.0Abs/μL的方式添加至以下的反应液中。
(2)反应液
将以下所示的组成的反应液作为基本组成，在单酶体系一步式RT-PCR中，检测了反应液中的诺如病毒。属于家族A的耐热性聚合酶在各条件下进行变更。
反应液
(rTaq DNA聚合酶10xBuffer(东洋纺)所附品)
10x引物液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
10x探针液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
0.2mM sNTPs Mixture(东洋纺)
2mM Mn(OAc)2(东洋纺)
4.2ng/μl各耐热性DNA聚合酶突变体
0.01μg/μl各抗耐热性DNA聚合酶抗体
3mg/ml BSA
5mg/ml鱼明胶
将上述各试剂混合，以最终液量为49μL的方式制备了RT-PCR反应液。将粪便悬浮液在RT-PCR反应液中各添加1μL，以使最终浓度达到以下条件，制成50μL反应体系并实施RT-PCR。使用BioRad制CFX96WELL DEEP并通过以下的温度循环对其实施了实时PCR反应。在52℃、40次循环的延伸步骤中进行荧光值的读取。
90℃ 1分钟(热处理条件)
58℃ 5分钟(逆转录条件)
95℃ 1秒-52℃ 10秒 10次循环(PCR)
95℃ 1秒-52℃ 10秒 40次循环(PCR-荧光读取)
(3)使用的耐热性DNA聚合酶及其突变体
将以下所示的耐热性聚合酶及其突变体按记载的浓度用于各自的反应。关于突变体的符号，依据氨基酸的单字母缩写来表示。关于突变导入位点，是包含在酶的名称中的数字，左变记载变更前的氨基酸、右变记载变更后的氨基酸。例如，“Tth突变体(E628K)”是指将Tth DNA聚合酶(序列号10)的第628位的E(谷氨酸)突变为K(赖氨酸)的情况。
(使用的酶)
·酶1：Tth DNA聚合酶(野生型)(东洋纺)
·酶2：Tth突变体(E628K)
·酶3：Tth突变体(Q509R)
·酶4：Tth突变体(D549G)
·酶5：Taq DNA聚合酶(野生型)(东洋纺)
·酶6：Taq突变体(E507R)
(4)结果
在对应于属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的TthDNA聚合酶及其突变体中，即使在不溶物质的浓度为1Abs/μL的条件下也确认了G1和G2两种诺如病毒的检测。
[表7]
Ct值(底纹:末检出)
Figure BDA0003494065640000341
试验例6.直接添加了粪便试样的条件下的一步式RT-PCR
(1-1)诺如病毒液的制备
作为诺如病毒的样品，利用了作为诺如病毒待检体的Norovirus GI和GII阳性对照(ZeptoMetrix、intact)。每一个反应添加相当于50拷贝的G1型和G2型诺如病毒的各待检体。
(1-2)粪便试样的添加
使用竹签采集诺如病毒阴性的粪便试样(2待检体)，直接添加至利用以下的方法制备的RT-PCR反应液中并使其悬浮。分取出一部分，确认浊度(OD660)为1.0Abs/μL左右。另外，由于试样的采集量存在偏差，因此以N＝3实施。
(2)RT-PCR反应液制备
将以下所示的组成的反应液作为基本组成，在单酶体系一步式RT-PCR中，检测了反应液中的诺如病毒。
反应液
(rTaq DNA聚合酶10xBuffer(东洋纺)所附品)
10x引物液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
10x探针液
(诺如病毒检测试剂盒G1/G2-高速探针检测-(东洋纺)所附品)
0.2mM sNTPs Mixture(东洋纺)
2mM Mn(OAc)2(东洋纺)
4.2ng/μl rTth DNA聚合酶(东洋纺)
0.01μg/μl抗Tth抗体
3mg/ml BSA(分子量：约60kDa)
5mg/mL鱼明胶(分子量：约20～25kDa)
将上述各试剂混合，以最终液量为100μL的方式制备了RT-PCR反应液。将粪便试样混合后，使用50μL实施了RT-PCR。用余量的50μL实施了浊度测定。使用BioRad制CFX96WELLDEEP并通过以下的温度循环对其实施了实时PCR反应。在52℃、40次循环的延伸步骤中进行荧光值的读取。
90℃ 1分钟(热处理条件)
58℃ 5分钟(逆转录条件)
95℃ 1秒-52℃ 10秒 10次循环(PCR)
95℃ 1秒-52℃ 10秒 40次循环(PCR-荧光读取)
(4)结果
确认了：在直接添加了粪便待检体的条件下，在不溶物质的浊度为0.8～1.25Abs/μL的范围内，对于G1和G2的诺如病毒，能够检测50拷贝。
[表8]
Ct值(底纹：未检出)
Figure BDA0003494065640000361
产业上的可利用性
本发明可适宜地用于以分子生物学研究以及临床检测、食品卫生管理等为目的的检测中。
序列表
<110> 东洋纺株式会社(TOYOBO. CO., LTD.)
<120> 经改良的病毒检测方法(Improved methods for detecting viruses)
<130> 190547WO01
<150> JP 2019-139565
<151> 2019-7-30
<150> JP 2019-139566
<151> 2019-7-30
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 诺如病毒(Norovirus)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n是a, c, g, 或 t
<400> 1
cgytggatgc gnttycatga 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 诺如病毒(Norovirus)
<400> 2
cttagacgcc atcatcatty ac 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 诺如病毒(Norovirus)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n是a, c, g, 或 t
<400> 3
cargarbcna tgttyagrtg gatgag 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 诺如病毒(Norovirus)
<400> 4
tttgagtcca tgtacaagtg gatgcg 26
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 诺如病毒(Norovirus)
<400> 5
tcgacgccat cttcattcac a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 诺如病毒(Norovirus)
<400> 6
agatygcgat cycctgtcca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 诺如病毒(Norovirus)
<400> 7
agatcgcggt ctcctgtcca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 诺如病毒(Norovirus)
<400> 8
tgggagggcg atcgcaatct 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 诺如病毒(Norovirus)
<400> 9
tgggagggsg atcgcratct 20
<210> 10
<211> 834
<212> PRT
<213> Tth DNA聚合酶(Tth DNA polymerase)
<400> 10
Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
50 55 60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
85 90 95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
115 120 125
Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
130 135 140
Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145 150 155 160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg
165 170 175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg
210 215 220
Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225 230 235 240
Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
260 265 270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
275 280 285
Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro
290 295 300
Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp
305 310 315 320
Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg
325 330 335
Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly
340 345 350
Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp
355 360 365
Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro
370 375 380
Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp
385 390 395 400
Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg
405 410 415
Asn Leu Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr
420 425 430
His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala
435 440 445
Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu
450 455 460
Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala
465 470 475 480
Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu
485 490 495
Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly
500 505 510
Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His
515 520 525
Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys
530 535 540
Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly
545 550 555 560
Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu
565 570 575
Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu
580 585 590
Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu
595 600 605
Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu
610 615 620
Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile
625 630 635 640
His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val
645 650 655
Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu
660 665 670
Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr
675 680 685
Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys
690 695 700
Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly
705 710 715 720
Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn
725 730 735
Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn
740 745 750
Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val
755 760 765
Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln
770 775 780
Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu
785 790 795 800
Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala
805 810 815
Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala
820 825 830
Lys Gly
<210> 11
<211> 834
<212> PRT
<213> Z05 DNA聚合酶(Z05 DNA polymerase)
<400> 11
Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
50 55 60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
85 90 95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
115 120 125
Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
130 135 140
Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145 150 155 160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys
165 170 175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg
210 215 220
Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225 230 235 240
Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
260 265 270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
275 280 285
Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro
290 295 300
Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp
305 310 315 320
Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg
325 330 335
Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly
340 345 350
Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp
355 360 365
Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro
370 375 380
Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp
385 390 395 400
Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln
405 410 415
Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr
420 425 430
Gln Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala
435 440 445
Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu
450 455 460
Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala
465 470 475 480
Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu
485 490 495
Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly
500 505 510
Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His
515 520 525
Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys
530 535 540
Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly
545 550 555 560
Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu
565 570 575
Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu
580 585 590
Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu
595 600 605
Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu
610 615 620
Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile
625 630 635 640
His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala Val
645 650 655
Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu
660 665 670
Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr
675 680 685
Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys
690 695 700
Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly
705 710 715 720
Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn
725 730 735
Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn
740 745 750
Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val
755 760 765
Lys Leu Phe Pro His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln
770 775 780
Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu
785 790 795 800
Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala
805 810 815
Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala
820 825 830
Lys Gly

Claims (41)

1.一种用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法，其特征在于，包括以下工序：
(1)制备混合液的工序，将事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样、与包含分子量为5～500kDa的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT-PCR反应液混合而制备混合液；以及，
(2)将反应容器密闭后实施一步式RT-PCR反应的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合液中的不溶物质的浊度在OD660下为0.01Abs/μL以上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述单酶体系一步式RT-PCR反应液中包含的分子量为5～500kDa的多肽包括选自由牛血清白蛋白、明胶、封闭肽片段即BPF、及丝胶蛋白组成的组中的至少1种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述混合液以该混合液中最终浓度计包含选自由0.5mg/mL以上的牛血清白蛋白、5mg/mL以上的明胶、5mg/mL以上的封闭肽片段即BPF、及5mg/mL以上的丝胶蛋白组成的组中的至少1种作为所述分子量为5～500kDa的多肽。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述工序(1)中使用的包含不溶物质的试样是未进行核酸的分离处理也未进行加热处理的试样。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述工序(1)和(2)在同一容器中进行。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述工序(2)中，在将反应容器密闭后在一次都不打开/关闭盖子的情况下实施一步式RT-PCR反应。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述工序(2)中包括在循环反应之前和/或循环反应中实施热处理的操作，以将病毒破碎而使病毒内的核酸露出和/或在核酸扩增反应中活化热启动酶。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述试样为血液试样、粪便试样和/或擦拭检测试样。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述试样是悬浮于水、生理盐水或缓冲液的悬浮液。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述不溶物质源自血液试样、粪便试样和/或擦拭检测试样。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述病毒是不具有包膜的RNA病毒。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，不具有包膜的RNA病毒为呼肠孤病毒科病毒或杯状病毒科病毒。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，呼肠孤病毒科病毒为轮状病毒。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，杯状病毒科病毒为诺如病毒。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，能够判断诺如病毒是GI型还是GII型。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述耐热性DNA聚合酶为属于家族A的DNA聚合酶。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其特征在于，所述耐热性DNA聚合酶为选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少1种。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述单酶体系一步式RT-PCR反应液还包含1mM以上的2价阳离子。
20.一种用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法，其特征在于，包括以下工序：
(1)制备混合液的工序，将事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样、与包含属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT-PCR反应液混合而制备混合液；以及
(2)将反应容器密闭后实施一步式RT-PCR反应的工序。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶是选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少一种具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述突变体由与Tth聚合酶(序列号10)或HawkZ05聚合酶(序列号11)的氨基酸序列显示出90％以上的同一性的氨基酸序列组成，且显示出逆转录活性和耐热性DNA聚合酶活性。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述突变体由在Tth聚合酶(序列号10)或Hawk Z05聚合酶(序列号11)的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸的缺失、置换和/或添加的氨基酸序列组成，且显示出逆转录活性和耐热性DNA聚合酶活性。
24.一种用于利用单酶体系一步式RT-PCR反应从事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样中进行RNA病毒的检测的组合物，其特征在于，含有分子量为5～500kDa的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述组合物与所述试样的混合液中的不溶物质的浊度在OD660下为0.01Abs/μL以上。
26.根据权利要求24或25所述的组合物，其中，所述单酶体系一步式RT-PCR反应液中包含的分子量为5～500kDa的多肽包括选自由牛血清白蛋白、明胶、封闭肽片段即BPF、及丝胶蛋白组成的组中的至少1种。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的组合物，其中，所述组合物与所述试样的混合液以如下方式制备、配混：以该混合液中最终浓度计包含选自由0.5mg/mL以上的牛血清白蛋白、5mg/mL以上的明胶、5mg/mL以上的封闭肽片段即BPF、及5mg/mL以上的丝胶蛋白组成的组中的至少1种作为所述分子量为5～500kDa的多肽。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的组合物，其中，所述包含不溶物质的试样是未进行核酸的分离处理也未进行加热处理的试样。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的组合物，其特征在于，所述耐热性DNA聚合酶为属于家族A的DNA聚合酶。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的组合物，其特征在于，所述耐热性DNA聚合酶为选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少1种。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的组合物，其中，所述单酶体系一步式RT-PCR反应液还包含1mM以上的2价阳离子。
32.根据权利要求24至31中任一项所述的组合物，其中，病毒是不具有包膜的RNA病毒。
33.根据权利要求32中任一项所述的组合物，其中，不具有包膜的RNA病毒为呼肠孤病毒科病毒或杯状病毒科病毒。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中，呼肠孤病毒科病毒为轮状病毒。
35.根据权利要求33所述的组合物，其中，杯状病毒科病毒为诺如病毒。
36.根据权利要求24至35中任一项所述的组合物，其特征在于，能够判断诺如病毒是GI型还是GII型。
37.一种用于利用单酶体系一步式RT-PCR反应从事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样中进行RNA病毒的检测的组合物，其特征在于，含有属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
38.根据权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶是选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少一种具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中，所述突变体由与Tth聚合酶(序列号10)或Hawk Z05聚合酶(序列号11)的氨基酸序列显示出90％以上的同一性的氨基酸序列组成，且显示出逆转录活性和耐热性DNA聚合酶活性。
40.根据权利要求38或39所述的组合物，其中，所述突变体由在Tth聚合酶(序列号10)或Hawk Z05聚合酶(序列号11)的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸的缺失、置换和/或添加的氨基酸序列组成，且显示出逆转录活性和耐热性DNA聚合酶活性。
41.一种用于在事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样中检测RNA病毒的存在的试剂盒，其包含权利要求24至40中任一项所述的组合物。
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