CN101680040A - 改良的诺如病毒rna检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种RNA扩增工序，其包括以下工序：使用下述引物对中的至少两组，通过逆转录酶，生成包含启动子序列的双链DNA，所述引物对为：由对于与诺如病毒的各个基因型的RNA相同或者互补的核酸序列杂交效率高的第一引物和第二引物(该引物中的任意一者的5’末端附加有启动子序列)组成的引物对；以该双链DNA作为模板，通过RNA聚合酶生成RNA转录产物；该RNA转录产物继续作为利用所述逆转录酶合成DNA的模板，生成所述双链DNA。在所述RNA扩增工序中，通过用嵌入剂性荧光染料标记的核酸探针测定被扩增的RNA转录产物量。

Description

改良的诺如病毒RNA检测方法
技术领域
本发明涉及一种简便、迅速地测定诺如病毒(Norovirus)的方法。本发明在临床检查、公共卫生、食品检查、食物中毒检查的领域中有用。
背景技术
诺如病毒是属于人杯状病毒(human calicivirus)科的病毒，其基因组中具有约7000个碱基的单链RNA。诺如病毒也称为小圆结构病毒(Small Round Structured Virus，SRSV)。
在日本报告的食物中毒中约20％被推测为起因于病毒。从这些病毒性食物中毒例子的约80％以上中检测到诺如病毒。主要的感染源是食品，生牡蛎经常成为问题。此外，从婴幼儿的(散发的)急性胃肠炎中也检测到诺如病毒，还报告有从人到人的感染例。由以上可知，诺如病毒的检查在公共卫生上及食品的品质管理上成为很大的课题，期望开发使用基因扩增法的、高灵敏度且迅速并且能够检测所有基因型或者检测率高的检查方法。以前，诺如病毒的检测基本通过电子显微镜进行观察。该方法中，虽然能够检测所有基因型，但由于灵敏度低，检测时需要106个/mL以上的病毒量，因此待测物仅限于患者粪便。此外，即便能够观察病毒，也无法进行鉴定。
此外，还开发了使用人杯状病毒的病毒样空心颗粒的特异抗体检测ELISA的试剂(WO2000/079280号公报)。但是，检测灵敏度与电子显微镜程度相同，决不能说是高灵敏度。
作为以高灵敏度测定诺如病毒的手段，可以列举出将诺如病毒RNA通过RT-PCR进行扩增的方法(日本专利3752102号公报)，但该方法的情况下，通常需要逆转录(RT)工序和PCR工序这两个阶段的工序。这种情况不仅使操作变得繁杂，并成为重现性变差的主要原因，而且还会增加二次污染的危险性。此外，将所述RT工序和PCR工序合在一起的话，通常需要2小时以上的时间，对于多个待测物的处理和检查成本的降低来说是不合适的。
作为靶RNA的定量法，正在广泛使用实时RT-PCR法，即，在嵌入剂性荧光染料存在下实施紧接着RT工序之后实施的PCR工序来测定荧光增加(Kageyama T.et al.，Journal ofClinical Microbiology，41，1548-1557(2003))，但在该方法中，存在引物二聚体等非特异扩增产物也被检测出的问题。进而，PCR需要急剧升降反应温度，这成为自动化时反应装置节省劳动力和低成本化的障碍。
另一方面，作为在一定温度下仅扩增RNA的方法，报告有NASBA法(日本专利2650159号公报和日本专利3152927号公报)、和TMA法(日本专利3241717号公报)等。该RNA扩增方法中，通过包含针对目标RNA的启动子序列的引物、逆转录酶及根据需要的核糖核酸酶H(RNase H)，合成包含启动子序列的双链DNA，并通过RNA聚合酶合成包含目标RNA的特定碱基序列的RNA，该RNA继续作为包含启动子序列的双链DNA合成的模板而进行链式反应。并且，在RNA扩增后，通过电泳或者使用结合有能够检测的标记的核酸探针通过杂交法等来检测被扩增的RNA。
以上那样，所述RNA扩增方法由于在一定温度下通过一个阶段仅扩增RNA，因此适于简便的RNA测定，但利用杂交法等的检测需要繁杂的操作，存在无法重现性好地进行定量的问题。
作为简便地扩增及测定RNA的方法，可以列举出Ishiguro等(日本特开2000-14400号公报和Ishiguro T.et al.，AnalyticalBiochemistry，314，77-86(2003))的方法。该方法中，在核酸探针的存在下，实施所述RNA扩增方法，并测定荧光特性的变化，所述核酸探针是用嵌入剂性荧光染料标记的核酸探针，且按照以下方式设计而成：当其与靶核酸形成互补的双链时，则嵌入剂性荧光染料部分嵌入所述互补的双链部分中，从而荧光特性发生变化；该方法可以简便地、在一定温度下、通过一个阶段且在密封容器内同时实施RNA扩增和测定。
所述各核酸扩增方法均是通过由正义引物(第一引物)和反义引物(第二引物)组成的引物对来扩增靶RNA的方法，众所周知构成该引物对的引物序列的组合对于所述核酸扩增的效率和特异性具有重要的意义。但是，由于诺如病毒具有极其多样的基因型，因此极其难以构建同样且高效率地扩增全部基因型的引物对。
发明内容
根据基因序列的差异，诺如病毒大致分为基因组(genogroup)I(GI)和基因组II(GII)这2种基因组。进而关于各基因组，目前GI分为14种基因型，GII分为17种基因型(参照感染症发生动向调查周报，6(11)，14-19(2004))。属于GI的基因型间、属于GII的基因型间的碱基序列的同源性各约为70％。此外，GI和GII的碱基序列的同源性为40～50％。
为了使用所述基因扩增法通过诺如病毒检测试剂获得高的检测率，作为引物结合区域，各种基因型间碱基序列高度保守的20个碱基以上的区域至少需要2处。然而，作为GenBank上的诺如病毒的序列，即使仅对以下6个序列(Chiba(No.AB042808)、Norwalk(No.M87661)、Southampton(No.L07418)、Camberwell(No.AF145896)、Hawaii(No.U07611)、HuCV(No.AY032605))的同源性进行调查，基因型间碱基序列相同的20个碱基以上的区域也是不存在的。
在这样的背景下，本发明人等已经提供了在GI、或者GII的广泛基因型中具有较高检测率的检测方法(日本特开2005-245434号公报)。但是，即使根据该方法，也不能说对诺如病毒的全部基因型达到了高灵敏度且同样的检测，期望以更高灵敏度检测更宽范围的基因型的诺如病毒RNA的检测方法。
本发明人为了解决所述问题进行了深入研究，结果能够以高灵敏度且简便、迅速地对诺如病毒RNA的宽范围的基因型进行测定。
第1方案为检测试样中的诺如病毒RNA的方法，其特征在于，其包括以下工序：
(1)以诺如病毒RNA内的特定核酸序列为模板，通过第一引物和第二引物、RNA依赖性DNA聚合酶、核糖核酸酶H(RNase H)、及DNA依赖性DNA聚合酶，生成包含启动子序列和在该启动子序列下游的所述特定碱基序列的双链DNA的工序，其中，在所述第一引物和所述第二引物的任意一者的5’末端附加有启动子序列；
(2)以该双链DNA作为模板，通过RNA聚合酶，生成包含所述特定碱基序列的RNA转录产物的工序；
(3)该RNA转录产物继续作为所述双链DNA合成的模板，从而将该RNA转录产物链式扩增的工序；
(4)测定所述RNA转录产物量的工序；
所述第一引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：序列与序列号1～4中记载的序列中的至少任意一者分别充分相同的寡核苷酸；所述第二引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：序列与序列号5～9中记载的序列中的至少任意一者分别充分互补的寡核苷酸。
第2方案与第1方案相关，其特征在于，在所述诺如病毒RNA的检测方法中，第一引物由选自下列序列号中记载的寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：作为序列号1的部分序列的序列号10、作为序列号2的部分序列的序列号11、及作为序列号3的部分序列的序列号12；第二引物由选自下列序列号中记载的寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：作为序列号5的互补链的序列号13、作为序列号7的互补链的序列号14、作为序列号8的互补链的序列号15、及作为序列号9的互补链的序列号16。
第3方案与第1方案相关，其特征在于，在所述诺如病毒RNA的检测方法中，第一引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：与序列号1～4中记载的序列中的至少任意一者相同的序列中的连续14个核苷酸。
第4方案与第1～3方案中的任一项相关，其特征在于，在所述诺如病毒RNA的检测方法中，在以诺如病毒RNA中的特定核酸序列为模板，通过5’末端附加有启动子序列的所述第一引物、所述第二引物、RNA依赖性DNA聚合酶、RNase H、及DNA依赖性DNA聚合酶，生成包含启动子序列和在该启动子序列下游的所述特定碱基序列的双链DNA的工序之前，进行如下工序：通过切断用寡核苷酸和RNase H，在所述特定碱基序列的5′末端部位将所述RNA切断；其中，所述切断用寡核苷酸与所述特定碱基序列中的与第一引物相同的区域的5′末端部位重复，并与从该部位向5’方向的相邻的区域互补；所述切断用寡核苷酸由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：序列与序列号17～21中记载的至少任意一者分别充分互补的寡核苷酸。
第5方案与第1～4方案中的任一项相关，其特征在于，在检测所述诺如病毒RNA的工序中，测定所述RNA转录产物量的工序(4)通过在核酸探针共存下测定该核酸探针的信号变化而进行，所述核酸探针由与序列号22充分互补的序列构成，并被设计成与靶RNA形成互补的双链时则信号特性发生变化。
附图说明
图1为实施例2中制备的标记有嵌入剂性荧光染料的核酸探针的结构。B1、B2、B3、B4表示碱基。是根据Ishiguro T.et al.，Nucleic Acids Research，24，4992-4997(1996)的方法，通过连接子使嵌入剂性荧光染料(噁唑黄)结合在磷酸二酯部分而成的探针。另外，为了防止3’末端的羟基的延伸反应，3’末端的羟基进行了乙醇酸修饰。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
本发明中的特定碱基序列是指与下述序列相同的RNA或者DNA的碱基序列：诺如病毒RNA上，从与第一引物相同的区域的5’末端到与第二引物互补的区域的3’末端为止的碱基序列。即，本发明中扩增来源于所述特定碱基序列的RNA转录产物。本发明中的与第一引物相同的区域的5’末端部位由在特定碱基序列内包含该相同区域的5’末端的部分序列构成，该部位是与切断用寡核苷酸互补的区域和与第一引物相同的区域重复的部位。本发明中的启动子是指与RNA聚合酶结合、开始转录的部位，对各种RNA聚合酶具有特异性的启动子序列是已知的，本发明的使用中没有特别限定，优选为分子生物学实验等中通用的T7启动子、SP6启动子、T3启动子等。
本发明中的充分互补的序列是指，在经优化的核酸扩增反应条件(盐浓度、寡核苷酸浓度、反应温度等)下能与特定碱基序列特异性且高效率地杂交的序列。此外，本发明中的充分相同的序列是指，在经优化的核酸扩增反应条件(盐浓度、寡核苷酸浓度、反应温度等)下能与特定碱基序列的完全互补序列特异性且高效率地杂交的序列。因此，本发明中所说的充分互补的或者充分相同的序列，只要在不对杂交的特异性和效率造成影响的范围内，则可任意设定长度等。但是，虽然没有特别限定，但本发明中的充分互补的序列是指，优选为由与特定碱基序列完全互补的序列中的至少连续14个碱基构成的寡核苷酸。同样虽然没有特别限定，但本发明中的充分相同的序列是指，优选为由与特定碱基序列完全相同的序列中的至少连续14个碱基构成的寡核苷酸。此外，这里所说的经优化的核酸扩增反应条件没有特别限定，可以为本说明书的实施例中所示的条件。
如前所述，目前诺如病毒GI RNA中存在14种基因型，诺如病毒GII RNA中存在17种基因型，而且，碱基序列高度保守的区域不够长。因此，通过一种由第一引物和第二引物组成的引物组合，难以高灵敏度地检测出全部的基因型。因此，本发明中，为了高灵敏度地检测更宽范围的基因型，构建了下述的检测方法：采用由具有与多个基因型充分相同或者互补的序列的、二种以上的第一引物和第二引物组成的引物组合。
即，本发明中，用于检测诺如病毒RNA的第一引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：序列与序列号1～4中记载的序列中的至少任意一者分别充分相同的寡核苷酸；且第二引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：序列与序列号5～9中记载的序列中的至少任意一者分别充分互补的寡核苷酸。
更优选的是，第一引物由选自序列号10～12中记载的寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成，并且第二引物由选自序列号13～16中记载的寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成。
作为本发明的一个方式，第一引物由序列号31、32和33中记载的序列的寡核苷酸的混合物组成，并且第二引物由序列号34和35中记载的序列的寡核苷酸的混合物组成。
本发明中，诺如病毒RNA在作为合成cDNA的模板之前，在该RNA内的特定核酸序列的所述5’末端部位被切断。通过在特定核酸序列的5’末端部位被切断，在cDNA合成后，通过将所述cDNA的3’末端延伸，可以更有效地合成与cDNA杂交的第一引物的启动子序列的互补DNA链，结果，形成了功能性双链DNA启动子结构。作为这样的切断方法，可以列举如下方法：通过具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶等，将通过添加了寡核苷酸(以下，称为切断用寡核苷酸)而形成的RNA-DNA杂交体的RNA部分切断，所述切断用寡核苷酸具有与诺如病毒RNA内的特定碱基序列的5’末端部位(在该特定碱基序列内包含5’末端的部分序列)重复、且与和5’方向相邻的区域互补的序列。为了防止该切断用寡核苷酸的3’末端的羟基的延伸反应，优选对其实施了适当修饰例如进行了氨基化等修饰后再使用。
为了高效率地切断所述5’末端部位，需要提高切断用寡核苷酸的杂交效率。但是，由于诺如病毒RNA中存在多种基因型，因此难以通过1种切断用寡核苷酸与各种基因型高效率地杂交。
因此，本发明中，作为切断用寡核苷酸，使用由选自下述寡核苷酸中的至少二种切断用寡核苷酸组成的混合物：序列与序列号17～21中记载的序列中的至少任意一者分别充分互补的寡核苷酸，更优选使用由选自下述寡核苷酸中的至少二种切断用寡核苷酸组成的混合物：与作为序列号17的互补链的部分序列的序列号23、作为序列号18的互补链的部分序列的序列号24、作为序列号19的互补链的部分序列的序列号25、和作为序列号20的互补链的部分序列的序列号26中记载的序列中的至少任意一者分别相同的序列中的至少连续24个寡核苷酸，从而提高切断用寡核苷酸与诺如病毒RNA的更宽范围的基因型的杂交效率，结果，能够提高对于更宽范围的基因型的灵敏度。
本发明中的靶RNA表示，在RNA转录产物上的特定碱基序列中，除与所述引物相同或者互补的区域以外的序列，具有能够与标记有嵌入剂性荧光染料的核酸探针互补结合的序列。因此，标记有嵌入剂性荧光染料的核酸探针成为与本发明中的一部分特定碱基序列互补的序列。因此，例如作为本发明的一个方式，作为标记有嵌入剂性荧光染料的核酸探针，可以利用具有与序列号22充分互补的序列的核酸探针。
作为本发明的一个方式，切断用寡核苷酸具有包含与序列号17～21中的至少任意一者分别充分互补的序列的序列，并且与诺如病毒RNA(基因型相对应)充分互补。此外，第一引物的5’末端具有启动子序列，第一引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：包含与序列号1～4中记载的序列中的至少任意一者分别充分相同的序列的寡核苷酸；这里各个寡核苷酸与诺如病毒RNA(基因型相对应)的完全互补序列充分互补。此外，第二引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸序列的混合物组成：包含与序列号5～9中记载的序列中的至少任意一者分别充分互补的序列的寡核苷酸；这里各个寡核苷酸为与诺如病毒RNA(基因型相对应)充分互补的序列，标记有嵌入剂性荧光染料的核酸探针优选具有包含与序列号22充分互补的序列的序列，并且与靶核酸充分互补。
更优选的是，作为本发明的所述切断用寡核苷酸，使用选自序列号28～30中记载的寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸序列；作为所述第一引物，使用选自序列号10～12中记载的寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸序列；作为所述第二引物，使用选自序列号13～16中记载的寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸序列；作为所述标记有嵌入剂性荧光染料的核酸探针，优选使用由序列号27中记载的序列构成的寡核苷酸序列。
在本发明的诺如病毒RNA的检测方法中，需要各种酶(具有以单链RNA作为模板的RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶(逆转录酶)、具有RNase H活性的酶、具有以单链DNA作为模板的DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶、和具有RNA聚合酶活性的酶)。各酶可以使用兼具几种活性的酶，也可以使用多个具有各个活性的酶。此外，例如，不仅可以在兼具以单链RNA作为模板的RNA依赖性DNA聚合酶活性、RNase H活性、和以单链DNA作为模板的DNA依赖性DNA聚合酶活性的逆转录酶中添加具有RNA聚合酶活性的酶，根据需要还可以进一步添加具有RNase H活性的酶，以进行补充等。所述逆转录酶优选为分子生物学实验等中通用的AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶、HIV逆转录酶、或者它们的衍生物等，最优选为AMV逆转录酶和其衍生物。此外，作为所述具有RNA聚合酶活性的酶，可以使用分子生物学实验等中通用的噬菌体来源的T7 RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、及它们的衍生物。
在本发明的一个方式中，在试样中的诺如病毒RNA中添加所述切断用寡核苷酸，利用所述逆转录酶的RNase H活性在所述特定碱基序列的5’末端部位将所述RNA切断。若以被切断的所述RNA作为模板并在所述第一引物和第二引物的存在下实施利用所述逆转录酶的逆转录反应，则第二引物与诺如病毒RNA内的特定碱基序列结合，利用所述逆转录酶的RNA依赖性DNA聚合酶活性进行cDNA合成。得到的RNA-DNA杂交体的RNA部分通过所述逆转录酶的RNase H活性而被分解、解离，从而第一引物与所述cDNA结合。接着，利用所述逆转录酶的DNA依赖性DNA聚合酶活性，生成来源于特定碱基序列的且在5’末端具有启动子序列的双链DNA。该双链DNA在启动子序列下游含有特定碱基序列，通过所述RNA聚合酶生成来源于特定碱基序列的RNA转录产物。该RNA转录产物成为用于通过所述第一和第二引物而合成所述双链DNA的模板，链式进行一连串的反应，所述RNA转录产物不断被扩增。
为了进行这样的链式反应，作为所述各酶所必须的已知的要素，不用说至少包括缓冲剂、镁盐、钾盐、三磷酸核苷、核糖核苷三磷酸。此外，作为用于调节反应效率的添加剂，也可以添加二甲基亚砜(DMSO)、二硫苏糖醇(DTT)、牛血清白蛋白(BSA)、糖等。
例如，使用AMV逆转录酶和T7 RNA聚合酶时，优选将反应温度设定在35～65℃的范围内，特别优选在40～44℃的范围。所述RNA扩增工序在一定温度下进行，可以将反应温度设定为逆转录酶和RNA聚合酶显示活性的任意的温度。
被扩增的RNA转录产物量可以通过已知的核酸测定法测定。作为这样的测定法，可以利用电泳或使用液相色谱法的方法、通过用能够检测的标记所标记的核酸探针而进行的杂交法等。但是，这些方法的工序操作多，而且由于将扩增产物取出到体系外进行分析，因而扩增产物向环境中飞散的危险性较大，容易引起二次污染。为了克服这些问题，优选采用按照当与靶核酸互补结合时荧光特性发生变化的方式设计的核酸探针。作为进一步优选的方法，可以列举如下方法：在核酸探针的存在下，实施所述核酸扩增工序，并测定荧光特性的变化，所述核酸探针是用嵌入剂性荧光染料标记的核酸探针，且按照以下方式设计而成：当与靶核酸形成互补的双链时，则嵌入剂性荧光染料部分嵌入所述互补的双链部分中，从而荧光特性发生变化(参照日本特开2000-14400号公报和所述Ishiguro T.et al.，(2003))。
作为所述嵌入剂性荧光染料没有特别限定，可以利用通用的噁唑黄、噻唑橙、溴化乙锭及它们的衍生物等。作为所述荧光特性的变化，可以列举荧光强度的变化。例如为噁唑黄的情况下，已知：因嵌入双链DNA，而510nm处的荧光(激发波长490nm)显著增加。所述标记有嵌入剂性荧光染料的核酸探针为与所述RNA转录产物上的靶RNA充分互补的寡核苷酸，嵌入剂性荧光染料通过适当的连接子与末端或者磷酸二酯部分或者碱基部分结合，进而，为了防止3’末端的羟基的延伸，具有该3’末端的羟基进行了适当修饰的结构(参照日本特开平8-211050号公报和所述Ishiguro T.et al.，(1996))。
嵌入剂性荧光染料对寡核苷酸的标记可以通过已知的方法在寡核苷酸中导入官能团，而使嵌入剂性荧光染料结合(参照日本特开2001-13147号公报和所述Ishiguro T.et al.，(1996))。此外，作为所述官能团的导入方法，也可以采用通用的Label-ON试剂(Clontech公司制)等。
作为本发明的一个方式，提供一种经时测定反应液的荧光强度的方法：在试样中添加至少包含5’末端具有T7启动子序列的第一引物(序列号10中记载的序列的5’末端附加有T7启动子序列(序列号58)的序列、序列号11中记载的序列的5’末端附加有T7启动子序列(序列号58)的序列、和序列号12中记载的序列的5’末端附加有T7启动子序列(序列号58)的序列)、第二引物(序列号15和序列号16所示的序列)、用嵌入剂性荧光染料标记的核酸探针(序列号27所示的序列)、切断用寡核苷酸(分别如序列号28、29和30所示的序列)、AMV逆转录酶、T7 RNA聚合酶、缓冲剂、镁盐、钾盐、三磷酸核苷、核糖核苷三磷酸、二甲基亚砜(DMSO)的扩增试剂，使其在反应温度35～65℃(优选为40～44℃)的一定温度下反应，同时经时测定反应液的荧光强度。
作为另一个方式，提供一种经时测定反应液的荧光强度的方法：在试样中添加至少包含5’末端具有T7启动子序列(序列号58)的第一引物(序列号31、32和33所示的序列)、第二引物(序列号34和序列号35所示的序列)、标记有嵌入剂性荧光染料的核酸探针(序列号27所示的序列)、切断用寡核苷酸(分别如序列号36、37和38所示的序列)、AMV逆转录酶、T7 RNA聚合酶、缓冲剂、镁盐、钾盐、三磷酸核苷、核糖核苷三磷酸、二甲基亚砜(DMSO)的扩增试剂，使其在反应温度35～65℃(优选为40～44℃)的一定温度下反应，同时经时测定反应液的荧光强度。
在所述方式中，由于经时测定荧光强度，因此可以在确认到显著的荧光增加的任意时刻结束测定，核酸扩增和测定合起来通常可以在1小时以内完成。
此外，关于能够将所述测定试剂中所含的全部试样封入单独的容器中这一点，应当特别说明。即，只要实施将一定量的试样分注到单独的容器中的操作，则其后就可以自动扩增并检测出诺如病毒RNA。该容器例如只要至少其一部分由透明的材料形成，使得可以从外部测定荧光染料所产生的信号即可，将试样分注后能够进行密封的容器由于可以防止污染，因此特别优选。
所述方式的RNA扩增和测定方法由于可以通过一个阶段、在一定温度下实施，因此与RT-PCR相比可以说是简便且适于自动化的方法。根据本发明，能够对诺如病毒RNA的宽范围的基因型进行高特异性、高灵敏度、迅速、简便、在一定温度下且通过一个阶段的测定。
实施例
以下，用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本申请实施例中使用的诺如病毒RNA(以下记载为标准RNA)通过(1)～(2)所示的方法来制备。
(1)制备登录于GenBank的诺如病毒cDNA碱基序列中表1所示的基因型、和碱基序列区域的双链DNA(另外，该DNA的5’末端侧附加了SP6启动子)。
(2)以(1)中制备的DNA作为模板，采用SP6 RNA聚合酶实施体外转录，接着通过DNase I处理将所述双链DNA完全消化后，将RNA纯化而制备。该RNA通过测定260nm处的吸光度来进行定量。
表1
  基因型   名称   GenBank No.   碱基序列区域
  GI/1   Norwalk   M87661   5113-5637
  GI/2   Southampton   L07418   5110-5634
  GI/3   Desert Shield   U04469   555-1079
  GI/4   Chiba   AB042808   5101-5625
  GI/7   Saitama T59   AB112114   16-540
  GI/8   WUG1   AB081723   5110-5634
  GI/9   Saitama SzU   AB078334   1346-1870
  GI/14   Saitama T25   AB112100   16-540
另外，虽然标准RNA的总长为533个碱基(该RNA的5’末端附加有来源于SP6启动子的8个碱基)，为诺如病毒RNA的全长(约7000个碱基)的一部分，但可以充分应用于本发明的测定对象即诺如病毒RNA的测定。此外，这次制备标准RNA的基因型为诺如病毒GI RNA的基因型总共14种中的8种，为一部分，但由于：
(A)GI/1、GI/6、及GI/8之间、
(B)GI/4、GI/5、及GI/9之间
(C)GI/3、GI/10、GI/11、GI/12、GI/13、及GI/14之间同源性分别很高(感染症发生动向调查周报、6(11)、14-19(2004))，因此若能检测出这次制备的标准RNA中的全部基因型，则推测能够检测出诺如病毒GI RNA的全部基因型。
实施例2
制备用嵌入剂性荧光染料标记的寡核苷酸探针。通过所述Ishiguro T.et al.，(1996)中记载的方法，制备下述的噁唑黄标记核酸探针：通过连接子使噁唑黄与序列号27中记载的序列的从5’末端起第12位C和第13位A之间、序列号57中记载的序列的从5’末端起第12位C和第13位A之间的磷酸二酯部分结合而形成的探针(图1)。
实施例3
在本申请发明的方法中，使用表2所示的组合的第一引物、第二引物、用嵌入剂性荧光染料标记的核酸探针(以下记载为INAF探针)、切断用寡核苷酸，通过(1)～(4)所示的方法，进行标准RNA的测定。另外，表2的组合中，组合A中记载的第一引物、第二引物和切断用寡核苷酸与日本特开2005-245434的实施例2中公开的序列相同。此外，序列号10、31、40、43和45分别为序列号1的部分序列，序列号11、32、41和46分别为序列号2的部分序列，序列号12、33和47分别为序列号3的部分序列，序列号42和44分别为序列号4的部分序列，序列号34为序列号5的互补链的部分序列，序列号48为序列号6的互补链序列，序列号35为序列号7的互补链的部分序列，序列号15为序列号8的互补链序列，序列号16为序列号9的互补链序列，序列号28、36、51和54分别为序列号17的互补链的部分序列，序列号29、52和55分别为序列号18的互补链的部分序列，序列号37为序列号19的互补链的部分序列，序列号30、38和56分别为序列号20的互补链的部分序列，序列号53为序列号21的互补链的部分序列，序列号27和57分别为序列号22的互补链的部分序列。
表2
Figure A20088002127300201
(1)将所述各标准RNA用RNA稀释液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.25U/μL核糖核酸酶抑制剂、5.0mMDTT)稀释至103拷贝/5μL，将其作为RNA试样使用。
(2)将组成如下的反应液20μL分注到0.5mL容量PCR管(GeneAmp薄壁反应管，Applied Biosystems制)中，并向其中添加所述RNA试样5μL。
反应液的组成：添加酶液后(30μL中)的最终浓度或者量
60mM Tris-HCl(pH8.6)
18mM 氯化镁
100mM 氯化钾
1mM DTT
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各3mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.6mM ITP
0.75μM 第一引物：该引物在各序列号记载的碱基序列的5’末端附加有T7启动子序列(序列号58)
1μM 第二引物
20nM 用嵌入剂性荧光染料标记的核酸探针(INAF探针)：该探针为实施例2中所制备的探针
0.16μM 切断用寡核苷酸：该寡核苷酸的3’末端的羟基被氨基修饰
6U 核糖核酸酶抑制剂(Takara Bio制)
13％ DMSO
(3)将上述反应液在43℃下保温5分钟后，添加以下组成的、预先在43℃下保温2分钟的酶液5μL。
酶液的组成：反应时(30μL中)的最终浓度或者量
2％山梨糖醇
6.4U AMV逆转录酶(Life Science制)
142U T7 RNA聚合酶(Invitrogen制)
3.6μg 牛血清白蛋白
(4)接着使用能够直接测定PCR管的带调温功能的荧光分光光度计，在43℃下反应，同时经时测定反应溶液的荧光强度(激发波长470nm、荧光波长520nm)60分钟。
以添加酶时作为0分钟，将反应液的荧光强度比(将规定时间的荧光强度值除以背景的荧光强度值的值)超过1.2时判断为阳性，以此时的时间作为检测时间，结果如表3所示。另外，表3中N.D.是指添加酶60分钟后的荧光强度比不到1.2(判断为阴性)的试样。
表3
Figure A20088002127300221
对诺如病毒GI RNA的主要基因型即GI/1(Norwalk)的标准RNA可迅速检测的寡核苷酸的组合为组合A、B、G、I和L。另一方面，对诺如病毒GI RNA的宽范围的基因型的标准RNA可迅速检测的寡核苷酸的组合为组合Q、R、T和U，特别优选的组合为组合T。
此外，与使用第一引物、第二引物、和切断用寡核苷酸分别为一种寡核苷酸的组合(组合A～D)时相比，使用第一引物、第二引物、和切断用寡核苷酸分别为二种以上的寡核苷酸的组合(组合E～L)时，可以对更宽范围的基因型的标准RNA进行检测。由此可知，为了对诺如病毒的宽范围的基因型高灵敏度地进行检测，优选分别使用二种以上该引物类。
进而，通过组合Q、R、T及U的比较可知，在第一引物的长度为20个寡核苷酸时(组合Q和R)、和第一引物的长度为14个寡核苷酸时(组合T和U)之间，各基因型的标准RNA的检测中几乎看不到差别，因此第一引物的长度只要为14个核苷酸就足够了。
以上表明，通过采用了本发明中记载的第一引物、第二引物、用嵌入剂性荧光染料标记的核酸探针、切断用寡核苷酸的RNA扩增和测定法，能够对诺如病毒GI RNA的宽范围的基因型高灵敏度地进行检测。
序列表
<110>东曹株式会社(TOSOH CORPORATION)
<120>改良的诺如病毒RNA检测方法
<130>V623-PCT
<150>JP 2007-164921
<151>2007-06-22
<160>58
<210>1
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>1
gatgcgcttc catgacctcg gattgtggac aggagatcgc gatcttctgc                  65
ccgaattcgt aaatg
<210>2
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>2
gatgcggttc catgaccttg gtttgtggac aggagatcgc aatctcctgc                  65
ccgaatttgt aaatg
<210>3
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>3
gatgcgcttc catgatctga gcatgtggac aggggatcgc gatctcctgc                  65
ccgattatgt aaatg
<210>4
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>4
gatgcgattc catgatttga gcttgtggac aggagaccgc gatctcttgc                  65
ccgattatgt aaatg
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>5
attgatccct ggataatt                                                     18
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>6
attgatccct ggattgtt                                                     18
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>7
attgacccct ggataatg                                                     18
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>8
attgatccct ggataatc                                                     18
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>9
attgacccct ggattatg                                                     18
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>10
tctgcccgaa ttcgtaaatg                                                   20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>11
cctgcccgaa tttgtaaatg                                                   20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>12
cctgcccgat tatgtaaatg                                                   20
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>13
aattatccag ggatcaat                                                     18
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>14
cattatccag gggtcaat                                                     18
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>15
gattatccag ggatcaat                                                     18
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>16
cataatccag gggtcaat                                                     18
<210>17
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>17
gcaggccatg ttccgctgga tgcgcttcca tgacctcgga ttgtggacag                  75
gagatcgcga tcttctgccc gaatt
<210>18
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>18
gcaagccatg ttccgttgga tgcggttcca tgaccttggt ttgtggacag                  75
gagatcgcaa tctcctgccc gaatt
<210>19
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>19
gcaggccatg ttccgctgga tgcgcttcca tgatctgagc atgtggacag                  75
gggatcgcga tctcctgccc gatta
<210>20
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>20
gcaggctatg ttccgctgga tgcgcttcca tgatctcgga ttgtggacag                  75
gagatcgcaa tctcttgccc gaatt
<210>21
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>21
gcaggccatg ttccgctgga tgcgattcca tgatttgagc ttgtggacag                  75
gagaccgcga tctcttgccc gatta
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记有嵌入剂性荧光团的核酸探针
<400>22
gtaaatgatg atggcgtcta agga                                              24
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>23
aattcgggca gaagatcgcg atctcctgtc                                        30
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>24
aattcgggca ggagattgcg atctcctgtc                                        30
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>25
taatcgggca ggagatcgcg atcccctgtc                                        30
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>26
aattcgggca agagattgcg atctcctgtc                                        30
<210>27
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记有嵌入剂性荧光团的核酸探针
<400>27
tccttagacg ccatcatc                                                     18
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>28
ggcagaagat cgcgatctcc tgtc                                              24
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>29
ggcaggagat tgcgatctcc tgtc                                              24
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>30
ggcaagagat tgcgatctcc tgtc                                              24
<210>31
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>31
cgaattcgta aatg                                                         14
<210>32
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>32
cgaatttgta aatg                                                          14
<210>33
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>33
cgattatgta aatg                                                          14
<210>34
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>34
atccagggat caat                                                          14
<210>35
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>35
atccaggggt caat                                                          14
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>36
aattcgggca gaagatcgcg atct                                              24
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>37
taatcgggca ggagatcgcg atcc                                              24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>38
aattcgggca agagattgcg atct                                              24
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>39
ttgtggacag gagatcgcta tct                                              23
<210>40
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>40
ccatgacctc ggattgtgga caggagatcg c                                     31
<210>41
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>41
ccatgacctt ggtttgtgga caggagatcg c                                     31
<210>42
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>42
ccatgatttg agcttgtgga caggagaccg c                                     31
<210>43
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>43
gatgcgcttc catg                                                         14
<210>44
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>44
gatgcgattc catg                                                         14
<210>45
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>45
tctgcccgaa ttcg                                                         14
<210>46
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>46
cctgcccgaa tttg                                                         14
<210>47
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>47
cctgcccgat tatg                                                         14
<210>48
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>48
aacaatccag ggatcaat                                                     18
<210>49
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>49
gattatccag ggatcaat                                                     18
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>50
ccacaatccg agatcatgga agcg                                              24
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>51
tcatggaagc gcatccagcg gaac                                              24
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>52
tcatggaacc gcatccaacg gaac                                              24
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>53
tcatggaatc gcatccagcg gaac                                              24
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>54
cgcatccagc ggaacatggc ctgc                                              24
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>55
cgcatccaac ggaacatggc ttgc                                              24
<210>56
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切断用寡核苷酸
<400>56
cgcatccagc ggaacatagc ctgc                                              24
<210>57
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记有嵌入剂性荧光团的核酸探针
<400>57
gacgccatca tcatttac                                                     18
<210>58
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>T7启动子序列
<400>58
aattctaata cgactcacta tagggaga                                          28

Claims (5)

1.一种诺如病毒RNA的检测方法，其特征在于，其为检测试样中的诺如病毒RNA的方法，包括以下工序：
(1)以诺如病毒RNA内的特定核酸序列为模板，通过第一引物和第二引物、RNA依赖性DNA聚合酶、核糖核酸酶H(RNase H)、及DNA依赖性DNA聚合酶，生成包含启动子序列和在该启动子序列下游的所述特定碱基序列的双链DNA的工序，其中，在所述第一引物和所述第二引物的任意一者的5’末端附加有启动子序列；
(2)以该双链DNA作为模板，通过RNA聚合酶，生成包含所述特定碱基序列的RNA转录产物的工序；
(3)该RNA转录产物继续作为所述双链DNA合成的模板，从而将该RNA转录产物链式扩增的工序；
(4)测定所述RNA转录产物量的工序；
所述第一引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：序列与序列号1～4中记载的序列中的至少任意一者分别充分相同的寡核苷酸；所述第二引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：序列与序列号5～9中记载的序列中的至少任意一者分别充分互补的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述诺如病毒RNA的检测方法中，第一引物由选自下列序列号中记载的寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：作为序列号1的部分序列的序列号10、作为序列号2的部分序列的序列号11、及作为序列号3的部分序列的序列号12；第二引物由选自下列序列号中记载的寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：作为序列号5的互补链的序列号13、作为序列号7的互补链的序列号14、作为序列号8的互补链的序列号15、及作为序列号9的互补链的序列号16。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述诺如病毒RNA的检测方法中，第一引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：与序列号1～4中记载的序列中的至少任意一者相同的序列中的连续14个核苷酸。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其特征在于，在所述诺如病毒RNA的检测方法中，在以诺如病毒RNA中的特定核酸序列为模板，通过5’末端附加有启动子序列的所述第一引物、所述第二引物、RNA依赖性DNA聚合酶、RNase H、及DNA依赖性DNA聚合酶，生成包含启动子序列和该启动子序列下游的所述特定碱基序列的双链DNA的工序之前，进行如下工序：通过切断用寡核苷酸和RNase H，在所述特定碱基序列的5′末端部位将所述RNA切断，其中，所述切断用寡核苷酸与所述特定碱基序列中的与第一引物相同的区域的5′末端部位重复，并与从该部位向5’方向的相邻的区域互补；
所述切断用寡核苷酸由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：序列与序列号17～21中记载的至少任意一者分别充分互补的寡核苷酸。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其特征在于，在检测所述诺如病毒RNA的工序中，测定所述RNA转录产物量的工序(4)通过在核酸探针共存下测定该探针的信号变化而进行，所述核酸探针由与序列号22充分互补的序列构成，并被设计成与靶RNA形成互补的双链时则信号特性发生变化。
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