JP2001046080A - アンプリコンの製法及びそれを用いた検出法 - Google Patents
アンプリコンの製法及びそれを用いた検出法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 検出感度及び特性が高く、しかも容易に検出
できるアンプリコンの製法及びそれを用いた検出法を提
供する。 【解決手段】 増幅用のプライマーに既知塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドを付加し、オリゴヌクレオチド
により標識されたアンプリコンを合成する。また、オリ
ゴヌクレオチドに相補的な領域を含むプローブを用いて
アンプリコンを検出する。簡便かつ精度良くアンプリコ
ンを検出できる。複数種のアンプリコンにおいて、プロ
ーブを共用化できる。
できるアンプリコンの製法及びそれを用いた検出法を提
供する。 【解決手段】 増幅用のプライマーに既知塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドを付加し、オリゴヌクレオチド
により標識されたアンプリコンを合成する。また、オリ
ゴヌクレオチドに相補的な領域を含むプローブを用いて
アンプリコンを検出する。簡便かつ精度良くアンプリコ
ンを検出できる。複数種のアンプリコンにおいて、プロ
ーブを共用化できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＲＮＡ又はＤＮＡ
の検出に好適に用いられるアンプリコンの製法及びそれ
を用いた検出法に関するものである。
の検出に好適に用いられるアンプリコンの製法及びそれ
を用いた検出法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子工学の進歩により微量の遺
伝子を大量に増幅する方法が、数多く開発され、これら
の方法を用いて高感度に遺伝子を検出できるようになっ
ている。これらの増幅法は、アンプリコンを、ＲＮＡと
して得る、ＲＮＡ増幅法と、ＤＮＡとして得る、ＤＮＡ
増幅法に大別できる。
伝子を大量に増幅する方法が、数多く開発され、これら
の方法を用いて高感度に遺伝子を検出できるようになっ
ている。これらの増幅法は、アンプリコンを、ＲＮＡと
して得る、ＲＮＡ増幅法と、ＤＮＡとして得る、ＤＮＡ
増幅法に大別できる。
【０００３】そして、このうち、代表的なＤＮＡ増幅法
であるＰＣＲ法では、アンプリコンに増幅用のプライマ
ーそのものが組み込まれる。したがって、アンプリコン
を検出するには、増幅反応の前に、このプライマーを、
例えばビチオンやハプテンなどの標識物で標識し、増幅
後に、これらの標識物を、アビジン−ビチオン反応や免
疫測定法などで捕捉すればよい。
であるＰＣＲ法では、アンプリコンに増幅用のプライマ
ーそのものが組み込まれる。したがって、アンプリコン
を検出するには、増幅反応の前に、このプライマーを、
例えばビチオンやハプテンなどの標識物で標識し、増幅
後に、これらの標識物を、アビジン−ビチオン反応や免
疫測定法などで捕捉すればよい。
【０００４】一方、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法といったＲ
ＮＡ増幅法では、プライマーは、ＲＮＡ合成のための鋳
型ＤＮＡに組み込まれ、そこから転写されるＲＮＡアン
プリコンには、プライマーそのものが含まれない。した
がって、ＲＮＡ増幅法では、ＤＮＡ増幅法のように、簡
便にアンプリコンを直接標識することは困難である。
ＮＡ増幅法では、プライマーは、ＲＮＡ合成のための鋳
型ＤＮＡに組み込まれ、そこから転写されるＲＮＡアン
プリコンには、プライマーそのものが含まれない。した
がって、ＲＮＡ増幅法では、ＤＮＡ増幅法のように、簡
便にアンプリコンを直接標識することは困難である。
【０００５】このため、ＲＮＡアンプリコンの検出に
は、標識プローブを用いた一般的なハイブリタイゼーシ
ョンが使用される。しかしながら、ハイブリタイゼーシ
ョンは、感度、特異性、最適温度条件などが、アンプリ
コンや検出用プローブの塩基配列に依存するため、検出
項目によっては十分な感度、特異性が得られなかった
り、検出項目毎に測定条件を変更しなければならないな
どの問題点がある。
は、標識プローブを用いた一般的なハイブリタイゼーシ
ョンが使用される。しかしながら、ハイブリタイゼーシ
ョンは、感度、特異性、最適温度条件などが、アンプリ
コンや検出用プローブの塩基配列に依存するため、検出
項目によっては十分な感度、特異性が得られなかった
り、検出項目毎に測定条件を変更しなければならないな
どの問題点がある。
【０００６】さらに、１種類の標的遺伝子に対して、捕
捉プローブと標識プローブの２種類のプローブを設計し
なければならず、この点が、設計上又は工業上の隘路に
なっていた。
捉プローブと標識プローブの２種類のプローブを設計し
なければならず、この点が、設計上又は工業上の隘路に
なっていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者は、特
にＲＮＡ増幅法において簡便かつ精度良くアンプリコン
を検出できる方法はないかと、鋭意研究の結果、本発明
を完成するに至ったものである。また、本発明者は、Ｒ
ＮＡ増幅法における発明をＤＮＡ増幅法にも応用できる
との知見を得た。即ち、本発明は、検出感度及び特性が
高く、しかも容易に検出できるアンプリコンの製法及び
それを用いた検出法を提供することを目的とする。
にＲＮＡ増幅法において簡便かつ精度良くアンプリコン
を検出できる方法はないかと、鋭意研究の結果、本発明
を完成するに至ったものである。また、本発明者は、Ｒ
ＮＡ増幅法における発明をＤＮＡ増幅法にも応用できる
との知見を得た。即ち、本発明は、検出感度及び特性が
高く、しかも容易に検出できるアンプリコンの製法及び
それを用いた検出法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明では、増幅用のプ
ライマーに既知塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
付加し、オリゴヌクレオチドにより標識されたアンプリ
コンを合成する。また、オリゴヌクレオチドに相補的な
領域を含むプローブを用いてアンプリコンを検出する。
ライマーに既知塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
付加し、オリゴヌクレオチドにより標識されたアンプリ
コンを合成する。また、オリゴヌクレオチドに相補的な
領域を含むプローブを用いてアンプリコンを検出する。
【０００９】この構成により、簡便かつ精度良くアンプ
リコンを検出できる。また、複数種のアンプリコンにお
いて、プローブを共用化できる。
リコンを検出できる。また、複数種のアンプリコンにお
いて、プローブを共用化できる。
【００１０】
【発明の実施の形態】請求項１記載のアンプリコンの製
法では、標的ＲＮＡを、ＴＭＡ法又はＮＡＳＢＡ法を用
いて増幅しＲＮＡアンプリコンを得るものであって、増
幅用のプライマーに既知塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドを付加し、オリゴヌクレオチドにより標識された
ＲＮＡアンプリコンを合成する。
法では、標的ＲＮＡを、ＴＭＡ法又はＮＡＳＢＡ法を用
いて増幅しＲＮＡアンプリコンを得るものであって、増
幅用のプライマーに既知塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドを付加し、オリゴヌクレオチドにより標識された
ＲＮＡアンプリコンを合成する。
【００１１】請求項２記載のアンプリコンの製法では、
標的ＲＮＡを、逆転写ＰＣＲ法を用いて増幅しＤＮＡア
ンプリコンを得るものであって、増幅用のプライマーに
既知塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを付加し、オ
リゴヌクレオチドにより標識されたＤＮＡアンプリコン
を合成する。
標的ＲＮＡを、逆転写ＰＣＲ法を用いて増幅しＤＮＡア
ンプリコンを得るものであって、増幅用のプライマーに
既知塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを付加し、オ
リゴヌクレオチドにより標識されたＤＮＡアンプリコン
を合成する。
【００１２】請求項３記載のアンプリコンの製法では、
標的ＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて増幅しＤＮＡアンプリ
コンを得るものであって、増幅用のプライマーに既知塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドを付加し、オリゴヌ
クレオチドにより標識されたＤＮＡアンプリコンを合成
する。
標的ＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて増幅しＤＮＡアンプリ
コンを得るものであって、増幅用のプライマーに既知塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドを付加し、オリゴヌ
クレオチドにより標識されたＤＮＡアンプリコンを合成
する。
【００１３】これらの構成により、合成されたアンプリ
コンそのものを標識することができる。この既知塩基配
列は、標的の核酸と相同性を持たないものである以上、
任意に設定でき、ＧＣ含量を調節できるなど、有利な条
件を選択できる。即ち、従来技術では、検査項目によっ
ては感度や特異性が不十分になりがちで、検査項目毎に
プローブを設計せざるを得なかった、ＲＮＡの検出性能
及び要領を大幅に改善できる。また、ＤＮＡについても
ＲＮＡと統一された方法で検出しやすいアンプリコンを
増幅できる。
コンそのものを標識することができる。この既知塩基配
列は、標的の核酸と相同性を持たないものである以上、
任意に設定でき、ＧＣ含量を調節できるなど、有利な条
件を選択できる。即ち、従来技術では、検査項目によっ
ては感度や特異性が不十分になりがちで、検査項目毎に
プローブを設計せざるを得なかった、ＲＮＡの検出性能
及び要領を大幅に改善できる。また、ＤＮＡについても
ＲＮＡと統一された方法で検出しやすいアンプリコンを
増幅できる。
【００１４】請求項４記載のアンプリコンの製法では、
オリゴヌクレオチドは、１５から２５の塩基配列からな
る。
オリゴヌクレオチドは、１５から２５の塩基配列からな
る。
【００１５】この構成により、事実上、標識領域の一部
の塩基配列とオリゴヌクレオチドが一致する確率はほと
んどゼロ（例えば、１５塩基では約１０億分の１）にな
り、プライマーに工夫するだけで、十分な感度及び特異
性を確保できる。
の塩基配列とオリゴヌクレオチドが一致する確率はほと
んどゼロ（例えば、１５塩基では約１０億分の１）にな
り、プライマーに工夫するだけで、十分な感度及び特異
性を確保できる。
【００１６】請求項６記載のアンプリコンの検出法で
は、請求項１から５記載のアンプリコンの製法により合
成したアンプリコンを、ハイブリダイゼーションにより
検出するものであって、オリゴヌクレオチドに相補的な
領域を含むプローブを用いてアンプリコンを検出する。
は、請求項１から５記載のアンプリコンの製法により合
成したアンプリコンを、ハイブリダイゼーションにより
検出するものであって、オリゴヌクレオチドに相補的な
領域を含むプローブを用いてアンプリコンを検出する。
【００１７】この構成により、プローブの感度及び特異
性を大幅に向上できる。
性を大幅に向上できる。
【００１８】請求項１０記載のアンプリコンの検出法で
は、複数の種類のアンプリコンについて、オリゴヌクレ
オチド及びプローブを共用する。
は、複数の種類のアンプリコンについて、オリゴヌクレ
オチド及びプローブを共用する。
【００１９】この構成により、プローブ（捕捉プローブ
又は標識プローブ）を共用化してコストダウンを図るこ
とができる。
又は標識プローブ）を共用化してコストダウンを図るこ
とができる。
【００２０】次に図面を参照しながら、本発明の実施の
形態について説明する。図１は、本発明の一実施の形態
における凡例図である。
形態について説明する。図１は、本発明の一実施の形態
における凡例図である。
【００２１】図１において、上段から順に、ＤＮＡ（１
本鎖）、ＤＮＡ（２本鎖）、ＲＮＡ（１本鎖）、任意配
列（既知塩基配列）部位、ＲＮＡポリメラーゼプロモー
ター部位を示している。図示しているように、最終的に
は、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれのアンプリコンについて
も、標的領域からはずれたその他の領域に、任意配列が
組み込まれることになる。
本鎖）、ＤＮＡ（２本鎖）、ＲＮＡ（１本鎖）、任意配
列（既知塩基配列）部位、ＲＮＡポリメラーゼプロモー
ター部位を示している。図示しているように、最終的に
は、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれのアンプリコンについて
も、標的領域からはずれたその他の領域に、任意配列が
組み込まれることになる。
【００２２】次に、本発明の方法を述べる前に、一般的
なＲＮＡ増幅法を説明する。ＲＮＡ増幅法とは、標的１
本鎖ＲＮＡを鋳型として相補的な２本鎖ＤＮＡを合成
し、その２本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラー
ゼによって、ＲＮＡを転写・増幅する方法である。これ
には、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplificatio
n）法（特表平４−５００７５９，ＵＳＰ ５，３９
９，４９１）及びＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence
Based Amplification）法（特開平９−３２７２９８、
ＵＳＰ ５，４０９，８１８、ＵＳＰ ５，１３０，２
３８）があるが、両者は使用する酵素の種類が異なるだ
けで、原理的には同一である。
なＲＮＡ増幅法を説明する。ＲＮＡ増幅法とは、標的１
本鎖ＲＮＡを鋳型として相補的な２本鎖ＤＮＡを合成
し、その２本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラー
ゼによって、ＲＮＡを転写・増幅する方法である。これ
には、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplificatio
n）法（特表平４−５００７５９，ＵＳＰ ５，３９
９，４９１）及びＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence
Based Amplification）法（特開平９−３２７２９８、
ＵＳＰ ５，４０９，８１８、ＵＳＰ ５，１３０，２
３８）があるが、両者は使用する酵素の種類が異なるだ
けで、原理的には同一である。
【００２３】次に、図２を参照しながら、ＲＮＡアンプ
リコンの製法を説明する。ここで、本発明では、プライ
マー２（プロモーター配列を含まない方のプライマー）
の５’末端側に、既知の任意塩基配列（好ましくは、１
５〜２５塩基）を付加したもの（さらに、必要に応じ
て、２０塩基以下の配列を付加してもよい）を作製し、
このプライマー２を含む増幅用反応液を調製する。な
お、他の組成は、従来のＲＮＡ増幅法と同じである。
リコンの製法を説明する。ここで、本発明では、プライ
マー２（プロモーター配列を含まない方のプライマー）
の５’末端側に、既知の任意塩基配列（好ましくは、１
５〜２５塩基）を付加したもの（さらに、必要に応じ
て、２０塩基以下の配列を付加してもよい）を作製し、
このプライマー２を含む増幅用反応液を調製する。な
お、他の組成は、従来のＲＮＡ増幅法と同じである。
【００２４】さて、試料中に標的ＲＮＡが存在すると、
これにプライマー１が結合（アニーリング）し、逆転写
酵素の持つＤＮＡポリメラーゼ活性によって、標的ＲＮ
Ａに相補的なＤＮＡが合成される（１サイクル目）。こ
の段階では、任意配列の部分に２本鎖が形成されていな
いため、転写されるＲＮＡアンプリコンには、任意配列
は組み込まれていない。
これにプライマー１が結合（アニーリング）し、逆転写
酵素の持つＤＮＡポリメラーゼ活性によって、標的ＲＮ
Ａに相補的なＤＮＡが合成される（１サイクル目）。こ
の段階では、任意配列の部分に２本鎖が形成されていな
いため、転写されるＲＮＡアンプリコンには、任意配列
は組み込まれていない。
【００２５】次に、２サイクル目に入る。ここで、上記
１サイクル目に転写されたＲＮＡアンプリコンを基に合
成される２サイクル目の鋳型ＤＮＡには、任意配列部分
に２本鎖が形成されるため、以降に起こるＲＮＡ転写時
には、任意配列が３’末端に組み込まれたＲＮＡアンプ
リコンが合成される。
１サイクル目に転写されたＲＮＡアンプリコンを基に合
成される２サイクル目の鋳型ＤＮＡには、任意配列部分
に２本鎖が形成されるため、以降に起こるＲＮＡ転写時
には、任意配列が３’末端に組み込まれたＲＮＡアンプ
リコンが合成される。
【００２６】その結果、ＲＮＡ増幅サイクルが進むと、
任意配列が組み込まれたＲＮＡアンプリコンが多数増幅
される。
任意配列が組み込まれたＲＮＡアンプリコンが多数増幅
される。
【００２７】次に、図３を参照しながら、ＰＣＲ（Poly
merase Chain Reaction）法（特開昭６０−２８１）を
用いたＤＮＡアンプリコンの製法を説明する。ここで、
ＰＣＲ法は、標的ＤＮＡの標的領域の両端に位置する２
種類のプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い
て、２本鎖ＤＮＡの熱変性と合成とを繰り返し行うこと
で、標的ＤＮＡを増幅する方法である。
merase Chain Reaction）法（特開昭６０−２８１）を
用いたＤＮＡアンプリコンの製法を説明する。ここで、
ＰＣＲ法は、標的ＤＮＡの標的領域の両端に位置する２
種類のプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い
て、２本鎖ＤＮＡの熱変性と合成とを繰り返し行うこと
で、標的ＤＮＡを増幅する方法である。
【００２８】そして、増幅反応は、次の３段階（３温
度）を繰り返しことで進行する。 （１）熱処理（９４〜９５℃）によって標的２本鎖ＤＮ
Ａを１本鎖に変性させる。 （２）温度を下げる（５０〜５５℃）ことで１本鎖ＤＮ
Ａにプライマーがアニーリングする。 （３）温度を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適温度（７
２〜７４℃）にして２本鎖ＤＮＡを合成する。 なお、これら工程（１）〜（３）の温度、時間、反応サ
イクルの制御は、ＰＣＲ専用機（サーマル・サイクラ
ー）で行われる。
度）を繰り返しことで進行する。 （１）熱処理（９４〜９５℃）によって標的２本鎖ＤＮ
Ａを１本鎖に変性させる。 （２）温度を下げる（５０〜５５℃）ことで１本鎖ＤＮ
Ａにプライマーがアニーリングする。 （３）温度を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適温度（７
２〜７４℃）にして２本鎖ＤＮＡを合成する。 なお、これら工程（１）〜（３）の温度、時間、反応サ
イクルの制御は、ＰＣＲ専用機（サーマル・サイクラ
ー）で行われる。
【００２９】図３から明らかなように、これらの工程を
経て増幅されるＤＮＡアンプリコンには、プライマー１
に付加された任意配列が組み込まれる。
経て増幅されるＤＮＡアンプリコンには、プライマー１
に付加された任意配列が組み込まれる。
【００３０】次に、図４を参照しながら、逆転写ＰＣＲ
法を用いたＤＮＡアンプリコンの製法を説明する。この
方法では、標的１本鎖ＲＮＡから２本鎖ＤＮＡを合成す
る逆転写反応の段階で、逆転写に使用するプライマーの
５’末端側に任意配列を付加する。これにより、任意配
列を含んだ１本鎖ＤＮＡが合成され、この１本鎖ＤＮＡ
を通常のＰＣＲサイクルに用いて、任意配列が組み込ま
れたＤＮＡを多数増幅する。
法を用いたＤＮＡアンプリコンの製法を説明する。この
方法では、標的１本鎖ＲＮＡから２本鎖ＤＮＡを合成す
る逆転写反応の段階で、逆転写に使用するプライマーの
５’末端側に任意配列を付加する。これにより、任意配
列を含んだ１本鎖ＤＮＡが合成され、この１本鎖ＤＮＡ
を通常のＰＣＲサイクルに用いて、任意配列が組み込ま
れたＤＮＡを多数増幅する。
【００３１】上記各形態では、次の効果がある。 （１）組み込んだ任意配列に対するハイブリダイゼーシ
ョン・プローブを使用して感度、特異性を向上できる。
このとき、ハイブリダイゼーション・プローブに標的遺
伝子配列が一部含まれるようにすると、一層特異性が向
上する。 （２）プローブの共用化により、コストを低減できる。
例えば、任意塩基配列に対する捕捉プローブを設計し
て、テストチューブやマイクロタイタープレートなどの
固相に使用すると、全ての検査項目で、固相を共通化で
き、標識プローブを変更することで、各項目の検査に使
用できる。 （３）反応条件、時間のばらつきを抑制できる。ハイブ
リダイゼーションは、一般に、アンプリコンとプローブ
の塩基配列（特にＧＣ含量）やプローブのサイズなどに
よって、最適な反応温度、反応時間が異なるが、任意塩
基配列及びプローブを共用化して、これらの条件の差異
を最小にすることができる。また、任意塩基配列は、試
料に含まれる核酸と相同性を持たなければ任意であるか
ら、ハイブリダイゼーションを任意の条件に設定するこ
ともできる。
ョン・プローブを使用して感度、特異性を向上できる。
このとき、ハイブリダイゼーション・プローブに標的遺
伝子配列が一部含まれるようにすると、一層特異性が向
上する。 （２）プローブの共用化により、コストを低減できる。
例えば、任意塩基配列に対する捕捉プローブを設計し
て、テストチューブやマイクロタイタープレートなどの
固相に使用すると、全ての検査項目で、固相を共通化で
き、標識プローブを変更することで、各項目の検査に使
用できる。 （３）反応条件、時間のばらつきを抑制できる。ハイブ
リダイゼーションは、一般に、アンプリコンとプローブ
の塩基配列（特にＧＣ含量）やプローブのサイズなどに
よって、最適な反応温度、反応時間が異なるが、任意塩
基配列及びプローブを共用化して、これらの条件の差異
を最小にすることができる。また、任意塩基配列は、試
料に含まれる核酸と相同性を持たなければ任意であるか
ら、ハイブリダイゼーションを任意の条件に設定するこ
ともできる。
【００３２】（配列例）次表の配列を、ＮＡＳＢＡの上
流プライマーの５’末端に連結して増幅を行い、下線部
の２０塩基を認識する標識プローブを用いてドットブロ
ット法で検出したところ、任意配列の組み込みが確認さ
れた。
流プライマーの５’末端に連結して増幅を行い、下線部
の２０塩基を認識する標識プローブを用いてドットブロ
ット法で検出したところ、任意配列の組み込みが確認さ
れた。
【００３３】
【表１】
【００３４】この表の配列を含めて、計９種類の任意配
列組み込みを行ったが、任意配列を組み込まない対照実
験よりも、増幅効率が上昇した。
列組み込みを行ったが、任意配列を組み込まない対照実
験よりも、増幅効率が上昇した。
【００３５】なお以下、任意配列を設計する上での、注
意点を指摘する。 （１）任意配列は、増幅対象を含む標的遺伝子と相同性
を持たないこと。 （２）標的遺伝子を含む生物が寄生性で、その標的遺伝
子が宿主の体液などから抽出される場合は、任意配列
は、宿主の遺伝子と相同性を持たないことが望ましい。 （３）ＲＮＡポリメラーゼの転写終結シグナルとなりう
る配列（例えば、Ｔ7ＲＮＡポリメラーゼに対するＡＴ
ＣＴＧＴＴなど；Ｈｅら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７３：１８８０２−１８８１１参照）を含ま
ないこと。 （４）ＲＮＡポリメラーゼが、条件によっては、鋳型Ｄ
ＮＡの末端１０数塩基を転写しない可能性がある場合に
は、標識プローブで検出する領域を確保するために、プ
ライマーに付加する任意配列の５’末端側に、任意配列
に加えてさらに２０塩基以下の配列を付加すること。 （５）Ａ+Ｔ-richな領域で、ＲＮＡポリメラーゼが遊離
することが知られており、検討においても、組み込む任
意配列のＧＣ含量が低いと、検出効率が良くなかった。
よって、組み込む任意配列のＧＣ含量は、４０％以上、
望ましくは、５０％以上にすること。 （６）任意配列の中に、塩基の偏在（特に、Ａ+Ｔ-rich
な部分）が、できるだけ無いようにすることが、望まし
い。
意点を指摘する。 （１）任意配列は、増幅対象を含む標的遺伝子と相同性
を持たないこと。 （２）標的遺伝子を含む生物が寄生性で、その標的遺伝
子が宿主の体液などから抽出される場合は、任意配列
は、宿主の遺伝子と相同性を持たないことが望ましい。 （３）ＲＮＡポリメラーゼの転写終結シグナルとなりう
る配列（例えば、Ｔ7ＲＮＡポリメラーゼに対するＡＴ
ＣＴＧＴＴなど；Ｈｅら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７３：１８８０２−１８８１１参照）を含ま
ないこと。 （４）ＲＮＡポリメラーゼが、条件によっては、鋳型Ｄ
ＮＡの末端１０数塩基を転写しない可能性がある場合に
は、標識プローブで検出する領域を確保するために、プ
ライマーに付加する任意配列の５’末端側に、任意配列
に加えてさらに２０塩基以下の配列を付加すること。 （５）Ａ+Ｔ-richな領域で、ＲＮＡポリメラーゼが遊離
することが知られており、検討においても、組み込む任
意配列のＧＣ含量が低いと、検出効率が良くなかった。
よって、組み込む任意配列のＧＣ含量は、４０％以上、
望ましくは、５０％以上にすること。 （６）任意配列の中に、塩基の偏在（特に、Ａ+Ｔ-rich
な部分）が、できるだけ無いようにすることが、望まし
い。
【００３６】（実施例） １．試料ＲＮＡ Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムの一部を、in vit
ro Transcription法で合成したものを試料ＲＮＡとし
た。
ro Transcription法で合成したものを試料ＲＮＡとし
た。
【００３７】２．ＮＡＳＢＡ 純水中に５μｌあたり１nｇの試料ＲＮＡを含む溶液
を、酵素を除くＮＡＳＢＡ反応液（プライマーや各基質
ヌクレオチド、バッファー成分を含む）１５μｌと混合
し、ＲＮＡ変性のために７０℃で１０分間インキュベー
トし、次いで、プライマーのアニーリングのために４２
℃で５分間インキュベートした。
を、酵素を除くＮＡＳＢＡ反応液（プライマーや各基質
ヌクレオチド、バッファー成分を含む）１５μｌと混合
し、ＲＮＡ変性のために７０℃で１０分間インキュベー
トし、次いで、プライマーのアニーリングのために４２
℃で５分間インキュベートした。
【００３８】次に、酵素溶液（逆転写酵素（ＡＭＶ−Ｒ
Ｔ）、Ｔ7ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、ＢＳＡ
を含む）５μｌを加えて軽く混合した後、４２℃で２時
間インキュベートした。対照の標準ＮＡＳＢＡに用いた
プライマーは、文献（Hollingsworthら(1996)J.Hepato
l.25:301-306参照）に記載された以下の塩基配列を有す
るＤＮＡであった。なお下流プライマーの下線部はＴ7
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を示す。 上流プライマー ５’−ＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡ−３’ 下流プライマー ５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＴＡ−３’
Ｔ）、Ｔ7ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、ＢＳＡ
を含む）５μｌを加えて軽く混合した後、４２℃で２時
間インキュベートした。対照の標準ＮＡＳＢＡに用いた
プライマーは、文献（Hollingsworthら(1996)J.Hepato
l.25:301-306参照）に記載された以下の塩基配列を有す
るＤＮＡであった。なお下流プライマーの下線部はＴ7
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を示す。 上流プライマー ５’−ＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡ−３’ 下流プライマー ５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＴＡ−３’
【００３９】任意配列組み込みに用いた上流プライマー
は、対照ＮＡＳＢＡの上流プライマーの５’末端に以下
の塩基配列を有するＤＮＡであった。なお下流プライマ
ーは対照ＮＡＳＢＡと同一プライマーを用いた。 ＮＰ９ ５’−ＡＧＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＧＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＣＧＡＣＣＡＧ−３’ ＮＰ１０ ５’−ＣＡＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＡＧＣＧＴＣＣＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡ−３’ ＮＰ１２ ５’−ＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴ−３’
は、対照ＮＡＳＢＡの上流プライマーの５’末端に以下
の塩基配列を有するＤＮＡであった。なお下流プライマ
ーは対照ＮＡＳＢＡと同一プライマーを用いた。 ＮＰ９ ５’−ＡＧＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＧＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＣＧＡＣＣＡＧ−３’ ＮＰ１０ ５’−ＣＡＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＡＧＣＧＴＣＣＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡ−３’ ＮＰ１２ ５’−ＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴ−３’
【００４０】また、最終的な各試薬の濃度は、次の通り
である。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５） ４０ ｍＭ ＭｇＣｌ2 １２ ｍＭ ＫＣｌ ７０ ｍＭ ＤＴＴ ５ ｍＭ ＤＭＳＯ １５ ％（v/v） ｄＮＴＰs 各１ ｍＭ ＮＴＰs 各２ ｍＭ 上流プライマー ０．２ μＭ 下流プライマー ０．２ μＭ ＲＮａｓｅインヒビター １２．０ units/tube ＲＮａｓｅＨ ０．１ units/tube Ｔ7ＲＮＡポリメラーゼ ４０．０ units/tube ＡＭＶ−ＲＴ ８．０ units/tube ＢＳＡ ２．５ μｇ/tube
である。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５） ４０ ｍＭ ＭｇＣｌ2 １２ ｍＭ ＫＣｌ ７０ ｍＭ ＤＴＴ ５ ｍＭ ＤＭＳＯ １５ ％（v/v） ｄＮＴＰs 各１ ｍＭ ＮＴＰs 各２ ｍＭ 上流プライマー ０．２ μＭ 下流プライマー ０．２ μＭ ＲＮａｓｅインヒビター １２．０ units/tube ＲＮａｓｅＨ ０．１ units/tube Ｔ7ＲＮＡポリメラーゼ ４０．０ units/tube ＡＭＶ−ＲＴ ８．０ units/tube ＢＳＡ ２．５ μｇ/tube
【００４１】３．ドットブロット・ハイブリタイゼーシ
ョンによる検出 ハイブリダイゼーションに用いるジゴキシゲニン（ＤＩ
Ｇ）標識プローブとしては、対照のＨＣＶ−ＲＮＡ検出
用として以下の塩基配列を有するＤＮＡを用いた。 ＨＣＶ−ＲＮＡ検出用プローブ ５’−ＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡ−３’
ョンによる検出 ハイブリダイゼーションに用いるジゴキシゲニン（ＤＩ
Ｇ）標識プローブとしては、対照のＨＣＶ−ＲＮＡ検出
用として以下の塩基配列を有するＤＮＡを用いた。 ＨＣＶ−ＲＮＡ検出用プローブ ５’−ＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡ−３’
【００４２】また任意配列検出用として以下の塩基配列
を有するＤＮＡを用いた。なお、これらのプローブはア
ンプリコン（アンチセンスＲＮＡ）に組込まれた任意配
列の５’側２０塩基の領域と結合する。 ＮＰ９検出用プローブ ５’−ＴＣＧＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＣＧＡＣＣＡＧ−３’ ＮＰ１０検出用プローブ ５’−ＣＴＡＧＣＧＴＣＣＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡ−３’ ＮＰ１２検出用プローブ ５’−ＡＣＧＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴ−３’
を有するＤＮＡを用いた。なお、これらのプローブはア
ンプリコン（アンチセンスＲＮＡ）に組込まれた任意配
列の５’側２０塩基の領域と結合する。 ＮＰ９検出用プローブ ５’−ＴＣＧＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＣＧＡＣＣＡＧ−３’ ＮＰ１０検出用プローブ ５’−ＣＴＡＧＣＧＴＣＣＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡ−３’ ＮＰ１２検出用プローブ ５’−ＡＣＧＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴ−３’
【００４３】プローブの標識は、市販のＤＩＧオリゴヌ
クレオチド３’末端標識キット（ロシュ・ダイアグノス
ティックス社製）を用いて、その説明書に従って標識プ
ローブを作製した。
クレオチド３’末端標識キット（ロシュ・ダイアグノス
ティックス社製）を用いて、その説明書に従って標識プ
ローブを作製した。
【００４４】ハイブリダイゼーションには、市販のＤＩ
Ｇ（ジゴキシゲニン）標識核酸検出キット（ロシュ・ダ
イアグノスティックス社製）を用いて、その説明書に従
って行なったが、ハイブリダイゼーションの温度条件
は、ＨＣＶ−ＲＮＡ検出用プローブを用いた場合は、ハ
イブリダイゼーション、洗浄ともに５０℃で行なった。
任意配列検出用プローブを用いた場合は、ハイブリダイ
ゼーションを４２℃、洗浄を４５℃で行なった。
Ｇ（ジゴキシゲニン）標識核酸検出キット（ロシュ・ダ
イアグノスティックス社製）を用いて、その説明書に従
って行なったが、ハイブリダイゼーションの温度条件
は、ＨＣＶ−ＲＮＡ検出用プローブを用いた場合は、ハ
イブリダイゼーション、洗浄ともに５０℃で行なった。
任意配列検出用プローブを用いた場合は、ハイブリダイ
ゼーションを４２℃、洗浄を４５℃で行なった。
【００４５】得られたＮＡＳＢＡ反応液を、ＲＮＡ希釈
液（６×ＳＳＣ、２０％（v/v）ホルムアルデヒド）で
１０倍希釈し、１片のナイロンメンブレン（プラスチャ
ージ、０．４５μｍ）上に４条件すべてをスポットして
室温で乾燥した後、ベーキング処理およびＵＶ照射で固
定化した。同様にして、ＲＮＡを固定化したメンブレン
４枚を準備した。
液（６×ＳＳＣ、２０％（v/v）ホルムアルデヒド）で
１０倍希釈し、１片のナイロンメンブレン（プラスチャ
ージ、０．４５μｍ）上に４条件すべてをスポットして
室温で乾燥した後、ベーキング処理およびＵＶ照射で固
定化した。同様にして、ＲＮＡを固定化したメンブレン
４枚を準備した。
【００４６】次に、準備したＲＮＡ固定化メンブレンの
１枚をＨＣＶ−ＲＮＡ検出用標識プローブで、残り３枚
をそれぞれＮＰ９検出用標識プローブ、ＮＰ１０検出用
標識プローブ、ＮＰ１２検出用標識プローブでハイブリ
ダイゼーションを行なった。次いで、ＤＩＧ標識核酸検
出キットに含まれるアルカリフォスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）標識抗ＤＩＧ抗体および基質液（ＢＣＩＰとＮＢＴ
を含む）で発色させた。メンブレン上のＲＮＡに標識プ
ローブが結合すると、プローブに標識したＤＩＧにＡＬ
Ｐ標識抗体が結合し、基質存在下で紫色の発色を呈す
る。下表にその結果を示した。
１枚をＨＣＶ−ＲＮＡ検出用標識プローブで、残り３枚
をそれぞれＮＰ９検出用標識プローブ、ＮＰ１０検出用
標識プローブ、ＮＰ１２検出用標識プローブでハイブリ
ダイゼーションを行なった。次いで、ＤＩＧ標識核酸検
出キットに含まれるアルカリフォスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）標識抗ＤＩＧ抗体および基質液（ＢＣＩＰとＮＢＴ
を含む）で発色させた。メンブレン上のＲＮＡに標識プ
ローブが結合すると、プローブに標識したＤＩＧにＡＬ
Ｐ標識抗体が結合し、基質存在下で紫色の発色を呈す
る。下表にその結果を示した。
【００４７】
【表２】
【００４８】対照のＨＣＶ−ＲＮＡ検出用プローブを用
いた場合、すべてのＮＡＳＢＡ反応液において発色が見
られ、ＨＣＶ−ＲＮＡアンプリコンが得られたことが確
認された。ＮＰ９検出用標識プローブ、ＮＰ１０検出用
標識プローブ、ＮＰ１２検出用標識プローブを用いた場
合、対応するプライマーを用いてＮＡＳＢＡ反応を行な
った場合のみ発色が見られ、組み込みを行なった任意配
列も増幅していることが確認された。
いた場合、すべてのＮＡＳＢＡ反応液において発色が見
られ、ＨＣＶ−ＲＮＡアンプリコンが得られたことが確
認された。ＮＰ９検出用標識プローブ、ＮＰ１０検出用
標識プローブ、ＮＰ１２検出用標識プローブを用いた場
合、対応するプライマーを用いてＮＡＳＢＡ反応を行な
った場合のみ発色が見られ、組み込みを行なった任意配
列も増幅していることが確認された。
【００４９】
【発明の効果】本発明は、アンプリコンに既知塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドを付加したので、次の効果
がある。感度、特異性が向上する。プローブを共用化し
て、コストダウンできる。共通の既知塩基配列と共通の
プローブを用いて、反応条件、反応時間のばらつきを抑
制できる。
からなるオリゴヌクレオチドを付加したので、次の効果
がある。感度、特異性が向上する。プローブを共用化し
て、コストダウンできる。共通の既知塩基配列と共通の
プローブを用いて、反応条件、反応時間のばらつきを抑
制できる。
【図１】本発明の一実施の形態における凡例図
【図２】本発明の一実施の形態におけるＲＮＡアンプリ
コン製造工程図
コン製造工程図
【図３】本発明の一実施の形態におけるＤＮＡアンプリ
コン製造工程図
コン製造工程図
【図４】本発明の一実施の形態におけるＤＮＡアンプリ
コン製造工程図
コン製造工程図
Claims (7)
- 【請求項１】標的ＲＮＡを、ＴＭＡ法又はＮＡＳＢＡ法
を用いて増幅しＲＮＡアンプリコンを得るアンプリコン
の製法であって、 増幅用のプライマーに既知塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドを付加し、前記オリゴヌクレオチドにより標識
されたＲＮＡアンプリコンを合成することを特徴とする
アンプリコンの製法。 - 【請求項２】標的ＲＮＡを、逆転写ＰＣＲ法を用いて増
幅しＤＮＡアンプリコンを得るアンプリコンの製法であ
って、 増幅用のプライマーに既知塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドを付加し、前記オリゴヌクレオチドにより標識
されたＤＮＡアンプリコンを合成することを特徴とする
アンプリコンの製法。 - 【請求項３】標的ＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて増幅しＤ
ＮＡアンプリコンを得るアンプリコンの製法であって、 増幅用のプライマーに既知塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドを付加し、前記オリゴヌクレオチドにより標識
されたＤＮＡアンプリコンを合成することを特徴とする
アンプリコンの製法。 - 【請求項４】前記オリゴヌクレオチドは、１５から２５
の塩基配列からなることを特徴とする請求項１から３記
載のアンプリコンの製法。 - 【請求項５】増幅用のプライマーに付加する前記オリゴ
ヌクレオチドの５’末端側に、前記オリゴヌクレオチド
に加えてさらに２０塩基以下の塩基配列を付加すること
を特徴とする請求項１から４記載のアンプリコンの製
法。 - 【請求項６】請求項１から５記載のアンプリコンの製法
により合成したアンプリコンを、ハイブリダイゼーショ
ンにより検出する方法であって、 前記オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含むプローブ
を用いてアンプリコンを検出することを特徴とする検出
法。 - 【請求項７】複数の種類のアンプリコンについて、前記
オリゴヌクレオチド及び前記プローブを共用することを
特徴とする請求項６記載の検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000071790A JP2001046080A (ja) | 1999-03-18 | 2000-03-15 | アンプリコンの製法及びそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-73132 | 1999-03-18 | ||
| JP7313299 | 1999-03-18 | ||
| JP2000071790A JP2001046080A (ja) | 1999-03-18 | 2000-03-15 | アンプリコンの製法及びそれを用いた検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001046080A true JP2001046080A (ja) | 2001-02-20 |
Family
ID=26414290
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000071790A Pending JP2001046080A (ja) | 1999-03-18 | 2000-03-15 | アンプリコンの製法及びそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001046080A (ja) |
-
2000
- 2000-03-15 JP JP2000071790A patent/JP2001046080A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061201 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091111 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100303 |