CN102277418A

CN102277418A - 一种用于检测梅毒螺旋体的引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102277418A
Application number: CN2011100287008A
Authority: CN
Inventors: 倪剑锋; 潘承斌; 戚琳玲; 徐辉; 杨文辉
Original assignee: GENEINN BIOTECHNOLOGY (NINGBO) CO Ltd
Current assignee: GENEINN BIOTECHNOLOGY (NINGBO) CO Ltd
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2011-12-14

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测梅毒的引物、试剂盒及方法。一种用于检测梅毒的引物，该引物的上游引物具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列（5′-CGTATTATTGATTGCGCGTGTGC-3′）；下游引物具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列（5′-GTTGACTCGGTATGAAGAGAAACGT-3′）。该引物可特异性的扩增出梅毒TP基因。本发明还提供利用该引物制备的用于检测梅毒的试剂盒，以及一种检测梅毒的方法。本发明有两点优于常规PCR检测，其一为：引入了内参基因，避免了假阴性的出现。其二为：采用了先进的检测方法，采用微流控芯片进行产物检测，灵敏度更高，特异性好，结果直观易判断，更适合临床检验的需要。

Description

一种用于检测梅毒螺旋体的引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测梅毒螺旋体的引物、试剂盒及方法。

背景技术

梅毒的病原体是梅毒螺旋体(TP)感染引起的性传播疾病。TP是一种密螺旋体，有外壁和胞浆膜(一种薄的聚肽糖层)，在胞质周围间隙有鞭毛。从两个尾端伸向菌的中间用脉冲电泳研究显示TP含一个环状的染色体，约1000kb，构成最小原核基因组之一。梅毒螺旋体感染侵入人体之后，因个人体质差异，潜伏时间长短不一，病原体被激活后，其感染目标多种多样，表现出的临床症状也各不相同，故其发病机理也不一样。近年来梅毒的发病率呈逐年上升之势，2005年中国卫生部公布的甲、乙类法定报告传染病中，梅毒患者数已从2002年的第7位跃居第5位。对梅毒螺旋体的早期诊断和及时治疗，减少患者痛苦和控制其蔓延至关重要。先天梅毒可引起多器官严重损害，患儿出生后数周即可出现全身皮疹，心、肺、肝、肾等器官损害，甚或死亡。新生儿先天性梅毒是一个多器官感染性疾病。新生儿先天梅毒临床特征：①皮肤黏膜损害，表现为肢端掌趾脱皮、斑丘疹、斑疹、丘疹、梅毒性天疱疮、口唇及肛周皮肤龟裂、眼鼻分泌物增多；②肝脾肿大，肝功能异常，新生儿高胆红素血症；③吸人性肺炎；④血液系统受累：轻度贫血、血小板减少、全血细胞减少；⑤血肌酐和尿素氮增高；⑥心肌酶谱升高，合并先天性心脏病。血钙明显降低，血培养均为阴性。

目前检测梅毒螺旋体的试验方法较多，主要有病原体的检查和血清学检测。已有的梅毒螺旋体检测方法有以下几种：1)病原学检查方法：暗视野进行梅毒螺旋体检查。2)血清学检测方法：非梅毒螺旋体抗原血清学试验、梅毒螺旋体抗原血清学试验。3)分子生物学检测方法梅毒螺旋体聚合酶链反应(PCR)方法主要是针对编码梅毒螺旋体的特有基因序列建立的体外DNA扩增试验。PCR检测方法敏感度和特异性均优于暗视野检测法和血清学试验。

PCR检测具有高度的特异性和敏感性，可以检测出微量的梅毒病毒DNA，从而推断出梅毒病毒存在与否，不失为一种较有效的判断母体有梅毒病毒的病原学诊断手段。国外近年来应用PCR诊断免疫缺陷病人梅毒感染取得较好的结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测梅毒螺旋体的引物，利用该引物可以在基因水平上对梅毒螺旋体迅速的进行诊断。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测梅毒螺旋体的试剂盒，该试剂盒采用上述引物作为PCR检测引物，是一种具有较好灵敏度和高效、高特异性的检测梅毒螺旋体的工具，具有节约时间、技术成熟及检测结果稳定的优点。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测梅毒螺旋体的方法，该方法检测耗时少、检测结果稳定。

本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：

一种用于检测梅毒螺旋体的引物，其特征在于该引物的上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列(5′-CGTATTATTGATTGCGCGTGTGC-3′)；下游引物具有如SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列(5′-GTTGACTCGGTATGAAGAGAAACGT-3′)。该引物可特异性的扩增出梅毒螺旋体TP基因。该引物用于检测梅毒螺旋体时，优选以人DNA保守序列特有基因β球蛋白(β-globin)基因作为内参引物，该内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3(5′-TGACAAGGCCATGAGGCTGGTGTA-3′)，所述的内参引物的下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.4(5′-GAGTCCATCACGATGCCAGTGGTA-3′)。经实验表明，通过PCR反应，该内参引物较之其它根据人DNA保守序列设计的引物能够更快速有效地识别人体DNA，可以确定模板的提取质量，避免扩增结果的假阴性。

一种用于检测梅毒螺旋体的试剂盒，其特征在于包括PCR反应液、本发明所述的引物和内参引物混合液、阴性对照物、阳性对照物和灭菌双蒸水。该试剂盒采用了本发明提供的梅毒螺旋体TP基因序列，是一种具有较好灵敏度和高效、高特异性的检测梅毒螺旋体的工具或方法。作为优选方案，所述的内参引物的上游引物具有如SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

作为优选方案，所述的PCR反应液包括H₂O7.5～7.9μl，10x PCRBuffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl和5U/μl Taq DNA聚合酶0.1～0.5μl。更为优选的是，PCR反应液包括H₂O7.5μl，10x PCR Buffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl和5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl。

作为优选方案，所述的引物和内参引物混合液是由10μM内参引物和10μM引物混合配制而成，其中内参引物/引物的体积比值范围为0.7～1.2。最佳的内参引物/引物的体积比值为1∶1。

作为优选方案，所述的阳性对照物为含梅毒螺旋体的宫颈组织DNA或静脉血液DNA；阴性对照物为ddH₂O。

一种检测梅毒的方法，包括以下步骤：1)提取样本DNA；2)使用本发明提供的引物或试剂盒对步骤1)得到的DNA进行PCR扩增；3)检测步骤2)所得到的扩增产物。其特征在于包括以下步骤：该方法采用了本发明提供的梅毒螺旋体基因和人DNA保守序列特有基因的特异性引物组合物，是一种具有较好灵敏度和高效、高特异性的检测梅毒螺旋体的工具或方法。该方法简单、成本低廉、适宜于广泛推广。其中，步骤1)中的样本优选为人的静脉全血、宫颈悬浮细胞及分泌物；步骤3)中的检测方法优选为微流体芯片检测法，该法检测原理即微流控技术，是在玻璃芯片上蚀刻若干微米级通道，构建“微型实验室”，分析样品从上样管道进入芯片，在电场作用下，进入分离管道，在分离管道内样品完成自动分离，到达监测点，激光激发荧光发光，仪器收集并自动处理数据，完成芯片上的自动化分析。

本发明有两点优于常规PCR检测，其一为：引入了内参基因，避免了假阴性的出现。其二为：采用了先进的检测方法，采用微流控芯片进行产物检测，灵敏度更高，特异性好，结果直观易判断。更适合临床检验的需要。

本发明通过对患者的静脉血细胞或者宫颈细胞及分泌物中的DNA进行梅毒螺旋体基因检测，从而诊断患者是否感染了梅毒螺旋体，具体包括以下步骤：

1)将本发明提供的引物(SEQ ID NO：1和2所示的核苷酸序列和内参引物(SEQ ID NO：3和4所示的核苷酸序列)混合，对被测样本的DNA进行多重PCR扩增；或采用本发明提供的试剂盒对被测样本的DNA进行多重PCR扩增；被扩增的目标基因片段大小各不相同；

2)扩增产物通过微流体芯片进行检测；

3)通过对各检测峰位置的判断，确定检测到的片段的大小，从而确定被检测到的基因，判断临床样本感染的病毒类别；

4)结果判断：a)未出现任何特异性峰，说明临床样本的DNA没有提取出，或者扩增无效，或检测无效；b)只出现DNA内参特异性峰，说明没有梅毒螺旋体感染；c)出现DNA内参和梅毒螺旋体基因特异性峰，说明有梅毒螺旋体感染。

与现有的检测方法和试剂盒相比，本发明具有以下优点：

1)本发明采用PCR技术，对梅毒螺旋体特异性基因片段进行扩增。其区别与其他已有基因检测的主要方面为：本试剂盒检测手段为微流体芯片检测法，不同于电泳检测或RT-PCR仪检测，检测结果更直观，灵敏度高，可信性好，且检测芯片为一次性使用，不会因污染而增加假阳性结果，适合临床应用。

2)内参引物的加入：优选的人DNA保守序列特有基因的特异性引物作为内参引物，该内参引物的设计选用了人β球蛋白(β-globin)基因，因为人体细胞中都含有此基因，引入该内参基因可以确定临床样本的提取质量，避免扩增结果的假阴性。

3)本发明提供的检测梅毒螺旋体的方法，可以在基因水平上迅速的进行诊断，具有较好的灵敏度和特异性。该方法可直接对患者的临床样本(例如静脉血、宫颈悬浮细胞)进行检测，不需要对样本进行培养后再对病毒株进行检测，节约了时间。同时，微流体芯片检测法比传统的DNA电泳检测法简单、快捷、直观，为临床用药提供了准确、及时的指导。因此，本发明所提供的方法技术成熟，检测结果稳定，比传统的滤纸片法、凝胶法等更快捷、灵敏、准确。

附图说明

图1内参引物扩增临床样本的电泳图，其中1-5是宫颈悬浮细胞DNA样品，6-10是静脉血液DNA样品，+是阳性对照，-是阴性对照，300是对应的Marker条带的bp数。

图2引物混合液扩增临床样本电泳图(3、6号样本感染TP)，-是阴性对照，M1是DNAMarker。

图3不同比例的引物和内参引物混合液扩增梅毒螺旋体阳性的临床样本电泳图，其中各点样孔中内参引物和引物的体积比如下：A1-A2：内参引物/引物＝0.7，B1-B2：内参引物/引物＝1.0，C1-C2：内参引物/引物＝1.2，-是阴性对照，M1是DNAMarker。

图4不同组分的PCR反应液扩增感染梅毒螺旋体的DNA样品图，其中0.1、0.2、0.3、0.4、0.5对应的是2x PCR Buffer中Taq DNA聚合酶的含量分别是：0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl，-是阴性对照，M1是DNAMarker。

图5未感染梅毒螺旋体的DNA样品的微流体芯片检测结果图。

图6感染梅毒螺旋体的DNA样品的微流体芯片检测结果图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例及附图来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。本发明所述的“PCR”是指聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，是本领域技术人员熟知的用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增的一项分子生物学技术。

本发明使用的检测仪器是宁波基内生物技术有限公司生产的微流控芯片仪，该仪器的专利申请号为：CN200910272437.X、CN200920230097.X、CN200910272874.X、CN200910273037.0、CN200920288540.9、CN200910272436.5。本发明实施例中的DNAMarker购自北京全式金生物技术有限公司。

实施例1：试剂盒的组成与配制

本发明的试剂盒由PCR反应液、引物和内参引物混合液、阴性对照物、阳性对照物和灭菌双蒸水组成。

1、配制PCR反应液：

2、配制引物和内参引物混合液：由10μM的内参引物和10μM的引物混合配制而成，内参引物/引物体积比值范围为0.7～1.2，其中优选的内参引物/引物体积比值为1∶1。

3、灭菌双蒸水(ddH₂O)；

4、阳性对照：含梅毒螺旋体宫颈组织DNA或静脉血液DNA；

5、阴性对照：ddH₂O。

为方便描述本发明的效果，以下各实施例均采用本试剂盒的最优配比，即本发明的试剂盒包括：

1、PCR反应液：

2、引物和内参引物混合液：由10μM的内参引物和10μM的引物混合配制而成，内参引物/引物体积比为1∶1；

3、灭菌双蒸水(ddH₂O)；

4、阳性对照：含梅毒螺旋体宫颈组织DNA或静脉血液DNA；

5、阴性对照：ddH₂O。

实施例2：临床样本的制备

本实施例制备本发明检测方法所使用的样本为人体静脉血液样本或宫颈细胞样本，提取用试剂盒为宁波基内生物技术有限公司生产的血液/组织基因组提取试剂盒(注册号：浙甬食药监械(准)字2010第1400013号)。使用此试剂盒分别提取5个临床宫颈组织样本和5个临床静脉血液样本详述如下。

1)a、血样处理：取新鲜血样或将加入抗凝剂的血液样本解冻，混匀后取100μl于1.5ml离心管中；

b、悬浮细胞样本处理：宫颈组织悬浮样本自然沉降后，取沉降溶液底部细胞液1ml放入EP管中，12000r/min离心2min，弃上清。

2)裂解-吸附-漂洗-洗涤-洗脱。具体操作同血液/组织基因组提取试剂盒说明书。

实施例3：内参引物序列的确定

本实施例为采用根据人DNA保守序列β球蛋白特有基因设计的DNA扩增引物扩增实施例2所制备的10个DNA样品，以确定基因组提取有效，避免假阴性。

1、单引物PCR扩增

1)体系的配制：

扩增体系如下：

配制过程：

a、配制混合体系：取干净无菌的1.5mlEP管，用移液枪依次加入136.5μl的ddH₂O，162.5μl的PCR反应液，13μl的10μM B297引物，短暂离心数秒，吹打混匀。

b、分装：取无菌PCR扩增管，每个扩增管中加入24μl的配制好的混合体系。

c、加样本：前面5个扩增管依次加入1μl的宫颈组织DNA样本，后5个扩增管依次加入1μl的静脉血液DNA样本。最后的两个扩增管一个加入1μl的已经验证正确的静脉血液DNA样本作为阳性对照，一管加入1μl的ddH₂O作为阴性对照，盖严各PCR扩增管的管盖，放入PCR仪中。

内参引物的具体序列如表1所示。

表1PCR扩增内参引物序列

2)PCR条件：

第一阶段94℃，2分钟；

第二阶段94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，60秒；30个循环；

第三阶段72℃，5分钟。

2、琼脂糖凝胶电泳

1)制胶(2％琼脂糖凝胶)

称取琼脂糖0.7g于三角瓶中，加入40ml TAE(购自上海生工生物工程技术服务有限公司，规格为50×TAE，稀释50倍使用)，混匀后于微波炉上高火煮2分钟。取出后冷却到60℃以下，加入0.5μl核酸荧光染料Goldview(购自上海赛百盛基因技术有限公司，规格1ml/支)，混匀后倒入两端封闭的胶板中，插入电泳齿梳。待彻底冷却后，去掉两端的封闭，拔掉齿梳，将胶板放入电泳槽中，倒入适量的TAE溶液，以刚好浸没胶板为宜。

2)点样

取以上得到的PCR产物5μl，加入1μl 6×上样缓冲液(含溴酚蓝染料，购自北京全式金生物技术有限公司，规格1ml/支)，混匀后点入胶孔中。同时，点DNAmarker(规格100bp，50次)2μl作为参照。

3)电泳

电泳条件：100V，100mA，30分钟。

4)记录结果

电泳结束后，在紫外仪观测结果。如图1所示，所有的样本都能扩增出内参目标条带，说明所有的临床样本DNA都被成功的提出，同时也可证实设计的内参引物是合理的。

实施例4：用引物组合物扩增DNA样本

本实施例为采用本发明所提供的混合引物序列扩增实施例2所提取的10个DNA样品，并采用凝胶电泳检测PCR的扩增结果。

1、混合引物扩增DNA样本

1)PCR体系如下：

配制过程：

a、配制混合体系：取无菌1.5mlEP管，用移液枪依次加入123.5μl的ddH₂O，162.5μl的PCR反应液，26μl的混合引物，短暂离心数秒，吹打混匀。

b、分装：取12个无菌PCR扩增管，每个扩增管中加入24μl的配制好的混合体系。

c、加样本：前面5个扩增管依次加入1μl的宫颈组织DNA样本，后5个扩增管依次加入1μl的静脉血液DNA样本。将含有梅毒螺旋体基因的质粒作为阳性对照品，无菌ddH₂O作为阴性对照。

表2PCR扩增混合引物序列

2)PCR条件：

第一阶段94℃，2分钟；

第二阶段94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，60秒；30个循环；

第三阶段72℃，5分钟。

2、琼脂糖凝胶电泳

1)制胶(2％琼脂糖凝胶)

称取琼脂糖0.7g于三角瓶中，加入40ml电泳缓冲液TAE，混匀后于微波炉上高火煮2分钟。取出后冷却到60℃以下，加入0.5μl核酸染料Goldview，混匀后倒入两端封闭的胶板中，插入电泳齿梳。待彻底冷却后，去掉两端的封闭，拔掉齿梳，将胶板放入电泳槽中，倒入适量的TAE溶液，以刚好浸没胶板为宜。

2)点样

取以上得到的PCR产物5μl，加入1μl 6×上样缓冲液，混匀后点入胶孔中。同时，点DNAmarker 2μl作为参照。

3)电泳

电泳条件：100V，100mA，30分钟。

4)记录结果

如图2所示，其中第3号样品和第6号样品扩增出梅毒螺旋体的TP基因条带，为感染梅毒螺旋体的临床样本，其它8个样品均只扩增出内参B297条带，为未感染梅毒螺旋体的DNA临床样本。

实施例5：不同引物比例的混合引物扩增DNA样本

本实施例采用由内参引物(B297)和引物(TP基因)配制而成的不同引物比例的混合液对实施例4中含有梅毒螺旋体基因的第3号DNA样本进行扩增，并采用凝胶电泳检测PCR的扩增结果。

将内参引物/引物的体积比定为3个梯度，分别定为0.7、1.0、1.2。采用这3种不同比例的混合引物分别对上述第3号DNA样本进行扩增。

1.不同引物比例的混合引物扩增DNA样本

1)体系的配制

PCR体系如下：

配制过程：

a.配制混合引物：取10μM的内参引物和10μM的TP基因引物，按内参引物/引物的体积比，分别配制体积比为0.7、1.0、1.2三个梯度的引物和内参引物混合液。

b.配制混合体系：按上述PCR体系，取一个无菌0.5ml的EP管，分别一次加入ddH₂O 66.5μl，PCR反应液87.5μl，第3号DNA样品7μl，短暂离心数秒，吹打混匀。

c、分装：取6个无菌PCR扩增管，每个扩增管中加入24μl的配制好的混合体系。

d、加引物和内参引物混合液：分别取3种引物和内参引物混合液2μl加到扩增管中，每种引物和内参引物混合液做两个重复。最后取一个PCR扩增管按上述PCR扩增体系配制一管用ddH₂O代替DNA样品的混合体系作为阴性对照。盖严各PCR扩增管的管盖，放入PCR仪中。

2)PCR条件：

第一阶段94℃，2分钟；

第二阶段94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，60秒；30个循环；

第三阶段72℃，5分钟。

2、琼脂糖凝胶电泳

1)制胶(2％琼脂糖凝胶)

称取琼脂糖0.7g，加入40ml电泳缓冲液TAE，混匀后融化。冷却到60℃以下，加入0.5μl核酸染料Goldview，混匀后倒入两端封闭的胶板中，插入电泳齿梳。待彻底冷却后，去掉两端的封闭，拔掉齿梳，将胶板放入电泳槽中，倒入适量的TAE溶液，以刚好浸没胶板为宜。

2)点样

3)电泳

电泳条件：100V，100mA，30分钟。

4)记录结果

如图3所示，当内参引物/引物的体积比分别为0.7、1.0、1.2时，都能扩增出正确的条带，只是当内参引物/引物的体积比为1.0时，条带是最亮的，可以证实当内参引物/引物的体积比在0.7～1.2之间时，PCR检测都是可行的，优选的内参引物/引物的体积比为1.0。

实施例6：不同组分的PCR反应液扩增DNA样本

本实施例采用由不同酶量配制而成的PCR反应液对实施例4中含有梅毒螺旋体基因的第3号DNA样本进行扩增，并采用凝胶电泳检测PCR的扩增结果。

将Taq DNA聚合酶的用量定为5个梯度，分别为：0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl。然后将Taq DNA酶低浓度、中浓度、高浓度分别对应组合，得到5种不同组分的PCR反应液。

第一组：

第二组：

第三组：

第四组：

第五组：

1.不同组分的PCR反应液扩增DNA样本

1)体系的配制

PCR体系如下：

配制过程：

a.配制不同组分的PCR反应液：按上述5组PCR反应液各组分的终浓度，依次配制不同组分的5种PCR反应液。

b.配制反应体系：按上述PCR体系，每个PCR反应液配制两个重复，盖严各PCR扩增管的管盖，放入PCR仪中。

2)PCR条件：

第一阶段94℃，2分钟；

第二阶段94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，60秒；30个循环；

第三阶段72℃，5分钟。

2、琼脂糖凝胶电泳

1)制胶(2％琼脂糖凝胶)

2)点样

3)电泳

电泳条件：100V，100mA，30分钟。

4)拍照

如图4所示。12.5ul体系中Taq DNA聚合酶的用量：0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl均可扩增得到目的条带。其中优选0.5μl。

实施例7：微流体芯片检测样本方法

本实施例为采用微流体芯片检测实施例4中所扩增出的DNA样品。微流体芯片检测样本具体包括以下操作步骤：

1)接通AMA2100型全自动微流芯片分析仪(宁波基内生物技术有限公司生产)电源。

2)连接检测池与主机箱正面输出接口，在缓冲溶液瓶中加入新配制好的缓冲溶液(2％HPMC-50，80mM MES，40mM Tris)，将电极和毛细管的两端浸在缓冲溶液中，保持毛细管两端出口在同一水平面上，且毛细管内必须充满缓冲溶液，关好仪器正门，确认仪器各部分连接正确后，按动高压启动按钮，如果发生异常应立即按动高压关断钮，检查并排除故障后，再重新加压。

3)进样：在样品池点加30ul样品溶液。

4)根据实验需要设定仪器工作参数。其中进样电压为380v，电泳电压为700v。

5)运行进样及电泳程序，当DNA条带通过检测点时，其信息由数据采集系统记录下来，并转化为电信号，即开始样品的分析工作，收集芯片检测图谱。

按照上述方法检测实施例4中所扩增出的DNA样品，其中未感染梅毒螺旋体的样品的微流体芯片检测结果图如图5所示，感染梅毒螺旋体的样品的微流体芯片检测结果图如图6所示。委托Invitrogen上海分公司对图6中所示感染梅毒螺旋体的样品的扩增结果进行测序比对，通过比对可知，该临床样本扩增得到的序列确实为梅毒螺旋体特有的基因序列。

<110> 宁波基内生物技术有限公司

<120> 一种用于检测梅毒螺旋体的引物、试剂盒及方法

<130> ZH10096

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgtattattg attgcgcgtg tgc 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttgactcgg tatgaagaga aacgt 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgacaaggcc atgaggctgg tgta 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagtccatca cgatgccagt ggta 24

Claims

1. 一种用于检测梅毒螺旋体的引物，其特征在于该引物的上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

2.一种用于检测梅毒螺旋体的试剂盒，其特征在于包括PCR反应液、如权利要求1所述的引物和内参引物混合液、阴性对照物、阳性对照物和灭菌双蒸水。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的内参引物的上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述的内参引物的下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于所述的PCR反应液包括H₂O7.5~7.9μl，10×PCR Buffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl和5U/μl Taq DNA聚合酶0.1~0.5μl。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的PCR反应液包括H₂O7.5μl，10×PCR Buffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl和5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl。

6.根据权利要求2或3或5所述的试剂盒，其特征在于所述的引物和内参引物混合液是由10μM内参引物和10μM引物混合配制而成，其中内参引物/引物的体积比值范围为0.7～1.2。

7.根据权利要求2或3或5所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性对照物为含梅毒螺旋体的宫颈组织DNA或静脉血液DNA；阴性对照物为ddH₂O。

8.一种检测梅毒螺旋体的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）提取样本DNA；

2）使用权利要求1所述的引物或权利要求3所述的试剂盒对步骤1）得到的DNA进行PCR扩增；

3）检测步骤2）所得到的扩增产物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤1）中的样本为人的静脉全血或宫颈悬浮细胞及分泌物。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1）用权利要求1所述的引物或权利要求3所述的试剂盒对被测样本的DNA进行多重PCR扩增；被扩增的目标基因片段大小各不相同；

2）扩增产物通过微流体芯片进行检测；

3）通过对各检测峰位置的判断，确定检测到的片段的大小，从而确定被检测到的基因，判断临床样本感染的病毒类别；

4）结果判断：a）未出现任何特异性峰，说明临床样本的DNA没有提取出，检测无效；b）只出现DNA内参特异性峰，说明没有梅毒螺旋体感染；c）出现DNA内参和梅毒螺旋体TP基因特异性峰，说明有梅毒螺旋体感染。