CN102140547A

CN102140547A - 麻疹病毒一步实时荧光定量rt-pcr试剂盒

Info

Publication number: CN102140547A
Application number: CN2011100678213A
Authority: CN
Inventors: 吴建国; 熊鹰; 艾洪武; 刘映乐; 石康; 章琪; 李彤亚; 杨操; 刘为勇; 王珊; 胡晓静; 王妍
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2011-03-21
Filing date: 2011-03-21
Publication date: 2011-08-03

Abstract

本发明公开了麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒，涉及生物技术领域中的PCR试剂盒。本试剂盒包括麻疹病毒的一对特异性引物、一条特异性荧光探针、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCRBuffer和EnzymeMix；特异性引物F：5'-ACASRGTGATCAAARTGRRARYGAGCTC-3'，R：5'-GYCCTGCCATGGYYTGCAC-3'；特异性探针FP：FAM-ATCYGATRCAGTRTCAATT-MGB-NQF。本发明检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；检测灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

Description

麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR试剂盒，尤其涉及一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录酶-聚合酶链锁反应)试剂盒。

背景技术

麻疹病毒(Measles Virus，MV)，属副黏病毒科，为球形或丝形，直径约120nm～250nm，核心为单负链RNA，不分节段，基因组全长约16kb，基因组有N、P、M、F、H、L六个基因。麻疹病毒是麻疹的病原体，是儿童常见的一种急性传染病，其传染性很强，以皮丘疹、发热及呼吸道症状为特征。我国自60年代初应用减毒活疫苗以来，儿童的发病率显著下降。但在发展中国家仍是儿童死亡的一个主要原因。在天花灭绝后，WHO已将麻疹列为计划消灭的传染病之一。另外，由于发现亚急性硬化性全脑炎(subacute sclerosing panencephalitits，SSPE)与麻疹病毒有关。

此前，麻疹病毒的诊断方法主要有病毒的分离培养和抗原抗体检测。病毒的分离培养，取患者发病早期的血液、咽洗液或咽拭子经抗生素处理后，接种于人胚肾、猴肾或人羊膜细胞中培养。病毒增殖缓慢，经7～10d可出现典型CPE，即有多核巨细胞、胞内和核内有嗜酸性包涵体，再以免疫荧光技术确认接种培养物中的麻疹病毒抗原。抗原抗体检测，取患者急性期和恢复期双份血清，常进行HI试验，检测特异性抗体，也可采用CF试验或中和试验。当抗体滴度增高4倍以上即可辅助临床诊断。除此之外，也可用间接荧光抗体法或ELISA检测IgM抗体。上述两种方法对麻疹病毒的检测在一定程度上是有效地，但是它们也有不足的地方，如病毒的分离培养，是需要耗费大量人力、物力和时间的，抗体检测对一些临床样本缺乏足够的灵敏度，有时不能判定出一些正常个体中麻疹病毒的潜伏感染。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

1、麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒(简称试剂盒)

本试剂盒是在对麻疹病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，利用实时荧光定量RT-PCR技术对麻疹病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对麻疹病毒的检测。

具体地说，本试剂盒包括麻疹病毒的一对特异性引物(F和R)、一条特异性荧光探针(FP)、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer和Enzyme Mix；

①麻疹病毒的一对特异性引物(F和R)

依据麻疹病毒N基因序列设计特异性引物：

F：5’-ACASRGTGATCAAARTGRRARYGAGCTC-3’28bp，

R：5’-GYCCTGCCATGGYYTGCAC-3’ 19bp；

②麻疹病毒的一条特异性荧光探针(FP)

依据麻疹病毒N基因序列设计特异性探针：

FP：FAM-ATCYGATRCAGTRTCAATT-MGB-NQF 19bp，

注：S＝G/C，R＝A/G，Y＝C/T；

③阳性对照

麻疹病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤一步5×RT-PCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

2、本试剂盒的使用方法

①病毒核酸的提取

A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

B、取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；

C、将标本(如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等)取200μl加入此管中，充分混匀；

D、再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；

E、加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

F、将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液，滤柱仍放回收集管上，将步骤C剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

G、滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

H、另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min，重复步骤H一次；

I、将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

J、将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

②一步实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系)

取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul一步实时荧光定量PCR反应液至八联管中进行荧光定量PCR扩增。

A、一步实时荧光定量PCR反应液(mix)的配制：

B、一步实时荧光定量PCR反应程序：

①50℃ 2min

②95℃ 10min

③95℃ 15s

④58℃ 1min

⑤Go to②，50cycles；

C、检测仪器：

本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪，在FAM通道进行检测。

D、结果判断：

在荧光定量PCR仪运转正常，阴性对照和阳性对照均正常的情况下，

(1)当Ct≤35时，判断样品为MV阳性；

(2)当35＜Ct≤40时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内就判断样品为MV阳性；

(3)当Ct＞40时，判断样品为MV阴性。

本发明具有下列优点和积极效果：

①检测时间周期短、检测效率高；

②检测病毒特异性高，准确率高；

③在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；

④检测灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法灵敏度高；

⑤操作简单、易于推广；

⑥实验结果重复性好。

附图说明

图1是MV病毒标准品扩增曲线；

图2是MV病毒标准品浓度标准曲线；

图3是7例MV阳性标本扩增曲线；

图4是6例MV阳性标本扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图和是实施例详细说明：

一、实施例1——麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒

1、试剂盒的组成：

取已知道浓度的MV病毒标准品进行浓度梯度稀释，得到6×10⁶，6×10⁵，6×10⁴，6×10³，6×10²，6×10copies/μl这6个浓度梯度的标准品，各取200μl提取病毒核酸；同时检测已确认的麻疹阳性标本7份，各取标本液200μl进行病毒核酸提取。

一对特异性引物F/R、一条特异性荧光探针FP、流感病毒A(MV)型阳性对照、RNase Free H₂O阴性对照、一步5xRT-PCR Buffer、Enzyme Mix

2、麻疹病毒的特异性扩增基因序列设计的引物为：

依据麻疹病毒N基因序列设计特异性引物：

F：5’-ACASRGTGATCAAARTGRRARYGAGCTC-3’28bp

R：5’-GYCCTGCCATGGYYTGCAC-3’ 19bp

依据麻疹病毒N基因序列设计特异性探针：

FP：FAM-ATCYGATRCAGTRTCAATT-MGB-NQF 19bp

注：S＝G/C，R＝A/G，Y＝C/T；

3、一步5xRT-PCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

4、Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

5、病毒核酸的提取

①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA。

②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中。

③将标本(如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等)取200μl加入此管中，充分混匀。

④再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min。

⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min。

⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液。

⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。

⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min。重复步骤⑧一次。

⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜。

⑩将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

6、一步实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系)

a)一步实时荧光定量PCR反应液(mix)的配制：

b)一步实时荧光定量PCR反应程序：

①50℃ 2min

②95℃ 10min

③95℃ 15s

④58℃ 1min

⑤Go to2，50cycles

c)检测：

本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪进行检测。

d)结果判断：

图1是MV病毒标准品扩增曲线，图2是MV病毒标准品浓度标准曲线，7份MV阳性标本经荧光定量PCR全部被检出，图3是这7例MV阳性标本的病毒扩增曲线，根据这7例MV阳性标本的C_t值结合标准曲线，由Roche LightCycler 480分析软件自动分析得到这7例MV阳性标本的病毒浓度，具体结果见表1。

表1 7例H1N1阳性标本病毒浓度

二、实施例2---临床检测

用上述方法对6例MV已确认阳性标本进行检测，全部检出，根据Ct值，参照标准曲线得到各阳性标本的病毒浓度，参见表2

表2 6例MV阳性标本病毒浓度

序列表

<110> 武汉大学

<120> 麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒

<140>

<141>

<160> 3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 麻疹病毒上游引物

<400>

5'-ACASRGTGATCAAARTGRRARYGAGCTC-3'。

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 麻疹病毒下游引物

<400>

5'-GYCCTGCCATGGYYTGCAC-3'。

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 荧光探针序列

<400>

FAM-ATCYGATRCAGTRTCAATT-MGB-NQF。

Claims

1.一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：

本试剂盒包括麻疹病毒的一对特异性引物、一条特异性荧光探针、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer和Enzyme Mix；

①麻疹病毒的一对特异性引物

依据麻疹病毒N基因序列设计特异性引物：

F：5’-ACASRGTGATCAAARTGRRARYGAGCTC-3’，

R：5’-GYCCTGCCATGGYYTGCAC-3’；

②麻疹病毒的一条特异性荧光探针

依据麻疹病毒N基因序列设计特异性探针：

FP：FAM-ATCYGATRCAGTRTCAATT-MGB-NQF；

③阳性对照

麻疹病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤一步5×RT-PCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。