CN104846119A - 一种麻疹病毒一步实时荧光定量rt-pcr试剂盒 - Google Patents

一种麻疹病毒一步实时荧光定量rt-pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒，涉及生物技术领域中的PCR试剂盒。本试剂盒包括麻疹病毒的一对特异性引物、一条特异性荧光探针、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer和Enzyme Mix；特异性引物F：5'-ACASRGTGATCAAARTGRRARYGAGCTC-3'，R：5'-GYCCTGCCATGGYYTGCAC-3'；特异性探针FP：FAM-ATCYGATRCAGTRTCAATT-MGB-NQF。本发明检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；检测灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

Description

一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的PCR试剂盒，尤其涉及一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录酶-聚合酶链锁反应）试剂盒。
背景技术
麻疹病毒（Measles Virus，MV），属副黏病毒科，为球形或丝形，直径约120nm～250nm，核心为单负链RNA，不分节段，基因组全长约16kb，基因组有N、P、M、F、H、L六个基因。麻疹病毒是麻疹的病原体，是儿童常见的一种急性传染病，其传染性很强，以皮丘疹、发热及呼吸道症状为特征。我国自60年代初应用减毒活疫苗以来，儿童的发病率显著下降。但在发展中国家仍是儿童死亡的一个主要原因。在天花灭绝后，WHO已将麻疹列为计划消灭的传染病之一。另外，由于发现亚急性硬化性全脑炎（subacute sclerosing panencephalitits，SSPE）与麻疹病毒有关。
此前，麻疹病毒的诊断方法主要有病毒的分离培养和抗原抗体检测。病毒的分离培养，取患者发病早期的血液、咽洗液或咽拭子经抗生素处理后，接种于人胚肾、猴肾或人羊膜细胞中培养。病毒增殖缓慢，经7～10d可出现典型CPE，即有多核巨细胞、胞内和核内有嗜酸性包涵体，再以免疫荧光技术确认接种培养物中的麻疹病毒抗原。抗原抗体检测，取患者急性期和恢复期双份血清，常进行HI试验，检测特异性抗体，也可采用CF试验或中和试验。当抗体滴度增高4倍以上即可辅助临床诊断。除此之外，也可用间接荧光抗体法或ELISA检测IgM抗体。上述两种方法对麻疹病毒的检测在一定程度上是有效地，但是它们也有不足的地方，如病毒的分离培养，是需要耗费大量人力、物力和时间的，抗体检测对一些临床样本缺乏足够的灵敏度，有时不能判定出一些正常个体中麻疹病毒的潜伏感染。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒。
本发明的目的是这样实现的：
1、麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒（简称试剂盒）
本试剂盒是在对麻疹病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，利用实时荧光定量RT-PCR技术对麻疹病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。
在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对麻疹病毒的检测。
具体地说，本试剂盒包括麻疹病毒的一对特异性引物（F和R）、一条特异性荧光探针（FP）、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer和Enzyme Mix；
①麻疹病毒的一对特异性引物（F和R）
依据麻疹病毒N基因序列设计特异性引物：
F：5'- CGAGCCTGGAAACTACTAATCAT-3'     
R：5'- GCCCTGAACAGCCAATATCATCT-3'
②麻疹病毒的一条特异性荧光探针（FP）
依据病毒N基因序列设计特异性探针：
FP: FAM-ATTGAGGCAATCAGACAAGCAGGGCA-MGB
    ③阳性对照
麻疹病毒标准品；
④阴性对照
RNase Free H2O；
⑤一步5×RT-PCR Buffer配制：
Tris·Cl           20mM
    KCl                80mM
（NH4）2SO4                   80mM
DTT                 1.5mM
MgCl2              12mM
dNTP               10mM
配置混合后于冰箱-20℃保存；
⑥Enzyme Mix配制：
    Tris·Cl           20mM
    KCl                80mM
DTT                 1mM
EDTA                0.1mM
Nonidet P-40        0.5％
Tween 20            0.5％
甘油               50％
Taq酶               2.5U/ul
M-MLV酶             2.5U/ul
配置混合后于冰箱-20℃保存。
2、本试剂盒的使用方法
①病毒核酸的提取
A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；
在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；
B、取30μl 蛋白酶放入1.5ml离心管中；
C、将标本（如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等）取200μl加入此管中，充分混匀；
D、再在每管分别加入200μl 漂洗液（含30μg/ml carrier RNA），混匀振荡30s，70℃温育10min；
E、加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；
F、将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液，滤柱仍放回收集管上，将步骤C剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；
G、滤柱中加入500μl 缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；
H、另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl 缓冲液2，12000rpm，离心1min，重复步骤H一次；
I、将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃ 15min以干燥滤膜；
J、将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H2O，室温静置2min。12 000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。
②一步实时荧光定量PCR扩增（每份25ul体系）
    取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul一步实时荧光定量PCR反应液至八联管中进行荧光定量PCR扩增。
A、一步实时荧光定量PCR反应液（mix）的配制：
    一步荧光定量5×PCR buffer             8ul
    Enzyme Mix                             5ul
    特异性引物F/R                       各1ul
    特异性荧光探针FP                       2ul
    Rnase Free H2O                          3ul
反应液体积：                          20ul
B、一步实时荧光定量PCR反应程序：
            50℃                             2min
            95℃                            10min
            95℃                              15s
            56℃                             1min
            Go to ，50 cycles；
      步骤设为荧光检测模式
    C、检测仪器：
    本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪，在FAM通道进行检测。
    D、结果判断：
在荧光定量PCR仪运转正常，阴性对照和阳性对照均正常的情况下，
（1）当Ct≤35时，判断样品为麻疹病毒阳性；
（2）当35<Ct≤40时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内就判断样品为麻疹病毒阳性；
（3）当Ct >40时，判断样品为麻疹病毒阴性。
本发明具有下列优点和积极效果：
①检测时间周期短、检测效率高；
②检测病毒特异性高，准确率高；
    ③在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；
④检测灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法灵敏度高；
⑤操作简单、易于推广；
⑥实验结果重复性好。
附图说明
图1是麻疹病毒病毒标准品扩增曲线；
图2是麻疹病毒病毒标准品浓度标准曲线；
图3是7例麻疹病毒阳性标本扩增曲线；
图4是6例麻疹病毒阳性标本扩增曲线。
具体实施方式
          下面结合附图和是实施例详细说明：
一、实施例1——麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒
1、试剂盒的组成：
取已知道浓度的麻疹病毒病毒标准品进行浓度梯度稀释，得到6×106，6×105，6×104，6×103，6×102，6×10 copies/μl 这6个浓度梯度的标准品，各取200μl提取病毒核酸；同时检测已确认的麻疹阳性标本7份，各取标本液200μl进行病毒核酸提取。
一对特异性引物F/R、一条特异性荧光探针FP、流感病毒A（麻疹病毒）型阳性对照、RNase Free H2O阴性对照、一步5xRT-PCR Buffer、Enzyme Mix
2、麻疹病毒的特异性扩增基因序列设计的引物为：
依据麻疹病毒N基因序列设计特异性引物：
    F：5'-ACASRGTGATCAAARTGRRARYGAGCTC-3'      28bp
    R：5'-GYCCTGCCATGGYYTGCAC-3'               19bp
    依据麻疹病毒N基因序列设计特异性探针：
    FP：FAM-ATCYGATRCAGTRTCAATT-MGB-NQF        19bp
    注：S=G/C，R=A/G，Y=C/T；
3、一步5xRT-PCR Buffer配制：
         Tris·Cl        20mM
         KCl             80mM
（NH4）2SO4             80mM
     DTT             1.5mM
     MgCl2            12mM
     dNTP            10mM
    配置混合后于冰箱-20℃保存。
4、 Enzyme Mix配制：
         Tris·Cl        20mM
         KCl            80mM
     DTT            1mM
    EDTA          0.1mM
    Nonidet P-40      0.5％
    Tween 20         0.5％
    甘油             50％
    Taq酶          2.5U/ul
    M-MLV酶      2.5U/ul
    配置混合后于冰箱-20℃保存。
5、病毒核酸的提取
    ① 首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA。
② 取30μl 蛋白酶放入1.5ml离心管中。
③ 将标本（大便、肛拭悬液等）取200μl加入此管中，充分混匀。
④再在每管分别加入200μl 漂洗液（含30μg/ml carrier RNA），混匀振荡30s，70℃温育10min。
⑤ 加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min。
⑥ 将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液。
⑦ 滤柱中加入500μl 缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。
⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl 缓冲液2，12000rpm，离心1min。重复步骤⑧一次。
⑨ 将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃ 15min以干燥滤膜。
⑩ 将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H2O，室温静置2min。12 000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。
6、一步实时荧光定量PCR扩增（每份25ul体系）
    取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul一步实时荧光定量PCR反应液至八联管中进行荧光定量PCR扩增。
        a）一步实时荧光定量PCR反应液（mix）的配制：
         一步荧光定量5xPCR buffer               8ul
         Enzyme Mix                            5ul
         特异性引物F/R                       各1ul
         特异性荧光探针FP                      2ul
         Rnase Free H2O                          3ul
         反应液体积：                           20ul
        b）一步实时荧光定量PCR反应程序：
            50℃                              2min
            95℃                              10min
            95℃                              15s
            58℃                              1min
            Go to2,50 cycles
        c）检测：
           本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪进行检测。
        d）结果判断：
图1是麻疹病毒病毒标准品扩增曲线，图2是麻疹病毒病毒标准品浓度标准曲线，7份麻疹病毒阳性标本经荧光定量PCR全部被检出，图3是这7例麻疹病毒阳性标本的病毒扩增曲线，根据这7例麻疹病毒阳性标本的Ct 值结合标准曲线，由Roche LightCycler 480分析软件自动分析得到这7例麻疹病毒阳性标本的病毒浓度，具体结果见表1。
表1  7例H1N1阳性标本病毒浓度 
样品编号 Ct值 H1N1病毒浓度（拷贝数/μl）
样品1 22.63 5.97×102
样品2 22.16 1.18×103
样品3 21.71 2.28×103
样品4 24.22 5.80×101
样品5 24.00 7.96×101
样品6 23.82 1.04×102
样品7 23.73 1.18×102
二、实施例2---临床检测
用上述方法对6例麻疹病毒已确认阳性标本进行检测，全部检出，根据Ct值，参照标准曲线得到各阳性标本的病毒浓度，参见表2 。
表2  6例麻疹病毒阳性标本病毒浓度
样品编号 Ct值 H1N1病毒浓度（拷贝数/μl）
样品1 23.10 3.00×102
样品2 21.93 1.65×103
样品3 21.83 1.93×103
样品4 21.51 3.05×103
样品5 22.54 6.79×102
 样品6 22.54 6.80×102

Claims (1)

1. 一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：
本试剂盒包括麻疹病毒的一对特异性引物、一条特异性荧光探针、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer和Enzyme Mix；
①麻疹病毒的一对特异性引物
依据麻疹病毒N基因序列设计特异性引物：
F：5'-ACASRGTGATCAAARTGRRARYGAGCTC-3'，
R：5'-GYCCTGCCATGGYYTGCAC-3'；
②麻疹病毒的一条特异性荧光探针
依据麻疹病毒N基因序列设计特异性探针：
FP：FAM-ATCYGATRCAGTRTCAATT-MGB-NQF；
    ③阳性对照
麻疹病毒标准品；
④阴性对照
RNase Free H2O；
⑤一步5×RT-PCR Buffer配制：
Tris·Cl           20mM
    KCl                80mM
（NH4）2SO4                   80mM
DTT                 1.5mM
MgCl2              12mM
dNTP               10mM ，
配置混合后于冰箱-20℃保存；
⑥Enzyme Mix配制：
    Tris·Cl           20mM
    KCl                80mM
DTT                 1mM
EDTA                0.1mM
Nonidet P-40        0.5％
Tween 20            0.5％
甘油               50％
Taq酶               2.5U/ul
M-MLV酶             2.5U/ul，
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