CN105734168B

CN105734168B - 一种12种呼吸道病毒核酸多重pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN105734168B
Application number: CN201510710405.9A
Authority: CN
Inventors: 李伯安; 金鑫; 刘文干; 郭桐生
Original assignee: NANJING MOKOBIO BIOTECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: NANJING MOKOBIO BIOTECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2035-10-28
Also published as: CN105734168A

Abstract

本发明公开了一种12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒，包括有用于扩增如下12种呼吸道病毒特异基因位点的引物：甲型流感病毒（Inf A）、甲型流感H1N1（2009）、甲型流感病毒H3N2、人副流感病毒（HPIV1）、人副流感病毒（HPIV2）、人副流感病毒（HPIV3）、人副流感病毒（HPIV4）、人偏肺病毒（hMPV）、呼吸道腺病毒（AdV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、博卡病毒（BoV）及冠状病毒（CoV）。本发明具有以下优点：本发明所述的试剂盒能够多重检测、灵敏度高且使用快捷方便。此外，本发明采用特异性的引物序列，保证检测结果的可靠性；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量大，试剂耗材成本低；可直接对呼吸道病原体样本提取的核酸进行检测；对检测平台和人工技术水平要求低，能够在常规检测中广泛推广。

Description

一种12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及一种由通用引物介导的多重PCR扩增方法检测12种呼吸道病毒核酸的试剂盒。

背景技术

呼吸道感染是世界范围内最常见的疾病之一，发病率在各国居民发病率总体结构中占据主要地位,每年的流行高峰期约有10％的居民患有呼吸道感染。造成呼吸道感染的主要由各种呼吸道病毒以及一些细菌、支原体、衣原体。病毒中常见的是甲型流感病毒(InfA)、甲型流感H1N1(2009)、甲型流感病毒H3N2、人副流感病毒(HPIV1)、人副流感病毒(HPIV2)、人副流感病毒(HPIV3)、人副流感病毒(HPIV4)、人偏肺病毒(hMPV)、呼吸道腺病毒(AdV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BoV)及冠状病毒(CoV)等。这些呼吸道病毒大都具有很强的感染力而且传播快、潜伏期短、发病急。并且有越来越多的新的致病性呼吸道病毒被发现,给临床相关疾病诊断和治疗造成极大的困难。而且由于近些年,呼吸道病原体所引发的疫情不断发生,一些呼吸道病毒如甲型流感病毒、腺病毒以及不断变异的新型病毒所导致爆发的疫情成为公共卫生领域面临的一个重要的问题,带来了很大的经济损失及社会危害。呼吸道病原体所引发的疾病及疫情的病原学复杂,精确的病原学分析不仅可以为疾病确诊提供充足的依据，也可以为选择合理的治疗方案提供坚实的基础。

流感病毒(influenza vims,Flu)即流行性感冒病毒,正黏病毒科,会造成急性上下呼吸道感染,并借由空气迅速的传播,引发疫情流行。根据抗原性流感病毒可分为三类:甲型、乙型和丙型流感病毒。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异,可引起世界性大流行。流感的特点是发病率高,病死率低,死亡通常由并发细菌性感染所致。但其可造成疫情流行,近100年来,已出现数次不同亚型流感病毒的全球大流行全球人口流动性不断增加,流感病毒交替、混合流行成为常态。1918年西班牙流感,H1N1,死亡4000-5000万人,1997年香港禽流感,H5N1,死亡率达63％，2013年4月我国H7N9流感病毒疫情爆发,引发多地感染,造成经济损失和社会恐慌。目前在人群中流感病毒主要以H1N1(2009)、H1N3流感病毒形式存在。

人副流感病毒(human parainfluenza virus,HPIV),副黏病毒科,主要可以引起儿童下呼吸道感染,其致病性仅次于呼吸道合胞体病毒(RSV)。人类人副流感病毒可以造成反复发作的感冒和喉晚痛等上呼吸道感染，也能造成严重的反复感染的肺炎,支气管炎和细支气管炎下呼吸道疾病。人副流感病毒也可以暴发疫情流行,其中疫情暴发以人副流感病毒III型为主,其流行以局部地方性流行为主,且四季均可以暴发流行。人副流感病毒I型疫情流行常见于幼儿，发生于儿科病房、幼儿园、小学及其他儿童场所。人副流感病毒I型或II型引起的流行性疾病有每年均可发生并交替占主导地位的倾向。

人偏肺病毒(human metapneumovirus，HMPV)，副黏病毒科,偏肺病毒属，为由包膜的单股负链RNA病毒，其基因组RNA长约13kb。目前认为，人类是hMPV已知的唯一天然宿主，hMPV感染为全年散发，但大多有明显季节性，可导致各年龄阶段的急性呼吸道感染，临床表现与同属副黏病毒科的呼吸道合胞病毒所致疾病相似。近年来HMPV已和呼吸道合胞病毒、腺病毒等一样被认为是导致小儿急性呼吸道感染的主要病原。

呼吸道腺病毒(adenovirus,Adv)，腺病毒科,是一类无包膜的双链DNA病毒,分为A-G 7个血清学组,包括56个血清型。腺病毒能在呼吸道、肠粘膜上皮细胞中引起溶解性感染；在淋巴样和腺样细胞中引起潜伏感染和在啮齿动物细胞中引起转化感染。呼吸道腺病毒经呼吸道可引发急性腺病毒型肺炎。腺病毒B组感染目前己成为急性呼吸系统疾病的重要因素。超过5％的急性呼吸道传染病为HAdV感染所致,特别是在急性下呼吸道感染儿童患者中HAdV感染阳性率最高可达37.3％。近年来,B2亚组中出现的新型HAdV-B55在成人特别是学校和军队特殊人群中引起日益频繁的急性呼吸道传染病流行。我国2009年首次报道了HAdV-B55疫情,导致247名师生及市民发病,1名学生死亡。考虑到HAdV并未列入我国传染病监控病原,腺病毒在我国引起的成人急性呼吸道传染病流行可能远高于实际报道病例,其潜在威胁不容忽视。

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)，副黏病毒科,是致呼吸道感染的常见病原体,也是婴幼儿呼吸道感染主要病原体,可以经空气飞沫和密切接触传播。呼吸道合胞病毒可以引起从新生儿到成年人任何年龄段的呼吸道感染。可以引起发热、鼻塞、咽炎和中耳炎上等呼吸道症状,哮喘,支气管炎,小支气管炎和肺炎下等呼吸道症状。呼吸道合胞体病毒感染对象主要是婴幼儿,且再感染率很高。成人急性感染也很常见,成人感染后,主要表现为上呼吸道感染。老年人可引起严重肺炎,并发展为成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。呼吸道合胞体病毒可以引发流行性喘憋性肺炎而导致婴幼儿尤其是新生儿的死亡。呼吸道合胞病毒可分为A和B两个亚型,A、B亚型可同时流行,但每个流行年的优势亚型不同，不同亚型病毒毒力强弱不同,造成的危害也不同,对呼吸道合胞体病毒的鉴定诊断可以促进与预防、免疫和社会经济因素等有关的呼吸道合胞体病毒分子流行病学研究。

博卡病毒(Bocavirus，BoV)是细小病毒科细小病毒亚科，是一种无包膜的单链、线性DNA病毒，基因组全长约5.3kb。BoV呈全球性分布，一年四季均可发生，以冬春季节为主，但不同的国家报道的季节性特征有所不同。博卡病毒通过空气传播，容易使婴幼儿罹患肺炎、支气管炎和支气管肺炎等疾病。其主要临床表现为咳嗽、发热、喘息、腹泻等症状，高发人群为6个月至3岁的婴幼儿。BoV与其他呼吸道病毒的共感染率可高达51％，且更多地出现在那些只有低拷贝博卡病毒的患儿样品中。博卡病毒可以以低拷贝数长期存在于呼吸道、血液以及尿液中达一个月之久。而共感染现象在这些长期感染博卡病毒的病人中十分普遍。

冠状病毒(Corona virus)，冠状病毒属于冠状病毒科,为单正链RNA有膜病毒。冠状病毒被认为是造成绝大部分成人普通感冒的病毒,主要发生在早春和冬季。目前已知的能感染人的冠状病毒共六种，分别为20世纪60年代发现的人冠状病毒HCOV-229E和HCOV-OC43，2003年新出现的冠状病毒SARS－COV，2004年发现的人冠状病毒HCOV-NL63，2005年新发现的人冠状病毒HCOV-HKU1以及2013年7月在中东地区出现的新型人冠状病毒HCOV-－MERS。冠状病毒导致以发热、胸闷、干咳为主的临床症状,严重者出现进展快速的呼吸系统衰竭,是一种新的呼吸道传染病且传染性极强、病情发展极为迅速。2003年我国爆发的SARS疫情以及2015年韩国爆发的MERS疫情均是有冠状病毒引起。

呼吸道病毒种类繁多,但其引起的症状基本相似而引发的疫情流行及带来的社会危害程度却不同,有效的鉴定呼吸道病原体，明确呼吸道感染病原体种类,对临床诊疗及疫情防控具有重要的意义，因此建立一套高效、灵敏、特异的呼吸道病原体检测方法,已成为当务之急。目前国内外对呼吸道病原体检测方法有很多种，它们各有优缺点。检测技术包括传统的分离培养法、免疫学检测技术以及新兴的分子生物学技术。近年来，以核酸为基础的分子检测方法以其快速、灵敏、特异以及省时省力的特点，成为呼吸道病原体检测的一项革命性技术。

多重PCR(Multiplex PCR，M-PCR)是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模版，即可同时在一个反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段，实现了一次性检测多种致病菌的目的。然而，由于多重PCR是在同一PCR反应体系里加入多对引物以扩增多个DNA片段的PCR反应，因此同一反应体系中的多对引物易发生相互作用，如形成发卡结构，二聚体结构等，引物对和引物量越多，引物之间的相互作用越明显，从而影响PCR扩增效率，进而影响了多重PCR的广泛应用。

通用引物多重PCR扩增是指在特异性引物的5’端添加一段与待测模板无任何扩增的寡核苷酸序列而进行的PCR扩增，5’端添加的寡核苷酸序列为通用引物，PCR扩增时嵌合引物浓度通常是通用引物的1/10，PCR扩增的最初几个循环中由嵌合引物的特异性序列进行扩增，富集核酸模板，随着PCR反应的进行，嵌合引物逐渐消耗，通用引物由于浓度较大发挥主要作用，余下循环中，所有的扩增均通过通用引物进行扩增，降低了普通多重PCR的扩增偏好性，使得低浓度的核酸模板得到有效扩增，且由于嵌合引物浓度较低，避免了引物间二级结构的影响。

发明内容

本发明的解决的技术问题：提供一种特异性强、灵敏度高、通量高的12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒，利用其可从呼吸道疾病患者咽拭子、鼻拭子或鼻咽抽提物样本中检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒，包括有用于扩增如下12种呼吸道病毒特异基因位点的引物：Inf A、H1N1(2009)、H3N2、HPIV1、HPIV2、HPIV3、HPIV4、HMPV、AdV、RSV、BoV及CoV。

作为本发明的一种优选方案，所述引物是由通用引物和特异性引物组合而成的嵌合引物，即在特异性引物的5’端添加一段通用引物序列。

其中，特异性引物序列为：Inf A，SEQ ID NO.1～2；H1N1(2009)，SEQ ID NO.3～4；、H3N2，SEQ ID NO.5～6；HPIV1，SEQ ID NO.7～8；HPIV2，SEQ ID NO.9～10；HPIV3，SEQID NO.11～12；HPIV4，SEQ ID NO.13～14；hMPV，SEQ ID NO.15～16；AdV，SEQ ID NO.17～18；RSV，SEQ ID NO.19～20；BoV，SEQ ID NO.21～22；CoV，SEQ ID NO.23～24；通用引物序列为：SEQ ID NO.25～26。检测靶标、引物序列及产物片段大小如表1所示：

表1检测靶标、引物序列及产物片段大小

作为本发明的一种优选技术方案，所述通用引物在扩增体系中的终浓度为400nM～1μM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为20nM～100nM。

进一步的，所述通用引物在扩增体系中的终浓度为400nM～1uM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为20nM～100nM。

进一步的，所述通用引物在扩增体系中的终浓度为800nM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为60nM。

含有上述引物的12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其组份为：表1中引物混合物、阳性对照品、阴性对照品、热启动DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、PCR反应缓冲液及DEPC水。其中，阳性对照品为表1中所述的12种检测靶标的10⁷copy/μL PMD19-T的克隆DNA。

一种12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒的应用，所述试剂盒用于甲型流感病毒、甲型流感H1N1(2009)、甲型流感病毒H3N2、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、人副流感病毒4型、人偏肺病毒、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒以及冠状病毒的检测。

作为本发明的一种优选技术方案，所述检测方法为多重PCR程序，具体如下：程序1，50℃、25min、1次循环；程序2，95℃、10min、1次循环；程序3，95℃、15s，56℃、30s，72℃、35s，10次循环；程序4，95℃、15s，65℃、35s，72℃、35s，10次循环；程序5，95℃、15s，48℃、30s，72℃、35s，20次循环；程序6，72℃、5min、1次循环；程序7，4℃保温。

进一步的，所述多重PCR程序是基于Labchip GX微流控芯片分析技术，检测扩增产物。

基于Labchip GX微流控芯片技术检测12种呼吸道病毒核酸的具体方法如下：(1)生产12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒；(2)采集样本并提取核酸；(3)以提取的核酸为模板进行多重PCR扩增反应；(4)Labchip GX微流控芯片分析PCR产物。

其中，采集样本为咽拭子和鼻拭子。按照常规标准方法进行样本采集，采集好的样本置于样本采集管中，样本采集管中应含有3ml无菌病毒采样液(含蛋白质稳定剂，防治细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液)。样本可立即用于检测；如不立即检测，样本在4℃条件下可保存48h，超过48h应置于-70℃或以下保存，应避免反复冻融。核酸样本的提取采用QIAGEN公司的QIAampMinElute Virus Spin Kit(货号：57704)或天根生化科技有限公司的病毒RNA提取试剂盒(货号：DP315)在样本处理区按照说明书操作步骤提取核酸。

以提取的核酸样本为模板进行多重PCR扩增反应，反应体系为25μL，具体如下：酶系2.0μL，PCR反应液18.0μL，核酸模板2-5μL，补DEPC水至25μL。所述酶系为含有反转录酶、RNA酶抑制剂、热启动酶及酶激活剂的混合物；所述PCR反应缓冲液为含有Buffer、Mg2+、dNTPs及表1中引物组的混合液。

Labchip GX微流控芯片分析PCR产物，将25μL PCR扩增产物直接在Labchip GX微流控芯片分析仪中按照实验操作说明进行操作，将Labchip GX分析得到的图谱与阳性对照品的标准图谱进行比对，判断病毒种类。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)多重检测：本发明首次公开了12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒，使用本试剂盒可一次性检测12种呼吸道病毒，降低检测成本，节省检测时间，适合对突发事件应急检测与常规检测。

(2)灵敏度高：本发明公开的多重PCR扩增方法及引物浓度避免了现有技术中多重PCR程序中引物间相互作用和引物对模板的扩增偏好性，提高了多重PCR扩增通量和检测灵敏度，尤其适合对低浓度模板的扩增，且操作简单，临床检测特异性好，灵敏度与定量PCR相当，具有较强的临床应用推广价值。

(3)检测方法快捷：本发明所提供的检测方法采用Labchip GX微流控芯片检测，检测灵敏度较琼脂糖凝胶电泳高，与毛细管凝胶电泳检测相当；通量大，可一次检测96个样本；快速方便，每个反应检测仅需1min。

综上所述，本发明提供一种12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒，并建立一种基于普通PCR平台的多重PCR扩增、检测方法。本发明采用特异性的引物序列，保证检测结果的可靠性；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量大，试剂耗材成本低；可直接对呼吸道病原体样本提取的核酸进行检测；对检测平台和人工技术水平要求低，能够在常规检测中广泛推广。

附图说明

图1试剂盒阳性对照扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2试剂盒阳性对照扩增产物微流控芯片图。

具体实施方式

实施例1 12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒

该试剂盒由PCR反应液、酶系、阳性对照品、阴性对照品和DEPC水构成，其中PCR反应液为5×one step RT-PCR Buffer(Tris-HCl pH8.5 100mM、KCl 500nM、MgCl₂ 15nM)、dNTPs(10mM each)、Mg²⁺、12对嵌合引物和1对通用引物；酶系由反转录酶、RNA酶抑制剂、热启动DNA聚合酶以及上述酶的激活剂构成；阳性对照品由12种靶标的10⁷copy/μL PMD19-T克隆DNA构成。

所述通用引物在扩增体系中的终浓度为800nM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为60nM。

该试剂盒的反应体系为25ul，具体如下：酶系2.0μL，PCR反应液18.0μL，核酸模板2～5μL，补DEPC水至25μL。

实施例2试剂盒的操作和结果判定

(1)病毒基因组DNA的提取

采用天根生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(货号：DP315)在样本处理区按照说明书操作步骤提取核酸。

(2)反应体系的配制

采用实施例1的试剂盒进行以下实验，待试剂盒PCR反应液在室温条件下完全溶解后，快速震荡混匀，25μL PCR反应体系为：PCR反应液18μL，酶系2μL，模板3μL，补DEPC水至25μL。

(3)PCR扩增

将PCR管放入普通PCR仪中，开启热盖后，按照如下要求设定PCR仪反应程序：程序1，50℃、25min、1次循环；程序2，95℃、10min、1次循环；程序3，95℃、15s，56℃、30s，72℃、35s，10次循环；程序4，95℃、15s，65℃、35s，72℃、35s，10次循环；程序5，95℃、15s，48℃、30s，72℃、35s，20次循环；程序6，72℃、5min、1次循环；程序7，4℃保温。

(4)Labchip GX微流控芯片仪分析PCR产物

(5)结果判读

本试剂盒的结果判读如表2所示；

表2检测结果判断

实施例3试剂盒特异性实验

采用实施例1所述的试剂盒对于鼻病毒、流感病毒H1N1、乙型流感病毒、肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、枸橼酸杆菌、阴沟杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜肺军团杆菌、百日咳鲍特菌，经检测均无任何片段扩增，而对目标菌株检测时，除目标片段外无非特异性片段产生，表明本发明试剂盒特异性好。

实施例4试剂盒灵敏度检测

将自制的12种病毒检测靶标的质粒标准品10⁷copy/mL梯度稀释成10⁶copy/mL、10⁵copy/mL、10⁴copy/mL、10³copy/mL、10²copy/mL、10¹copy/mL，使用实施例1所述的试剂盒对上述稀释后的模板分别进行扩增，根据实施例2中的结果判定标准进行判定，12种病毒检测灵敏度结果如表3所示：

表3 12种呼吸道病毒核酸用本试剂盒检测灵敏度结果

从表3可见，当病毒模板为10²copy/mL时，实施例1所述试剂盒仍能利用其作为模板进行扩增，因此，在低浓度模板情况下，本发明所述试剂盒然能进行检测，因而具有很高的灵敏度。

以上实施例并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本领域技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京美宁康诚生物科技有限公司

<120> 一种12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒

<140>

<141>

<160>26

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测甲型流感病毒M Protein基因正向引物。

<400> 1

AGACCAATYYTGTCACCTCTG

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测甲型流感病毒M Protein基因反向引物。

<400> 2

CGGGTCCCCATTCCCATT

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测甲型流感H1N1（2009）HA基因正向引物。

<400> 3

GGTTTGAGATATTCCCCAARAC

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测甲型流感H1N1（2009）HA基因反向引物。

<400> 4

AGGATTTGCTGAGCTTTGGGTATG

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测甲型流感病毒H3N2 HA基因正向引物。

<400> 5

CGAAGCAAAGCCTACAGCAAC

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测甲型流感病毒H3N2 HA基因反向引物。

<400> 6

TGTCAAATTGTTCATTGTTTGGCAT

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测人副流感病毒1型Nucleoprotein基因正向引物。

<400> 7

ACTAGGTGTGACAGACACAGCAA

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测人副流感病毒1型Nucleoprotein基因基因反向引物。

<400> 8

TGTTGTCCCGATCAGCAGTGTC

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于人副流感病毒2型HN基因正向引物。

<400> 9

AATGGGCCACAATCAATCCT

<210>10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于人副流感病毒2型HN基因基因反向引物。

<400> 10

ATAACATAGAGCCTGCCTTCTGC

<210>11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测人副流感病毒3型Nucleoprotein基因正向引物。

<400> 11

TTCATCTGTATCCTCAGAGATCCC

<210>12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测人副流感病毒3型Nucleoprotein基因反向引物。

<400> 12

CTCATCTGAGCTTCAGCATCAC

<210>13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测人副流感病毒4型Nucleoprotein基因正向引物。

<400> 13

CTGAAGAGAGAMGRCTGGCYAAG

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测人副流感病毒4型Nucleoprotein基因反向引物。

<400> 14

AGCTGGAGCAAATTCCATCAATTC

<210>15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测人偏肺病毒Nucleoprotein基因正向引物。

<400> 15

CATAYAARCATGCTATATTAAAAGAGTC

<210>16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测人偏肺病毒Nucleoprotein基因反向引物。

<400> 16

GTTTCTTAGAATCTGCTGTACTCTCT

<210>17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测呼吸道腺病毒Hexon protein基因正向引物。

<400> 17

AGGACGCYTCGGAGTACCT

<210>18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测呼吸道腺病毒Hexon protein基因反向引物。

<400> 18

GCTAGGACCTCTATCAAGCACC

<210>19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测呼吸道合胞病毒Nucleoprotein基因正向引物。

<400> 19

TTAGCAAAGTCAAGYTGAATGATAC

<210>20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测呼吸道合胞病毒Nucleoprotein基因反向引物。

<400> 20

CTTTAAGTATCTTTATAGTGTCTTC

<210>21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测博卡病毒NP1基因正向引物。

<400> 21

GAAGAGACACTGGCAGACAACTC

<210>22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测博卡病毒NP1基因反向引物。

<400> 22

AACATTAGCTAAGTGTCTACGGTAC

<210>23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测冠状病毒COBL基因正向引物。

<400> 23

ATGGGACAATAAAAGAGAAACC

<210>24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于检测冠状病毒（CoV）COBL基因反向引物。

<400> 24

TGTGAATCCAGGGAAATGATG

<210>25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于试剂盒扩增通用引物的正向引物。

<400> 25

AGGTGACACTATAGAATA

<210>26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于试剂盒扩增通用引物的反向引物。

<400> 26

AGGTGACACTATAGAATA

Claims

1.一种12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下12种呼吸道病毒特异基因位点的引物：Inf A、H1N1（2009）、H3N2、HPIV1、HPIV2、HPIV3、HPIV4、hMPV、AdV、RSV、BoV及CoV；所述引物是由通用引物和特异性引物组合而成的嵌合引物，即在特异性引物的5’端添加一段通用引物序列；

所述引物中，特异性引物序列为：Inf A，SEQ ID NO.1~2；H1N1（2009），SEQ ID NO.3~4；、H3N2，SEQ ID NO.5~6；HPIV1，SEQ ID NO.7~8；HPIV2，SEQ ID NO.9~10；HPIV3，SEQ IDNO.11~12；HPIV4，SEQ ID NO.13~14； hMPV，SEQ ID NO.15~16； AdV，SEQ ID NO.17~18；RSV，SEQ ID NO.19~20；BoV，SEQ ID NO.21~22；CoV，SEQ ID NO.23~24；通用引物序列为：SEQ ID NO.25~26。

2.根据权利要求1所述的一种12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述通用引物在扩增体系中的终浓度为800nM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为60nM。

3.根据权利要求1 所述的一种12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组份为：引物混合物、阳性对照品、阴性对照品、热启动DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、PCR反应缓冲液及DEPC水，所述的引物混合物为通用引物和特异性引物组合而成的嵌合引物的混合物。