CN102732638A - 人冠状病毒oc43、229e、nl63、hku1和sars一管多重荧光pcr检测方法及其引物、探针和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人冠状病毒五种型别的一管多重荧光PCR检测方法，该方法采用了序列如SEQ ID NO：1-10所示的引物，还采用了序列如SEQ ID NO：11-15所示的探针。本发明还提供了包含上述引物和探针的人冠状病毒五种型别的一管多重荧光PCR检测试剂盒。本发明采用自身设计的OC43、229E、NL63、HKU1、SARS特异引物及Taqman探针，使用TAMRA/CY5/FAM/ROX/JOE多重荧光素标记，实现对人冠状病毒五种型别的一管多重检测，具有特异性强、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低廉等多种优点，可作为检测试剂用于科研及临床。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体是人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别的一管多重荧光定量PCR检测方法及其引物、探针和试剂盒。
背景技术
人冠状病毒(human coronavirus virus，HCOV)是单链正义RNA病毒，属冠状病毒科。病毒为多形态，略呈球形。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein)，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点；小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein)较小，与包膜结合的蛋白；膜糖蛋白(M，Membrane Protein)，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成。
冠状病毒是成人普通感冒的主要病原之一，在儿童可以引起上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道。冠状病毒感染的潜伏期一般为2至5天，平均为3天。典型的冠状病毒感染呈流涕、不适等感冒症状。不同型别病毒的致病力不同，引起的临床表现也不尽相同，OC43和229E是引起人类普通感冒的主要病原体，OC43株引起的症状一般比229E病毒严重。NL63感染病人通常出现较温和的症状，但在感染小儿可出现严重的下呼吸道症状，该病毒在特定人群中危害严重。HKU1表现为细支气管炎和肺炎，多伴有基础疾病，尤其是呼吸道和心血管系统疾病。SARS可引起肺炎，并且容易引发严重急性呼吸综合症。
鉴于人类冠状病毒所造成的严重呼吸道疾病，特别是儿童，这就需要医疗机构提供准确快速灵敏的检测方法，快速诊断治疗，以达到控制疾病防止其流行的目的。目前，冠状病毒的诊断方法主要有以下几种：(1)病毒的培养分离；(2)血清学检测特异的IgG及IgM；(3)RT-PCR方法及荧光定量PCR方法。前两种方法都是早期开发的经典方法，PCR方法是针对病原体核酸的检测方法，克服了前面两种方法中存在的周期长、灵敏度不高的问题，特别是荧光定量PCR方法的引进，解决了PCR方法容易产生假阳性的问题，使其得到了快速的发展，该方法具有高特异性、高灵敏度、周期短、操作简单、成本低等多种优点。如中国专利申请CN03142615公开的“一种SARS冠状病毒荧光分子信标PCR检测技术”，是在S A R S-C o v的表面刺突蛋白基因区域设计一对基因扩增引物，在上下游引物中间设计一条荧光分子信标探针。此技术采用逆转录P C R的方法检测靶基因片段，适用于定性、定量检测标本中的S A R S-C o v R N A。
但目前开发的冠状病毒分型试剂基本都为单重荧光定量PCR检测试剂，不能对人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别进行同时检测；如要同时检测，也需要分别在5管中进行，其操作繁琐、费时耗力。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SAARS五种型别的一管多重荧光PCR检测方法，以改进目前现有方法，从而使检测达到灵敏、快速、准确、节约材料和试剂的目的。
本发明的人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别一管多重荧光PCR检测方法包括样品核酸的制备和多重PCR扩增步骤，其中，多重PCR扩增步骤中采用了序列如下所示的引物(见序列表SEQ ID NO：1-10所示序列)：
CoVOC43-F：CGATGAGGCTATTCCGACTAGGT
CoVOC43-R：CCTTCCTGAGCCTTCAATATAGTAACC
CoV229E-F：CAGTCAAATGGGCTGATGCA
CoV229E-R：AAAGGGCTATAAAGAGAATAAGGTATTCT
CoVNL63-F：GACCAAAGCACTGAATAACATTTTCC
CoVNL63-R：ACCTAATAAGCCTCTTTCTCAACCC
CoVHKU1-F：CCTTGCGAATGAATGTGCT
CoVHKU1-R：TTGCATCACCACTGCTAGTACCAC
CoVSARS-F：GTTTATCACCCGCGAAGAAG
CoVSARS-R：TCTCTAGTTGCATGACAGCCCT
其中引物CoVOC43-F和CoVOC43-R用来检测OC43型冠状病毒，我们称之为OC43组引物；引物CoV229E-F和CoV229E-R用来检测229E型冠状病毒，我们称之为229E组引物；引物CoVNL63-F和CoVNL63-R用来检测NL63型冠状病毒，我们称之为NL63组引物；引物CoVHKU1-F和CoVHKU1-R用来检测HKU1型冠状病毒，我们称之为HKU1组引物；引物CoVSARS-F和CoVSARS-R用来检测SARS型冠状病毒，我们称之为SARS组引物。
所述多重PCR扩增步骤中还采用了序列如SEQ ID NO：11-15所示的探针。
更优选，上述方法中还采用了如下序列所示的荧光探针：
CoVOC43-probe：TAMRA-TCCGCCTGGCACGGTACTCCCT-BHQ2
CoV229E-probe：Cy5-CCCTGACGACCACGTTGTGGTTCA-BHQ3
CoVNL63-probe：FAM-AACACGCT“T”CCAACGAGGTTTCTTCAACTGAG-phosphate其中“T”标记BHQ1
CoVHKU1-probe：ROX-TGTGTGGCGGTTGCTATTATGTTAAGCCTG-BHQ2
CoVSARS-probe：JOE-GCTCGTGCGTGGATTGGCTTTGAT-BHQ1
其中，CoVOC43-probe是用来检测OC43型冠状病毒的探针；CoV229E-probe是用来检测229E型冠状病毒的探针；CoVNL63-probe是用来检测NL63型冠状病毒的探针；CoVHKU1-probe是用来检测HKU1型冠状病毒的探针；CoVSARS-probe是用来检测SARS型冠状病毒的探针。上述5种荧光标记的探针在本发明中被称之为TAMRA/CY5/FAM/ROX/JOE多重荧光素标记探针。
本发明中采用一管多重方式检测人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS时，将上述OC43、229E、NL63、HKU1、SARS组引物和5种Taqman探针混合在一个反应管中，使用‘Bio-Rad iQ TMSupermix试剂盒’中的iQ Supermix进行性试剂配制，其中各引物的使用量为3-5pmol，各探针的使用量为5-10pmol。反应总体积为20ul，其中配制试剂体积18ul/反应，预留2ul用于添加cDNA模板，该方法的条件为94℃5min，94℃15s，55℃1min，共45个循环。更需要说明的是，本发明所说的一管多重方式包括在同一管内同时检测人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS任意一种或几种病毒。
本发明之二是提供了用于人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别PCR检测的引物，所述引物序列选自与如SEQ ID NO：1-10所示的序列中的至少一种相同、相似或互补的序列。
本发明之三是提供了用于人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别PCR检测的探针，所述探针能与上述的引物扩增得到的核酸序列杂交的序列。
作为优选，所述探针选自序列如SEQ ID NO：11-15所示的序列中的至少一种相同、相似或互补的序列。
更优选，所述探针为以下探针中的至少一种：
CoVOC43-probe：TAMRA-TCCGCCTGGCACGGTACTCCCT-BHQ2
CoV229E-probe：Cy5-CCCTGACGACCACGTTGTGGTTCA-BHQ3
CoVNL63-probe：FAM-AACACGCT“T”CCAACGAGGTTTCTTCAACTGAG-phosphate其中“T”标记BHQ1
CoVHKUl-probe：ROX-TGTGTGGCGGTTGCTATTATGTTAAGCCTG-BHQ2
CoVSARS-probe：JOE-GCTCGTGCGTGGATTGGCTTTGAT-BHQ1
本发明之四是提供了一种人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别的一管多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含如下引物(见序列表SEQ IDNO：1-10)
CoVOC43-F：CGATGAGGCTATTCCGACTAGGT
CoVOC43-R：CCTTCCTGAGCCTTCAATATAGTAACC
CoV229E-F：CAGTCAAATGGGCTGATGCA
CoV229E-R：AAAGGGCTATAAAGAGAATAAGGTATTCT
CoVNL63-F：GACCAAAGCACTGAATAACATTTTCC
CoVNL63-R：ACCTAATAAGCCTCTTTCTCAACCC
CoVHKU1-F：CCTTGCGAATGAATGTGCT
CoVHKU1-R：TTGCATCACCACTGCTAGTACCAC
CoVSARS-F：GTTTATCACCCGCGAAGAAG
CoVSARS-R：TCTCTAGTTGCATGACAGCCCT
所述试剂盒还包含如下的荧光标记探针
CoVOC43-probe：TAMRA-TCCGCCTGGCACGGTACTCCCT-BHQ2
CoV229E-probe：Cy5-CCCTGACGACCACGTTGTGGTTCA-BHQ3
CoVNL63-probe：FAM-AACACGCT“T”CCAACGAGGTTTCTTCAACTGAG-phosphate其中“T”标记BHQ1
CoVHKU1-probe：ROX-TGTGTGGCGGTTGCTATTATGTTAAGCCTG-BHQ2
CoVSARS-probe：JOE-GCTCGTGCGTGGATTGGCTTTGAT-BHQ1
与现有技术相比，本发明采用自身设计的OC43/229E/NL63/HKU1/SARS特异引物及Taqman探针，使用TAMRA/CY5/FAM/ROX/JOE多重荧光素标记，实现对人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS五种型别的一管多重检测，具有特异性强、灵敏度高、快速、操作简单方便、节约耗材，成本低廉等多种优点，可作为人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS检测的试剂，用于科研及临床，包括对人冠状病毒的流行病学研究等方面。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下例实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1：引物、探针特异性实验
运用生物信息学和设计引物探针的生物软件对现有数据库中的人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS的序列资料进行比对分析后，设计了如表1所示的引物和探针，以实现人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS五种型别的一管多重荧光PCR检测。表1为人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS引物及探针序列。
表1人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS引物及探针序列
为验证所设计的引物和探针的特异性，首先设计单重荧光PCR反应，对引物和探针进行评估，即分别检测OC43、229E、NL63、HKU1、SARS五组引物探针单独检测的特异性。实验采用培养的阳性株进行，阳性株来源于中山大学粤港联合实验室和中山大学热带病防治研究教育部重点实验室。分别选择冠状病毒(OC43)、冠状病毒(229E)、冠状病毒(NL63)、冠状病毒(HKU1)、冠状病毒(SARS)、流感A型(FluA)、流感B型(FluB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、偏肺病毒(HMPV)、副流感病毒(PIV-1)、副流感病毒(PIV-2)、副流感病毒(PIV-3)各2株。实验分别取100ul上述培养物标本，通过常规RNA/DNA提取方法，得到50ul核酸产物。使用Fermentas‘RevertAidTMFirst S trandcDNA SynthesisKit’(cDNA第一链合成试剂盒)将冠状病毒(OC43)、冠状病毒(229E)、冠状病毒(NL63)、冠状病毒(HKU1)、冠状病毒(SARS)、流感A型(FluA)、流感B型(FluB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、偏肺病毒(HMPV)、副流感病毒(PIV-1)、副流感病毒(PIV-2)、副流感病毒(PIV-3)的RNA逆转录为cDNA(腺病毒为DNA病毒不需做逆转录，其核酸可直接用于实验)，再使用‘Bio-Rad iQ TMSupermix试剂盒’中的iQ Supermix进行试剂配制，其中加入表1中的各引物的量为3-5pmol，加入表1中的各探针的量为5-10pmol，配制试剂体积18ul/反应，即在八排管中分别加入18ul 5种人冠状病毒各单重反应液，预留2ul用于添加cDNA模板，反应总体积为20ul，最后放置于荧光定量PCR仪中反应，反应条件如下：94℃5min，热循环为94℃15s，55℃1min，共45个循环。表2为引物探针的单重反应的特异性检测结果。
表2引物探针的单重反应的特异性检测结果
| 样品编号 | OC43 | 229E | NL63 | HKU1 | SARS |
| OC43 | 27.51 | ||||
| OC43 | 25.22 | ||||
| 229E | 30.32 | ||||
| 229E | 31.56 | ||||
| NL63 | 28.19 | ||||
| NL63 | 27.43 | ||||
| HKU1 | 30.01 | ||||
| HKU1 | 29.08 | ||||
| SARS | 25.67 | ||||
| SARS | 26.90 | ||||
| FluA | |||||
| FluA | |||||
| FluB | |||||
| FluB | |||||
| RSV | |||||
| RSV | |||||
| ADV | |||||
| ADV | |||||
| HMMPV | |||||
| HMMPV | |||||
| PIV-1 | |||||
| PIV-1 |
| PIV-2 | |||||
| PIV-2 | |||||
| PIV-3 | |||||
| PIV-3 | |||||
| DEPC水 | |||||
| DEPC水 |
表2的实验结果表明，利用本发明的引物探针对阳性培养物进行对照检测筛查，所设计的引物探针特异性高，与其他常见呼吸道病原体，包括流感A型、流感B型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、偏肺病毒、副流感病毒PIV-1\PIV-1\PIV-3无交叉反应，OC43、229E、NL63、HKU1、SARS之间亦无交叉反应，检测方法特异性高。
实施例2：人冠状病毒多种检测试剂的特异性实验
多重检测试剂使用Fermentas‘RevertAidTMFirst Strand cDNA SynthesisKit’(cDNA第一链合成试剂盒)将冠状病毒(OC43)、冠状病毒(229E)、冠状病毒(NL63)、冠状病毒(HKU1)、冠状病毒(SARS)的RNA逆转录为cDNA，再使用‘Bio-Rad iQ TMSupermix试剂盒’中的iQ Supermix进行试剂配制，将表1中的人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS的引物及探针配制为一管反应液，配制试剂体系为18ul/反应，各引物的量为3-5pmol，各探针的量为5-10pmol，预留2ul用于添加cDNA模板，反应总体积为20ul。
分别使用单阳性模板(OC43、229E、NL63、HKU1、SARS)、双阳性模板(OC43和229E混合、OC43和NL63混合，OC43和HKU1混合，OC43和SARS混合，229E和NL63混合，229E和HKU1混合，229E和SARS混合，NL63和HKU1混合，NL63和SARS混合，HKU1和SARS混合)、三阳性模板(OC43、229E和NL63混合，OC43、NL63和HKU1混合，OC43、HKU1和SARS混合，229E、NL63和HKU1混合，229E、HKU1和SARS混合，NL63、HKU1和SARS混合)、四阳性模板(OC43、229E、NL63和HKU1混合，229E、NL63、HKU1和SARS混合)、五阳性模板(OC43、229E、NL63、HKU1和SARS混合)对多重检测试剂进行试验，同时使用单重荧光PCR试剂进行对比。实验结果见表3，表3是各种模板情况下多重人冠状病毒检测试剂与单重检测的对比结果表。
表3各种模板情况下多重人冠状病毒检测试剂与单重检测的对比结果表
从表3的实验数据可看出，多重检测试剂的特异性与单重相比基本没有什么差异，同时从CT值的表现来看，多重人冠状病毒试剂与单重检测基本一致甚至优于单检试剂。
实例3：人冠状病毒多重检测试剂的灵敏性实验
为进一步检验试剂的灵敏性，对人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS阳性样品进行10倍梯度稀释，为稀释梯度1至5，分别表示OC43、229E、NL63、HKU1、SARS稀释10至105倍，分别用多重人冠状病毒检测试剂与单重检测进行对比。表4为多重及单重人冠状病毒定量PCR检测试剂对10倍梯度稀释的病毒的对比实验结果数据表
表4
从上面的实验结果，根据其稀释的倍数分别做标准曲线，得出各自的线性关系都在0.99以上，线性较好，多重人冠状病毒检测试剂可代替单重检测，而不影响实验结果。
实施例4：多重人冠状病毒试剂临床标本检测实验
使用单重和多重人冠状病毒定量PCR检测试剂同时对932份咽拭子临床标本(标本来源于中山大学第三附属医院)，检测OC43阳性2株，229E阳性1株，NL63阳性10株，HKU1阳性3株，SARS阳性0株。结果见下表。表5表示932份临床呼吸道咽拭子样品使用单重和多重检测的结果
表5
从上面的实验表明，本发明所研发的一管多重人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS检测试剂，可用于科研及临床工作，达到灵敏、快速、准确、节约的检测人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS的目的。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别的一管多重荧光PCR检测方法，包括样品核酸制备和多重PCR扩增步骤，其特征在于，所述多重PCR扩增步骤中采用了序列如SEQ ID NO：1-10所示的引物。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增步骤中还采用了序列如SEQ ID NO：11-15所示的探针。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增步骤中还采用了如下荧光标记的探针：
CoVOC43-probe：TAMRA-TCCGCCTGGCACGGTACTCCCT-BHQ2
CoV229E-probe：Cy5-CCCTGACGACCACGTTGTGGTTCA-BHQ3
CoVNL63-probe：FAM-AACACGCT“T”CCAACGAGGTTTCTTCAACTGAG-phosphate其中“T”标记BHQ1
CoVHKU1-probe：ROX-TGTGTGGCGGTTGCTATTATGTTAAGCCTG-BHQ2
CoVSARS-probe：JOE-GCTCGTGCGTGGATTGGCTTTGAT-BHQ1
4.用于人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别PCR检测的引物，其特征在于，所述引物序列选自与SEQ ID NO：1-10所示的序列中的至少一种相同、相似或互补的序列。
5.用于人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别PCR检测的探针，其特征在于，所述探针是能与权利要求4所述的引物扩增得到的核酸序列杂交的序列。
6.根据权利要求5所述的探针，其特征在于，所述探针选自序列如SEQ IDNO：11-15所示的序列中的至少一种相同、相似或互补的序列。
7.根据权利要求5所述的探针，其特征在于，所述探针为以下探针中的至少一种：
CoVOC43-probe：TAMRA-TCCGCCTGGCACGGTACTCCCT-BHQ2
CoV229E-probe：Cy5-CCCTGACGACCACGTTGTGGTTCA-BHQ3
CoVNL63-probe：FAM-AACACGCT“T”CCAACGAGGTTTCTTCAACTGAG-phosphate其中“T”标记BHQ1
CoVHKU1-probe：ROX-TGTGTGGCGGTTGCTATTATGTTAAGCCTG-BHQ2
CoVSARS-probe：JOE-GCTCGTGCGTGGATTGGCTTTGAT-BHQ1
8.人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别的一管多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含序列如SEQ ID NO：1-10所示引物。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含如下荧光标记的探针：
CoVOC43-probe：TAMRA-TCCGCCTGGCACGGTACTCCCT-BHQ2
CoV229E-probe：Cy5-CCCTGACGACCACGTTGTGGTTCA-BHQ3
CoVNL63-probe：FAM-AACACGCT“T”CCAACGAGGTTTCTTCAACTGAG-phosphate其中“T”标记BHQ1
CoVHKU1-probe：ROX-TGTGTGGCGGTTGCTATTATGTTAAGCCTG-BHQ2
CoVSARS-probe：JOE-GCTCGTGCGTGGATTGGCTTTGAT-BHQ1。
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