CN113493856A

CN113493856A - 一种用于冠状病毒检测分型的多重rt-pcr试剂盒、方法及引物组

Info

Publication number: CN113493856A
Application number: CN202010254818.1A
Authority: CN
Inventors: 余丁; 朱浩威; 卢文波; 李贵霞; 张迪骏; 余道福; 张�成; 王伟建; 章壮; 吴勇
Original assignee: Ningbo Health Gene Technologies Co ltd; Ningbo Women and Children Hospital
Current assignee: Ningbo Health Gene Technologies Co ltd; Ningbo Women and Children Hospital
Priority date: 2020-04-02
Filing date: 2020-04-02
Publication date: 2021-10-12
Anticipated expiration: 2040-04-02
Also published as: CN113493856B

Abstract

本发明公开了一种用于冠状病毒检测并分型的多重RT‑PCR试剂盒、使用方法及其专用的引物组，该试剂盒采用单管多重反转录PCR结合毛细电泳片段分析方法针对人呼吸道样本检测并区分人易感冠状病毒，包括2019新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)、人冠状病毒229E(HCoV‑229E)、人冠状病毒NL63(HCoV‑NL63)、人冠状病毒HKU1(HCoV‑HKU1)、人冠状病毒OC43(HCoV‑OC43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS‑CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS‑CoV)。本发明的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP‑UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。

Description

一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR试剂盒、方法及引物组

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测技术领域，具体涉及一种针对人呼吸道样本进行七种人易感冠状病毒检测并分型的多重RT-PCR试剂盒及其使用方法以及专用的引物组合。

背景技术

冠状病毒属于巢状病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，因电镜下病毒颗粒形式类似于王冠而得名，能感染从哺乳动物到禽类等一大批脊椎动物，到目前为止共发现七种能够感染人体的冠状病毒，分别为 2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。在这七种冠状病毒种，HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、HCoV-OC43 呈全球性分布及在人群中普遍存在，通常引起呼吸道感染，特别是婴幼儿，临床症状为发热，流涕，咳嗽等，严重者可能出现毛细支气管肺炎，肺炎，喉炎等症状。SARS-CoV于2003年爆发，共造成全球 8422人感染，916人死亡，临床症状为严重的急性呼吸道感染导致呼吸衰竭并最终导致死亡。MERS-CoV于2012年及2015年呈现地域性流行趋势，在26个国家中共有1618人感染，579人死亡，临床症状为重症呼吸道感染导致的肾功能衰竭而死亡。截止2020年3月， SARS-CoV-2在全球范围内已有10余万人感染，其中死亡4000多人，主要临床表现为发热、乏力、干咳、呼吸困难等，部分患者病症轻微，可无发热，但也出现少量重症患者，其表现为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒及出凝血功能障碍等。

由于针对不同冠状病毒感染患者的诊疗方式存在本质区别，使得冠状病毒分型具有潜在临床价值，特别是在SARS-CoV-2爆发期间，通过冠状病毒分型检测将不同感染源的患者进行分流，集中医疗资源对SARS-CoV-2感染者进行针对性治疗，有助于提升治愈率，同时阻止疫情蔓延。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR试剂盒及其使用方法以及专用的引物组合，该试剂盒采用单管多重RT-PCR同时检测 SARS-CoV-2S基因和ORF1ab基因、HCoV-NL63 ORF1ab基因、 SARS-CoVORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-229E ORF1ab基因、MERS-CoV ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因和人内参B2M基因，区分呼吸道样本中不同型别的冠状病毒。本发明的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

本发明所提供的一种用于冠状病毒分型的多重RT-PCR检测试剂盒包含RT-PCR反应液、引物组、RT-PCR酶液、阳性对照以及阴性对照。其中RT-PCR反应液包括多重RT-PCR反应所需的dNTPs、 dUTP、Mg²⁺、缓冲液(表1)。

表1 RT-PCR反应液试剂组成(50人份)

其中引物组包含用于扩增SARS-CoV-2S基因和ORF1ab基因、 HCoV-NL63 ORFlab基因、SARS-CoV ORFlab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-229E ORF1ab基因、MERS-CoVORF1ab基因、 HCoV-OC43 ORF1ab基因和人内参B2M基因的引物，引物序列信息如表2所示，引物组组成如表3所示。由上述正反向引物和衍生序列也属于本发明内容，所述衍生序列是指在SEQ ID NO：1～18的基础上，在序列的5’端或3’端添加或减少一个或多个碱基得到的序列。

表2 用于冠状病毒分型的引物序列

表3 引物组组成(50人份)

所述引物组中，用于扩增SARS-CoV-2S基因的正向引物，如SEQ ID NO：1所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增SARS-CoV-2 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：3所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增HCoV-NL63 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ IDNO：5所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增SARS-CoV ORF1ab基因的正向引物，如SEQID NO：7所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增HCoV-HKU1 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：9所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增HCoV-229E ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：11所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增MERS-CoV ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：13所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增HCoV-OC43ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：15所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于检测人内参B2M基因的正向引物，如SEQ ID NO：17所示的5’端添加荧光报告基团FAM。

其中RT-PCR酶液中包含逆转录酶、热启动DNA聚合酶和UNG 酶，其组分配比详见表4。

表4 RT-PCR酶液各组分配比(50人份)

其中阳性对照为包含SARS-CoV-2S基因和ORF1ab基因、 HCoV-NL63 ORF1ab基因、SARS-CoV ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-229E ORF1ab基因、MERS-CoV ORF1ab基因、 HCoV-OC43 ORF1ab基因和人内参B2M基因序列的重组质粒；所述冠状病毒分型检测阴性对照为RNase-free H₂O。

进一步地，所述试剂盒的检测方法为通过对人呼吸道样本进行采集和RNA提取，配制扩增反应体系后进行多重反转录PCR扩增，并对获得的扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳图谱进行冠状病毒分型判断；具体使用方法包括以下步骤：

(1)采用核酸自动提取仪对采集的呼吸道样本进行RNA提取；

(2)根据表5在8联管中配制RT-PCR反应体系；

表5 RT-PCR反应体系(单次反应)

(3)将配制好的体系振荡、混匀、离心后置于PCR仪上，按照表6程序进行RT-PCR扩增；

表6 RT-PCR扩增程序

(4)准备电泳样品，每个电泳孔分别加入Hi-Di 8.7μL，SIZE-500 0.3μL，RT-PCR产物1μL，混匀后离心备用；

(5)毛细管电泳分离样品，将样品板置于3500DX基因分析仪中，选择“fragment”电泳方法，进行电泳，具体操作方法详见3500DX 操作说明书；

(6)结果分析。当特征靶点的峰高大于等于500RFU，判定为阳性结果，并判断冠状病毒型别；当特征靶点的峰高小于等于300 RFU，判定为阴性结果；当特征靶点的峰高大于300RFU并小于500 RFU时，判定为灰区，需重新取样并再次检测，若结果为阳性或灰区，则判定为阳性结果，并判断冠状病毒型别，否则判定为阴性结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种用于冠状病毒分型的多重RT-PCR试剂盒及其使用方法以及专用的引物组合，该试剂盒采用单管多重RT-PCR同时检测SARS-CoV-2S基因和ORF1ab基因、HCoV-NL63 ORF1ab基因、 SARS-CoV ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-229EORF1ab基因、MERS-CoV ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因和人内参B2M基因，区分呼吸道样本中不同型别的冠状病毒。本发明的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。

附图说明

图1为冠状病毒分型检测试剂盒阳性对照检测结果。

图2为冠状病毒分型检测试剂盒阳性样本A检测结果。

图3为冠状病毒分型检测试剂盒阳性样本B检测结果。

图4为冠状病毒分型检测试剂盒阳性样本C检测结果。

图5为冠状病毒分型检测试剂盒阳性样本D检测结果。

图6为冠状病毒分型检测试剂盒阳性样本E检测结果。

图7为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本F检测结果。

图8为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本G检测结果。

图9为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本H检测结果。

图10为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本I检测结果。

图11为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本J检测结果。

图12为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本K检测结果。

图13为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本L检测结果。

图14为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本M检测结果。

图15为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本N检测结果。

图16为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本O检测结果。

图17为冠状病毒分型检测试剂盒阴性样本P检测结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1～3所述冠状病毒分型检测试剂盒中的RT-PCR反应液试剂组成如表1所示，引物序列如表2所示，引物组组成如表3所示， RT-PCR酶液各组分配比如表4所示；所述引物组中，用于扩增 SARS-CoV-2S基因的正向引物，如SEQ ID NO：1所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增SARS-CoV-2 ORF1ab基因的正向引物，如 SEQ ID NO：3所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增 HCoV-NL63 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：5所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增SARS-CoV ORF1ab基因的正向引物，如SEQ IDNO：7所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增 HCoV-HKU1 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：9所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增HCoV-229E ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：11所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增 MERS-CoV ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：13所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于扩增HCoV-OC43ORFlab基因的正向引物，如SEQ IDNO：15所示的5’端添加荧光报告基团FAM；用于检测人内参B2M基因的正向引物，如SEQ ID NO：17所示的5’端添加荧光报告基团FAM。

实施例1

本实施例应用冠状病毒分型检测试剂盒检测阳性对照，包括如下步骤：

(1)根据表5配制RT-PCR反应体系，并加入5μL阳性对照，配制完成后将反应管瞬时离心10s，并竖直置于冰上；

(2)将反应管置于PCR仪中，根据表6设定程序并开始RT-PCR 反应；

(3)准备电泳样品，每个电泳孔分别加入Hi-Di 8.7μL，SIZE-500 0.3μL，PCR产物1μL，混匀后离心备用；

(4)毛细管电泳分离样品，将样品板置于3500DX基因分析仪中，选择“fragment”电泳方法，进行电泳，具体操作方法详见3500DX操作说明书；

(5)毛细管电泳结果如图1所示，冠状病毒分型检测试剂盒对阳性对照扩增良好，扩增产物长度与预期长度一致，各个产物和引物间无明显干扰。

实施例2

本实施例应用冠状病毒分型检测试剂盒检测呼吸道阳性样本，包括如下步骤：

(1)收集临床呼吸道阳性样本，具体样本信息详见表7；

表7 呼吸道阳性样本信息

样本编号	冠状病毒感染型别	确诊方法
			A	SARS-CoV-2	qPCR
B	HCoV-OC43	测序
			C	HCoV-NL63	测序
D	HCoV-229E	测序
			E	HCoV-HKU1	测序

(2)使用核酸提取试剂在全自动核酸提取仪上同时对呼吸道样本A/B/C/D/E进行RNA提取，将完成提取的核酸样本置于-20℃保存；

(3)根据表5配制RT-PCR反应体系，配制完成后将反应管瞬时离心10s，并竖直置于冰上；

(4)将反应管置于PCR仪，根据表6设定程序并开始RT-PCR反应；

(5)准备电泳样品，每个电泳孔分别加入Hi-Di 8.7μL，SIZE-500 0.3μL，PCR产物1μL，混匀后离心备用；

(6)毛细管电泳分离样品，将样品板置于3500DX基因分析仪中，选择“fragment”电泳方法，进行电泳，具体操作方法详见3500DX操作说明书；

(7)结果分析。冠状病毒分型检测试剂盒对样本A的检测结果 (图2)表明，感染样本A的冠状病毒型别为SARS-CoV-2，与qPCR 检测结果一致；样本B的检测结果(图3)表明，感染样本B的冠状病毒型别为HCoV-OC43，与测序结果一致；样本C的检测结果(图4) 表明，感染样本C的冠状病毒型别为HCoV-NL63，与测序结果一致；样本D的检测结果(图5)表明，感染样本D的冠状病毒型别为 HCoV-229E，与测序结果一致；样本E的检测结果(图6)表明，感染样本E的冠状病毒型别为HCoV-HKU1，与测序结果一致。上述结果表明，冠状病毒分型检测试剂盒对临床样本同样具有非常好的分型效果，能够针对呼吸道样本区分冠状病毒型别。

实施例3

本实施例应用冠状病毒分型检测试剂盒检测其他常见呼吸道病毒感染样本，包括如下步骤：

(1)收集临床呼吸道阳性样本，具体样本信息详见表8；

表8 其他常见呼吸道病原体感染样本信息

(2)使用核酸提取试剂在全自动核酸提取仪上同时对呼吸道样本F/G/H/I/J/K/L/M/N/O/P进行RNA提取，将完成提取的核酸样本置于 -20℃保存；

(4)将反应管置于PCR仪，根据表6设定程序并开始RT-PCR反应；

(7)结果分析。如图7～图17所示，冠状病毒分型检测试剂盒对其他常见呼吸道病毒具有较好的特异性，在RT-PCR过程中不会因为非特异性扩增而造成假阳性结果的出现。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波海尔施基因科技有限公司、宁波市妇女儿童医院

<120> 一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR试剂盒、方法及引物组

<130> 2020-03-27

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

cggccttact gttttgccac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

ctgcaccaaa ggtccaacca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

agtgggggac aaccaatcac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

acagacaaca cgatgcacca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

gcaacgttct gtcgttgtgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

cctgaaaacc ttgtgcagcg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

cagtcttgca ggctgtaggt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

acatcacaac ctggggcatt 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 9

gctaatggtg gtactggttt ttgt 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 10

acacgctgtc catctctatc at 22

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 11

tgttgacaaa tgggatgatt tttgc 25

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 12

tcaacgactt aagccagtct ct 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 13

ggaggtacca gtagcggaga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 14

agcaaacgac accgtcatca 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 15

tgttgttgga cctgatgcga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 16

ttaaaggaaa gacgcgctgc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 17

cctggaggct atccagcgta 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 18

tgcttacatg tctcgatccc a 21

Claims

1.一种用于冠状病毒检测分型的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于扩增SARS-CoV-2 S基因和ORF1ab基因、HCoV-NL63 ORF1ab基因、SARS-CoV ORF1ab基因、HCoV-HKU1ORF1ab基因、HCoV-229E ORF1ab基因、MERS-CoV ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因和人内参基因B2M的引物。

2.如权利要求1所述的一种用于冠状病毒检测分型的引物组，其特征在于，

所述用于扩增SARS-CoV-2 S基因的正向引物序列为5’-CGGCCTTACTGTTTTGCCAC-3’，如SEQ ID NO：1所示，反向引物序列为5’-CTGCACCAAAGGTCCAACCA-3’，如SEQ ID NO：2所示；

所述用于扩增SARS-CoV-2 ORF1ab基因的正向引物序列为5’-AGTGGGGGACAACCAATCAC-3’，如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列为5’-ACAGACAACACGATGCACCA-3’，如SEQ ID NO：4所示；

所述用于扩增HCoV-NL63 ORF1ab基因的正向引物序列为5’-GCAACGTTCTGTCGTTGTGG-3’，如SEQ ID NO：5所示，反向引物序列为5’-CCTGAAAACCTTGTGCAGCG-3’，如SEQ ID NO：6所示；

所述用于扩增SARS-CoV ORF1ab基因的正向引物序列为5’-CAGTCTTGCAGGCTGTAGGT-3’，如SEQ ID NO：7所示，反向引物序列为5’-ACATCACAACCTGGGGCATT-3’，如SEQ ID NO：8所示；

所述用于扩增HCoV-HKU1 ORF1ab基因的正向引物序列为5’-GCTAATGGTGGTACTGGTTTTTGT-3’，如SEQ ID NO：9所示，反向引物序列为5’-ACACGCTGTCCATCTCTATCAT-3’，如SEQ ID NO：10所示；

所述用于扩增HCoV-229E ORF1ab基因的正向引物序列为5’-TGTTGACAAATGGGATGATTTTTGC-3’，如SEQ ID NO：11所示，反向引物序列为5’-TCAACGACTTAAGCCAGTCTCT-3’，如SEQ ID NO：12所示；

所述用于扩增MERS-CoV ORF1ab基因的正向引物序列为5’-GGAGGTACCAGTAGCGGAGA-3’，如SEQ ID NO：13所示，反向引物序列为5’-AGCAAACGACACCGTCATCA-3’，如SEQ ID NO：14所示；

所述用于扩增HCoV-OC43 ORF1ab基因的正向引物序列为5’-TGTTGTTGGACCTGATGCGA-3’，如SEQ ID NO：15所示，反向引物序列为5’-TTAAAGGAAAGACGCGCTGC-3’，如SEQ ID NO：16所示；

所述用于扩增人内参B2M基因的正向引物序列为5’-CCTGGAGGCTATCCAGCGTA-3’，如SEQID NO：17所示，反向引物序列为5’-TGCTTACATGTCTCGATCCCA-3’，如SEQ ID NO：18所示。

3.如权利要求2所述的一种用于冠状病毒检测分型的引物组，其特征在于，

所述用于扩增SARS-CoV-2 S基因的正向引物，如SEQ ID NO：1所示的5’端添加荧光报告基团FAM；

所述用于扩增SARS-CoV-2 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：3所示的5’端添加荧光报告基团FAM；

所述用于扩增HCoV-NL63 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：5所示的5’端添加荧光报告基团FAM；

所述用于扩增SARS-CoV ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：7所示的5’端添加荧光报告基团FAM；

所述用于扩增HCoV-HKU1 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：9所示的5’端添加荧光报告基团FAM；

所述用于扩增HCoV-229E ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：11所示的5’端添加荧光报告基团FAM；

所述用于扩增MERS-CoV ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：13所示的5’端添加荧光报告基团FAM；

所述用于扩增HCoV-OC43 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：15所示的5’端添加荧光报告基团FAM；

所述用于检测人内参B2M基因的正向引物，如SEQ ID NO：17所示的5’端添加荧光报告基团FAM。

4.一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RT-PCR反应液、如权利要求1～3任意一项所述的引物组、RT-PCR酶液、阳性对照和阴性对照。

5.如权利要求4所述的一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液包括多重RT-PCR反应所需的dNTPs、dUTP、Mg²⁺、缓冲液。

6.如权利要求4所述的一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR酶液包括UNG酶、反转录酶和热启动DNA聚合酶。

7.如权利要求4所述的一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为包括SARS-CoV-2S基因和ORF1ab基因、HCoV-NL63 ORF1ab基因、SARS-CoV ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-229E ORF1ab基因、MERS-CoV ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因和人内参B2M基因序列的重组质粒；所述阴性对照为RNase-freeH₂O。

8.一种用于非疾病诊断目的的冠状病毒检测分型的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，通过对人呼吸道样本进行采集和RNA提取，应用如权利要求4～7任意一项所述的一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR试剂盒配制反应体系后进行多重RT-PCR扩增，并将产物进行毛细管电泳，根据电泳图谱作出分型判断。

9.如权利要求8所述的一种用于非疾病诊断目的的冠状病毒检测分型的多重RT-PCR检测方法其特征在于扩增体系包括10μL所述RT-PCR反应液、4μL所述引物组、1μL所述RT-PCR酶液、5μL待检测的RNA样本或5μL阴/阳性对照。

10.如权利要求8所述的一种用于非疾病诊断目的的冠状病毒检测分型的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，扩增程序为：25℃5min；50℃15min；95℃2min；94℃30s，65℃→60℃30s，每次循环降低1℃，72℃1min，循环6次；94℃30s，60℃30s，72℃1min，循环29次；72℃10min；4℃保持至扩增结束。

11.如权利要求8所述的一种用于非疾病诊断目的的冠状病毒检测分型的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，分型判断标准为：当特征靶点的峰高大于等于500RFU，判定为阳性结果，并判断冠状病毒型别；当特征靶点的峰高小于等于300RFU，判定为阴性结果；当特征靶点的峰高大于300RFU并小于500RFU时，判定为灰区，需重新取样并再次检测，若结果为阳性或灰区，则判定为阳性结果，并判断冠状病毒型别，否则判定为阴性结果。