CN103710462A - 冠状病毒hku1实时荧光pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法 - Google Patents

冠状病毒hku1实时荧光pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法 Download PDF

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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明公开了一种冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法，在HCoV-HKU1基因的保守区域设计引物及Taqman MGB探针，优化反应体系和反应条件，分析TaqMan MGB探针实时荧光PCR方法的特异性、最低检测限和重复性，并确定CUT OFF值。结果HCoV-HKU1实时荧光PCR方法最低检测量为4.96×101Copies/mL。该方法针对其他病原微生物及类基因组无反应信号，特异性好。4个梯度稀释质粒样品的4次重复检测CT值变异系数均小于5%，说明重复性好。结论HCoV-HKU1实时荧光PCR检测方法特异性好、敏感性高、稳定性好，在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的检测中具有很好的应用前景。

Description

冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法
技术领域
本发明涉及一种冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
背景技术
冠状病毒因其复制机制比较独特，同源RNA的重组频率很高，容易出现新的变异株。对于任何一种病毒都不能掉以轻心，应积极从来源、传播途径、病毒特点、所引发的疾病以及相应的检测和治疗等方面进行研究，才能避免像SARS那样的灾难。快速而敏感的检测方法的建立，对于冠状病毒HKU1（HCoV-HKU1）以及目前尚未发现的冠状病毒变异株的检测有重要的意义。分子生物学技术为WHO（世界卫生组织）推荐的病原检测手段，其可在短时间内确认病原、大幅节约检测时间和成本，敏感度和特异性也超越现有各类实验室检测手段。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，该方法能够对病毒快速、灵敏、高效的检测，本发明的另一目的是提供一种实施上述方法的冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其设计的引物和探针为：
Figure BDA0000416430480000011
进一步，所述非诊断性检测方法的具体步骤为：
1）设计所述引物和探针；
2）提取病毒RNA；
3）实时荧光PCR扩增及分析：通过调整反应体系中探针和引物的反应浓度，选择最佳反应体系。
进一步，所述反应体系为：2X One Step RT-PCR Buffer3 12.5μl，TaKaRa Ex Taq HS0.5μl，PrmieScrip RT Enzyme Mix2 0.5μl，Primer1 0.2μl，Primer2 0.2μl，Probe1μl，ROX Dye II 0.5μl，Rnase Free dH2O 4.6μl。
进一步，所述反应体系的反应条件为：42℃8min；95℃10s；95℃5s，58℃34s，45Cycles。
进一步，所述非诊断性检测方法对冠状病毒HKU1的最低检测量为4.96×101Copies/mL。
一种实施上述方法的冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒中采用的引物和探针为：
本发明非诊断性检测方法和试剂盒对HCoV-HKU1实时荧光PCR检测方法特异性好、敏感性高、稳定性好，在临床鉴别诊断、口岸物品所携带冠状病毒的检测中具有很好的应用前景。
附图说明
图1为实时PCR最低检测限反应曲线图；
图2为实时PCR重复性反应曲线图；
图3为实时荧光PCR方法重复4次检测稀释至10-8病毒质粒度样品的反应曲线图。
图4为正常咽拭子样本实时荧光PCR方法检测结果图。
具体实施方式
下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术员。
本发明冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，所涉及的材料包括：
HCoV-HKU1质粒：根据提供的DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段。DNA合成由大连宝生物有限公司完成。将合成的HCoV-HKU1DNA连接、转化至E.coli Competent CellJM109载体上，构建质粒，用于实时荧光PCR的模板。病毒基因的合成和质粒的构建由大连宝生物有限公司完成。
阳性标本：甲型流感病毒、2009甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒阳性咽拭子标本均为本实验室测序确证样本、H5N1和H9N2核酸为北京疾病预防控制中心和中国军事医学科学院提供。肠道病毒CA16和EV71标本为四川国际旅行卫生保健中心提供。
阴性标本：采集的94份正常咽拭子来自深圳口岸医院正常群。
实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司ABI7500型。核酸提取试剂盒为德国Qiagen公司Viral RNA Mini Kit。Real-time PCR试剂盒为日本Takara公司产品。引物和探针由上海生工有限公司合成。
本发明冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，所涉及的引物和探针的设计：
从NCBI-Genebank获取HCoV-HKU1的基因序列利用软件BIOEDIT5.0对各型基因组序列进行比对找出一段高度保守区用primer express3.0和Primer5设计引物和探针，并且对所设计的引物探针进行NCBI-BLAST检索，其结果为100%与HCoV-HKU1同源理论上排除了其他微生物或类基因组扩增的可能性。Taq-man MGB探针修饰5'-FAM3'-NEG，PCR产物的大小为64bp。
表1为HCoV-HKU1real time RT-PCR引物和探针的名称、序列和碱基的位置：
Figure BDA0000416430480000031
病毒RNA的提取：
采用QIAGEN病毒RNA提取试剂盒，将560μ1准备好的含有Carrier RNA的AVL缓冲液加入1.5ml离心管；
取咽拭子浸泡液140微升AVL／Carrier RNA缓冲液的离心管，震荡混匀15秒；室温(15-25℃)孵育10分钟；
将1.5ml离心管短暂离心，消除管盖内的液滴；加入560μl乙醇(96-100％)，震荡混匀15秒；
震荡混匀后，将离心管短暂离心，消除管盖内的液滴；
将630μl上一步骤中的溶液小心转入QIAamp RNA提取柱（放置于2ml收集管里），注意不要碰湿柱子边缘；
盖上盖子，6000g(8000rpm)离心1分钟，将柱子移入一新的2ml收集管（提供），丢弃剩有滤液的收集管；小心打开柱子的盖子，重复该步骤一次；
小心打开柱子的盖子，加入500μl AW1液，盖上盖子，6000g(8000rpm)离心1分钟。
将柱子放入一新的2ml收集管，丢弃剩有滤液的收集管；
小心打开柱子的盖子，加入500μl AW2液，盖上盖子，全速(20，000g，14，000rpm)离心3分钟；将柱子放入一新的1.5ml离心管(自备)，丢弃剩有滤液的收集管。
小心打开柱子的盖子，加入60μl已平衡至室温的AVE缓冲液，盖上盖子，室温孵育1分钟后，6000g(8000rpm)离心1分钟。
反应体系和反应条件的优化：
采用ABI7500PCR仪进行实时荧光PCR扩增及分析。通过调整反应体系中探针和引物的反应浓度，选择最佳反应体系，确定的反应体系为：2X One Step RT-PCRBuffer3 12.5μl，TaKaRa Ex Taq HS0.5μl，PrmieScrip RT Enzyme Mix2 0.5μl，Primer1
0.2μl，Primer2 0.2μl，Probe1μl，ROX Dye II 0.5μl，Rnase Free dH2O 4.6μl。将退火温度设置为54℃、56℃、58℃、60℃分别进行实验，结果显示退火温度为58℃时，反应曲线呈典型的S型，荧光信号最强，本实验反应条件确定为：42℃8min；95℃10s；95℃5s，58℃34s（45Cycles）。
本发明还提供一种实施上述方法的冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒中采用的引物和探针为：
Figure BDA0000416430480000041
特异性实验：
分别用甲型流感病毒、2009甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒、H5N1流感病毒、H9N2流感病毒、肠道病毒Cox A16和EV71的RNA提取物和基因组为对照模板，应用实时荧光PCR方法检测。
最低检测限实验：
将HCoV-HKU1质粒样品分别稀释制成10倍差的梯度浓度,共8个梯度，经优化好的反应体系检测该方法的最低检测限。
重复性实验：
10倍系列稀释HCoV-2012质粒样品，稀释4个梯度，每个梯度样品重复测定4次，分别得到4个Ct值。通过计算Ct值的差异来验证方法的重现性。
CUT OFF值的确定：
对最低检测限稀释度质粒样品进行4次重复检测，计算其CT值均值和标准差，并对94例正常咽拭子样本进行检测分析其结果。结合以上结果综合分析实时荧光PCR方法的CUT OFF值。
特异性的检测：
实时荧光PCR方法针对HCoV-2012质粒的检测中，曲线呈“S”形，结果为阳性。甲型流感病毒、2009甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒、H5N1流感病毒、H9N2流感病毒、肠道病毒Cox A16和EV71的RNA提取物和基因组检测结果均为阴性，表明该方法有很好的特异性。
最低检测限的检测：
以10倍梯度稀释的病毒质粒为模板进行实时荧光PCR检测，10-2至10-9各稀释浓度样品检测的CT值分别为：16.51、19.63、22.65、27.09、30.02、32.36、34.94和38.30。实验结果显示，样品浓度降低，荧光信号减弱，而CT值增加，，最低检测限为4.96×101copies/ml（如图1所示）。
图1为实时PCR最低检测限反应曲线图，横坐标为实时PCR反应CT值，纵坐标为荧光信号强度，1-8号代表质粒样品浓度分别为4.96×108、4.96×107、4.96×106、4.96×105、4.96×104、4.96×103、4.96×102、4.96×101copies/ml。
重复性实验的检测：
实时荧光RT-PCR方法的重复性检测结果分析显示，10-2至10-5四个稀释度分别重复检测4次，检测10-2浓度样品的CT值分别为：17.09、17.02、16.99、16.94；检测10-3浓度样品的CT值分别为：20.77、20.70、20.55、20.65；检测10-4浓度样品的CT值分别为：24.37、24.26、24.02、24.07；检测10-5浓度样品的CT值分别为：29.21、28.94、28.66、29.37。四个稀释度样品Ct平均值分别是17.01、20.67、24.18、29.05，标准差分别是0.06、0.09、0.16、0.31，变异系数分别是0.37％、0.45％、0.68％、1.07％，变异系数均小于5%（如图2所示）。
图2为实时PCR重复性反应曲线图，横坐标为实时PCR反应CT值，纵坐标为荧光信号强度，1-4号代表10-2至10-5四个稀释度质粒样品。
CUT OFF值的确定：
实时荧光PCR方法最低检测限实验结果显示，稀释至10-9病毒质粒样品有荧光信号，但无标准的S形荧光信号反应曲线产生。将稀释至10-8病毒质粒度样品,重复检测4次,通过计算Ct值的差异来验证方法的重现性。稀释至10-8病毒质粒度样品的CT值分别为：39.67、36.37、38.16、39.01，CT值平均值为38.30，标准差为1.43。94份阴性样本均无荧光信号。综合以上实验结果最终确定CUT OFF值为40（如图3、图4所示）。
图3为实时荧光PCR方法重复4次检测稀释至10-8病毒质粒度样品的反应曲线图，横坐标为实时荧光PCR反应的CT值，纵坐标为荧光信号强度，4条曲线代表稀释至10-8病毒质粒度样品分别在4个反应孔的检测结果。图4为正常咽拭子样本实时荧光PCR方法检测结果图，横坐标为实时PCR反应CT值，纵坐标为荧光信号强度，S型信号曲线为阳性参照物。
由于HCoV-HKU1近年新发现的呼吸道病毒，有关其在我国的流行情况的研究报道相对较少，因此，建立一种敏感、精确、快速、简便的病原检测方法是进行大规模的流行病学研究的基础。
本发明建立一种快速、灵敏、高效的冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)实时荧光PCR检测方法用于咽拭子标本检测。方法在HCoV-HKU1基因的保守区域设计引物及Taqman MGB探针，优化反应体系和反应条件，分析TaqMan MGB探针实时荧光PCR方法的特异性、最低检测限和重复性，并确定CUT OFF值。结果HCoV-HKU1实时荧光PCR方法最低检测量为4.96×101Copies/mL。该方法针对其他病原微生物及类基因组无反应信号，特异性好。4个梯度稀释质粒样品的4次重复检测CT值变异系数均小于5%，说明重复性好。结论：HCoV-HKU1实时荧光PCR检测方法特异性好、敏感性高、稳定性好，在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的检测中具有很好的应用前景。
本研究建立的HCoV-HKU1实时荧光PCR检测方法仅需要咽拭子标本就可能检测，方便了临床医生和口岸检疫工作者采样操作。本研究所用试剂成本低检测周期短，能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据。本研究的关键步骤之一就是引物探针的设计，我们从NCBI数据库检索到截自2013年6月1日的所有HCoV-HKU1基因序列，经相关生物信息学软件反复比对设计，最终确定了该病毒基因的保守区域设计，而且在试验中我们也选取了多套自己设计的引物探针序列实验比对，最终确定了一套最佳检测用引物探针序列。总之，本研究建立了一种快速有效的HCoV-HKU1荧光PCR检测方法，经过实验论证说明其具有极高的潜在应用价值。本研究方法将逐步完善并应用于临床和出入境检验检疫冠状病毒感染的诊断中。
                       SEQUENCE LISTING
 
<110>  深圳国际旅行卫生保健中心
 
<120>  冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法
 
<130>  发明
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213>  HKU1-FP
 
<400>  1
CACAGCCGGCGTTCTTTTAA                                         20
 
 
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  HKU1-RP
 
<400>  2
AATACCATCTCGGTAACAACTGCTT                                    25
 
 
<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  HKU1-Probe
 
<400>  3
ACAGCTGATGGTCAACA                                            17
 
 

Claims (6)

1.冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其特征在于，其设计的引物和探针为：
Figure FDA0000416430470000011
2.如权利要求1所述冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述非诊断性检测方法的具体步骤为：
1）设计所述引物和探针；
2）提取病毒RNA；
3）实时荧光PCR扩增及分析：通过调整反应体系中探针和引物的反应浓度，选择最佳反应体系。
3.如权利要求1所述冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述反应体系为：2X One Step RT-PCR Buffer3 12.5μl，TaKaRa Ex Taq HS0.5μl，PrmieScrip RT Enzyme Mix2 0.5μl，Primer1 0.2μl，Primer2 0.2μl，Probe 1μl，ROXDye II 0.5μl，Rnase Free dH2O 4.6μl。
4.如权利要求1所述冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述反应体系的反应条件为：42℃8min；95℃10s；95℃5s，58℃34s，45Cycles。
5.如权利要求1所述冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述非诊断性检测方法对冠状病毒HKU1的最低检测量为4.96×101Copies/mL。
6.冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中采用的引物和探针为：
Figure FDA0000416430470000012
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