CN113699145B - 基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液及其产品与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液及其产品与应用。裂解结合液，包括以下组分：100‑140mM Tris‑HCl pH8.0‑9.0，3.0‑3.8M异硫氰酸胍，3‑9w/v％NP‑40，0‑0.5w/v％SDS，5‑15w/v％PEG6000，3‑9w/v％Triton X‑100和10‑30mM乙二胺四乙酸二钠。该裂解结合液作为一个整体，可以实现待测样本裂解和核酸与磁珠结合两个过程，无需使用蛋白酶K、RNA助沉剂等也可以提取出不抑制后续PCR检测的高质量核酸样本。不存在腐蚀性，同时简化了核酸提取步骤，缩短了核酸提取时间。

Description

基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液及其产品与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液及其产品与应用。
背景技术
随着诊断技术的发展，分子诊断技术逐渐成为人类日常生活中诊断疾病的主要手段，而基于核酸信息的分子诊断技术更是其中的重要手段，因此分子诊断前的核酸提取不仅为必需步骤，对其要求也不断提高。
核酸提取的一个常用方法是磁珠法。目前，常规的磁珠法核酸提取试剂已能做到与自动化仪器配合，其中，深孔板预装核酸提取试剂是一种较为常见的形式，但是，由于很多试剂中含乙醇或异丙醇等有机溶剂，对深孔板封板膜的腐蚀作用较强，容易造成产品漏液，并且有机溶液过多对蛋白质含量高的样本也会产生一些不良影响。此外，目前大部分核酸提取试剂的操作较为繁琐，通常包含裂解液、结合液、去蛋白液、洗涤液、洗脱液等组分，有的核酸提取试剂还需要添加蛋白酶K、RNA助沉剂等额外组分，即使使用自动化仪器人工操作依然较多，且多步洗涤使整个操作时间在20min左右。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液。
本发明的第二目的在于提供一种基于磁珠法病原体核酸提取的试剂。
本发明的第三目的在于提供上述裂解结合液和试剂的应用。
本发明的第四目的在于提供一种病原体核酸提取的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液，包括以下组分：100-140mMTris-HClpH8.0-9.0，3.0-3.8M异硫氰酸胍，3-9w/v％NP-40，0-0.5w/v％SDS，5-15w/v％PEG6000，3-9w/v％Triton X-100和10-30mM乙二胺四乙酸二钠。
进一步地，包括以下组分：120mMTris-HClpH8.5，3.0-3.8M异硫氰酸胍，3-9w/v％NP-40，0-0.5w/v％SDS，5-15w/v％PEG6000，3-9w/v％Triton X-100和20mM乙二胺四乙酸二钠。
进一步地，包括以下组分：120mMTris-HCl pH8.5，3.4M异硫氰酸胍，3-9w/v％NP-40，0-0.5w/v％SDS，10w/v％PEG6000，3-9w/v％Triton X-100和20mM乙二胺四乙酸二钠。
进一步地，包括以下组分：120mM Tris-HClpH8.5，3.4M异硫氰酸胍，6w/v％NP-40，0.5w/v％SDS，10w/v％PEG6000，9w/v％Triton X-100和20mM乙二胺四乙酸二钠。
一种基于磁珠法病原体核酸提取的试剂，包括上述的裂解结合液和洗涤液；
洗涤液包括：5-15mM Tris-HCl，2-8mM乙二胺四乙酸二钠，3-13w/v％PEG6000，0.2-1M NaCl和0-4M尿素。
进一步地，还包括洗脱液；
洗脱液包括无酶水，优选为无酶超纯水。
进一步地，还包括25-50mg/ml磁珠溶液；
优选地，磁珠为羧基修饰磁珠。
上述的裂解结合液或试剂在制备核酸提取用预装深孔板中的应用。
一种基于本发明试剂的病原体核酸提取的方法，裂解结合液、待测样本和磁珠溶液混匀反应，再经洗涤液清洗后，利用洗脱液洗脱得到目标核酸溶液。
进一步地，裂解结合液与待测样本的体积比为(3-5)：2；
优选地，混匀反应的时间为60-120s；
优选地，清洗次数为2-3次。
进一步地，洗脱的步骤包括：先加入洗脱液混匀15-25s，再55-75℃孵育50-70s，去磁珠后得到目标核酸溶液；
优选地，所述方法采用核酸提取仪进行操作。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的裂解结合液，作为一个整体，可以实现待测样本裂解和核酸与磁珠结合两个过程，无需使用蛋白酶K、RNA助沉剂等也可以提取出不抑制后续PCR检测的高质量核酸样本。该组分不含有乙醇或异丙醇等有机溶剂，对于复合膜不存在腐蚀性，可以用于大规模生产的预装板试剂。同时简化了核酸提取步骤，缩短了核酸提取时间。
本发明提供的基于磁珠法病原体核酸提取的试剂，由于含有上述裂解结合液，所以具有其相关功能和技术效果。同时该试剂含有的洗涤液，因为配方中无乙醇、异丙醇等有机溶剂，相比一般的提取试剂无需额外的磁珠晾干步骤，因此该试剂可以将核酸提取时间缩短到9min左右。当试剂被分装在深孔板中并用复合膜进行封膜，由于主要成分不含醇类物质减少了漏液的可能性，提高了产品的质量。
本发明提供的病原体核酸提取的方法，人工操作简化了操作步骤，配合核酸提取仪使用缩短了提取时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为效果例3中本发明的核酸提取试剂提取的核酸用荧光PCR法检测结果；
图2为效果例4中本发明的核酸提取试剂与竞品试剂提取的核酸用荧光PCR法检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明提供一种基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液，包括以下组分：100-140mM Tris-HCl pH8.0-9.0，3.0-3.8M异硫氰酸胍，3-9(w/v)％NP-40，0-0.5％(w/v)SDS，5-15％(w/v)PEG6000，3-9％(w/v)Triton X-100和10-30mM乙二胺四乙酸二钠。
上述裂解结合液可以实现待测样本裂解和核酸与磁珠结合的两个过程，无需使用蛋白酶K、RNA助沉剂等也可以提取出不抑制后续PCR检测的高质量核酸样本。该组分不含有乙醇或异丙醇等有机溶剂，不存在腐蚀性。同时简化了核酸提取步骤，缩短了核酸提取时间。
需要说明的是，异硫氰酸胍是一种强离液剂，也是一种强蛋白变性剂，在核酸提取过程中能使蛋白变性并且迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，释放核酸，同时也能抑制细胞释放出的核酸酶，防止核酸降解。在没有额外添加蛋白酶K的条件下，在本裂解液中加入了三种不同的表面活性剂，包括Triton-X-100、NP-40和SDS，其中Triton-X-100、NP-40为非离子型表面活性剂，SDS为阴离子表面活性剂，调整三种表面活性剂的比例，在保持溶液稳定的同时促进三种表面活性剂的协同作用，提高对细胞或目标病原体的裂解作用，并且对蛋白质杂质的去除作用也更加明显。因为加入了较高的表面活性剂，尤其是SDS本身即为溶解度较小的表面活性剂，在本裂解液中为了保证体系稳定，胍盐浓度控制在较低水平。为了进一步增强整个裂解液的稳定性，在其中加入了以PEG6000为代表的促溶剂；PEG除了具有促溶剂的作用外，其提供的空间位阻作用能使磁珠与核酸结合更充分，且由于本反应适配羧基磁珠，羧基磁珠在PEG存在条件下与核酸结合效果更佳，能达到更好的核酸提取效果。本发明中，病原体包括细菌、病毒、支原体和衣原体等。
Tris-HCl的浓度可以但不限于为100mM、110mM、120mM、130mM或140mM；Tris-HCl的pH可以但不限于为8.0、8.25、8.5、8.75或9.0；异硫氰酸胍的浓度可以但不限于为3.0M、3.3M、3.4M、3.5M、3.6M、3.7M或3.8M；NP-40的浓度可以但不限于为3(w/v)％、4(w/v)％、5(w/v)％、6(w/v)％、7(w/v)％、8(w/v)％或9(w/v)％；SDS的浓度可以但不限于为0w/v％、0.1w/v％、0.2w/v％、0.3w/v％、0.4w/v％或0.5w/v％；PEG6000的浓度可以但不限于为5w/v％、7w/v％、10w/v％、13w/v％或15w/v％；Triton X-100的浓度可以但不限于为3(w/v)％、4(w/v)％、5(w/v)％、6(w/v)％、7(w/v)％、8(w/v)％或9(w/v)％；乙二胺四乙酸二钠的浓度可以但不限于为10mM、20mM或30mM。
在优选地实施方式中，裂解结合液包括以下组分：110-130mM Tris-HCl pH8.0-9.0，3.0-3.8M异硫氰酸胍，5-9(w/v)％NP-40，0.25-0.5％(w/v)SDS，7-13％(w/v)PEG6000，6-9％(w/v)Triton X-100和10-30mM乙二胺四乙酸二钠。更进一步优选为：120mM Tris-HClpH8.5，3.4M异硫氰酸胍，6(w/v)％NP-40，0.5％(w/v)SDS，10％(w/v)PEG6000，9％(w/v)Triton X-100和20mM乙二胺四乙酸二钠。
本发明还提供一种包括上述裂解结合液的基于磁珠法病原体核酸提取的试剂。该试剂还需要包括洗涤液和洗脱液。洗涤液包括：5-15mM Tris-HCl，2-8mM乙二胺四乙酸二钠，3-13％PEG6000，0.2-1M NaCl和0-4M尿素；洗脱液包括无菌水，优选为无菌超纯水。
需要说明的是，在本洗涤液中，主要通过氯化钠和PEG的搭配，使得核酸在洗去盐离子和表面活性剂的同时依然紧密结合在磁珠上。同时加入缓冲体系Tris-HCl和乙二胺四乙酸二钠，确保整个体系稳定。尿素作为一种蛋白溶解剂，可以选择性的在洗涤液中加入，在对蛋白质含量较高的样本进行核酸提取时，帮助去除吸附在磁珠表面或是磁珠上的蛋白质杂质。并且本洗涤液中的各种组分，对后续PCR反应的抑制作用较小，可以在洗涤后直接用于PCR反应，提高核酸提取速度。
Tris-HCl的浓度可以但不限于为5mM、7mM、9mM、11mM、13mM或15mM；乙二胺四乙酸二钠的浓度可以但不限于为2mM、4mM、6mM或8mM；PEG6000的浓度可以但不限于为3％、5％、7％、9％、11％或13％；NaCl的浓度可以但不限于为0.2M、0.4M、0.6M、0.8M或1M；尿素的浓度可以但不限于为0M、1M、2M、3M或4M。
在一些实施方式中，试剂还包括磁珠溶液，磁珠溶液的浓度为25-50mg/ml，磁珠优选为羧基修饰磁珠。
可以理解的是，本发明的裂解结合液，核酸提取试剂在改善了核酸提取操作和质量的同时，均不含有有机溶剂，无刺激性气味，不会对核酸提取仪提取过程中的深孔板、复合膜等产生腐蚀作用，可以直接将核酸提取试剂预装在深孔板中，封孔后作为产品销售或使用。
基于上述试剂，本发明提供一种病原体核酸提取的方法，裂解结合液、待测样本和磁珠溶液混匀反应，再经洗涤液清洗后，利用洗脱液洗脱得到目标核酸溶液。
需要说明的是，上述提取过程也可以采用核酸提取仪操作完成。
在一些实施方式中，具体的核酸提取过程可以为如下流程：
(1)在1.5ml离心管中加入200μl的拭子样本，加入300μl的裂解结合液、30μl含有磁珠的溶液，涡旋混匀120s。
(2)将步骤(1)中的离心管放置于磁力架上静置120s，溶液完全澄清后，吸弃液体。从磁力架上取下离心管，加入500μl洗涤液，吹打混匀后将离心管放置于磁力架上，静置60s，吸弃液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl洗涤液，吹打混匀后将离心管放置于磁力架上，静置60s，吸弃液体。
(3)将步骤(2)的离心管从磁力架上取下，加入100μl洗脱液，涡旋混匀20s，放置于60℃金属浴上孵育60s，将孵育好的1.5ml离心管放置在磁力加上静置25-35s，磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至一个新离心管中，完成核酸提取。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
一种基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液，由以下组分构成：100-140mMTris-HClpH8.5，3.0M异硫氰酸胍，3(w/v)％NP-40，0％(w/v)SDS，5％(w/v)PEG6000，3％(w/v)Triton X-100和10-30mM乙二胺四乙酸二钠，用水作为溶剂。优化其中Tris-HCl和乙二胺四乙酸二钠的浓度配比，具体搭配如下：
表1缓冲体系优化方案
Figure BDA0003248561860000081
本实例采用新冠假病毒模拟的咽拭子样本作为核酸提取样本，其中样本基质为不同厂家的采样套装(厂家一、厂家二、厂家三)，并通过比较最终提取Ct值作为核酸提取效果的评判标准。
核酸提取步骤采用上述步骤。其中，洗涤液采用：80％乙醇。
取商品化的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)用于检测，PCR检测反应体系反应程序设置参考试剂盒说明书。
表2裂解液配方缓冲体系优化结果
Figure BDA0003248561860000082
Figure BDA0003248561860000091
根据表2结果，Tris-HCl120mM，乙二胺四乙酸二钠20mM时qPCR检测结果最好，且三种采样套装检测均一性较好，当Tris-HCl浓度高于120mM，乙二胺四乙酸二钠高于20mM时，检测效果基本一致，当Tris-HCl和乙二胺四乙酸二钠浓度过高时，可能导致溶液不稳定，造成盐类析出。
实施例2
一种基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液，由以下组分构成：120mMTris-HClpH8.5，3.0-3.8M异硫氰酸胍，3(w/v)％NP-40，0％(w/v)SDS，5-15％(w/v)PEG6000，3％(w/v)Triton X-100和20mM乙二胺四乙酸二钠，用水作为溶剂。对其中异硫氰酸胍和PEG的浓度进行优化，具体配制方法如下：
表3结合体系优化方案
序号 异硫氰酸胍(M) PEG(w/v％)
配方一 3 5
配方二 3 10
配方三 3 15
配方四 3.4 5
配方五 3.4 10
配方六 3.4 15
配方七 3.8 5
配方八 3.8 10
配方九 3.8 15
本实例采用新冠假病毒模拟的咽拭子样本作为核酸提取样本，其中样本基质为病原体保存液，并通过比较最终提取Ct值作为核酸提取效果的评判标准。
核酸提取步骤采用上述步骤。其中，洗涤液采用：80％乙醇。
取商品化的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)用于检测，PCR检测反应体系反应程序设置参考试剂盒说明书。
表4结合体系优化结果
序号 异硫氰酸胍(M) PEG(w/v％) 1 2 3 AVG
配方一 3 5 27.99 28.19 28.07 28.08
配方二 3 10 27.46 27.27 27.29 27.34
配方三 3 15 27.09 26.92 26.95 26.99
配方四 3.4 5 28.09 28.03 27.70 27.94
配方五 3.4 10 26.76 26.84 26.86 26.82
配方六 3.4 15 27.01 26.83 26.56 26.80
配方七 3.8 5 27.17 27.26 26.97 27.13
配方八 3.8 10 26.95 26.97 26.79 26.90
配方九 3.8 15 27.01 26.83 26.56 26.80
根据表4结果，在异硫氰酸胍浓度大于3.4M，PEG6000浓度大于10％(w/v)时，最终检测效果基本一致，为给裂解液组分优化留下空间，选择3.4M异硫氰酸胍、10％(w/v)PEG6000。
实施例3
一种基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液，由以下组分构成：120mM Tris-HCl pH8.5，3.4M异硫氰酸胍，3-9(w/v)％NP-40，0-0.5％(w/v)SDS，10％(w/v)PEG6000，3-9％(w/v)Triton X-100和20mM乙二胺四乙酸二钠，用水作为溶剂。对其中NP-40、Triton-X-100、SDS的浓度进行优化，具体配制方法如下：
表5裂解体系优化
序号 NP-40(w/v％) Triton-X-100(w/v％) SDS(w/v％)
配方一 3 3 0
配方二 3 6 0.25
配方三 3 9 0.5
配方四 6 3 0
配方五 6 6 0.25
配方六 6 9 0.5
配方七 9 3 0
配方八 9 6 0.25
配方九 9 9 0.5
本实例分别采用新冠假病毒模拟的咽拭子样本和金黄色葡萄球菌培养物作为核酸提取样本，其中样本基质为病原体保存液，并通过比较最终提取Ct值作为核酸提取效果的评判标准。
核酸提取步骤采用上述步骤。其中，洗涤液采用：80％乙醇。
取商品化的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)和金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)用于检测，PCR检测反应体系反应程序设置参考试剂盒说明书。
表6新冠假病毒核酸检测结果
Figure BDA0003248561860000111
表7金黄色葡萄球菌检测结果
Figure BDA0003248561860000112
从最终检测结果可以看出，对于新冠假病毒来说不同浓度的裂解组分对检测结果的影响较小；对于金葡培养物来说，SDS的裂解液作用较为明显，且当该裂解液中SDS浓度高于0.5％时，裂解液中易有盐类析出，因此根据该结果，选择NP-40(w/v)6％，Triton-X-100(w/v)9％，SDS(w/v)0.5％满足要求。
实施例4
一种基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液，由以下组分构成：120mM Tris-HCl pH8.5，3.4M异硫氰酸胍，6(w/v)％NP-40，0.5％(w/v)SDS，10％(w/v)PEG6000，9％(w/v)Triton X-100和20mM乙二胺四乙酸二钠，用水作为溶剂。
对比例1
与实施例4相比，将异硫氰酸胍的浓度分别调节至5M，6M，其余不变。裂解液配制后有盐类析出，无法进行后续实验。
对比例2
与实施例4相比，分别用水代替NP-40、Triton-X-100、SDS，其余组分不变。
对比例3
与实施例4相比，减少Tris-HCl浓度至40mM，并减少乙二胺四乙酸二钠浓度至5mM。
效果例1
取上述对比例2中三种裂解结合液配方，与实施例4中裂解结合液配方进行对比，分别对新冠假病毒和金葡培养物进行提取，样本基质为病原体保存液。核酸提取步骤按照上述所述步骤，洗涤液采用80％乙醇。
表8对比实验结果-新冠假病毒
序号 配方 1 2 3 AVG
配方一 实施例4配方 31.53 31.75 31.32 31.54
配方二 实施例4配方，用水代替NP-40 32.47 31.92 32.19 32.19
配方三 实施例4配方，用水代替Triton-X-100 32.34 32.00 32.25 32.20
配方四 实施例4配方，用水代替SDS 31.92 31.69 31.15 31.59
表9对比实验结果-金葡培养物
序号 配方 1 2 3 AVG
配方一 实施例4配方 29.67 30.65 30.48 30.27
配方二 实施例4配方，用水代替NP-40 31.70 32.10 31.69 31.83
配方三 实施例4配方，用水代替Triton-X-100 32.61 31.71 32.94 32.42
配方四 实施例4配方，用水代替SDS 31.03 31.27 31.00 31.10
由该结果可知，单独缺少NP-40或Triton-X-100，都会导致检测结果延后，可能由于裂解能力下降且裂解液中水分增加，导致核酸结合效率下降。而缺少SDS与实例4中结果一致，导致金葡的检测结果延后，说明仅有非离子型表面活性剂对细菌的裂解作用不足。
取上述对比例3中配方，与实施例4中裂解结合液配方进行对比，对新冠假病毒进行提取，其中样本基质为三个不同厂家的采样套装，并通过比较最终提取Ct值作为核酸提取效果的评判标准。
核酸提取步骤采用上述步骤。其中，洗涤液采用：10mM Tris-HClpH8.0，5mM乙二胺四乙酸二钠，8％PEG6000，0.2M NaCl和2M尿素。
取商品化的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)和金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)用于检测，PCR检测反应体系反应程序设置参考试剂盒说明书。
表10对比实验结果-不同样本基质
Figure BDA0003248561860000131
由该结果可知，降低Tris-HCl和乙二胺四乙酸二钠浓度后，该配方在厂家一和厂家二的采样套装基质中与实施例4种裂解液配方无明显差异，但在厂家三的采样套装基质中有明显延后。
以实施例4作为下面试验中的裂解结合液。
实施例5
一种基于磁珠法病原体核酸提取的试剂，包括裂解结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠溶液。
洗涤液：5-15mM Tris-HClpH 8.0，2-8mM乙二胺四乙酸二钠，13％PEG6000，1MNaCl和0M尿素；
洗脱液：无菌超纯水；
羧基修饰磁珠溶液：50mg/ml。
具体洗涤液配制方案如下表：
表11洗涤液缓冲体系优化
序号 Tris-HCl(M) 乙二胺四乙酸二钠(M)
配方一 5 2
配方二 5 5
配方三 5 8
配方四 10 2
配方五 10 5
配方六 10 8
配方七 15 2
配方八 15 5
配方九 15 8
本实例采用新冠假病毒模拟的咽拭子样本作为核酸提取样本，其中样本基质为病原体保存液，并通过比较最终提取Ct值作为核酸提取效果的评判标准。
核酸提取步骤采用上述步骤。
取商品化的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)用于检测，PCR检测反应体系反应程序设置参考试剂盒说明书。
表12洗涤液缓冲体系优化结果
Figure BDA0003248561860000141
Figure BDA0003248561860000151
由上述结果可知，在给定范围内，Tris-HCl和乙二胺四乙酸二钠的浓度变化，不会对检测最终结果造成明显的影响，因此选择中间值作为洗涤液的缓冲体系，分别为Tris-HCl 10mM，乙二胺四乙酸二钠5mM。
实施例6
一种基于磁珠法病原体核酸提取的试剂，包括裂解结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠溶液。
洗涤液：10mM Tris-HCl pH 8.0，5mM乙二胺四乙酸二钠，3-13(w/v)％PEG6000，0.2-1M NaCl和0M尿素；
洗脱液：无菌超纯水；
羧基修饰磁珠溶液：25mg/ml。
具体洗涤液配制方案如下表：
表13洗涤液主要成分优化
序号 PEG(w/v) NaCl(M)
配方一 3 0.2
配方二 3 0.6
配方三 3 1
配方四 8 0.2
配方五 8 0.6
配方六 8 1
配方七 13 0.2
配方八 13 0.6
配方九 13 1
本实例采用新冠假病毒模拟的咽拭子样本作为核酸提取样本，其中样本基质为病原体保存液，并通过比较最终提取Ct值作为核酸提取效果的评判标准。
核酸提取步骤采用上述步骤。
取商品化的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)用于检测，PCR检测反应体系反应程序设置参考试剂盒说明书。
表14洗涤液缓冲体系优化结果
序号 PEG(w/v) NaCl(M) 1 2 3 AVG
配方一 3 0.2 35.72 36.78 36.48 36.33
配方二 3 0.6 34.15 33.80 34.40 34.12
配方三 3 1 33.65 32.50 33.29 33.15
配方四 8 0.2 30.48 30.80 29.91 30.40
配方五 8 0.6 30.09 30.59 31.08 30.59
配方六 8 1 29.97 30.84 31.41 30.74
配方七 13 0.2 30.08 31.04 31.16 30.76
配方八 13 0.6 30.71 30.50 29.86 30.36
配方九 13 1 30.77 30.74 29.81 30.44
由上述结果可知，配方四到配方九检测结果基本一致，但是PEG浓度过高会增加磁珠在洗涤液中的吸磁时间，并且NaCl浓度过高时，可能会被磁珠带入洗脱液中，造成后续检测反应被抑制，根据该结果，选择8％PEG6000，0.2M NaCl作为后续实验的配方。
实施例7
一种基于磁珠法病原体核酸提取的试剂，包括裂解结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠溶液。
洗涤液：10mM Tris-HCl，5mM乙二胺四乙酸二钠，8(w/v)％PEG8000，0.2M NaCl和0-4M尿素；
洗脱液：无菌超纯水；
羧基修饰磁珠溶液：25-50mg/ml。
对比例4
参照实施例7，但是将洗涤液中PEG8000替换成乙醇。
对比例5
参照实施例7，删除NaCl。
对比例6
Magen核酸提取及纯化试剂(磁珠法病原体总核酸提取试剂盒)。
效果例2
具体实验安排如下表：
表15洗涤液效果测试
序号 尿素
配方一 0M
配方二 2M
配方三 4M
配方四 6M
配方五 对比例4
配方六 对比例5
配方七 对比例6
本实例采用新冠假病毒模拟的咽拭子样本作为核酸提取样本，其中样本基质为10mg/ml的BSA溶液，并通过比较最终提取Ct值作为核酸提取效果的评判标准。
核酸提取步骤采用上述步骤。
取商品化的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)用于检测，PCR检测反应体系反应程序设置参考试剂盒说明书。
表16洗涤液效果测试结果
序号 尿素 1 2 3 AVG
配方一 0M 28.76 29.05 28.44 28.75
配方二 2M 26.93 27.33 27.41 27.22
配方三 4M 26.89 27.11 26.96 26.98
配方四 6M 34.45 34.31 34.34 34.37
配方五 对比例4 34.28 35.22 36.05 35.18
配方六 对比例5 34.74 33.92 34.92 34.52
配方七 对比例6 27.73 27.40 27.17 27.43
由上述结果表明，该洗涤液在面对蛋白质浓度较高的样本时，加入尿素能明显提高检测效果，略优于对比例7中的核酸提取试剂，但是尿素浓度过高时，可能会抑制扩增结果，因此尿素浓度范围最好为0-4M。通过对比例5和对比例6也能看出，PEG6000和NaCl对核酸洗涤效果由重大影响。
实施例7的试剂为如下试验的核酸提取试剂，其中尿素浓度为2M。
效果例3稳定性检测
核酸提取方法如下：
1、样本准备：以新冠假病毒作为模拟样本，用阴性口咽拭子稀释，稀释为105cope/ml，作为待测样本备用。
2、核酸提取：
(1)在1.5ml离心管中加入200μl的拭子样本，加入300μl的裂解液、30μl含有磁珠的溶液，涡旋混匀120s。
(2)将步骤(1)中的离心管放置于磁力架上静置120s，溶液完全澄清后，吸弃液体。从磁力架上取下离心管，加入500μl洗涤液，吹打混匀后将离心管放置于磁力架上，静置60s，吸弃液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl洗涤液，吹打混匀后将离心管放置于磁力架上，静置60s，吸弃液体。
(3)将步骤(2)的离心管从磁力架上取下，加入100μl洗脱液，涡旋混匀20s，放置于60℃金属浴上孵育60s，将孵育好的1.5ml离心管放置在磁力加上静置25-35s，磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至一个新离心管中，完成核酸提取。
3、样本的荧光定量PCR检测
取商品化的新型冠状病原体核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)，PCR检测反应体系反应程序设置参考试剂盒说明书。
4、新冠假病毒提取产物PCR检测从步骤1-3重复8个样本，结果如表17和图1所示。从表中可以看出，本发明提供的核酸提取试剂稳定性好。
表17效果例3测试结果
ORF1ab
1 28.78
2 28.84
3 28.74
4 28.99
5 28.81
6 28.60
7 28.55
8 28.89
平均值 28.77
标准差 0.15
CV值 0.51％
效果例4提取核酸质量检测
本发明试剂可配合自动化核酸提取仪使用，能够快速、高效的提取样本中的病原体核酸，包括如下步骤：
1、样本准备：以新冠假病毒作为模拟样本，用阴性口咽拭子稀释，稀释为104，105，106cope/ml，作为待测样本备用。
2、使用上海伯杰医疗科技有限公司BG-Flex-32全自动核酸提取仪，使用时孔位添加试剂说明如下：
第1、7孔：待测样本200μl，裂解结合液300μl，磁珠溶液30μl；
第3、9孔：洗涤液500μl；
第4、10孔：洗涤液300μl；
第6、12孔：洗脱液100μl；
3、BG-Flex-32全自动核酸提取仪程序设置入表18：
表18 BG-Flex-32全自动核酸提取仪程序设置
Figure BDA0003248561860000191
4、竞品试剂核酸提取
竞品试剂选择某公司磁珠法核酸提取试剂(需加入蛋白酶K和助沉剂)，按说明书进行操作，洗脱液统一为100μl。
5、样本的荧光定量PCR检测
表19效果例4测试结果
Figure BDA0003248561860000192
Figure BDA0003248561860000201
取商品化的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)用于检测，PCR检测反应体系反应程序设置参考试剂盒说明书。检测结果见图2及表19，可以看出本发明提供的核酸提取试剂无需额外加入蛋白酶K和助沉剂，但是能获得比竞品试剂更好的核酸提取效果。
效果例5腐蚀性检测
基于磁珠法的核酸提取试剂大部分用于预分装试剂，而一般提取试剂中的有机溶剂和表面活性剂等组分通常会对深孔板的封板膜进行腐蚀，造成膜分层或漏液的现象。因此将本发明的核酸提取试剂的主要组分(裂解结合液、洗涤液)预分装进深孔板后进行封膜，到放于42℃烘箱，对膜分层情况进行统计。封膜条件为172℃，2s。以竞品试剂的洗涤液作为对比，其主要成分为80％乙醇。具体结果见表20。可见，本发明提供的核酸提取试剂充分考虑了试剂组分在深孔板中对包装的腐蚀性，通过调整配方使组分对封板膜的腐蚀作用大大降低，更适用于生产预分装试剂；搭配相应的全自动核酸提取仪，能在更短的时间内获得较好的检测效果。
表20试剂组分对封板膜腐蚀结果
Figure BDA0003248561860000202
Figure BDA0003248561860000211
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (12)

1.一种基于磁珠法病原体核酸提取的试剂，其特征在于，包括裂解结合液和洗涤液；
裂解结合液由以下组分组成：120-140mM Tris-HCl pH8.0-9.0，3.4-3.8M 异硫氰酸胍，3-6w/v% NP-40，0.25-0.5 w/v %SDS，10-15 w/v %PEG6000，3-9 w/v % Triton X-100和10-30mM 乙二胺四乙酸二钠；
洗涤液由以下组分组成：5-15mM Tris-HCl，2-8mM 乙二胺四乙酸二钠，8-13 w/v %PEG6000，0.2-1M NaCl和0-4M尿素。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述裂解结合液由以下组分组成：120mMTris-HCl pH8.5，3.4M 异硫氰酸胍，6w/v% NP-40，0.5 w/v %SDS，10 w/v %PEG6000，9 w/v%Triton X-100和20mM 乙二胺四乙酸二钠。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，还包括洗脱液；
洗脱液包括无酶水。
4.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，还包括25-50mg/ml磁珠溶液。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述磁珠为羧基修饰磁珠。
6.权利要求1-5任一项所述的试剂在制备核酸提取用预装深孔板中的应用。
7.一种基于权利要求1-5任一项所述的试剂的病原体核酸提取的方法，其特征在于，裂解结合液、待测样本和磁珠溶液混匀反应，再经洗涤液清洗后，利用洗脱液洗脱得到目标核酸溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，裂解结合液与待测样本的体积比为（3-5）：2。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，混匀反应的时间为60-120s。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，清洗次数为2-3次。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，洗脱的步骤包括：先加入洗脱液混匀15-25s，在60-75℃孵育50-70s，去磁珠后得到目标核酸溶液。
12.根据权利要求7-11任一项所述的方法，其特征在于，所述方法采用核酸提取仪进行操作。
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