CN113462683A

CN113462683A - 适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液及核酸提取试剂盒

Info

Publication number: CN113462683A
Application number: CN202110831513.7A
Authority: CN
Inventors: 冯二环; 李玫杰; 谢正华
Original assignee: Shanghai 3D Medicines Co Ltd
Current assignee: Shanghai 3D Medicines Co Ltd
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2041-07-22
Also published as: CN113462683B

Abstract

本发明公开了一种适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液及核酸提取试剂盒。所述无醇清洗液包括清洗液A和清洗液B，所述清洗液A包括30mM～50mM的Tris‑HCl、15％～30％的PEG、2～3M的钠盐，所述清洗液B包括30mM～50mM的Tris‑HCl、50～100mg/mL的硅基磁珠、10％～15％的PEG、1.5～2.5M的钠盐。本发明提供的核酸提取试剂盒包括所述无醇清洗液以及裂解液、蛋白酶K和洗脱液。本发明的核酸提取试剂盒可用于多类型样本(口咽拭子样本、鼻咽拭子样本、血浆、血清、痰液、唾液)的提取。采用本发明的核酸提取试剂盒可以减少乙醇残留对下游实验的影响，提高核酸纯度，进而提高检测的准确性。

Description

适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液及核酸提取试剂盒

技术领域

本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液及核酸提取试剂盒。

背景技术

核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基础，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。而核酸的提取效率与纯度对下游实验的结果也会产生非常大的影响。

核酸提取主要过程为：待提取样本在含有硫氰酸胍、蛋白酶K、二硫苏糖醇、柠檬酸三钠、Tween-20、布里杰-35等原料为主的裂解液中充分裂解，使核酸释放，释放的核酸在高盐、低PH的条件下与超顺磁羟基磁珠结合，后随磁场转移至不同的清洗液中洗去残留的杂质，最后在低盐溶液中磁珠与核酸分离，进而得到高纯度的核酸。

核酸提取的步骤主要分为样本裂解、核酸分子与磁珠或者硅胶柱结合、清洗、洗脱四个环节，清洗步骤作为核酸纯化过程中非常重要的环节，清洗的效果会直接影响提取的效率与纯度。目前核酸提取过程中最常用的清洗方法多为乙醇清洗，核酸在乙醇中的溶解度较低，经过不同含量的乙醇清洗后，可除去残留的蛋白与盐离子，从而得到高纯度的核酸。在清洗环节中，市场上常见的提取试剂清洗液多为两种，第一种清洗液多为高浓度的胍盐与一定含量的乙醇，用于除去残留的蛋白质及部分盐类。第二种多为75％～85％乙醇溶液，用于除去残留的盐类，对核酸进一步纯化。

核酸提取过程中使用乙醇清洗具有原料货源广、成本低等优点。但在使用过程中也会存在如下问题：1.乙醇残留：使用乙醇清洗后，需要增加一个晾干环节使残留的乙醇充分挥发，若晾干时间不足，残留的乙醇对下游酶反应将会有比较大的抑制作用；若晾干时间过长，体系失水过多，会导致磁珠与核酸进一步聚集，最终核酸很难回溶到水中，核酸的回收率大幅降低，进而可能造成低拷贝的核酸样本无法检出的情况。2.运输问题：乙醇属于易燃、易挥发的液体，其蒸气能与空气形成爆炸性混合物，清洗液中含有高浓度的乙醇，使核酸提取试剂的运输成为一大难题。很多厂家为了解决运输问题，将乙醇交由客户收到试剂后自行添加，但此方式使核酸提取的操作步骤变得繁琐，对于大批量样本检测时会造成检测效率降低。3.试剂开瓶稳定性：乙醇易挥发，添加过乙醇的提取试剂需即开即用，乙醇的含量对核酸清洗很重要，一般都要求新鲜配制，浓度太低，体系中过多的水会将部分核酸从磁珠上溶解下来，造成核酸的损失。具体使用多少浓度的乙醇视情况而定，浓度越高，体系中水越少，清洗盐离子的能力减弱，但核酸的溶解度小，回收率高；酒精浓度越低，盐离子可以清洗得更干净，但核酸的回收率可能会收到影响。因此，无封闭状态下乙醇挥发会造成提取效率大幅降低，从而导致提取效率降低。

发明内容

本发明的目的是，提供一种适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液及核酸提取试剂盒。主要解决现有技术中核酸提取过程使用乙醇清洗存在的诸多问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液，所述无醇清洗液包括清洗液A和清洗液B，所述清洗液A包括30mM～50mM的Tris-HCl、15％～30％的PEG、2～3M的钠盐，所述清洗液B包括30mM～50mM的Tris-HCl、50～100mg/mL的硅基磁珠、10％～15％的PEG、1.5～2.5M的钠盐。

作为优选实施方案，所述PEG的分子量为7200-8800

作为优选实施方案，所述Tris-HCl的pH值为7.3-7.5。

作为优选实施方案，所述钠盐为NaCl、NaSO₄、或CH₃COONa。

本发明还提供一种核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括所述的无醇清洗液。

作为优选实施方案，所述核酸提取试剂盒还包括裂解液，所述裂解液包括2.5～3.5M胍盐、2％～5％布里杰-35、15％～25％PEG、2％～5％非离子表面活性剂、50～80mM柠檬酸三钠、10～20mM Tris-HCl、0.15％～0.35％DTT。

作为优选实施方案，所述非离子表面活性剂为Tween 20、Triton X-100、或NP-40。

作为优选实施方案，所述核酸提取试剂盒还包括蛋白酶K溶液，其中蛋白酶K的浓度为20-50mg/mL。

作为优选实施方案，所述蛋白酶K溶液由20-50mg/mL的蛋白酶K(w/v)、30％～50％的甘油(v/v)、10mM～50mM的Tris、3Mm～8mM的氯化钙、30％～50％的DEPC水(v/v)组成。

作为优选实施方案，所述核酸提取试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液包括1～10mMTris-HCl、0.1～1mM EDTA。

本发明还提供所述的无醇清洗液、以及核酸提取试剂盒在提取生物样品中核酸的应用。

作为优选实施方案，所述生物样品为口咽拭子样本、鼻咽拭子样本、血浆、血清、痰液或唾液。

本发明的无醇清洗液提取核酸的方法包括如下步骤：

1.样本准备：将待抽提的样本充分混匀、短暂离心备用；

2.准备1.5mL的离心管，在管盖上做好标记备用；

3.往离心管中加入200μL～300μL待抽提的样本、500～700μL的裂解液、10～30μL的蛋白酶K溶液，充分混匀，于室温下静置5～15分钟，其中每3～5分钟上下颠倒混匀5～10次；

4.短暂离心，将离心管置于磁力架上1～2分钟，弃去上清；

5.往离心管中加入500～900μL的清洗液A，盖好管盖于涡旋震荡仪上混匀0.5～1分钟，短暂离心，后将离心管置于磁力架上1～2分钟，弃去上清；

6.往离心管中加入500～900μL的清洗液B，盖好管盖于涡旋震荡仪上混匀0.5～1分钟，短暂离心，后将离心管置于磁力架上1～2分钟，弃去上清；

7.加入50～100μL的洗脱液，于涡旋震荡仪上震荡3～5分钟，短暂离心，后将离心管置于磁力架上1～2分钟，待溶液澄清后将上清转移至新的1.5mL的离心管中，做好标记，于适当温度下保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1，本发明的无醇清洗液包括清洗液A和清洗液B两种，清洗液A为高浓度的PEG和一定浓度NaCl的水溶液，清洗液B为较低浓度的PEG和一定浓度NaCl水溶液。PEG可减少磁珠对杂质的吸附，一定浓度的NaCl也可以降低核酸在水中的溶解度。在不同浓度的PEG与NaCl溶液中清洗后可得到高含量高纯度的核酸样本。

2，采用本发明的核酸提取试剂盒可以减少乙醇残留对下游实验的影响，提高核酸纯度，进而提高检测的准确性。解决了乙醇的运输问题，提高了运输安全性。解决乙醇挥发导致的开平稳定性问题，使试剂稳定性更好。

附图说明

图1是本发明实施例1中配方一、配方二、有醇提取对应的平均Ct值的示意图。

图2是本发明实施例2中本发明试剂盒与竞品专利试剂盒提取样本Ct值的ROX通道(N)对比图。

图3是本发明实施例2中本发明试剂盒与竞品专利试剂盒提取样本Ct值的FAM通道(ORF-1ab)对比图。

图4是本发明实施例2中本发明试剂盒与竞品专利试剂盒提取样本Ct值的CY5通道(InfluA)对比图。

图5是本发明实施例2中本发明试剂盒与竞品专利试剂盒提取样本Ct值的VIC通道(InfluB)对比图。

图6是本发明实施例2中本发明试剂盒与竞品专利试剂盒提取样本Ct值的TAMRA通道(MS2)对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

在磁珠法提取核酸的反应体系中，核酸分子(DNA&RNA)会由线性压缩成球状，暴露出核酸骨架上大量的负电基团与反应体系中的阳离子连接，在磁珠最外层负电基团的作用下，形成“阴离子-阳离子-阴离子”的盐桥结构，使核酸分子被特异性地吸附到磁珠表面。而当反应缓冲液被弃除后，加入水性分子，会快速充分水化核酸分子，解除三者之间的离子相互作用，使吸附到磁珠上的核酸分子被纯化出来。

在较高浓度的PEG和NaCl溶液中，PEG夺取核酸分子(DNA&RNA)外面水化层的水，导致水化层被破坏，核酸分子发生聚集沉淀，带负电的磷酸基团裸露出来，通过钠离子与磁珠表面的羧基形成“盐桥”，使得核酸分子吸附到磁珠表面。核酸分子越长，表面裸露出来带负电的磷酸基团越多，整条分子带的负电就更强，更容易吸附到磁珠，只需要较低浓度的PEG和NaCl，就可以回收；核酸分子越短，就需要更高浓度的PEG和NaCl，将其表面的水化层破坏得更彻底，裸露出来足够多带负电的磷酸基团，才能被磁珠吸附住，从而得到回收；体系中的PEG还可以增加溶液的粘稠度，让磁珠保持悬浮不容易沉聚，在结合过程中更充分与核酸分子接触；同时PEG也不易造成蛋白变性和非特异性吸附。

结合后在磁力作用下，将吸附有核酸分子的磁珠转移至不同的清洗液中清洗，清洗过程依然是在PEG-NaCl体系中完成，除去蛋白、盐类及其他小分子化合物。

清洗完成后，将吸附有核酸分子的磁珠转移至水或者TE缓冲液中，这时体系中已经没有钠离子和PEG，无法形成电桥结构，带负电的核酸分子和磁珠之间相排斥，水重新包裹核酸形成水化层，使其从磁珠上洗脱下来，溶解到溶液中，进而得到高回收率、高纯度的核酸样本。

实施例1口咽拭子样本核酸的提取

自动化提取口咽拭子样本主要操作步骤如下：

1)按表1中的配方分别配制一批试剂备用。

表1

2)取一块干净的96孔深孔板，往深孔板的第一列中加入700μL配方一的裂解液，第二列加入900μL配方一的清洗液A，第三列加入900μL配方一的清洗液B与10μL的50mg/mL的硅基磁珠，第六列加入100μL配方一的洗脱液；

3)往上述深孔板的第七列中加入700μL配方二的裂解液，第八列加入900μL配方二的清洗液A，第九列加入900μL配方二的清洗液B与10μL的100mg/mL的硅基磁珠，第十二列加入100μL配方二的洗脱液。

4)将两种蛋白酶K溶液上下颠倒混匀，短暂离心备用。

5)准备有醇核酸提取试剂(上海思路迪生物医学科技有限公司沪闵械备20200069号，货号3103010007)作为参比试剂。

6)样本准备：采集足量的阴性咽拭子样本作为基质，将ANDiS SARS-CoV-2andInfluenza A/B RT-qPCR Detection Kit中的阳性对照稀释10倍，充分混匀备用。

7)对照组样本提取：从参比试剂盒(上海思路迪生物医学科技有限公司沪闵械备20200069号，货号3103010007)中取出一块试剂板上下颠倒混匀，短暂离心后撕去封板膜，分别往试剂板的第1列中加入200μL的上述样本、20μL的蛋白酶K溶液。后置于ANDiS 350核酸提取仪上按照表2所示的提取程序运行，程序运行结束后将第6列中回收到的核酸转移至8连管中，于2℃～8℃冰箱中暂存。

表2

8)本发明试剂提取：将配制好的各组分按要求分装至96孔深孔板中，分装量同参比试剂，分别往试剂板的第1列中加入200μL的上述样本、20μL配方一中的蛋白酶K溶液，往试剂板的第7列中加入200μL的上述样本、20μL配方二中的蛋白酶K溶液，后置于ANDiS 350核酸提取仪上运行表2中所示的提取程序，程序运行结束后将第6列与第12列中回收到的核酸转移至8连管中，于2℃～8℃冰箱中暂存。

9)根据思路迪ANDiS SARS-CoV-2and Influenza A/B RT-qPCR Detection Kit说明书要求，将提取到的两组样本分别使用该试剂盒在ABI7500上检测，按表3中的反应体系配制PCR Mix：

表3

10)在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上运行表4中的程序：

表4

11)程序运行结束后，导出数据，关闭仪器。

12)数据分析：样本提取Ct值的数据统计参见表5、表6、表7，经对比发现针对检测的5个通道，测试组样本Ct值与对照组样本相比，平均Ct值的差异均在1以内。参见图1，为配方一、配方二、有醇提取对应的平均Ct值的示意图。由图1可以看出：两种无乙醇提取的配方其提取效率不低于有乙醇提取。

表5配方一提取后Ct值

表6配方二提取后Ct值

表7有醇提取后Ct值

实施例2本发明核酸提取与同类产品的比对

本发明的核酸提取试剂与同类产品(一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒，申请号201910054549.1)对比如下：

1)配方对比：参见表8和表9，其中表8为本发明提取试剂配方，表9为对比专利201910054549.1的提取试剂配方。

表8

表9

2)提取性能对比：

a)试剂准备：按上述配方分别配制足量本发明与对比专利的核酸提取试剂；

b)样本准备：采集足量的阴性咽拭子样本作为基质，将ANDiS SARS-CoV-2andInfluenza A/B RT-qPCR Detection Kit中的阳性对照稀释10倍，充分混匀备用；

c)分别使用两种核酸提取试剂提取上述样本各8次；

d)根据思路迪ANDiS SARS-CoV-2and Influenza A/B RT-qPCR Detection Kit说明书要求，将提取到的两组样本分别使用该试剂盒在ABI7500上检测，按表3中的反应体系配制PCR Mix：

e)在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上运行表4中的程序：

f)程序运行结束后，导出数据，关闭仪器。

g)数据分析：样本提取Ct值的数据统计参见表10，经对比发现针对检测的5个通道，本发明提取的样本Ct值均比竞品试剂盒提取的样本Ct值提前2个Ct值以上，参见图2-图6，分别为本发明试剂盒与竞品专利试剂盒提取样本Ct值对应5个通道的对比图。数据结果表明：本发明提取试剂的回收率远远高于竞品无醇提取试剂的回收率。

表10

由表10数据可以得到：本发明的平均Ct相比专利201910054549.1提前约2个Ct以上，即理论回收率可达到对比专利的4倍以上。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

Claims

1.适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液，其特征在于：所述无醇清洗液包括清洗液A和清洗液B，所述清洗液A包括30mM～50mM的Tris-HCl、15％～30％的PEG、2～3M的钠盐，所述清洗液B包括30mM～50mM的Tris-HCl、50～100mg/mL的硅基磁珠、10％～15％的PEG、1.5～2.5M的钠盐。

2.如权利要求1所述的适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液，其特征在于：所述PEG的分子量为7200-8800。

3.如权利要求1所述的适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液，其特征在于：所述Tris-HCl的pH值为7.3-7.5。

4.如权利要求1所述的适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液，其特征在于：所述钠盐为NaCl、NaSO₄、或CH₃COONa。

5.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～4任一项所述的无醇清洗液。

6.如权利要求5所述的核酸提取试剂盒，其特征在于：所述核酸提取试剂盒还包括裂解液，所述裂解液包括2.5～3.5M胍盐、2％～5％布里杰-35、15％～25％PEG、2％～5％非离子表面活性剂、50～80mM柠檬酸三钠、10～20mM Tris-HCl、0.15％～0.35％DTT。

7.如权利要求6所述的核酸提取试剂盒，其特征在于：所述非离子表面活性剂为Tween20、Triton X-100、或NP-40。

8.如权利要求5所述的核酸提取试剂盒，其特征在于：所述核酸提取试剂盒还包括蛋白酶K溶液，蛋白酶K的浓度为20-50mg/mL。

9.如权利要求8所述的核酸提取试剂盒，其特征在于：所述蛋白酶K溶液由20-50mg/mL的蛋白酶K(w/v)、30％～50％的甘油(v/v)、10mM～50mM的Tris、3Mm～8mM的氯化钙、30％～50％的DEPC水(v/v)组成。

10.如权利要求5所述的核酸提取试剂盒，其特征在于：所述核酸提取试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液包括1～10mM Tris-HCl、0.1～1mM EDTA。

11.权利要求1～4任一项所述的无醇清洗液、3-10任一项所述的核酸提取试剂盒在提取生物样品中核酸的应用。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于：所述生物样品为口咽拭子样本、鼻咽拭子样本、血浆、血清、痰液或唾液。