CN118109649A - 一种基于RT-LAMP和CRISPR/Cas12a的猪塞内卡病毒可视化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种基于RT‑LAMP和CRISPR/Cas12a的猪塞内卡病毒可视化检测方法，属于病毒检测领域。本发明基于LAMP和CRISPR/Cas12a技术，建立了SVA检测方法，通过荧光法和试纸条法两种报告信号判别结果。实施例结果表明，该方法特异性强、灵敏性高。此外，本发明所述方法操作便捷，结果可视化；当体系中是荧光报告分子时，15～37℃反应15min，紫外光照射可观察结果；当体系中是生物素报告分子，15～37℃反应15min后，试纸条检测5min，肉眼可观察到结果。本发明所述方法的整个检测过程不超过1.5h，与PCR检测相比，大大节省了检测时间且不需要特殊仪器，并且CRISPR/Cas12a反应在室温10‑30℃就可以达到检测效果，使得本发明建立的方法更贴近基层临床检测。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种基于RT-LAMP和CRISPR/Cas12a的猪塞内卡病毒可视化检测方法。
背景技术
塞内卡病毒(SenecavirusA，SVA)是一种新发现的小型单股正链型RNA病毒，属于小RNA病毒科，塞内卡病毒属，其病毒粒子呈典型的二十面体对称，直径约为22～27nm。2002年，科学家首次从人类的胚胎视网膜细胞培养物中分离获得该病毒。因该病毒能特异靶向神经分泌细胞，具有溶瘤作用，所以，早期被用于抗肿瘤治疗研究。研究表明，该病毒可以感染不同年龄段的猪，临床症状主要表现为吻突部、皮肤、口腔粘膜和蹄部出现严重水泡甚至溃疡，新生仔猪死亡率最高。其特点与口蹄疫(Foot andmouth disease，FMD)、猪水疱病(Swine vesicular disease，SVD)、水疱性口炎病(Vesicular stomatitis，VS)等疾病相似，常常混合感染，这使得临床鉴别诊断变得困难。
目前，研究人员，已将PCR、RT-PCR、RT-qPCR以及ELISA等方法用于SVA实验室检测。然而，这些方法耗时较长，需要复杂的仪器设备、实验室环境及专业的操作人员，尤其不适用于临床环境检测。因此，迫切需要一种便捷、灵敏性高、特异性强、可视化的SVA检测方法，以便进行有效的病毒监测和流行病学调查。
发明内容
本发明的目的在于提供一种便捷、灵敏性高、特异性强、可视化的SVA检测方法，本发明提供的方法不仅特异性强、灵敏性高，而且便于携带，检测结果可视化，能够于SVA现场快速检测。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种猪塞内卡病毒可视化检测方法，所述方法包括：提取样品RNA进行RT-LAMP扩增，将扩增产物进行Cas12a切割反应，反应后对报告分子进行检测；所述切割反应的体系包括：Cas12a、crRNA、ssDNA报告分子和缓冲液，所述crRNA为SEQ ID No.11-13所示的序列之一；
优选的，所述crRNA为SEQ ID No.11所示的序列。
优选的，所述RT-LAMP扩增的反应体系中的引物包括：F3和B3，FIP和BIP，LF和LR，其序列为SEQ ID No.1-6所示。
优选的，RT-LAMP扩增反应的反应温度为50～65℃。
优选的，RT-LAMP扩增反应的反应时间为15～60min。
优选的，RT-LAMP扩增反应体系中包括Mg2+，Mg2+浓度为3～10mM。
优选的，RT-LAMP扩增反应结束后，80℃加热3min。
本发明所述检测方法中ssDNA报告分子为ssDNA荧光报告分子，所述ssDNA荧光报告分子为：5′-FAM-TTATT-BHQI-3′。
优选的，ssDNA荧光报告分子的浓度为50～1000nM。
优选的，Cas12a为LbCas12a，crRNA与LbCas12a的浓度均为25～250nM，。
优选的，反应温度4～42℃，反应时间为15min-35min。
本发明所述检测方法中ssDNA报告分子为ssDNA生物素报告分子，所述ssDNA生物素报告分子为：5′-FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin-3′。
优选的，所述ssDNA探针浓度为5～50nM，反应时间为10～35min，孵育时间为5～min。
本发明还提供了上述方法在检测猪塞内卡病毒中的应用。
有益效果
本发明基于LAMP和CRISPR/Cas12a技术，建立了SVA检测方法，通过荧光法和试纸条法两种报告信号判别结果。实施例结果显示，该检测方法不与FMDV、CSFV、PEDV、PCV2和PRRSV出现非特异交叉反应，CRISPR/Cas12a结合RT-LAMP扩增最低检测限为9.6copise/μL，和RT-qPCR检测最低限一致，表明本发明建立的方法特异性强、灵敏性高。
本发明建立了2步检测方法。第一步，提取样品RNA，进行RT-LAMP扩增，在65℃的恒温条件45min即可完成扩增。第二步，配制CRISPR/Cas12a检测体系，若体系中是荧光报告分子，37℃反应15min，紫外光照射可观察结果。若体系中是生物素报告分子，37℃反应15min后，试纸条检测5min，肉眼可观察到结果。整个检测过程不超过1.5h，与PCR检测相比，大大节省了检测时间且不需要特殊仪器。本发明还发现CRISPR/Cas12a反应，并不需要37℃，室温10-30℃就可以满足实验要求，这使得建立的方法更贴近基层临床检测。
本发明所述方法在RT-LAMP扩增结束后，80℃加热3min，使Bst 4.0DNA/RNAPolymerase酶完全失活，避免了开盖气溶胶污染，取得良好的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为SVA检测示意图
图2为SVAPCR扩增，其中M：DNAMarker；1：SVAPCR产物；2：阴性对照
图3为RT-LAMP反应温度测试结果
图4为RT-LAMP反应时间测试结果
图5为RT-LAMP反应Mg2+浓度测试结果
图6为crRNA1靶点序列
图7为crRNAs活性筛选结果
图8为crRNAs筛选结果柱状图
图9为crRNA1序列保守性分析
图10为荧光法ssDNA探针浓度检测结果
图11为荧光法ssDNA探针浓度检测结果柱状图
图12为crRNA与LbCas12a最适浓度的测试
图13为CRISPR/Cas12a荧光法反应温度检测结果图
图14为CRISPR/Cas12a荧光法反应温度检测结果柱状图
图15为CRISPR/Cas12a荧光法反应时间检测结果图
图16为CRISPR/Cas12a荧光法反应时间检测结果折线图
图17为试纸条法ssDNA探针浓度检测结果
图18为试纸条法Cas12a切割时间检测结果
图19为试纸条孵育时间检测结果
图20为CRISPR/Cas12a荧光法特异性试验结果图
图21为CRISPR/Cas12a荧光法特异性试验结果柱状图
图22为CRISPR/Cas12a试纸条特异性试验结果
图23为CRISPR/Cas12a荧光法结合PCR扩增灵敏性试验结果
图24为CRISPR/Cas12a荧光法结合PCR扩增灵敏性试验结果柱状图
图25为CRISPR/Cas12a试纸条法结合PCR扩增灵敏性试验结果
图26为CRISPR/Cas12a荧光法结合LAMP扩增灵敏性试验结果图
图27为CRISPR/Cas12a荧光法结合LAMP扩增灵敏性试验结果柱状图
图28为CRISPR/Cas12a试纸条法结合LAMP扩增灵敏性试验结果
图29为CRISPR/Cas12a荧光法结合RT-LAMP扩增灵敏性试验结果图
图30为CRISPR/Cas12a荧光法结合RT-LAMP扩增灵敏性试验结果柱状图
图31为CRISPR/Cas12a试纸条法结合RT-LAMP扩增灵敏性试验结果
图32为RT-qPCR灵敏性试验结果
具体实施方式
本发明提供了一种猪塞内卡病毒可视化检测方法，所述方法包括：提取样品RNA进行RT-LAMP扩增，将扩增产物进行Cas12a切割反应，反应后对报告分子进行检测；所述切割反应的体系包括：Cas12a、crRNA、ssDNA报告分子和缓冲液，所述crRNA为SEQ ID No.11-13所示的序列之一；所述crRNA优选为SEQ ID No.11所示的序列。SVA检测示意图如图1所示。
本发明中的RT-LAMP扩增反应体系中的引物包括：F3和B3，FIP和BIP，LF和LR，其序列为SEQ ID No.1-6所示。本发明中RT-LAMP扩增反应体系中其它成分不做特殊限定，采用本领域常规成分即可。
本发明中的RT-LAMP扩增反应的反应温度为50～65℃，优选为65℃。
本发明中的RT-LAMP扩增反应的反应时间为15～60min，优选为45～60min，最优选为45min。
本发明中的RT-LAMP扩增反应体系中还包括Mg2+，Mg2+浓度为3～10mM，优选为7mM。
RT-LAMP扩增反应结束后，80℃加热3min，使Bst 4.0DNA/RNA Polymerase酶完全失活，避免开盖气溶胶污染，产生假阳性结果。
本发明所述检测方法中ssDNA报告分子为ssDNA荧光报告分子，所述ssDNA荧光报告分子为：5′-FAM-TTATT-BHQI-3′。该方法为荧光法检测的方法。ssDNA荧光报告分子的浓度为50～1000nM，优选为500～1000nM，最优选为500nM。
本发明荧光法检测的方法中，Cas12a为LbCas12a，crRNA与LbCas12a的浓度均为25～250nM，优选为：LbCas12a浓度为200nM，crRNA浓度100nM。
本发明荧光法检测的方法中的反应温度4～42℃，优选为37℃，或优选为10-30℃。反应时间为15min-35min，优选为15min。
本发明所述检测方法中ssDNA报告分子为ssDNA生物素报告分子，所述ssDNA生物素报告分子为：5′-FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin-3′。CRISPR-Cas12a反应结束后用试纸条检测，该方法为试纸条法。ssDNA探针浓度为5～50nM，优选为50nM。反应时间为10～35min，优选为15min。孵育时间为5～min，优选为5min。
本发明所述检测方法的靶向序列可以是如SEQ ID No.16所示的序列，SEQ IDNo.16：
TTAGCGGGTCTCCTCACAAATTTCAGTGGAATCTTGAACCCTCTTGGCTACCTCAAAGATCACAATACCGAAGAAATGGAAAACTCTGCTGATCGAGTCATAACGCAAACGGCGGGCAACACTGCCATAAACACGCAATCATCACTGGGTGTGTTGTGTGCCTACGTTGAAGACCCGACCAAGTCTGACCCTCCGTCCAGCAGCACAGATCAGC
本发明实施例中用到的主要材料包括：
塞内卡病毒(SVA)FJ株、口蹄疫病毒(FMDV)O型MYA98株、猪瘟病毒(CSFV)毒株C、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株、猪圆环病毒2型(PCV2)LG株和猪蓝舌病毒(PRRSV)JXA1株的来源没有要求，可以是来源于中国农业科学兰州兽医研究所国家重点实验室的保藏株。核酸Marker、PrimeSTAR酶、T4连接酶、RT-PCR试剂盒、RT-qPCR试剂盒和体外T7转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司、LbCas12a(Cpf1)Nuclease试剂盒购自TOLOBIO公司，LAMP试剂盒购自哈尔滨新海基因有限公司、Cas12a核酸检测试纸条购自北京同汇生物技术有限公司。DNA纯化回收试剂盒和Trizol购自天根生物科技(北京)有限公司。RNA纯化回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。Top10和BL21大肠杆菌感受态购自北京全式金生物技术有限公司，69份临床样本来自甘肃不同养殖场病猪的水疱液和血液。
本发明实施例中涉及到的生产工艺、实验方法或检测方法，若无特别说明，均为现有技术中的常规方法，且其名称和/或简称均属于本领域内的常规名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
本发明实施例中使用的各种仪器、设备、原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过正规商业途径购买获得的常规产品，也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
引物设计与质粒构建
引物设计和序列合成
通过GenBank获取SVA公布的多条SVA基因组序列，使用BLAST进行比对分析，利用在线设计软件Primer ExplorerV 5.0，在其基因组保守区域设计选用评分最高的LAMP引物(纯化方式为HPLC)，共3对引物，分别为：F3和B3；FIP和BIP；LF和LR。利用Primer5.0软件设计RT-qPCR引物：Q-F和Q-R，通过在引物5′端添加T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)设计RNA标准品扩增引物：RNA-F和RNA-R。
利用在线网站CRISPOR(http://crispr.tefor.net/)，设计3对crRNAs，分别为：crRNA1、crRNA2、crRNA3。根据文献报道设计ssDNA荧光报告分子(5′-FAM-TTATT-BHQI-3′)和ssDNA生物素报告分子(5′-FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin-3′)。以上序列均由金唯智(天津)生物科技股份有限公司合成，序列如表1所示。
表1序列信息
为符合产权组织ST.26标准，序列表文件中SEQ ID No.11-13中的U为T表示。
重组质粒构建与RNA标准品制备
将培养的SVA样品，按照RNA提取说明书提取病毒RNA。以RNA为模板，进行RT-PCR扩增。扩增体系(25μL)为：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μL，2×1Step Buffer 12.5μL，F3，B3引物各1μL，模板1μL，ddH2O 8.5μL。反应程序为：50℃30min，94℃2min，98℃10s，60℃30s，72℃1min，30个循环。经过PCR扩增后，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示：在214bp处有特异条带，大小符合预期(图2)。扩增产物，经纯化回收与pDM19-T经T4 DNA连接酶16℃连接3h。连接体系(20μL)为：T4 DNA Ligase 1μL、T4 DNA Ligase buffer 2μL、扩增产物11μL，线性化pDM19-T质粒1μL、ddH2O 5μL。得到的连接产物(pDM19-TMB)经42℃热激转化至大肠杆菌感受态细胞Top10中，提取质粒，经测序验证，成功构建重组质粒pMD19-TMB，-80℃保存备用。
以测序正确的线性化pMD19-TMB为模版，RNA-F和RNA-R为引物，进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳鉴定后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收。将回收产物按T7转录酶说明书步骤37℃转录5h，对RNA转录产物进行DNaseⅠ消化后，用RNA纯化回收试剂盒进行纯化，得到RNA标准品，-80℃保存备用。
实施例2
RT-LAMP方法的反应体系构建及各反应条件测试
RT-LAMP反应体系：
根据表2所示RT-LAMP反应体系进行扩增，并以无RNA酶水作为阴性对照。待反应结束后，80℃加热3min，使Bst 4.0DNA/RNA Polymerase酶完全失活，避免开盖气溶胶污染，产生假阳性结果。接着，吸取3μL扩增产物，0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳。
表2RT-LAMP反应体系
LAMP反应条件测试：
反应温度
按试剂盒推荐体系，分别于50℃、55℃、60℃、65℃进行RT-LAMP扩增，待反应结束，利用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳检测，各温度的扩增结果如图3所示，各温度均可扩增出目标产物，最佳反应温度为65℃。
反应时间
在最佳反应温度下，保持温度不变，RT-LAMP反应分别进行15min、30min、45min和60min，扩增产物，利用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测结果如图4所示，各反应时间均可扩增出目标产物，45min时的扩增效果与60min基本一致，选择最佳反应时间为45min。
Mg2+浓度
在最佳反应温度和最佳反应时间条件下，保持温度和时间不变，分别使用Mg2+浓度为3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM和10mM进行RT-LAMP扩增，扩增产物，利用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳检测，反应结果如图5所示，各浓度均可扩增出目标产物，Mg2+浓度为7mM时，RT-LAMP扩增效率较高。
实施例3
基于CRISPR/Cas12a系统结合RT-LAMP检测SVA
crRNAs活性筛选
按TOLOBIO公司LbCas12a(Cpf1)Nuclease试剂盒说明步骤(反应体系如表3所示)，分别用crRNA1、crRNA2、crRNA3与重组质粒、LbCas12a Nuclease、ssDNAReporter(荧光探针)及10×HOLMES Buffer为体系，37℃进行反应，待反应结束后，使用凝胶成像仪进行结果观察，同时，检测每组反应体系荧光信号强度。
结果如图7和图8所示，含有3对crRNAs体系的试管中均发出绿色荧光，说明3对crRNAs均有切割活性。经荧光测定，crRNA1荧光强度最高(靶点序列设计如图6所示)，crRNA2次之，crRNA3最弱，说明crRNA1靶向活性最高。因此，选用crRNA1进行后序实施例的试验。对crRNA1的保守性进行分析，结果发现，crRNA1在NCBI上公布的不同SVA毒株(仅显示18株)序列中，高度保守，未出现突变(图9)。因此，该crRNA可用于SVA诊断检测。
表3LbCas12a切割反应体系
CRISPR-Cas12a检测体系构建
(1)CRISPR-Cas12a荧光法检测体系各反应条件的测试
CRISPR-Cas12a荧光法ssDNA探针浓度
按照表3所示体系，其他条件不变，调整ssDNA探针浓度为：0nM、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、500nM和1000nM，检测结果如图10和图11所示，随着ssDNA探针浓度升高，荧光值增强。当ssDNA探针浓度为1000nM时，荧光强度最高，但荧光强度与500nM时的荧光强度相比，变化不大，差异不显著(p<0.01)。当ssDNA探针浓度低于50nM时，荧光强度与对照组荧光强度相比，差异不显著(p<0.01)。为了使荧光尽可能释放出来且节省成本，ssDNA探针最佳反应浓度为为500nM。
CRISPR-Cas12a荧光法crRNA与LbCas12a浓度
按照表3所示体系，在重组质粒、ssDNAReporter和10×HOLMES Buffer浓度不变的情况下，根据LbCas12a浓度(25nM、50nM、100nM、150nM、200nM和250nM)与crRNA浓度(25nM、50nM、100nM、150nM、200nM和250nM)，进行正交实验，同时，检测每组反应体系荧光信号强度。检测结果如图12和表4所示，当LbCas12a浓度为200nM，crRNA浓度100nM时，荧光强度最高。crRNA与LbCas12a的最适浓度为：LbCas12a浓度为200nM，crRNA浓度100nM。
表4crRNA与LbCas12a最适浓度的测试
CRISPR-Cas12a荧光法反应温度
在ssDNA探针、crRNA和LbCas12a最适浓度下，分别在4℃、15℃、25℃、37℃和42℃进行CRISPR-Cas12a反应，并以无RNA酶水作为阴性对照，30min后，检测结果如图13和图14所示，不同温度下，反应均能产生绿色荧光，但在37℃的条件下，荧光强度最高。因此，37℃为CRISPR-Cas12a荧光法最适反应温度。但在实际操作过程中，37℃恒温条件不容易实现或者操作过于繁琐，室温下(10-30℃)进行往往更为便捷，因此，后序试验均在室温下进行。
CRISPR-Cas12a荧光法反应时间
在ssDNA探针、crRNA、LbCas12a最适浓度以及最佳反应温度下，进行CRISPR-Cas12a反应，在反应5min、10min、15min、20min、25min、30min和35min时，检测每组反应体系荧光信号强度，并以无RNA酶水作为阴性对照。检测结果如图15和图16所示，随着反应时间增加，反应荧光强度也随之增强，在15min-35min时，荧光强度变化幅度较小。因此，以15min作为CRISPR-Cas12a荧光法反应时间。
(2)CRISPR-Cas12a侧向流层析试纸条法检测体系各反应条件的测试CRISPR-Cas12a试纸条法ssDNA探针浓度
根据侧向流层析试纸条说明步骤，将ssDNA探针浓度稀释为：5nM、50nM、500nM、5μM、50μM后，插入试纸条后，将只有C线显色而T线不显色的ssDNA探针浓度作为阴性对照浓度。结果如图17所示，当ssDNA探针浓度小于50nM时，T线不再出现，因此，选择ssDNA探针终浓度为50nM用于后续试验。
CRISPR-Cas12a试纸条法Cas12a切割时间
使用50nM的ssDNA探针浓度，进行CRISPR-Cas12a反应，设置6个反应时间梯度，分别在反应5min、10min、15min、20min、25min、30min和35min时，无RNA酶水补足70μL，将试纸条插入每组试管。观察试纸条T线变化情况，结果如图18所示，随着反应时间延长，试纸条T线也变得越发明显，15min时，T线已经很明显，且能满足实验需求。所以选择15min为试纸条Cas12a反应时间，用于后续实验。
CRISPR-Cas12a试纸条孵育时间
使用上述ssDNA浓度和CRISPR-Cas12a切割时间，待反应结束后，无RNA酶水补足70μL。在反应第5min和10min时，观察试纸条T线情况，结果如图19所示，孵育5min时，阴性试纸条仅出现C线，阳性试纸条则出现C和T线。孵育10min时，试纸条与孵育5min时的结果一致。为了避免孵育时间过长，出现假阳性，5min作为试纸条最佳孵育时间。
侧向流层析试纸条检测结果判断标准：如果只出现C线，表明结果为阴性，反应产物中不含待测病毒核酸。如果同时出现C线和T线，表明结果为阳性，反应产物中含有待测病毒核酸。如果只出现T线，同样表明结果为阳性，反应产物中含有高浓度的待测病毒核酸。
实施例4
CRISPR-Cas12a检测体系特异性试验
使用实施例2、3中最优的反应条件，以SVA、FMDV、CSFV、PEDV、PCV2和PRRSV的核酸(RNA或DNA)作为模板，进行RT-LAMP扩增(PCV2为LAMP扩增)。待反应结束后，以扩增产物进行CRISPR/Cas12a荧光法和试纸条法检测，并以无RNA酶水，作为阴性对照。
RT-LAMP扩增结果显示，仅仅以SVA为扩增模板时，凝胶电泳时出现条带。CRISPR/Cas12a荧光法结果显示，仅仅检测SVA的试管中出现绿色荧光(图20和图21)。CRISPR/Cas12a试纸条法结果显示，仅检测SVA的试纸条出现T线(阳性)，检测的其余病毒及阴性试纸条仅出现C线(阴性)(图22)。结果证明，本研究建立的方法特异性良好。
实施例5
CRISPR-Cas12a检测灵敏性试验
(1)CRISPR/Cas12a结合PCR扩增灵敏性试验
将重组质粒浓度换算成拷贝数，10倍梯度稀释，选择8,3×100-8.3×108拷贝数作为模板，进行PCR扩增。待反应结束后，以PCR扩增产物进行CRISPR/Cas12a荧光法和试纸条法检测。检测结果显示，CRISPR/Cas12a结合PCR扩增荧光法和试纸条法最低检测限为8.3×103copies/μL(图23、图24和图25)。
(2)CRISPR/Cas12a结合LAMP扩增灵敏性试验
将重组质粒浓度换算成拷贝数，10倍梯度稀释，选择8.3×10-1-8.3×108拷贝数作为模板，进行LAMP扩增。待反应结束后，进行CRISPR/Cas12a荧光法和试纸条法检测。检测结果显示，CRISPR/Cas12a结合LAMP扩增，荧光法和试纸条法最低检测限均为8.3copies/μL(图26、图27和图28)。
(3)CRISPR/Cas12a结合RT-LAMP扩增灵敏性试验
将RNA标准品浓度换算成拷贝数，10倍梯度稀释，选择9.6×10-1-9.6×106拷贝数作为模板，进行RT-LAMP扩增。待反应结束后，CRISPR/Cas12a荧光法和试纸条法检测灵敏性。同时，以RT-qPCR进行平行检测，比较3种方法的灵敏性，RT-qPCR以样本Ct值大于35作为阴性判断标准。结果如图29、图30和图31显示，以RNA标准品拷贝数为模板进行RT-LAMP扩增，荧光法和试纸条法最低检测限为9.6copies/μL。RT-qPCR检测最低限为9.6copies/μL(图32)。即CRISPR/Cas12a结合RT-LAMP扩增灵敏性与RT-qPCR检测结果一致。
实施例6
临床样本的检测
采集来自甘肃不同养殖场的病猪水疱液和血液样本，提取69份样本RNA后，使用本研究建立的RT-LAMP-CRISPR/Cas12a荧光法和试纸条法进行检测。同时，用RT-qPCR进行平行检测，结果三者检出阳性率均为26.1％，符合率为100％(表5)。结果证明，本研究建立的RT-LAMP-CRISPR/Cas12a方法，具有临床应用价值。
表5SVA临床样本检测结果
由以上实施例可知本发明提供的方法灵敏性高、特异性强、不需要大型仪器以及专业操作人员，为SVA的早期快速诊断、流行病学调查提供新的手段。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种猪塞内卡病毒可视化检测方法，其特征在于，所述方法包括：提取样品RNA进行RT-LAMP扩增，将扩增产物进行Cas12a切割反应，反应后对报告分子进行检测；所述切割反应的体系包括：Cas12a、crRNA、ssDNA报告分子和缓冲液，所述crRNA为SEQ ID No.11-13所示的序列之一。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RT-LAMP扩增的反应体系中的引物包括：F3和B3，FIP和BIP，LF和LR，其序列为SEQ ID No.1-6所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RT-LAMP扩增反应的反应温度为50～65℃，反应时间为15～60min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RT-LAMP扩增反应结束后，80℃加热3min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ssDNA报告分子为ssDNA荧光报告分子，所述ssDNA荧光报告分子为：5′-FAM-TTATT-BHQI-3′。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas12a为LbCas12a，crRNA与LbCas12a的浓度均为25～250nM。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，Cas12a切割反应的反应温度为4～42℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ssDNA报告分子为ssDNA生物素报告分子，所述ssDNA生物素报告分子为：5′-FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin-3′。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ssDNA探针浓度为5～50nM，反应时间为10～35min，孵育时间为5～min。
10.权利要求1-9任一项所述方法在检测猪塞内卡病毒中的应用。
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