CN117106980A - 一种检测传染性脾肾坏死病毒isknv的引物组、试剂盒和方法 - Google Patents

一种检测传染性脾肾坏死病毒isknv的引物组、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组、试剂盒和方法。本发明针对ISKNV的MCP保守序列设计得到的引物组，包含核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物，该引物组能够特异性地检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV。实验表明，采用本发明提供的引物组能够特异性地将ISKNV病毒，最低检出限为6.71×100copies/μL，灵敏度高、准确性强，且操作过程简便快捷。

Description

一种检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组、试剂盒和方法。
背景技术
ISKNV成熟病毒粒子为二十面体，横切面为六边形，直径约为150nm，因该病主要引起鳜鱼的肾脏和脾脏肿大，故将其命名为传染性脾肾坏死病毒。ISKNV病毒的发病率高达60％以上，感染ISKNV病毒初期，病鱼活动力下降，体表有多处出血点，解剖后可见脾肾肿大坏死，肝表面有出血点，小肠有黄色透明流晶样液体，感染病毒7～10d后死亡率达100％，严重影响着我国鳜鱼养殖业的发展。
现有技术中针对传染性脾肾坏死病毒的检测方法，包括病理解剖、电镜观察法、常规PCR和常规血清学方法等。然而，这些方法过程较为复杂，无法快速、灵敏的对传染性脾肾坏死病毒进行检测。此外，尽管荧光定量PCR检测方法已被广泛应用于多种病毒的检测之中，但目前还未见以SYBR Green荧光定量PCR检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组、试剂盒和方法，该方法具有简便快捷、灵敏度高、特异性强的特点。
本发明提供了一种特异性检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了上述技术方案的引物组在制备检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的试剂盒和/或试剂中的应用。
优选的，所述检测的样本来源包括鲈鱼、鳜鱼和罗非鱼中的一种或多种。
本发明提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组和PCR扩增试剂。
优选的，所述PCR扩增试剂包括SYBR GreenMasterMix。
优选的，所述引物组中上游引物和下游引物的浓度分别为10μM。
本发明还提供了一种检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA为模板，利用检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组进行SYBR Green实时荧光PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线；
对所述荧光定量PCR扩增曲线进行分析并作出判断；
当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值＜35时，则判定待测样本为阳性；
当无荧光定量PCR扩增曲线或所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值≥35时，则所述待测样本为阴性。
优选的，所述待测样本包括：脾组织样、肾组织、肌肉组织、肠系膜和血液中的一种或多种。
优选的，所述SYBR Green实时荧光PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：10.0μL的2×SYBR Green Premix Ex Taq II，(1.9～2.1)μL的基因组DNA模板，0.8μL 10μM的上游引物，0.8μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL。
优选的，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，58～61℃退火34s，运行40个循环。
有益效果：
本发明提供了一种特异性检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该引物组是针对ISKNV的保守序列设计得到的，能够特异性地检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV。
基于上述技术优势，本发明还提供了一种检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA为模板，利用检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组进行SYBR Green实时荧光PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线；对所述荧光定量PCR扩增曲线进行分析并作出判断；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值＜35时，则判定待测样本为阳性；当无荧光定量PCR扩增曲线或所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值≥35时，则所述待测样本为阴性。实验表明，采用本发明提供的检测方法能够特异性地将ISKNV病毒，最低检出限为6.71×100copies/μL，灵敏度高、准确性强，且操作过程简便快捷。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中模板添加量为1.7μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图2为实施例1中模板添加量为1.8μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图3为实施例1中模板添加量为1.9μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图4为实施例1中模板添加量为2.0μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图5为实施例1中模板添加量为2.1μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图6为实施例1中模板添加量为2.2μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图7为实施例1中模板添加量为2.3μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图8为实施例1中引物添加量为0.6μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图9为实施例1中引物添加量为0.8μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图10为实施例1中引物添加量为1μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图11为实施例1中引物添加量为1.2μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图12为实施例1中引物添加量为1.4μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图13为实施例1中退火温度为57℃时的荧光定量PCR扩增曲线；
图14为实施例1中退火温度为58℃时的荧光定量PCR扩增曲线；
图15为实施例1中退火温度为59℃时的荧光定量PCR扩增曲线；
图16为实施例2中荧光定量PCR的标准曲线；
图17为实施例3中荧光定量PCR的敏感性实验结果图；
图18为实施例3中普通PCR的敏感性实验结果图；
图19为实施例4中荧光定量PCR的特异性实验结果图；
图20为实施例5中荧光定量PCR的变异系数分析结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种特异性检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明中，所述引物组是针对ISKNV的MCP保守序列(NCBI序列号为HQ317460)设计得到的。本发明所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-GAGGACCTGCTCATCAGCCAGAG-3’；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’-TTGGTCAGTGCGGGTGCTACATT-3’。本发明所述上游引物和下游引物能够特异性的检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV。
本发明还提供了上述技术方案的引物组在制备检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的试剂盒和/或试剂中的应用。在本发明中，所述引物组优选为在制备检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的试剂盒中的应用，所述检测的种类优选为鲈鱼、鳜鱼和罗非鱼中的一种或多种，更优选为鳜鱼。利用本发明提供的引物组能够特异性地将鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV检测出来。
本发明还提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组和PCR扩增试剂。在本发明中，所述PCR扩增试剂优选包括SYBR Green I、DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+。本发明对所述SYBR Green I、DNA聚合酶、dNTPs和缓冲试剂的来源、用量没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可，同时，本申请所述PCR扩增试剂可自行组合配制也可使用市售试剂盒或预混液，如在本发明的具体实施例中，所述PCR扩增试剂为SYBR Green Master Mix，进一步优选包括SYBR Green Premix Ex Taq II，更优选包括2×SYBR Green Premix Ex Taq II。本发明对所述SYBR GreenMasterMix的来源、品牌没有限制，常规购买即可。
本发明所述上游引物的浓度优选为10μM；所述下游引物的浓度优选为10μM。
本发明还提供了一种检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物组进行SYBR Green实时荧光PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线；对所述荧光定量PCR扩增曲线进行分析并作出判断；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值＜35时，则判定待测样本为阳性；当无荧光定量PCR扩增曲线或所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值≥35时，则所述待测样本为阴性。
本发明优选提取待测样本的基因组DNA，得到待测样本基因组DNA。在本发明中，所述待测样本基因组DNA的提取方式优选为采用病毒基因组DNA提取试剂盒。在本发明的具体实施例中，采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的病毒基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取。本发明所述取待测样本优选为脾组织样、肾组织、肌肉组织、肠系膜、血液和环境样本中的一种或多种，更优选为脾组织样、肾组织、肌肉组织、肠系膜、血液或环境样本；所述环境样本优选包括污水、淤泥、人员、车辆等环境样品。
得到所述待测样本基因组DNA后，本发明以待测样本的基因组DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物组进行SYBR Green实时荧光PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线。本发明所述SYBR Green实时荧光PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括：10.0μL的2×SYBR Green Premix Ex Taq II，(1.9～2.1)μL的基因组DNA模板，0.8μL 10μM的上游引物，0.8μL 10μM的下游引物，余量无RNA酶水。
在本发明中，所述基因组DNA模板的添加量进一步优选为2.0μL，通过优化荧光定量PCR扩增的反应体系中各物质的添加量有利于荧光定量PCR扩增曲线Ct值更为稳定。
本发明所述实时荧光PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性30s，95℃变性5s，58～61℃退火34s，运行40个循环。在本发明中，所述退火温度优选为58～59℃，更优选为59℃。采用本发明提供的实时荧光PCR扩增的反应体系和反应程序尤其适合检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV。
得到所述荧光定量PCR扩增曲线后，本发明依据荧光定量PCR扩增曲线的Ct值对检测结果进行分析值对检测结果进行判断。在本发明中，当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值＜35时，则判定待测样本为阳性；当无荧光定量PCR扩增曲线或所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值≥35时，则所述待测样本为阴性。通过对荧光定量PCR扩增曲线进行分析，有利于提高检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的特异性。
本发明所述检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的方法优选为非诊断目的的检测，但是诊断目的的检测方法也属于本发明的保护范围。
实验证明，采用本发明提供的检测方法能够特异性地检测鳜鱼ISKNV病毒，其最低检出限为6.71×100copies/μL，因此，本发明提供的方案灵敏度高、准确性强，且操作过程简便快捷。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组、试剂盒和方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
传染性脾肾坏死病毒SYBR Green实时荧光PCR检测方法的建立：
1.引物设计：根据ISKNV的MCP保守序列设计特异性引物组合：ISKNV-F和ISKNV-R，扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5’-GAGGACCTGCTCATCAGCCAGAGCAACCAGGCCGACATGGCCATATCG ACCGTCACCCTGGCTAACATTGGCAATGTAGCACCCGCACTGACCAA-3’。该引物组合的核苷酸序列如表1所示，引物均于擎科生物科技有限公司合成。
表1SYBR Green实时荧光定量PCR引物组合核苷酸序列
2.标准品的建立：以ISKNV的MCP保守序列(NCBI序列号为HQ317460)构建阳性质粒，阳性质粒由北京擎科生物科技股份有限公司合成，纯化后的PCR产物以T载体连接，构建重组质粒。重组质粒的初始拷贝数为6.71×1010copies/μL，对其进行10倍浓度稀释，获得拷贝数为6.71×109～1×100copies/μL等10个稀释度的重组质粒作为标准品模板，将拷贝数为6.71×109copies/μL的重组质粒记作标准品1，将拷贝数为6.71×108copies/μL的重组质粒记作标准品2，将拷贝数为6.71×107copies/μL的重组质粒记作标准品3，将拷贝数为6.71×106copies/μL的重组质粒记作标准品4，将拷贝数为6.71×105copies/μL的重组质粒记作标准品5，将拷贝数为1×104copies/μL的重组质粒记作标准品6，将拷贝数为6.71×103copies/μL的重组质粒记作标准品7，将拷贝数为6.71×102copies/μL的重组质粒记作标准品8，将拷贝数为6.71×101copies/μL的重组质粒记作标准品9，将拷贝数为6.71×100copies/μL的重组质粒记作标准品10。
3.反应条件的优化
3.1模板DNA添加量的确定
以标准品5为模板DNA；分别设置模板的添加量为1.7μL、1.8μL、1.9μL、2.0μL、2.1μL、2.2μL和2.3μL添加到PCR扩增的反应体系中，以不添加模板DNA的处理为空白对照组，每个添加量重复扩增三次(结果见图1～图7，图1～图7的横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数)。
引物信息：
上游引物ISKNV-F：5’-GAGGACCTGCTCATCAGCCAGAG-3’；
下游引物ISKNV-R：5’-TTGGTCAGTGCGGGTGCTACATT-3’。
PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×SYBR Green Premix Ex Taq II(TaRaKa公司)，模板DNA，0.8μL 10μM的上游引物，0.8μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，59℃退火34s，运行40个循环。
由图1～图7可以看出，当模板DNA的添加量为1.9～2.1μL时(图3～图5)，其扩增曲线的Ct值更为稳定，重复性好；而当模板DNA添加量为1.7μL(图1)时扩增曲线的Ct值分别为17.53、20.61、17.63；1.8μL(图2)时扩增曲线的Ct值分别为18.58、18.76、17.80；2.2μL(图6)时扩增曲线的Ct值分别为17.57、17.39、16.90和2.3μL(图7)时扩增曲线的Ct值分别为17.12、16.93、17.58，扩增曲线的Ct值浮动大，稳定性和重复性差，不利于特异性扩增。因此，当模板DNA的添加量为1.9～2.1μL时，其扩增曲线稳定性好且扩增速度快，尤其当模板DNA的添加量为2.0μL时，稳定性最好且扩增速度最快。
3.2引物添加量的确定
以标准品5为模板DNA，分别设置引物的添加量为0.6μL、0.8μL、1μL、1.2μL和1.4μL添加到PCR扩增的反应体系中，每个添加量重复扩增三次(结果见图8～图12，图8～图12的横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数)。
引物信息：
上游引物ISKNV-F：5’-GAGGACCTGCTCATCAGCCAGAG-3’；
下游引物ISKNV-R：5’-TTGGTCAGTGCGGGTGCTACATT-3；
其中上游引物和下游引物的浓度分别为10μM和10μM，且PCR扩增的反应体系中上下游引物的添加量相同。
PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×SYBR GreenPremix Ex Taq II，2.0μL的模板DNA，10μM的上游引物，10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，59℃退火34s，运行40个循环。
由图8～图12可以看出，当上游引物和下游引物的添加量分别为0.8μL时(图9)，扩增曲线的Ct值相对较为稳定；而当上游引物和下游引物的添加量分别为0.6μL(图8)、1μL(图10)、1.2μL(图11)和1.4μL(图12)时，扩增曲线的Ct值稳定性较差，不利于特异性扩增。因此，当上游引物和下游引物的添加量分别为0.8μL时，稳定性更好且扩增速度更快。
3.3退火温度的确定
以标准品5为模板DNA，分别设置退火温度为57℃、58℃和59℃进行PCR扩增的反应，每个温度设置三次重复扩增(结果见图13～图15，图13～图15的横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数)。
引物信息：
上游引物ISKNV-F：5’-GAGGACCTGCTCATCAGCCAGAG-3’；
下游引物ISKNV-R：5’-TTGGTCAGTGCGGGTGCTACATT-3’，
PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×SYBR GreenPremix Ex Taq II，2.0μL的模板DNA，0.8μL 10μM的上游引物，0.8μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，退火34s，运行40个循环。
由图13～图15可以看出，当退火温度和58℃(图14)和59℃时(图15)，其扩增曲线的Ct值浮动小更为稳定；而当退火温度为57℃(图13)时，其扩增曲线的Ct值稳定性较差，其浮动范围广，不利于特异性扩增。因此，当退火温度为58～59℃时，扩增曲线的Ct值较为稳定，且当退火温度为59℃时，扩增曲线的Ct值更稳定，扩增速度更快。
综上可知，利用SYBR Green实时荧光PCR检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV时SYBRGreen实时荧光PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×SYBR Green Premix Ex Taq II，(1.9～2.1)μL的基因组DNA模板，0.8μL 10μM的上游引物，0.8μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL；实时荧光PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，(58～59)℃退火34s，运行40个循环。最佳PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×SYBR GreenPremix ExTaq II，2.0μL的基因组DNA模板，0.8μL 10μM的上游引物，0.8μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL；最佳PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，59℃退火34s，运行40个循环。
实施例2
标准曲线的建立：
采用实施例1中的特异性扩增引物、标准品3～标准品8和空白对照(以无菌无RNA酶水为待测样品)为模板DNA进行检测，每个标准品和对照分别做3次平行重复。根据起始模板拷贝数的对数值和反应的循环数(即Ct值)的线性关系，构建检测ISKNV的标准曲线，所用试剂均购于TaRaKa公司。具体步骤如下：
上游引物ISKNV-F：5’-GAGGACCTGCTCATCAGCCAGAG-3’；
下游引物ISKNV-R：5’-TTGGTCAGTGCGGGTGCTACATT-3’。
PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×SYBR GreenPremix Ex Taq II，2.0μL的模板DNA，0.8μL 10μM的上游引物，0.8μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，59℃退火34s，运行40个循环。当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值＜35时，则判定待测样本为阳性；当无荧光定量PCR扩增曲线或所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值≥35时，则所述待测样本为阴性。
结果发现，标准品均出现典型扩增曲线，检测结果为阳性，空白对照无扩增曲线，检测结果为阴性。根据标准品Ct值绘制标准曲线如图16所示(图16中横坐标为拷贝数对数，纵坐标为Ct值)。
由图16可以看出，标准品得到的Ct值与质粒标准品拷贝数的对数呈良好的线性关系，标准曲线方程为Y＝-3.688x+42.675，R2＝0.995。
实施例3
敏感性实验
采用实施例1中的特异性扩增引物、标准品3～标准品10和空白对照(以无菌无RNA酶水为待测样品)为模板DNA分别进行SYBR Green实时荧光定量PCR和普通PCR，每个标准品和对照分别做3次平行重复。检测后，比较两者的最低拷贝浓度，SYBR Green荧光定量PCR扩增结果见图17(图17中，1表示标准品3的扩增曲线、2表示标准品4的扩增曲线、3表示标准品5的扩增曲线、4表示标准品6的扩增曲线、5表示标准品7的扩增曲线、6表示标准品8的扩增曲线、7表示标准品9的扩增曲线、8表示标准品10的扩增曲线)；经普通PCR扩增后，对其扩增产物进行脂糖凝胶电泳，结果见图18。
其中，SYBR Green荧光定量PCR扩增的体系与条件与实施例2中PCR扩增的反应体系和PCR扩增的反应条件相同；
普通PCR扩增的反应体系如下：10μl 2×Taq Master Mix(Dye Plus)、2.0μL的模板DNA，0.8μL 10μM的上游引物，0.8μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL(相关试剂购买自南京诺唯赞生物科技有限公司)。
由图17可以看出，采用本发明提供的方法检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV时，最低检出限为标准品10即6.71×100copies/μL，而根据图18可以看出，当样品的浓度为6.71×107～6.71×101copies/μL时，对其扩增产物进行脂糖凝胶电泳能够显示清晰的条带，而当样品浓度为6.71×100copies/μL时，其扩增产物不能显示条带。因此，普通PCR的最低检出限为标准品9即6.71×101copies/μL。
综上可知，与普通PCR相比，采用本发明提供的SYBR Green荧光定量PCR检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的敏感性更强，最低检出限为6.71×100copies/μL。
实施例4
特异性实验
将已制备的ISKNV、WSSV以及GCHV的重组阳性质粒DNA标准品(本实验室提供)，以10倍浓度梯度连续稀释10次，将拷贝数为1×105Copies/μL的ISKNV、WSSV以及GCHV重组阳性质粒作为SYBR Green实时荧光定量PCR反应的模板，同时以RNaseFreed H2O设置阴性对照，配制反应体系，设置反应程序，进行SYBR Green实时荧光定量PCR反应，每个标准品和清水对照分别做3次平行重复，构建检测ISKNV的特异性曲线，所用试剂均购于TaRaKa公司。
荧光定量PCR扩增的体系与条件与实施例2中PCR扩增的反应体系和PCR扩增的反应条件相同。
判定标准：当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值＜35时，则判定待测样本为阳性；当无荧光定量PCR扩增曲线或所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值≥35时，则所述待测样本为阴性，结果见图19。
由图19可以看出，只有含ISKNV的样品及引物的反应体系能够出现良好的扩增曲线，而其他样品均未出现扩增曲线，说明建立的SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法特异性良好，无交叉反应。
实施例5
变异系数分析
采用实施例1中的特异性扩增引物组以及实施例2中PCR扩增的反应体系和PCR扩增的反应条件，选择标准品4～6作为模板DNA，进行三次SYBR Green荧光定量PCR重复检测，计算组内变异系数，结果见表1和图20(在图20中，1表示标准品6，2表示标准品5，3表示标准品4)。
表1组内重复性检测结果表
由表1和图20可以看出，本发明提供的检测方法，其组内变异系数普遍低于1％，说明SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法重复性良好。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种特异性检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的试剂盒和/或试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测的样本来源包括鲈鱼、鳜鱼和罗非鱼中的一种或多种。
4.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的引物组和PCR扩增试剂。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括SYBR GreenI、DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物组中上游引物和下游引物的浓度分别为10μM。
7.一种检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述的引物组进行SYBR Green实时荧光PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线；
对所述荧光定量PCR扩增曲线进行分析并作出判断；
当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值＜35时，则判定待测样本为阳性；
当无荧光定量PCR扩增曲线或所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct值≥35时，则所述待测样本为阴性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括：脾组织样、肾组织、肌肉组织、肠系膜、血液和环境样本中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SYBR Green实时荧光PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：10.0μL的2×SYBR GreenPremix Ex TaqII，(1.9～2.1)μL的基因组DNA模板，0.8μL 10μM的上游引物，0.8μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，58～61℃退火34s，运行40个循环。
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