CN110923325A - 用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组、试剂盒及方法，属于基因检测技术领域。本发明提供的引物Blocker组包括引物组和与所述引物组相对应的Blocker序列，其中，引物组包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对和第八引物对中的一种或多种；Blocker序列包括第一Blocker、第二Blocker、第三Blocker、第四Blocker、第五Blocker、第六Blocker、第七Blocker和第八Blocker中的一种或者多种；另外，本发明提供的检测方法可检测EGFR基因的32种突变，每种突变对应标准曲线均可以在0.1%‑50%范围内准确定量，特别是可以明确区分0%模板和0.1%突变，其相比现有检测方法，具有高灵敏度和低成本等优点。

Description

用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体是一种用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组、试剂盒及方法。

背景技术

对于发生EGFR(Epidermal Growth Ffactor Receptor)突变的晚期非小细胞肺癌患者(NSCLC)，应用表皮生长因子受体-酪氨酸抑制剂(EGFR-TKIs)类靶向药物治疗非常有效，例如吉非替尼、埃克替尼、厄洛替尼，使用第一代和第二代TKIs发生耐药后，如检出T790M突变患者可服用第三代TKI药物奥西替尼。因此，检测EGFR基因是否突变成为肺癌病人是否使用EGFR靶向药物的前提条件，这也已经在非小细胞肺癌EGFR基因突变检测领域形成专家共识。

肿瘤释放DNA(DeoxyriboNucleic Acid)片段包含肿瘤特异性突变信息，cfDNA(cell free DNA)由于其取样方便、可无创检测，近些年越来越多地作为肿瘤标志物用于检测点突变、拷贝数变异和DNA甲基化变异。cfDNA半衰期短，约16min-13h，加上肿瘤相关ctDNA(Cell free tumor DNA)含量低，因此ctDNA检测对难度大，需要高灵敏度检测方法。

市场上低频突变基因检测技术包括ARMS(Amplification Refractory MutationSystem)、NGS(Next Generation Sequencing)(SafeSeq/CAPPSeq)和数字聚合酶链式反应(Polym erase Chain Reaction，PCR)等，但以上技术不能兼具灵敏度高、成本低和周期短优点。例如，对于ARMS技术可检测1-10％突变，不能满足cfDNA检测对于灵敏度的需求；低深度NGS技术，如SafeSeq6和CAPPseq7灵敏度可达到0.1％，但是该技术存在成本高、周期长问题；数字PCR技术灵敏度可达到0.01％，但是该技术需要合成Taqman探针、并且需要购置数字PCR仪，成本高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组，所述引物Blocker组包括引物组和与所述引物组相对应的Blocker序列；所述引物组包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对和第八引物对中的一种或多种；所述第一引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1～3所示；所述第二引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4～5所示；第三引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6～7所示；第四引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8～9所示；第五引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10～11所示；第六引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:12～13所示；第七引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:14～15所示；第八引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:16～17所示。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的Blocker序列包括第一Blocker、第二Blocker、第三Blocker、第四Blocker、第五Blocker、第六Blocker、第七Blocker和第八Blocker中的一种或者多种；所述第一Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示；所述第二Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示；所述第三Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:20所示；所述第四Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:21所示；所述第五Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:22所示；所述第六Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:23所示；所述第七Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:24所示；所述第八Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:25所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种用于检测EGFR基因突变的试剂盒，其包括DNA聚合酶缓冲液混合物、阳性质控品和阴性质控品，所述的试剂盒还包括上述的引物Blocker组。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的DNA聚合酶缓冲液混合物包括DNA聚合酶、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核酸混合物和PCR增强剂；所述氯化镁的摩尔浓度为5～8mmol/L，所述三磷酸脱氧核糖核酸混合物的摩尔浓度为0.2～0.6mmol/L。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的阳性质控品为阴性质控品与EGFR基因突变质粒的混合液；所述EGFR基因突变质粒包括T790M突变质粒、exon19del突变质粒、L858R突变质粒、L861Q突变质粒、G719S突变质粒、C797S突变质粒、S768I突变质粒和H773_V774insH突变质粒中的一种或者多种。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述T790M突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:26所示；所述exon19del突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:27所示；所述L858R突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:28所示；所述L861Q突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:29所示；所述G719S突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:30所示；所述C797S突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:31所示；所述S768I突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示；所述H773_V774insH突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种用于检测EGFR基因突变的方法，其包括以下步骤：

获取待测样品的核酸，作为模板；

将上述的引物组、上述的DNA聚合酶缓冲液混合物以及上述模板混在一起进行荧光定量PCR扩增反应，得到第一PCR产物和第一CT值；

将上述的引物组、上述的Blocker序列、上述的DNA聚合酶缓冲液混合物以及上述模板混在一起进行荧光定量PCR扩增反应，得到第二PCR产物和第二CT值；

对所述第一PCR产物和第二PCR产物进行一代测序，判断待测样品的EGFR基因是否突变以及突变的类型；

若所述待测样品的EGFR基因发生突变，根据EGFR基因的突变类型，将第一CT值与所述第二CT值的差值代入到对应突变类型的标准曲线方程中，得到对应EGFR基因突变类型的突变频率。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述标准曲线方程的确定方法包括以下步骤：

将上述的EGFR基因突变质粒和野生型模板混合，制备成不同浓度梯度的标准品。

分别将所述不同浓度梯度的标准品与所述的引物组、所述的DNA聚合酶缓冲液混合物以混在一起进行荧光定量PCR扩增反应，得到多组第一标准CT值；

分别将所述不同浓度梯度的标准品与所述的引物组、所述的Blocker序列、所述的DNA聚合酶缓冲液混合物混在一起进行荧光定量PCR扩增反应，得到多组第二标准CT值；

根据多组所述第一标准CT值与所述第二标准CT值的差值以及不同浓度梯度的对数值进行作图，并进行线性拟合，得到所述标准曲线。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：

(1)本发明提供的检测方法可检测EGFR基因的32种突变，每种突变对应标曲均可以在0.1％-50％范围内准确定量，特别是可以明确区分0％模板和0.1％突变，以实现高灵敏度检测。

(2)本发明提供的检测方法与现有技术的AEMS-qPCR、NGS、核酸质谱等技术相比，其检测灵敏度较高，可达0.1％，更适合肿瘤的液体活检。

(3)本发明所提供的引物组和Blocker序列均为普通寡核苷酸片段，其合成成本低，且检测仪器所使用的荧光定量PCR仪器成本相对低、易于获取。

附图说明

图1为Block序列设计的原理图。

图2为1％突变频率的EGFR基因T790M突变样品(不加Block)的Sanger测序峰图。

图3为1％突变频率的EGFR基因T790M突变样品(加Block)的Sanger测序峰图。

图4为0.1％突变频率的EGFR基因T790M突变样品(不加Block)的Sanger测序峰图。

图5为0.1％突变频率的EGFR基因T790M突变样品(加Block)的Sanger测序峰图。

图6为EGFR基因T790M位点突变的标准曲线图。

图7为实施例4得到的不同突变频率标准品的荧光定量PCR扩增曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均是采用市售的设备和试剂。

实施例1

该实施例提供了一种用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组，其包括引物组和Blocker序列；所述引物组包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对和第八引物对，各引物对分别用于检测对应的790位点、exon19位点、858位点、861位点、719_rev位点、797位点、768_771位点、771_774位点的突变；所述第一引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1～3所示；所述第二引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4～5所示；第三引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6～7所示；第四引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8～9所示；第五引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10～11所示；第六引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:12～13所示；第七引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:14～15所示；第八引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:16～17所示。

所述的Blocker序列包括第一Blocker、第二Blocker、第三Blocker、第四Blocker、第五Blocker、第六Blocker、第七Blocker和第八Blocker，分别对应实施例1的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对和第八引物对；其中，所述第一Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示；所述第二Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示；所述第三Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:20所示；所述第四Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:21所示；所述第五Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:22所示；所述第六Blocker的核苷酸序列如序列表SEQID NO:23所示；所述第七Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:24所示；所述第八Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:25所示。

具体的，各引物对和Blocker的序列如下表1所示：

表1

由于cfDNA平均大小约166bp，检测方法的扩增产物越小，扩增出的cfDNA量越高。因此本发明扩增EGFR基因片段控制在60-80碱基。

实施例2

该实施例提供一种用于检测EGFR基因突变的试剂盒，其包括DNA聚合酶缓冲液混合物、阳性质控品、阴性质控品以及上述的引物Blocker组。其中，所述的DNA聚合酶缓冲液混合物包括DNA聚合酶、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核酸混合物和PCR增强剂；所述氯化镁的摩尔浓度为5～8mmol/L，所述三磷酸脱氧核糖核酸混合物的摩尔浓度为0.2～0.6mmol/L。

另外，阴性质控品是健康人基因组经Covaris打断至100-500bp片段制备而成；阳性质控品为阴性质控品与EGFR基因突变质粒的混合液，EGFR基因突变质粒的质量浓度为1％；其中，所述EGFR基因突变质粒包括T790M突变质粒、exon19del突变质粒、L858R突变质粒、L861Q突变质粒、G719S突变质粒、C797S突变质粒、S768I突变质粒和H773_V774insH突变质粒，其均在通用生物系统(安徽)有限公司合成的，分别对应实施例1的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对和第八引物对。具体的，将上述八种质粒稀释至6×10³copies/μL，Covaris打断至100-500bp后等体积混合，并加入一定量阴性质控品，制备成1％含量的阳性质控品。其中，所述T790M突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:26所示；所述exon19del突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQID NO:27所示；所述L858R突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:28所示；所述L861Q突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:29所示；所述G719S突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:30所示；所述C797S突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:31所示；所述S768I突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示；所述H773_V774insH突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33所示。

本发明实施例是在SNP或者indel上下游设计一对引物，用以将含有SNP或者indel区域扩增出来，同时设计一条覆盖SNP或者indel、与野生型序列完全匹配的Blocker，当低频突变存在时，Blocker结合野生型序列，阻止上下游引物的扩增，只有突变序列才能扩增，从而使低频突变得到富集(原理图见附图1所示)。根据研究数据，本发明实施例可以将突变序列富集1000倍以上。需要说明的是，上述八组引物对、八组Blocker以及八组阳性质控品可以根据实际需要选择其中一组或者多组进行检测，且选用的引物对、Blocker和阳性质控品要一一对应，譬如当选用第一引物对进行检测时，则需要选用对应的第一Blocker和含有T790M突变质粒的阳性质控品进行配合检测。

实施例3

该实施例提供了一种用于检测EGFR基因突变的方法，其包括以下步骤：

(1)获取待测样品的核酸，作为模板；具体的，核酸的获取方法包括以下步骤：

抽提样本的核酸；选择适合样本类型的方法抽提核酸，所述样本类型包括外周血细胞、外周血血浆/血清、体液、腔道的脱落物、病变组织；特别地，对于血浆样本的游离核酸抽提，步骤如下：

S11、血浆的分离：先置于4℃、1900g、10min的低速离心条件下去除细胞；接着，置于4℃、16000g、10min的高速离心条件下进一步去除细胞来源核酸杂质，得到血浆。

S12、裂解：每毫升血浆加入100μL蛋白酶K和0.8ml缓冲液ACL，且每个样本加入1μg载体RNA，并置于60℃下孵育30min；接着，每毫升血浆加入1.8ml缓冲液ACB。涡旋混匀，冰浴5min，得到裂解液。

S13、核酸吸附至硅膜：将步骤S12的裂解液加入至核酸吸附柱。

S14、清洗：分别使用缓冲液ACW1、ACW2和96-100％乙醇清洗核酸上述吸附柱。

S15、乙醇去除：在56℃、10min的条件下挥发上述乙醇。

S16、洗脱：对上述吸附柱使用20-100μL的AVE洗脱核酸，即可得到模板，备用。

(2)将上述的引物组、上述的DNA聚合酶缓冲液混合物以及上述模板混在一起进行PCR扩增反应，得到第一PCR产物和第一CT值；具体的，取25μL上述实施例2提供的DNA聚合酶缓冲液混合物、0.4μL摩尔浓度为100μM的引物组(fp上游引物和rp下游引物的浓度和用量一样)、10μL的上述模板(0.3-30ng/μL)，混在一起，并用水补齐至50μL，得到第一反应液；将第一反应液置于ABI 7500PCR仪器中进行荧光定量实时PCR扩增反应，即可得到第一PCR产物和第一CT值。

(3)将上述的引物组、上述的Blocker序列、上述的DNA聚合酶缓冲液混合物以及上述模板混在一起进行PCR扩增反应，得到第二PCR产物和第二CT值；具体的，取25μL上述实施例2提供的DNA聚合酶缓冲液混合物、0.4μL摩尔浓度为100μM的引物组(fp上游引物和rp下游引物的浓度和用量一样)、2μL的Blocker序列、10μL的上述模板(0.3-30ng/μL)，混在一起，并用水补齐至50μL，得到第一反应液；将第一反应液置于ABI7500PCR仪器中进行荧光定量实时PCR扩增反应，即可得到第二PCR产物和第二CT值。

其中，步骤(2)和(3)qPCR程序设置如下：打开ABI 7500仪器和软件，选择“SYBRGreen Reagents”模式，并设定以下PCR程序：95℃/3分钟，(95℃/10秒，60℃/30秒(收集荧光))×50个循环，95℃/15秒，60℃/1分钟，以1％速度升温至95℃(收集荧光)，60℃/15秒。

(5)对所述第一PCR产物和第二PCR产物进行一代Sanger测序，判断待测样品的EGFR基因是否突变以及突变的类型。譬如，EGFR基因的0.1％突变频率和1％突变频率的T790M突变的样品分别按照上述进行检测，其PCR产物经富集后的Sanger测序结果如附图2～5所示。其中，加有Block的实验组可检测1％和0.1％突变频率的具体基因突变类型。

(6)若所述待测样品的EGFR基因发生突变，根据EGFR基因的突变类型，将第一CT值与所述第二CT值的差值代入到对应突变类型的标准曲线方程中，得到对应EGFR基因突变类型的突变频率。其中，标准曲线方程的确定方法包括以下步骤：

将不同突变型质粒与健康人基因组混合，制备成50％、10％、5％、1％、0.1％、0％比例标准品梯度。

针对每种比例标准品、将上述的引物组、上述的DNA聚合酶缓冲液混合物以及标准品混在一起进行荧光定量PCR扩增反应，得到第一标准CT值；具体的，将实施例2提供的阳性质控品替换步骤(2)的模板，其余成分用量及反应条件均与步骤(2)相同。

S62、将上述的引物组、上述的Blocker序列、上述的DNA聚合酶缓冲液混合物以及标准品梯度混在一起进行PCR扩增反应，得到第二标准CT值；具体的，将实施例2提供的阳性质控品替换步骤(3)的模板，其余成分用量及反应条件均与步骤(3)相同。

S63、根据所述第一标准CT值与所述第二标准CT值的差值，确定所述的标准曲线方程；具体的，以第一标准CT值与第二标准CT值的差值(△CT值)作为“y”值，则“x”值为lg(VAF)，其中VAF为突变频率(Variant of Allele Fraction)。lg(VAF)的确定方法如下：标准品梯度50％、10％、5％、1％、0.1％、0％分别得到六组△CT值以及对应的浓度的lg值，△CT值和lg(VAF)作图，线性拟合曲线的公式即为标准曲线。

譬如，采用实施例2提供的第一引物对、实施例2提供的第一Blocker以及实施例2提供的含有T790M突变质粒的阳性质控品对某样品EGFR基因T790M位点按照上述方法进行检测，其得到T790M位点的标准曲线如附图6所示，对应的标准曲线方程为y＝-3.0705x-0.3228，具体地说如果△CT值为3.2，经计算，VAF为7.12％，即该样品的EGFR基因T790M位点的突变频率为7.12％。

另外，采用该方法可以求出EGFR基因的32种突变类型对应的标准曲线及R²值，如下表2所示。

表2

需要说明的是，上述引物组和Blocker序列在检测过程中均需要做质量控制，具体的，质量判定条件为：CTd＝22～24；CtQ＝|CTb-CTd|<1；ΔCt＝(CTc-CTa)>8～10；CtDelay＝CTa-CTb≤1；满足上述要求的引物组和Blocker序列方可继续进行后续实验。其中，CTa为上述的第二标准CT值，CTb为上述的第一标准CT值；CTd为第一阴性CT值，CTc为第二阴性CT值；第一阴性CT值和第二阴性CT值的获取方法如下：

A、将上述的引物组、上述的DNA聚合酶缓冲液混合物以及上述的阴性质控品混在一起进行PCR扩增反应，得到第一阴性CT值；具体的，将实施例2提供的阴性质控品替换步骤(2)的模板，其余成分用量及反应条件均与步骤(2)相同。

B、将上述的引物组、上述的Blocker序列、上述的DNA聚合酶缓冲液混合物以及上述的阴性质控品混在一起进行PCR扩增反应，得到第二阴性CT值；具体的，将实施例2提供的阴性质控品替换步骤(3)的模板，其余成分用量及反应条件均与步骤(3)相同。

将A步骤阴性质控品换成突变型质粒，得到第一标准CT值，将步骤B阴性质控品换成突变型质粒，得到第二标准CT值。

另外，为了保证cfDNA扩增效率的同时，提高一代测序的成功率，在8对引物对和Blocker的下游引物5’端加上一段30-40碱基的tag。实验数据显示，经过优化的下游引物，不仅保证cfDNA扩增拷贝数，同时满足一代测序的需要。

实施例4

为了验证本发明检测灵敏度和准确度，购买市售的Horizon EGFR cfDNAreference standard的标准品作为模板，并通过上述实施例3提供的测试方法进行测试。上述标准品为T790M、L858R、ΔE746-A750(6223)、G719S、L861Q、S768I位点突变模板的混合物，且包含5％、1％、0.1％和0％等4种突变频率，因此采用上述引物组和Blocker序列，分别进行每种突变频率cfDNA的“加Blocker”(实施例3的步骤(3))和“不加Blocker”(实施例3的步骤(2))的荧光定量PCR扩增反应实验，得到四组荧光定量PCR扩增曲线，如附图7所示，并将对应的PCR产物进行一代测序，确认是否发生突变及突变序列。且计算两组的qPCR的CT差值，带入上表2相应的标准曲线方程，并计算突变频率。实验数据显示，本发明方法检测突变结果及突变频率与预期相符。以T790M位点为例，下表3为T790M“加Blocker”和“不加Blocker”组实验的CT值差值及计算突变比例。根据下表3，本发明方法的检测结果跟预期一致。

表3

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

序列表

<110> 阅尔基因技术（苏州）有限公司

<120> 用于检测EGFR基因突变的Blocker引物组、试剂盒及方法

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccaccgtgca gctcatca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaccgtgca actcatca 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtgttcccg gacatagtcc a 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagttaaaat tcccgtcgct atcaa 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcgaggattt ccttgttggc t 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcagcatgtc aagatcacag att 23

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctccttctg catggtattc tttct 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catggtattc tttctcttcc gca 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

accgcagcat gtcaagatca 20

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgccgaacgc accgga 16

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caaccaagct ctcttgagga tct 23

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagctcatgc ccttcggc 18

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

actgggagcc aatattgtct ttg 23

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaagcctacg tgatggcca 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaggtgaggc agatgccc 18

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tggccagcgt ggacaa 16

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcatgagctg cgtgatgag 19

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctcatcacg cagctcatgc ccaaaa 26

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtcgctatca aggaattaag agaagcaaca tcaaat 36

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gatcacagat tttgggctgg ccaaac 26

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccgcacccag cagtttggca taa 23

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caccggagcc cagcactttg atcaaaaa 28

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttcggctgcc tcctggacta tgtaaaaa 28

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tggccagcgt ggacaacccc tttta 25

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tggacaaccc ccacgtgtgc caaaaa 26

<210> 26

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cgtcttcacc tggaaggggt ccatgtgccc ctccttctgg ccaccatgcg aagccacact 60

gacgtgcctc tccctccctc caggaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg 120

tgtgccgcct gctgggcatc tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcatg cagctcatgc 180

ccttcggctg cctcctggac tatgtccggg aacacaaaga caatattggc tcccagtacc 240

tgctcaactg gtgtgtgcag atcgcaaagg taatcaggga agggagatac ggggagggga 300

gataaggagc caggatcctc acatgcggtc tgcgctcctg ggatagcaag agtttgccat 360

ggggat 366

<210> 27

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccagcaatat cagccttagg tgcggctcca cagccccagt gtccctcacc ttcggggtgc 60

atcgctggta acatccaccc agatcactgg gcagcatgtg gcaccatctc acaattgcca 120

gttaacgtct tccttctctc tctgtcatag ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt 180

aaaattcccg tcgctatcaa aacatctccg aaagccaaca aggaaatcct cgatgtgagt 240

ttctgctttg ctgtgtgggg gtccatggct ctgaacctca ggcccacctt ttctcatgtc 300

tggcagctgc tctgctctag accctgctca tctccacatc ctaaatgttc actttctatg 360

tctttccctt tctagctcta gtgg 384

<210> 28

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

acatgaccct gaattcggat gcagagcttc ttcccatgat gatctgtccc tcacagcagg 60

gtcttctctg tttcagggca tgaactactt ggaggaccgt cgcttggtgc accgcgacct 120

ggcagccagg aacgtactgg tgaaaacacc gcagcatgtc aagatcacag attttgggcg 180

ggccaaactg ctgggtgcgg aagagaaaga ataccatgca gaaggaggca aagtaaggag 240

gtggctttag gtcagccagc attttcctga caccagggac caggctgcct tcccactagc 300

tgtattgttt aacacatgca ggggaggatg ctctccagac attctgggtg agctcgcagc 360

agctgctgct ggcagctg 378

<210> 29

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgaacatgac cctgaattcg gatgcagagc ttcttcccat gatgatctgt ccctcacagc 60

agggtcttct ctgtttcagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga 120

cctggcagcc aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg 180

gctggccaaa cagctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtaag 240

gaggtggctt taggtcagcc agcattttcc tgacaccagg gaccaggctg ccttcccact 300

agctgtattg tttaacacat gcaggggagg atgctctcca gacattctgg gtgagctcgc 360

agcagctgct g 371

<210> 30

<211> 361

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gtccccctgc tgggccatgt ctggcactgc tttccagcat ggtgagggct gaggtgaccc 60

ttgtctctgt gttcttgtcc cccccagctt gtggagcctc ttacacccag tggagaagct 120

cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 180

agctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc tggcacaggc ctctgggctg 240

ggccgcaggg cctctcatgg tctggtgggg agcccagagt ccttgcaagc tgtatatttc 300

catcatctac tttactcttt gtttcactga gtgtttggga aactccagtg tttttcccaa 360

g 361

<210> 31

<211> 361

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ctggaagggg tccatgtgcc cctccttctg gccaccatgc gaagccacac tgacgtgcct 60

ctccctccct ccaggaagcc tacgtgatgg ccagcgtgga caacccccac gtgtgccgcc 120

tgctgggcat ctgcctcacc tccaccgtgc agctcatcac gcagctcatg cccttcggct 180

ccctcctgga ctatgtccgg gaacacaaag acaatattgg ctcccagtac ctgctcaact 240

ggtgtgtgca gatcgcaaag gtaatcaggg aagggagata cggggagggg agataaggag 300

ccaggatcct cacatgcggt ctgcgctcct gggatagcaa gagtttgcca tggggatatg 360

t 361

<210> 32

<211> 361

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cgtccctgtg ctaggtcttt tgcaggcaca gcttttcctc catgagtacg tattttgaaa 60

ctcaagatcg cattcatgcg tcttcacctg gaaggggtcc atgtgcccct ccttctggcc 120

accatgcgaa gccacactga cgtgcctctc cctccctcca ggaagcctac gtgatggcca 180

tcgtggacaa cccccacgtg tgccgcctgc tgggcatctg cctcacctcc accgtgcagc 240

tcatcacgca gctcatgccc ttcggctgcc tcctggacta tgtccgggaa cacaaagaca 300

atattggctc ccagtacctg ctcaactggt gtgtgcagat cgcaaaggta atcagggaag 360

g 361

<210> 33

<211> 365

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cttttgcagg cacagctttt cctccatgag tacgtatttt gaaactcaag atcgcattca 60

tgcgtcttca cctggaaggg gtccatgtgc ccctccttct ggccaccatg cgaagccaca 120

ctgacgtgcc tctccctccc tccaggaagc ctacgtgatg gccagcgtgg acaaccccca 180

ccacgtgtgc cgcctgctgg gcatctgcct cacctccacc gtgcagctca tcacgcagct 240

catgcccttc ggctgcctcc tggactatgt ccgggaacac aaagacaata ttggctccca 300

gtacctgctc aactggtgtg tgcagatcgc aaaggtaatc agggaaggga gatacgggga 360

gggga 365

Claims (8)

1.用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组，其特征在于，所述引物Blocker组包括引物组和与所述引物组相对应的Blocker序列；所述引物组包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对和第八引物对中的一种或多种；所述第一引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1~3所示；所述第二引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4~5所示；第三引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6~7所示；第四引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8~9所示；第五引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10~11所示；第六引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:12~13所示；第七引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:14~15所示；第八引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:16~17所示。

2.根据权利要求2所述的用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组，其特征在于，所述的Blocker序列包括第一Blocker、第二Blocker、第三Blocker、第四Blocker、第五Blocker、第六Blocker、第七Blocker和第八Blocker中的一种或者多种；所述第一Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示；所述第二Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示；所述第三Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:20所示；所述第四Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:21所示；所述第五Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:22所示；所述第六Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:23所示；所述第七Blocker的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:24所示；所述第八Blocker的核苷酸序列如序列表SEQID NO:25所示。

3.用于检测EGFR基因突变的试剂盒，包括DNA聚合酶缓冲液混合物、阳性质控品和阴性质控品，其特征在于，所述的试剂盒还包括如权利要求1或2所述的引物Blocker组。

4.根据权利要求3所述的用于检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述的DNA聚合酶缓冲液混合物包括DNA聚合酶、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核酸混合物和PCR增强剂；所述氯化镁的摩尔浓度为5~8mmol/L，所述三磷酸脱氧核糖核酸混合物的摩尔浓度为0.2~0.6mmol/L。

5.根据权利要求3所述的用于检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品为阴性质控品与EGFR基因突变质粒的混合液；所述EGFR基因突变质粒包括T790M突变质粒、exon19del突变质粒、L858R突变质粒、L861Q突变质粒、G719S突变质粒、C797S突变质粒、S768I突变质粒和H773_V774insH突变质粒中的一种或者多种。

6.根据权利要求3所述的用于检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述T790M突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:26所示；所述exon19del突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:27所示；所述L858R突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:28所示；所述L861Q突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:29所示；所述G719S突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:30所示；所述C797S突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQID NO:31所示；所述S768I突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示；所述H773_V774insH突变质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33所示。

7.用于检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取待测样品的核酸，作为模板；

将如权利要求1所述的引物组、如权利要求3或4所述的DNA聚合酶缓冲液混合物以及上述模板混在一起进行荧光定量PCR扩增反应，得到第一PCR产物和第一CT值；

将如权利要求1所述的引物组、如权利要求2所述的Blocker序列、如权利要求3或4所述的DNA聚合酶缓冲液混合物以及上述模板混在一起进行荧光定量PCR扩增反应，得到第二PCR产物和第二CT值；

对所述第一PCR产物和第二PCR产物进行一代测序，判断待测样品的EGFR基因是否突变以及突变的类型；

若所述待测样品的EGFR基因发生突变，根据EGFR基因的突变类型，将第一CT值与所述第二CT值的差值代入到对应突变类型的标准曲线方程中，得到对应EGFR基因突变类型的突变频率。

8.根据权利要求7所述的用于检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，所述标准曲线方程的确定方法包括以下步骤：

将如权利要求书5或6所述的EGFR基因突变质粒和野生型模板混合，制备成不同浓度梯度的标准品；

分别将所述不同浓度梯度的标准品与所述的引物组、所述的DNA聚合酶缓冲液混合物以混在一起进行荧光定量PCR扩增反应，得到多组第一标准CT值；

分别将所述不同浓度梯度的标准品与所述的引物组、所述的Blocker序列、所述的DNA聚合酶缓冲液混合物混在一起进行荧光定量PCR扩增反应，得到多组第二标准CT值；

根据多组所述第一标准CT值与所述第二标准CT值的差值以及不同浓度梯度的对数值进行作图，并进行线性拟合，得到所述标准曲线。

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