CN113789345A - 一种用于检测可复制性慢病毒(rcl)的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测可复制性慢病毒(RCL)的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括包含所述的重组表达载体pUC19‑NL4‑3HIV‑EGFP‑ATT或者所述的重组菌NL4‑3HIV‑EGFP‑ATT，所述重组菌NL4‑3HIV‑EGFP‑ATT含有所述的重组表达载体pUC19‑NL4‑3HIV‑EGFP‑ATT。本发明的试剂盒与现有方法相比能够杜绝假阳性结果的发生；使用更多检测点，检测结果更可靠，安全性更高。

Description

一种用于检测可复制性慢病毒(RCL)的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测可复制性慢病毒的试剂盒及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T cellImmunotherapy)，简称CAR-T技术。CAR(嵌合抗原受体)的结构包括胞外单链抗体区、铰链区、跨膜区和胞内信号肽区。单链抗体(scFv)是由特异性识别抗原的单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)可变区片段连接而组成的；铰链区一般为免疫球蛋白序列，如CD8α或TCRβ链，其具有变形和伸缩的活性，给单链抗体提供更多变形和接近抗原的空间；跨膜区一般有同源或异源二聚体膜蛋白如CD4、CD8或CD28组成，是CAR的二聚化、内源性T细胞受体交叉激活的关键区域；胞内信号肽区通常由共刺激分子和免疫受体酪氨酸活化基序组成，用于传递细胞激活信号。

在嵌合抗原受体细胞治疗产品的制备过程中，通常利用逆转录病毒载体或慢病毒载体将CAR或TCR基因高效地导入免疫细胞中，虽然所用的γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体均为复制缺陷型载体，但在病毒载体生产过程中因穿梭载体、包装载体及包装细胞中的内源性逆转录元件之间，或病毒载体与免疫细胞的内源性逆转录元件之间发生同源或非同源重组，会导致可复制慢病毒(Replication competent lentivirus，RCL)产生。RCL同逆转录病毒载体一样可以整合在细胞基因组中，从而产生因整合诱发的激活原癌基因、破坏抑癌基因或使促细胞生长因子表达增高而造成二次肿瘤的风险；此外，因其具有复制性，即可产生具有复制能力的病毒，加之慢病毒载体采用了可感染多种细胞的膜蛋白VSV-G，大大增加了整合而造成二次肿瘤的风险。

临床RCL检测方法有效性的关键是其最小化假阴性和假阳性的能力，因此阳性对照的条件设定十分关键，需要设置对阳性对照实验，需研究阳性对照病毒NL4-3 H IV-EGFP-ATT病毒添加量，为《可复制慢病毒(RCL)敏感细胞检测法》中阳性对照条件的设定提供依据。另外，每次检测时，供试品可能会抑制RCL对C8166细胞的感染，导致检测时出现RCL假阴性，因此，在进行检测时需要设置抑制对照组，来排除假阴性。

目前，RCL的检测方法主要包括针对特定基因(如VSV—G基因、psi—gag基因或GALV基因)的PCR法或QPCR法以及敏感细胞感染试验法。为了提高试验的灵敏度，FDA和NMPA推荐使用以细胞培养为基础的感染性试验进行RCL的检测，该方法首先将可能存在的RCL在敏感细胞上扩增，并在培养终点利用敏感、快速的检测方法进行检测。

然而现有方法具有以下问题：1.目前RCL检测方法的阳性对照无蛋白标签，定量灵敏度较低。2.国外采用的阳性对照毒株与第三代包装系统中转移载体序列上的一致性不高，存在系统差别，容易导致假阴性。3.没有做供试品剂量相关的抑制试验，容易出现假阴性。

发明内容

为解决以上问题，本发明针对当前细胞治疗产品首次提出了一种以现有慢病毒载体起源的慢病毒元件为基础的创新型RCL检测方法，并制备了相应的条件可复制性慢病毒弱毒株，试剂盒用于实施细胞治疗产品的RCL检测方法。

本发明提供一种条件可复制性慢病毒弱毒株表达载体，所述载体为名称为pUC19-NL4-EGFP-1的重组载体，所述载体pUC19-NL4-EGFP-1为在质粒pUC19-NL4-EGFP中添加终止密码子的Vif、VPR、VPU和Nef基因序列的重组表达载体。

进一步，所述载体pUC19-NL4-EGFP-1为将质粒pUC19-NL4-EGFP的SphI和XhoI位点之间的序列替换为序列表中序列2中第2148位至10935位的序列。

其中，添加终止密码子的Vif对应序列2中第5740位至6330位；添加终止密码子的VPR对应序列2中第6264位至6560位；添加终止密码子的VPU对应序列2中第6772位至7023位；添加终止密码子的Nef对应序列2中第10824位至11450位。

本发明还提供一种条件可复制性慢病毒弱毒株表达载体的构建方法，包括以下步骤：

a.添加终止密码子的Vif、VPR、VPU和nef基因序列的构建:通过序列比对设计的引物对gag-F/vif-R扩增带有终止密码子的Vif基因序列，经测序验证终止密码子添加在Vif基因后，作为同源重组基因片段2；经序列比对设计合成引物对vif-F/Vpr-R扩增基因片段3，通过扩增在VPR基因的起始密码子后添加两个终止密码子并经测序验证正确；经序列比对设计合成引物对Vpr-F/vpu-R扩增片段4，通过扩增在VPU基因的起始密码子后添加两个终止密码子并经测序验证正确；经序列比对设计合成引物对vpu-F/nef-R扩增片段5，通过扩增在nef基因后添加两个终止密码子并经测序验证正确；

b.将步骤1中的同源重组基因片段2、同源重组基因片段3、同源重组基因片段4和同源重组基因片段5替换质粒pUC19-NL4-EGFP的SphI-HF和XhoI位点之间的序列，并保持其他序列不变，得到重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT。

本发明还提供一种用于检测条件可复制性慢病毒的重组菌，所述重组菌中含有所述的重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT。

所述重组菌为NL4-3 HIV-EGFP-ATT，所述NL4-3 HIV-EGFP-ATT为导入重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT的大肠杆菌DH-5a。

本发明提供一种检测可复制慢病毒的试剂盒，包含所述的重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT或者所述的重组菌NL4-3 HIV-EGFP-ATT，所述重组菌NL4-3 HIV-EGFP-ATT含有所述的重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT。

所述试剂盒还包括述成套试剂，所述成套试剂包括引物F、引物R和探针P；

所述引物F为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列3所示的单链核苷酸分子；

a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链核苷酸分子；

所述引物R为如下a3)或a4)：

a3)序列表中序列4所示的单链核苷酸分子；

a4)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链核苷酸分子；

所述探针P为如下a5)或a6)：

a5)序列表中序列5所示的单链核苷酸分子；

a6)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链核苷酸分子。

本发明提供一种条件可复制性慢病毒的检测方法，包括慢病毒的快速检测和慢病毒的验证检测；

其中所述慢病毒的验证检测包括：将一定滴度的致弱的条件可复制性慢病毒作为阳性对照，将一定滴度的致弱的条件可复制性慢病毒和待检测样品混合作为抑制对照，C8166细胞完全培养基作为阴性对照；

使用待检测样品，阴性对照，阳性对照，和抑制对照，分别转导人T细胞系C8166；培养21天后，再次扩增，培养终点时通过定性检测细胞培养上清中的p24蛋白，可判断检测样品中是否含可复制慢病毒。

进一步，所述致弱的条件可复制性慢病毒为重组菌NL4-3 HIV-EGFP-ATT。

进一步，所述慢病毒的快速检测包括:

S1：根据权利要求1-2中所述的成套试剂制作标准曲线；

S2：对CAR-T产物进行荧光定量检测，将测得的Ct值与标准曲线对照，得到VSVG基因拷贝数。

进一步，所述S1包括：

S11：提取T细胞基因组DNA和CAR-T细胞DNA；

S12、模板DNA的制备：使用含有Psi-gag基因的pUC19-NL4-EGFP质粒作为标准品母液，用T细胞基因组DNA稀释pUC19-NL4-EGFP质粒至每u l含有不同梯度的拷贝数；

S13：进行实时荧光定量PCR反应，得到Ct值，其中，T细胞基因组DNA作为阴性对照；

S14：根据Ct值和LogSQ绘制标准曲线。

所述的载体、所述重组菌或所述的成套引物在制备检测条件可复制性慢病毒的产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述的方法在检测条件可复制性慢病毒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明的优点包括但不限于：

1、使用条件可复制性慢病毒弱毒株，其仅保持持HIV复制需要的最少基因，维持最低水平的复制表达，同时也降低了HIV的细胞毒性；

2、NL4毒株是三代慢病毒载体基因元件的直接来源，与现有技术使用的毒株相比，其复制周期和特性与三代慢病毒载体高度一致，作为阳性对照更加适宜；

3、使用人T细胞系C8166，其对HIV及以VSV-G为包膜的慢病毒载体均具有高度的敏感性，并允许HIV弱毒株可以在C8166细胞上感染和传代；

4、可通过检测p24蛋白进行定量；

5、现有方法中，如果不做添加量实验，加入过多的待检样本会抑制细胞增殖和病毒扩增，本发明的方法中扩增阶段均包含生长和感染抑制试验，用于指导供试品的使用剂量，与现有方法相比，杜绝假阳性结果的发生；

6、使用更多检测点，检测结果更可靠，安全性更高。

7、以此为依据可以对当前开发的Q-PCR快检方法进行平行验证，以确认基于Psi-gag基因建立的Q-PCR快速放行检测方法的准确性。

附图说明

图1为本发明实施例1中的质粒提取步骤中的菌落生长情况；

图2为本发明实施例中弱毒株NL4-3 HIV-EGFP-ATT的结构示意图；

图3为本发明的可复制慢病毒检测方法的部分流程示意图；

图4为本发明实施例中细胞库细胞对C8166细胞扩增抑制作用的研究结果；

图5为本发明实施例中细胞库细胞对慢病毒感染C8166细胞抑制作用的研究结果；

图6为本发明实施例中生产慢病毒的终末细胞对C8166细胞扩增抑制作用的研究结果；

图7为本发明实施例中生产慢病毒的终末细胞对慢病毒感染C8166细胞抑制作用的研究结果；

图8为本发明实施例中慢病毒上清液对C8166细胞扩增抑制作用的研究结果；

图9为本发明实施例中慢病毒上清液对CD19慢病毒感染C8166细胞抑制作用的研究结果；

图10为本发明实施例中慢病毒制品对C8166细胞扩增抑制作用的研究结果；

图11为本发明实施例中慢病毒制品对CD19慢病毒感染C8166细胞抑制作用的研究结果；

图12为本发明实施例中CD19 CAR-T细胞对C8166细胞扩增抑制作用的研究结果；

图13为本发明实施例中CD19 CAR-T细胞对慢病毒感染C8166细胞抑制作用的研结果。

图14.基于Psi-gag基因建立的Q-PCR快速放行检测方法的标准曲线

该标准曲线说明在10^6-10^1之间呈现良好的线性扩增，判断述慢病毒RCL检测方法中采用的引物对、探针均具有较好的扩增效率和特异性。(Cut-off的Ct值＝36.78)

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1条件可复制性阳性弱毒株重组表达基因NL-TAA质粒的设计构建及病毒包装

HIV NL4毒株基因表达质粒pUC19-NL4-EGFP(序列为SEQ ID NO.1)(中国科学院武汉病毒所)。依据现有慢病毒载体研究相同起源的慢病毒毒株基因元件，通过在基因Vif，VPR，VPU，Nef中设计添加终止密码子，用以减弱HIV NL4毒株基因的表达，构建表达HIV NL4条件可复制性弱毒株的质粒，具体构建过程如下：

a.将HIV NL4毒株重组表达载体pUC19-NL4-EGFP转化大肠杆菌感受态菌DH-5a，具体步骤如下1-7所示：

1.超净工作台紫外照射30分钟后开风机运行5分钟。

2.取出同源重组质粒，放入超净工作台。

3.用冰盒取DH-5a感受态，微融化时加入1ul质粒，放于冰水混合物上至4℃冰箱内，放置30分钟。

4.42℃水浴热击90秒，热击后迅速放置于冰上冷却5分钟。

5.加入800ul不含卡那霉素的LB培养基，混匀(轻柔拨动容器底部)后37℃、200rpm震荡培养1小时。

6.菌液混匀后取25μl涂布于含有卡那霉素的固体LB平板上，倒置放于平台的37℃细菌培养箱中，过夜培养。

7、第二天上午(培养时间：18:00～第二天10:00)观察菌落生长情况，在菌落比较密集但能满足挑取单克隆的要求(菌落大小适中，位置相对“独立”)挑取克隆送测序；

b.测序正确，使用SphI/XhoI酶双酶切提取纯化后的pUC19-NL4-EGFP质粒，回收基因片段1；

c.(1)采用聚合酶链式反应技术扩增用于同源重组的4个基因片段：通过比对设计的引物对gag-F/vif-R(对应序列表中的序列6和7)，以pUC19-NL4-EGFP为模板进行扩增，得到带有终止密码子的基因序列Vif，经测序验证终止密码子正确添加在Vif基因后，作为同源重组基因片段2，所述重组基因片段2的序列如序列2的第5740位至6330所示；

(2)经序列比对设计合成引物对vif-F/Vpr-R(对应序列表中的序列8和9)以pUC19-NL4-EGFP为模板进行扩增，得到扩增基因片段3，通过扩增在VPR基因的起始密码子后添加两个终止密码子并经测序验证正确，所述重组基因片段3的序列如序列2的第6264位至6560所示；

(3)经序列比对设计合成引物对Vpr-F/vpu-R(对应序列表中的序列10和11)以pUC19-NL4-EGFP为模板进行扩增，得到扩增片段4，通过扩增在VPU基因的起始密码子后添加两个终止密码子并经测序验证正确，所述重组基因片段4的序列如序列2的第6772位至7023所示；

(4)经序列比对设计合成引物对vpu-F/nef-R(对应序列表中的序列12和13)以pUC19-NL4-EGFP为模板进行扩增，得到扩增片段5，通过扩增在nef基因后添加两个终止密码子并经测序验证正确，所述重组基因片段5的序列如序列2的第10824位至11450所示；

d.将5个所述片段同源重组，得到重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT，所述质粒pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT为将pUC19-NL4-EGFP质粒的SphI和XhoI位点之间的序列替换为由同源重组基因片段2、同源重组基因片段3、同源重组基因片段4和同源重组基因片段5的序列，并保持其他序列不变的重组表达载体，所述重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT的序列如序列表中的序列2所示。

e.将重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT转化大肠杆菌感受态菌DH-5a，具体步骤如下所示：

先将超净工作台紫外照射30分钟后开风机运行5分钟。取出同源重组质粒，放入超净工作台。用冰盒取DH-5a感受态，微融化时加入1ul质粒，放于冰水混合物上至4℃冰箱内，放置30分钟。42℃水浴热击90秒，热击后迅速放置于冰上冷却5分钟。加入800ul不含卡那霉素的LB培养基，混匀(轻柔拨动容器底部)后37℃、200rpm震荡培养1小时。菌液混匀后取25μl涂布于含有卡那霉素的固体LB平板上，倒置放于平台的37℃细菌培养箱中，过夜培养。第二天上午(培养时间：18:00～第二天10:00)观察菌落生长情况，在菌落比较密集但能满足挑取单克隆的要求(菌落大小适中，位置相对“独立”)挑取克隆送测序

f.测序正确的克隆命名为pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT，简称NL4-3 HIV-EGFP-ATT，基因组结构和质粒图谱如图2所示。

g.按照如下步骤进行质粒提取：

先将超净工作台紫外照射30分钟后开风机运行5分钟。从冰箱取出NL4-3 HIV-EGFP-ATT和包装质粒，75％酒精擦拭后放入超净工作台。用冰盒取DH-5a感受态，微融化时加入1ul质粒，放于冰水混合物上至4℃冰箱内，放置30分钟。42℃水浴热击90秒，热击后迅速放置于冰上冷却5分钟。加入800ul不含抗性的LB培养基，混匀(轻柔拨动容器底部)后37℃、200rpm震荡培养1小时。菌液混匀后取20μl涂布于含有抗性的固体LB平板上，倒置放于平台的37℃细菌培养箱中，过夜培养。第二天上午(培养时间：18:00～第二天10:00)观察菌落生长情况(如图1所示)，选取标记单克隆阳性菌落位置，然后放回细菌培养箱。从冰箱取出LB液体培养基(4个50ml锥形瓶)，恢复室温。超净工作台紫外照射30分钟后开风机运行5分钟。向LB培养基里加入卡那抗性。从细菌培养箱中取出LB固体平皿，75％酒精擦拭后放入超净工作台。用2.5μl移液器插取枪头后挑取1个大小、位置合适的菌落，然后连同枪头一起打入培养基里。包好透气膜后放入摇床，37℃、200rpm培养。超净工作台紫外照射30分钟，实验前开风机运行5分钟。取出锥形瓶，75％酒精擦拭后放入超净工作台。按照1:1000的比例接种至200ml(装有100ml含抗性的LB培养基)锥形瓶，放入摇床，37℃、200rpm过夜培养。NL4-3 HIV-EGFP-ATT和包装质粒的阳性克隆菌保种：取1.5mlEP管，加入500μl的50％甘油和500μl的菌液混匀，封口膜密封后放入平台的-80℃冰箱保存。超净工作台紫外照射30分钟后开风机运行5分钟。从摇床里取出锥形瓶，75％酒精擦拭后放入超净工作台。将菌液转至2个50ml离心管，各45ml。(无内毒素大提试剂盒Qiagen，货号：157038671)qiagen试剂盒为6000g、15分钟、4℃。弃净上清(尽量去干液体)，取出qiagen试剂盒的P3溶液，4度冰箱预冷。将Rnase A加入到P1中，4度冰箱暂存。超净工作台紫外照射30分钟后开风机运行5分钟。向留有菌体沉淀的离心管中加入10ml P1，充分混悬。向离心管中加入10ml P2，温和地上下颠倒混匀6次，室温放置5分钟。将QIAfilter Cartridge cap连接到QIAfilter Cartridge上，整体放置在试剂盒的收集管中。向离心管中加入10ml P3，立即上下颠倒混匀10次。将全部裂解物倒入QIAfilter Cartridge，室温静置10分钟。去掉QIAfilter Cartridge cap，慢慢地插入柱塞，将裂解液过滤到天根收集管。向10中的滤出液里加入2.5ml的buffer ER，上下颠倒10次混匀，4度冰箱静置30分钟。在11结束前15分钟，向QIAGEN-tip 500里加入10mlbuffer QBT，依靠重力作用排空。将11的液体倒入QIAGEN-tip 500里，重力排空。用30ml的buffer QC洗涤2次，两次洗涤～30分钟。用15ml的buffer QN将质粒洗脱到新的收集管。加入10.5ml室温的异丙醇，颠倒混匀，15000g，30分钟，4℃离心，小心弃掉上清。用5ml 70％乙醇(无内毒素，室温)洗涤质粒沉淀，15000g，10分钟，4℃离心，小心弃掉上清(保持沉淀不被破坏)。70％乙醇洗涤质粒沉淀的时候，用1ml移液器吹打混匀约20次。敞口静置10分钟，干燥。用200μl的bufferTE混悬质粒。使用Thermo公司的Nanodrop One超微量分光光度计测取260nm/280nm时的OD值和每微升质粒浓度值。

h.慢病毒制备：

293T细胞使用含10％FBS的DMEM(简称D10)培养，转染前一天上午，按照6.6×106/T75瓶铺细胞，培养基D10为12ml/瓶，保证次日上午病毒包装时细胞融合度可达到80％～90％；

NL4-3 HIV-EGFP-ATT质粒与包装质粒共转染(以转染1×T75瓶为例)，包括如下步骤：(1)转染前，用室温放置的PBS轻柔洗一遍(4ml/瓶)，弃掉，再加入无血清无抗生素的DMEM；准备转染试剂PEI及质粒：(2)PEI工作液浓度：1mg/ml。长期保存于-80，短期于4度储存。(3)质粒和PEI的准备，质粒(μg):TR(μl)＝1:3，(4)质粒配制比例为：主质粒：包装质粒＝3:1；(5)将质粒加入到500μl无血清无抗生素的DMEM中，混匀，室温放置5min；(6)将PEI加入到500μl无血清无抗生素的DMEM中，混匀室温放置5min；(7)将步骤(5)、(6)中的质粒与PEI混匀，室温孵育20min；(8)20min后，将步骤(7)中的质粒与PEI混合物逐滴加入到步骤(1)的细胞中，将T75瓶水平摇晃几次后，放于培养箱。(9)转染4小时后换为含5％FBS(D5)培养基(第一次换液)，12ml/瓶；注：转染可以在中午13：30内完成，转染4h后，即下午17:30可以进行第一次换液操作。

病毒液收集包括如下步骤：

(1)换液后24h，即次日下午17:00左右，进行第一次病毒液收集，病毒液收集后离心，2500rpm、10min，将上清放于4度保存；再向T75瓶中添加15ml D5培养基(第二次换液)，放于培养箱中继续培养。(2)转染后约48h左右，进行第二次病毒液收集。病毒液收集后离心，2500rpm、10min，收上清。(3)将两次收集到的病毒液混合，0.22um滤膜过滤后进行超速离心浓缩，(4)将过滤后的病毒液分装于Beckman超速离心管中，35ml/支，配平，保证各管之间的重量，误差控制在0.1g之内。将高速离心管对称放入高速离心机转头内，离心：24500rpm，15℃，2h。离心结束后，在安全柜中倒掉上清，将超速离心管倒扣在干净的卫生纸上10min，再向离心管中加入180μl病毒保存液，扣上离心管盖，4℃放1h，每20min涡旋震荡，1min/次。最后一次涡旋震荡后，轻微吹打病毒悬液10次，将超速离心管瞬离，1500rpm，1min。将超速离心管中的浓缩病毒液收集到灭菌1.5mlEP管中，轻微吹打病毒悬液10次，再进行集中分装，200μl/支，收获致弱表达HIV NL4条件可复制性阳性慢病毒，用作可复制慢病毒检测中的阳性对照病毒，命名为NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒，用液氮速冻，再置于-80℃保存。

可复制慢病毒浓度测定，具体按照如下配置测定：

1、消化293T细胞，置于15ml离心管中。12孔板每孔接种293T细胞2×105个，300μl/孔，尽量保证细胞均匀。细胞铺板操作见293T细胞传代标准操作规程。

2、病毒原液：每孔分别加入200μl，100μl，50μl，20μl，再用D10培养液(DMEM+10％FBS)补至500μl。留2孔作为阴性对照。病毒浓缩液：每孔分别加入5μl，1μl，0.2μl，0.1μl，再用D10培养液补至500μl。留2孔作为阴性对照。每孔中加入Polybrene至终浓度8μg/ml。

3、将孔板中的细胞摇匀，使细胞均匀分散，置于培养箱中。

4、换液:加入病毒液24h后，将每孔中的上清吸掉，每孔重新加入500μlD10培养液，将孔板放回培养箱中

5、细胞传代:继续培养24h后，将每孔细胞进行1:2传代，每孔D10培养液终体积为1ml。将孔板放回培养箱中。

6、结果检测:

将12孔板从培养箱中取出，吸去培养基；用胰酶消化5孔细胞，吸去胰酶；每孔添加1ml D10培养液，将细胞吹打成单细胞悬液。从每孔中取出0.5ml细胞悬液，分别转移到1.5ml EP管中，再向每管中添加0.5ml PBS，离心，1500rpm，3min。配置一抗和二抗，一抗原液稀释比例为1:200，二抗稀释比例为1:800。染色方法：弃掉离心后的上清，每管中加入50μl一抗，室温20min，再向每管中加入1mlPBS，离心，1500rpm，3min。弃掉离心后的上清，每管中加入100μl二抗，避光，室温15min。向每管中加入1ml PBS，离心，1500rpm，3min。弃上清，向每管中加入400μl PBS，重悬细胞，将细胞悬液转移至流式管中，进行流式检测。根据滴度测算：依据293T细胞感染法滴度测定方法，滴度/ml＝细胞数×流式细胞仪检测感染率×(1000μl/病毒体积)＝滴度

同时，还可以使用Lenti-X^TM p24 Rapid Titer Kit(生产厂商TAKARA货号632200)，按照说明书使用，检测p24蛋白含量。

RCL检测方法：

采用包装的NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒作为阳性对照病毒，按照药典所述指示细胞培养法:通过感染敏感C8166细胞株，来判定RCL检测结果的有效性。RCL检测实验开始之前，必须对包装的NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒的活性进行测定，用以确定在后续RCL检测过程中，实际添加的阳性对照病毒的量。具体采用半数细胞培养物感染量TCID50(50％tissueculture infective dose)来表征所包装的NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒活性。因NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒基因组中插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因，所以在病毒成功感染C8166细胞后，会表达绿色荧光蛋白，即可在荧光显微镜下直接观察到，培养的孔板中出现携带绿色荧光的细胞的孔即为阳性孔。

1.NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒TCID50确定：用C8166细胞培养基梯度稀释NL4-3HIV-EGFP-ATT病毒和P24蛋白，梯度稀释后P24的浓度依次为1fg/mL、10fg/mL、100fg/mL、1pg/mL、10pg/mL，100pg/mL；分别用上述各浓度的病毒稀释液重悬C8166细胞，重悬后调整细胞密度为2.5×10⁵个/mL，加入聚凝胺(polybrene)，终浓度为8μg/mL，混合均匀；然后将上述含不同浓度病毒的细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，每个浓度做10个复孔，将96孔板置37℃，5％CO₂的细胞培养箱中；感染72小时后补加50μL新鲜的细胞培养液；感染168小时后补加50μL新鲜的细胞培养液；600小时后，从细胞培养箱取出，在荧光显微镜下逐个观察各孔的荧光情况，即各稀释梯度的阳性孔个数，TCID50的值可根据Reed-Muench两氏法计算公式进行计算，如下：

距离比例＝(高于50％阳性率的百分数-50％)/(高于50％阳性率的百分数-低于50％阳性率的百分数)

lg^TCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％阳性率的稀释度的对数。

2.根据TCID50的值及病毒p24蛋白含量，换算得到制备的NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒浓度。

RCL检测的系统工作流程，主要包括：

FDA推荐的RCL检测方法是利用敏感细胞对病毒载体中可能存在的RCL进行培养扩增，并在培养终点进行检测，检测流程如图3所示，该方法首先将可存在的RCL在敏感细胞上扩增，并在培养终点利用敏感、快速的检测方法进行检测。有效的感染试验法首先要求RCL的供试品(阳性参照品)可以感染敏感细胞，其次要求在敏感细胞中可产生感染性病毒颗粒并释放出来，且感染试验要具有足够的灵敏度，可以检出低MOI的阳性对照病毒。

RCL检测中各供试品添加量的研究：

对于RCL的控制，RCL检测点主要包括构建稳转细胞株，生产病毒载体的终末细胞、基因表达载体上清液、基因表达载体转导的细胞、细胞库、病毒制品，终末放行嵌合抗原受体细胞及终末放行嵌合抗原受体细胞上清液。

(1)研究生产慢病毒的工作细胞库细胞、生产慢病毒的终末细胞、慢病毒上清液、慢病毒制品、终末放行的嵌合抗原受体细胞及终末放行的嵌合抗原受体细胞上清液的添加量对C8166敏感细胞增殖和感染的影响，通过分析结果，可确定各供试品添加量。

(2)生产慢病毒的细胞库细胞、生产慢病毒的终末细胞、慢病毒上清液、慢病毒制品、终末放行嵌合抗原受体细胞及终末放行嵌合抗原受体细胞上清液对C8166细胞扩增抑制作用的研究，结果判定标准如表1所示。

表1研究结果判定标准

①无菌条件下，分别添加工作细胞库的细胞1×10⁶、2.5×10⁶、3×10⁶、3.5×10⁶、4×10⁶个至C8166敏感细胞培养体系中，混合均匀，共培养6天后，无菌取样计数，将各组计数结果与不加生产慢病毒的工作细胞库细胞的组进行比较，对比分析是否存在显著性差异。结果表明工作细胞库细胞添加量低于4×10⁶个时对C8166敏感细胞增殖无抑制，结果如图4所示。

②无菌条件下，分别添加生产慢病毒的终末细胞1×10⁶、2.5×10⁶、3×10⁶、3.5×10⁶、4×10⁶个至C8166敏感细胞培养体系中，混合均匀，共培养6天后，无菌取样计数，将各组计数结果与不加生产慢病毒的终末细胞的组进行比较，对比分析是否存在显著性差异。结果表明生产慢病毒终末细胞添加量低于4×10⁶个时对C8166敏感细胞增殖无抑制，结果如图6所示。

③无菌条件下，添加用于包装慢病毒的细胞上清液，通过测定确定其p24含量分别为250ng、500ng、1000ng分别添加至C8166敏感细胞培养体系中，混合均匀，共培养6天后，无菌取样计数，将各组计数结果与不加用于包装慢病毒的细胞上清液的组进行比较，对比分析是否存在显著性差异。结果表明用于包装慢病毒的细胞上清液添加量低于1000ng时对C8166敏感细胞增殖无抑制，结果如图8所示。

④无菌条件下，添加慢病毒制品，通过测定确定其p24含量分别为500ng、1000ng、2000ng分别添加至C8166敏感细胞培养体系中，混合均匀，共培养6天后，无菌取样计数，将各组计数结果与不加慢病毒制品的组进行比较，对比分析是否存在显著性差异。结果表明慢病毒制品添加量低于1000ng时对C8166敏感细胞增殖无抑制，结果见如图10所示。

⑤无菌条件下，添加嵌合抗原受体细胞(CAR-T细胞)，其数量分别为5×10⁶、1×10⁷、2×10⁷个至C8166敏感细胞培养体系中，混合均匀，共培养6天后，无菌取样计数，将各组计数结果与不加嵌合抗原受体细胞的组比较，进行对比分析是否存在显著性差异。结果表明嵌合抗原受体细胞添加量低于2×10⁷个时对C8166敏感细胞增殖无抑制，结果如图12所示。

(3)生产慢病毒的工作细胞库细胞、生产慢病毒的终末细胞、慢病毒上清液、慢病毒制品及终末放行嵌合抗原受体细胞，终末放行嵌合抗原受体细胞上清液。对经致弱的条件可复制性慢病毒感染的C8166细胞抑制作用的研究

①无菌条件下，分别添加生产慢病毒的工作细胞库的细胞1×10⁶、2.5×10⁶、3×10⁶、3.5×10⁶、4×10⁶个至C8166敏感细胞培养体系中，同时参照MOI值分别添加相同量的慢病毒，混合均匀，控制细胞感染效率不超过40％，共培养72小时后，无菌取样，流式检测CAR+C8166敏感细胞比例，将各组统计结果与不加生产慢病毒的工作细胞库细胞的组进行比较，对比分析是否存在显著性差异。结果表明细胞库细胞添加量低于2×10⁶个时对慢病毒感染C8166敏感细胞无抑制，结果如图5所示。

②无菌条件下，分别添加生产慢病毒的终末细胞1×10⁶、2.5×10⁶、3×10⁶、3.5×10⁶、4×10⁶个至C8166敏感细胞培养体系中，同时参照MOI值分别添加相同量的慢病毒，，混合均匀，控制细胞感染效率不超过40％，共培养72小时后，无菌取样，流式细胞仪检测CAR+C8166敏感细胞比例，将各组统计结果与不加生产慢病毒的终末细胞的组进行比较，对比分析是否存在显著性差异。结果表明细胞库细胞添加量低于2×10⁶个时对慢病毒感染C8166敏感细胞无抑制，结果如图7所示。

③无菌条件下，添加用于包装慢病毒的细胞上清液，通过测定确定其p24含量分别为250ng、500ng、1000ng分别添加至C8166敏感细胞培养体系中，同时参照MOI值分别添加相同量的慢病毒，混合均匀，控制细胞感染效率不超过40％，共培养72小时后，无菌取样，流式细胞仪检测CAR+C8166敏感细胞比例，将各组统计结果与不加慢病毒上清液的组进行比较，对比分析是否存在显著性差异。结果表明慢病毒上清液添加量的p24低于500ng时对慢病毒感染C8166敏感细胞无抑制，结果如图9所示。

④无菌条件下，添加慢病毒制品，通过测定确定其p24含量分别为500ng、1000ng、2000ng分别添加至C8166敏感细胞培养体系中，同时参照MOI值分别添加相同量的慢病毒，混合均匀，控制细胞感染效率不超过40％，共培养72小时后，无菌取样，流式细胞仪检测CAR+C8166敏感细胞比例，将各组统计结果与不加慢病毒制品的组进行比较，对比分析是否存在显著性差异。结果表明慢病毒制品添加量低于500ng时对慢病毒感染C8166敏感细胞无抑制，结果如图11所示。

⑤无菌条件下，添加嵌合抗原受体细胞(CAR-T细胞)，其数量分别为5×10⁶、1×10⁷、2×10⁷个至C8166敏感细胞培养体系中，同时参照MOI值分别添加相同量的慢病毒，混合均匀，控制细胞感染效率不超过40％，共培养72小时后，无菌取样，流式细胞仪检测CAR+C8166敏感细胞比例，将各组统计结果与不加CAR-T细胞的组进行比较，对比分析是否存在显著性差异。结果表明嵌合抗原受体细胞添加量低于5×10⁶时对慢病毒感染C8166敏感细胞无抑制，结果如图13所示。C8166所用培养基为1640(10％FBS)完全培养基，置于37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱培养。以后每隔2天传代一次，传代前需用血球计数板计数，根据计数结果传代，保证传代后细胞密度为2.5×10⁵个/mL。

实施例2阳性对照、抑制对照设置条件的研究及完整RCL检测方法

(1)实验概述

①采用3个浓度的NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒(1TCID50、5TCID50、10TCID50)分别感染C8166细胞，每个浓度做3个重复，摸索阳性对照组NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒添加量。

②采用2个浓度的NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒(5TCID50、10TCID50)分别感染C8166细胞，并分别同时添加各供试品(生产慢病毒的细胞库细胞、生产慢病毒的终末细胞、慢病毒上清液、慢病毒制品及终末放行的嵌合抗原受体细胞，终末放行的嵌合抗原受体细胞上清液，各供试品添加量依据RCL检测中各供试品添加量的研究结果)，每个浓度做3个重复，摸索抑制对照组NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒添加量。

③RCL检测过程分为扩增放大阶段和指示阶段，在培养终点收集细胞培养上清液，进行P24检测，选择阳性率≥3/3的组中，NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒浓度最低的组，设置为慢病毒制品可复制慢病毒(RCL)检测中阳性对照组和抑制对照组的条件。

(2)实验方法

①实验起始

a.从-80℃冰箱取出NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒原液，根据已测定的病毒TCID50值，用RPMI 1640完全培养基对病毒进行梯度稀释，得到1TCID₅₀、5TCID₅₀、10TCID₅₀的病毒稀释液。

b.阳性对照组：取C8166细胞用病毒稀释液重悬到12孔板中，每组设置3个复孔，每孔细胞密度为5×10⁶/mL，polybrene 8μg/mL。

抑制对照：取C8166细胞用病毒稀释液重悬到12孔板中，添加供试品，每组设置3个复孔，每孔细胞密度为5×10⁶/mL，polybrene 8μg/mL。

阴性对照：取C8166细胞用RPMI 1640完全培养基重悬到12孔板中，设置3个复孔，每孔细胞密度为5×10⁶/mL，polybrene 8μg/mL。

供试品组：取C8166细胞用RPMI 1640完全培养基重悬到12孔板中，并添加供试品，设置3个复孔，每孔细胞密度为5×10⁶/mL，polybrene 8μg/mL。

表2 RCL检测阳性对照、抑制对照及阴性对照的设置

c.置37℃5％CO₂细胞培养箱孵育4h后，将各孔细胞悬液分别转移至T75培养瓶中，并做好标记，向各T75培养瓶中加入12mL RPMI 1640完全培养基，混匀。

②扩增放大阶段

a.3天后，向各瓶补加新鲜的C8166细胞完全培养基。

b.以后每隔2天传代一次，传代比例1:4，共传代5次(三周)。

c.第21天时，将各瓶细胞悬液转移至离心管中，400g离心5min，弃上清，向各管中加入RPMI 1640完全培养基重悬细胞，回培养箱继续培养。

d.48小时后，分别收集每瓶中的细胞悬液至离心管中，400g离心5分钟，上清用0.45μm的滤膜过滤，收集上清，当天用于指示阶段的实验。

③指示阶段

a.在扩增放大阶段的最后一周，准备新的未经处理的C8166细胞并扩增，为即将开始的指示阶段提供细胞。

b.C8166细胞进行计数后，将细胞悬液转移至50mL离心管，1×10⁶cells/管，400g离心5min，弃上清，分别用4mL RPMI 1640完全培养基重悬细胞，接入6孔板，共12孔，置于5％CO2，37℃的CO2细胞培养箱中培养过夜，400g离心5min，弃上清，分别用1mL从扩增放大阶段收集的过滤后的细胞培养上清液(含8μg/mL polybrene)重悬各孔细胞，并做好标记，置于5％CO2，37℃的CO2细胞培养箱中。4小时后，分别400g离心5min，弃上清，用4mL RPMI1640完全培养基重悬各管细胞，至6孔板培养。72小时后，将各孔中的细胞悬液分别转移到培养瓶中，并各加新鲜的RPMI 1640完全培养基。置于5％CO2，37℃CO2细胞培养箱中培养。

c.接种扩增放大阶段的细胞培养上清液6天后，400g离心5min，弃上清，分别用新鲜的RPMI 1640完全培养基重悬细胞，继续培养。换液48小时后，400g离心5min，收集细胞培养上清，并用0.45μm滤膜过滤，待用。

④p24检测

a.将Lenti-X^TM p24 Rapid Titer Kit试剂盒中所有试剂置于室温复温。

b.每个待检样本、空白对照、阳性质控均设置2个复孔，根据样本数取适量8孔条安装到ELISA框架中，做好标记。

c.向每孔中加入20μL裂解缓冲液(lysis buffer)。

d.阳性质控(p24含量为：100pg/mL)：用RPMI 1640完全培养基将p24标准品(10ng/mL)进行100倍稀释，即，取5μLp24标准品(10ng/mL)，加入到495μL RPMI 1640完全培养基中，混匀。

e.空白对照：C8166细胞完全培养基。分别取200μL指示阶段结束时收集的各组细胞培养上清液，加入到相应的孔中。

f.用封板膜封住反应板，37℃孵育60min。

g.移去封板膜，弃去孔板中液体，每孔加入300μL 1×wash buffer，左手手持孔板，保持水平，用右手手指高频轻敲孔板边缘，充分洗涤30sec。

h.弃去washbuffer，并倒扣于吸水纸上，轻扣吸干。

i.重复步骤g～h，共洗涤5次。

j.向每孔中加入100μL生物素标记的anti-p24抗体，用封板膜封住反应板，37℃孵育60min。

k.移去封板膜，弃去每孔抗体，重复g～h操作，洗涤孔板5次。

l.向每孔加入100μL Streptavidin-HRP，室温孵育30min。

m.弃去每孔Streptavidin-HRP，重复g～h操作，洗涤孔板5次。

n.立即向各孔加入100μL Substrate Solution，避光置于室温孵育30min。

o.向每孔加入100μL Stop Solution，立即置于酶标仪下，读出450nm吸光值。

p.Lenti-X^TM p24 Rapid TiterKit的cut-off值为0.203，OD450值大于等于cut-off值的判断为阳性，小于cut-off值的判断为阴性。

⑤根据阳性对照和抑制对照各组结果，取阳性率≥3/3的组中，NL4-3HIV-EGFP-ATT病毒的浓度作为阳性对照和抑制对照组的设置条件。

分别将不同的供试品按照上述方法进行检测和对照，结果如表3-表**所示

表3：生产慢病毒的细胞库细胞RCL检测阳性对照、抑制对照设置条件的研究实验结果

表3中以生产慢病毒的细胞库细胞为供试品进行RCL检测阳性对照、抑制对照设置条件的研究实验结果表明5TCID₅₀作为阳性参照，抑制对照添加量无影响，阴性对照为阴性，生产慢病毒的细胞库细胞RCL检测阴性。

表4：生产慢病毒的终末细胞RCL检测阳性对照、抑制对照设置条件的研究实验结果

表4中以生产慢病毒的终末细胞为供试品进行RCL检测阳性对照、抑制对照设置条件的研究。实验结果表明，5TCID₅₀作为阳性参照，抑制对照添加量无影响，阴性对照为阴性，生产慢病毒的终末细胞RCL检测阴性。

表5：嵌合抗原受体细胞RCL检测阳性对照、抑制对照设置条件的研究实验结果

表5中以嵌合抗原受体细胞为供试品进行RCL检测阳性对照、抑制对照设置条件的研究实验结果表明，5TCID₅₀作为阳性参照，抑制对照添加量无影响，阴性对照为阴性，供试品阴性。

表6：慢病毒上清液RCL检测阳性对照、抑制对照设置条件的研究实验结果

表6中以慢病毒上清液为供试品进行RCL检测阳性对照、抑制对照设置条件的研究实验结果表明，5TCID₅₀作为阳性参照，抑制对照添加量无影响，阴性对照为阴性，慢病毒上清液RCL检测阴性。

表7：慢病毒制品的RCL检测阳性对照、抑制对照设置条件的研究实验结果

表7中以慢病毒制品为供试品进行RCL检测阳性对照、抑制对照设置条件的研究实验结果表明，5TCID₅₀作为阳性参照，抑制对照添加量无影响，阴性对照为阴性，慢病毒制品RCL检测阴性。

表8-12是连续三个批次的检测结果

表8：生产慢病毒的细胞库的细胞RCL检测结果

表8中的额三批生产慢病毒的细胞库的细胞RCL检测结果均为阴性。

表9：生产慢病毒的终末细胞RCL检测结果

表9中的生产慢病毒的终末细胞RCL检测结果表明，5TCID50作为阳性参照，抑制对照添加量无影响，阴性对照为阴性，慢病毒生产终末细胞检测阴性。表

表10：大规模中试生产三批的嵌合抗原受体细胞RCL检测结果

表10中的大规模中试生产三批的CAR-T细胞RCL检测结果为阴性。

表11：大规模中试生产三批的慢病毒上清液RCL检测结果

表11中的大规模中试生产三批的慢病毒上清液RCL检测结果为阴性。

表12：中试三批慢病毒制品RCL检测

表12里面中试三批慢病毒制品RCL检测结果为阴性。

综上所述，在实验室条件和中试条件下，均证明了本发明方法的安全，有效，高效；确保了慢病毒商品的安全性。

实施例2

采用本发明所述的条件可复制性慢病毒的检测方法进行检测：

1.首先对待测样品进行快速检测：

A、(1)细胞样本的准备：计算细胞数目，吸取所需体积细胞培养液，300×g离心5min，小心将上清完全吸弃，切勿吸走细胞沉淀。

(2)将Spin Column(核酸纯化柱)置于Collection Tube(收集管)中，加入250μlBuffer BL，12,000×g离心1min，活化硅胶膜。

(3)细胞样本的消化：取20μl Proteinase(蛋白酶)K至1.5ml离心管底部，然后加入200μl高纯水悬浮的细胞沉淀，涡旋振荡10s；再加入200μl Buffer gA1，涡旋振荡10s，56℃孵育0.5～1h，期间震荡3～5次。

(4)孵育结束后加入200μl无水乙醇，涡旋振荡混匀。无水乙醇体积≈(细胞样本体积+Buffer gA1体积)/2。

(5)将步骤(4)所得溶液全部转入Spin Column中，12,000×g离心1min，弃废液。

(6)向Spin Column中加入500μl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000×g离心30s，弃废液。

(7)重复步骤(6)一次。

(8)向Spin Column中加入500μl Wash Buffer(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000×g离心30s，弃废液。

(9)将Spin Column放回Collection Tube中，12,000×g离心2min，开盖晾干1min。

(10)取出Spin Column，放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μl TE Buffer(65℃预热5min洗脱效果更佳)，20～25℃放置2min，12,000×g离心2min。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入Spin Column中，离心2min。

所述反应体系如表13所示，其中引物F为序列表中序列3所示的单链核苷酸分子；引物R为序列表中序列4所示的单链核苷酸分子；探针P为序列表中序列5所示的单链核苷酸分子。

表13 20ul反应体系

B、样品DNA中VSVG基因残留量的检测：

1)如表13所示，配置检测组(CAR-T细胞基因组DNA)和对照组(T细胞基因组DNA)的共20ul反应体系，每组重复三次。

2)使用Light Cycler 480 Instrument II Real-Time PCR仪按照如下设定进行qPCR反应在72℃延伸反应时荧光定量检测，荧光定量检测中的PCR反应程序分为第一阶段和第二阶段，所述第一阶段为94℃，300s，1个循环；第二阶段：依次为94℃，20s；53℃，20s；72℃，40s，一共40个循环。

3)根据检测组(CAR-T细胞基因组DNA)和对照组(T细胞基因组DNA)的Ct值对比标准曲线，确定CAR-T细胞是否含有Psi-gag基因残留，以Psi-gag基因残留量。

2.通过本发明的慢病毒验证检测方法进行验证检测，具体步骤如下：

生产慢病毒的终末细胞RCL敏感细胞检测法的建立

C8166细胞的准备

(1)提前7天复苏C8166敏感细胞，若有正在培养中的且代次符合要求的C8166细胞，则不需重新复苏。

(2)C8166敏感细胞正常传代扩增：即间隔2天传代一次，(注：每次传代前)对细胞进行计数，计数方式按照《血细胞计数板计数标准操作规程》。按细胞密度进行传代，传代后调整细胞密度为2.5×10⁵个/mL。

(3)RCL检测方法的建立：实验前24小时，准备C8166敏感细胞：细胞计数，300g离心换液，换液重悬后的细胞密度调整为4.2×10⁵个/mL。放回细胞培养箱继续培养。

供试品的准备

无菌取用于包装慢病毒的终末细胞悬液进行计数，依据计数结果，无菌取所需细胞数(总数为B，B为n的整数倍，n由7.2.1.1.生产慢病毒的终末细胞添加量的研究结果确定)的悬液加入50mL尖底离心管中，300g离心5min后，收集细胞上清液至洁净无菌的新50mL尖底离心管中。细胞沉淀用一次性无菌研磨棒研磨。均匀研磨结束后，用合适体积的1640(10％FBS)细胞完全培养基重悬，重悬后的体积调整为500μL×B/n，无菌取10μL混合物于血球计数板上，置显微镜下观察，四个大格内细胞总数应小于10个。细胞内溶物2～8℃冷藏存放、备用。

实验起始

(1)实验分组设计

表14：生产慢病毒的终末细胞RCL敏感细胞检测法的建立实验分组

(2)实验步骤

a.阳性对照：

将分装好的NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒从-80℃冰箱中取出放置4℃冷藏柜融解后，用1640(10％FBS)完全细胞培养基进行梯度稀释至N TCID₅₀/mL(N的值根据7.2.2.CD19CAR-T细胞RCL敏感细胞检测法的建立实验中关于阳性对照的条件设置实验结果确定)。从细胞培养箱中取出培养期的C8166细胞，细胞计数后，取1.5×10⁷个C8166细胞，300g离心6分钟，弃去细胞上清液。用3mL N TCID₅₀/mL的NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒稀释液重悬C8166细胞，加入polybrene至终浓度为8μg/mL，混合均匀，平均分成3份分别加至12孔板的3个指定孔中。分别标记为N-1、N-2、N-3。混合均匀后，放回37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱继续培养。

b.抑制对照实验条件设置的研究

①NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒稀释准备：无菌条件下取阳性对照实验中已稀释至10²TCID50/mL的NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒，然后用1640(10％FBS)细胞完全培养基进行梯度稀释至20TCID₅₀/mL、10TCID₅₀/mL。

②C8166细胞准备：细胞计数，根据计数结果，分别取2管细胞悬液，调整至每管1.5×10⁷个C8166细胞，300g离心5分钟，弃去上清。

③分别用1.5mL含10TCID₅₀/mL和20TCID₅₀/mL的NL4-3HIV-EGFP-ATT病毒稀释液重悬上述已准备好的2管C8166细胞，同时，分别加入1.5mL已备好的用于慢病毒包装生产的终末细胞内溶物，然后加入polybrene至终浓度为8μg/mL，混合均匀，平均分成6份分别加至12孔板的指定6个孔中。依次标记为ZM10-1、ZM10-2、ZM10-3，此3孔NL4-3HIV-EGFP-ATT病毒添加量均为10TCID₅₀；ZM5-1、ZM5-2、ZM5-3，此3孔NL4-3 HIV-EGFP-ATT病毒添加量均为5TCID50。

c.阴性对照

①C8166细胞准备：细胞计数，依据计数结果，取1管细胞悬液，调节至1.5×10⁷个C8166细胞，300g离心5分钟，弃去上清。

②用3mL 1640(10％FBS)完全培养基重悬上述已准备好的C8166细胞，加入polybrene至终浓度为8μg/mL，混匀，均分至12孔板的3个孔中。标记为Y-1、Y-2、Y-3。置37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱培养。

d.供试品(生产CD19慢病毒的终末细胞)：

①C8166细胞准备：计数，根据计数结果，取一管细胞悬液，含5×10⁶个C8166细胞，标记为GM T-1，取另一管细胞悬液，含2.0×10⁷个C8166细胞，标记为GM T-4。300g离心5分钟弃上清。

②用0.5mL已准备好的生产慢病毒的内溶物重悬GM T-1管中的C8166细胞，补加0.5mL 1640(10％FBS)完全培养基，加入polybrene至终浓度为8μg/mL，混匀，将细胞悬液转移至12孔板的1个孔中。

③用2mL已准备好的生产慢病毒的内溶物重悬GM T-4管中的C8166细胞，补加2mL1640(10％FBS)完全培养基，加入polybrene至终浓度为8μg/mL，混匀，将细胞悬液转移至T25瓶中。置37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱培养。

e.4h后，将各组细胞从二氧化碳培养箱拿出，各孔/瓶中的细胞悬液分别转移至T75瓶中，各瓶分别补加12mL 1640(10％FBS)完全培养基。置37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱培养。记为0天。

扩增放大阶段

放大阶段是的实验按照下述步骤进行：

第3天，向各瓶补加36mL新鲜的1640(10％FBS)完全培养基。以后每隔2天传代一次，传代比例1:4，共传代5次(三周)。传代方法：每次传代时先轻轻吹散细胞，吸弃36mL细胞悬液，补加36mL新鲜的1640(10％FBS)完全培养基。第21天时，将各瓶细胞悬液转移至50mL离心管中，共15管，300g离心5min，弃上清，向各管中加入48mL 1640(10％FBS)完全培养基重悬细胞，继续培养。24～48小时后，分别收集每瓶中的细胞悬液至50mL离心管中，300g离心5分钟，上清用0.45μm的滤膜过滤，收集上清，当天用于指示阶段的实验。

其中，所述指示阶段的实验包括如下步骤：

在扩增放大阶段的最后一周，准备新的未经处理的C8166细胞并扩增，为即将开始的指示阶段提供细胞。指示阶段的前一天，将细胞300g，离心5min，换液，活细胞密度调为4.2×10⁵/mL。C8166细胞进行计数，将细胞悬液转移至50mL离心管，1×10⁶个/管，300g离心5min，弃上清，分别用1mL从扩增放大阶段收集的过滤后的细胞培养上清液(含8μg/mLpolybrene)重悬各管细胞，并做好标记，置于5％CO₂，37℃的二氧化碳培养箱中，供试品(“GM T-1、GM T-4”)组需接种2个重复。置于37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养。4小时后，分别300g离心5min，弃上清，用4mL 1640(10％FBS)完全培养基重悬各管细胞于6孔板，置于5％CO₂，37℃二氧化碳培养箱中培养。此时记为第0天。第3天，将各孔中的细胞悬液分别转移到T75培养瓶中，并各加12mL新鲜的1640(10％FBS)完全培养基。供试品组分别将将2瓶合并为1瓶，置于37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养。接种扩增放大阶段的细胞培养上清液6天后，300g离心5min，弃上清，分别用12mL新鲜的1640(10％FBS)完全培养基重悬细胞，继续培养。换液24～48小时后，300g离心5min，收集细胞培养上清，并用0.45μm滤膜过滤，收集上清，用于p24检测(马上检测或者置-80℃冰箱1周内检测)。

其中，p24检测包括如下步骤：

(1)将试剂盒中所有试剂置于室温复温。

(2)每个待检样本、空白对照、阳性质控均设置2个复孔，根据样本数取适量8孔条安装到ELISA框架中，做好标记。

(3)向每孔中加入20μL lysis buffer。

(4)阳性质控(p24含量为：100pg/mL)：用1640(10％FBS)完全培养基将p24标准品(10ng/mL)进行100倍稀释，即，取5μLp24标准品(10ng/mL)，加入到495μL 1640(10％FBS)完全培养基中，混匀。

(5)空白对照：1640(10％FBS)完全培养基。

(6)分别取200μL指示阶段结束时收集的各组细胞培养上清液，加入到相应的孔中。

(7)用封板膜封住反应板，37.0℃孵育60min。

(8)移去封板膜，弃去孔板中液体，每孔加入300μL 1×wash buffer，左手手持孔板，保持水平，用右手手指高频轻敲孔板边缘，充分洗涤30sec。

(9)弃去wash buffer，并倒扣于吸水纸上，轻扣吸干。

(10)重复步骤(8)～(9)，共洗涤5次。

(11)向每孔中加入100μL生物素标记的anti-p24抗体，用封板膜封住反应板，37.0℃孵育60min。

(12)移去封板膜，弃去每孔抗体，重复(8)～(9)操作，洗涤孔板5次。

(13)向每孔加入100μL Streptavidin-HRP，室温孵育30min。

(14)弃去每孔Streptavidin-HRP，重复(8)～(9)操作，洗涤孔板5次。

(15)立即向各孔加入100μL Substrate Solution，避光置于室温孵育30min。

(16)向每孔加入100μL Stop Solution，立即置于酶标仪下，读出450nm吸光值。

(17)Lenti-XTM p24 Rapid Titer Kit的cut-off值为0.205，OD450值大于等于cut-off值的判断为阳性，小于cut-off值的判断为阴性。

(18)根据各组结果，在满足阳性率3/3的前提下，抑制对照组NL4-3HIV-EGFP-ATT病毒的最低添加量作为抑制对照实验的设置条件。若所有的组阳性率都不满足3/3，则需根据实验结果适当增加病毒添加量重新实验。若“GM T-4”和“GM T-1”组的C8166细胞都能正常扩增，则以后在生产慢病毒的终末细胞RCL敏感细胞检测法中，选择“GM T-4”的条件。

为降低同源重组产生有复制能力病毒的可能性，从最初的二质粒系统发展为三质粒、四质粒表达系统，三质粒系统包装成分分别构建在两个质粒上，一个表达gag和pol，另一个表达env。三质粒表达系统包括包装质粒、异源包膜蛋白质粒和转移质粒。异源包膜蛋白质粒是用编码水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因代替env基因，扩大了靶细胞的范围。为细胞产品使用的安全，防止可复制病毒的产生，在慢病毒载体表达的嵌合抗原受体修饰的细胞生产中需要进行可复制病毒(RCL)的检测。另一方面，这一改造有利于作为不同于病毒自身基因的标记物，基于此，开发Q-PCR快速检测试剂盒，利用这一试剂盒检测待测样品，可以为快速放行细胞制品提供便利条件，因快速检测试剂盒检测必须与相应的培养方法平行验证检测结果前后一致，才可以应用与嵌合性抗原修饰的受体细胞的快速检测放行

实验结果分析：以CD19 CAR-T样品为例，分别按照上述方法进行检测，通过基于Q-PCR的快速检测步骤检测，判定结果为：阴性；在经过基于培养法的验证检测步骤，判定结果为：阴性。而阳性对照样品来说，检测QPCR判定结果为阳性，培养法检测判定也是阳性。二者比较结果说明Psi-gag快检法和RCL传统培养法具有高度的一致性

参照实施例2中试验步骤，采用本发明所述的条件可复制性慢病毒的检测方法进行检测数据表明：基于Psi-gag基因建立的Q-PCR快速放行检测方法的标准曲线，该标准曲线说明在10^6-10^1之间呈现良好的线性扩增，判断述慢病毒RCL检测方法中采用的引物对、探针均具有较好的扩增效率和特异性。图14基于Psi-gag基因建立的Q-PCR快速放行检测方法与培养法的结果比较.比较结果说明Psi-gag快检法和传统培养法具有高度的一致性。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 康美润源（北京）生物技术有限公司

<120> 一种用于检测可复制性慢病毒(RCL)的试剂盒及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14221

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cattttttta gtctctactg tgcctaacct tgtaagttaa atttgatcag aggtgtgttc 60

ccagagggaa aacagtatat acagggttca gtactatcgc atttcaggcc tccacctggg 120

tcttggaatg tgtcccccga ggggtgatga ctacctcagt tggatctcca caggtcacag 180

tgacacaaga taaacaagac acctcccaag gctaccacaa tgggccgccc tccacgtgca 240

catggccgga ggaactgcca tgtcggaggt gcaagcacac ctgcgcatca gagtccttgg 300

tgtggaggga gggaccagcg cagcttccag ccatccacct gatgaacaga acctagggaa 360

agccccagtt ctacttacac caggaaaggc tggaagggct aatttggtcc caaaaaagac 420

aagagatcct tgatctgtgg atctaccaca cacaaggcta cttccctgat tggcagaact 480

acacaccagg gccagggatc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc aagttagtac 540

cagttgaacc agagcaagta gaagaggcca atgaaggaga gaacaacagc ttgttacacc 600

ctatgagcca gcatgggatg gaggacccgg agggagaagt attagtgtgg aagtttgaca 660

gcctcctagc atttcgtcac atggcccgag agctgcatcc ggagtactac aaagactgct 720

gacatcgagc tttctacaag ggactttccg ctggggactt tccagggagg tgtggcctgg 780

gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat gctacatata agcagctgct ttttgcctgt 840

actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac 900

ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgctca aagtagtgtg tgcccgtctg 960

ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct 1020

agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag cgaaagtaaa gccagaggag atctctcgac 1080

gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta 1140

cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcggta 1200

ttaagcgggg gagaattaga taaatgggaa aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa 1260

caatataaac taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat 1320

cctggccttt tagagacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc 1380

cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata caatagcagt cctctattgt 1440

gtgcatcaaa ggatagatgt aaaagacacc aaggaagcct tagataagat agaggaagag 1500

caaaacaaaa gtaagaaaaa ggcacagcaa gcagcagctg acacaggaaa caacagccag 1560

gtcagccaaa attaccctat agtgcagaac ctccaggggc aaatggtaca tcaggccata 1620

tcacctagaa ctttaaatgc atgggtaaaa gtagtagaag agaaggcttt cagcccagaa 1680

gtaataccca tgttttcagc attatcagaa ggagccaccc cacaagattt aaataccatg 1740

ctaaacacag tggggggaca tcaagcagcc atgcaaatgt taaaagagac catcaatgag 1800

gaagctgcag aatgggatag attgcatcca gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag 1860

atgagagaac caaggggaag tgacatagca ggaactacta gtacccttca ggaacaaata 1920

ggatggatga cacataatcc acctatccca gtaggagaaa tctataaaag atggataatc 1980

ctgggattaa ataaaatagt aagaatgtat agccctacca gcattctgga cataagacaa 2040

ggaccaaagg aaccctttag agactatgta gaccgattct ataaaactct aagagccgag 2100

caagcttcac aagaggtaaa aaattggatg acagaaacct tgttggtcca aaatgcgaac 2160

ccagattgta agactatttt aaaagcattg ggaccaggag cgacactaga agaaatgatg 2220

acagcatgtc agggagtggg gggacccggc cataaagcaa gagttttggc tgaagcaatg 2280

agccaagtaa caaatccagc taccataatg atacagaaag gcaattttag gaaccaaaga 2340

aagactgtta agtgtttcaa ttgtggcaaa gaagggcaca tagccaaaaa ttgcagggcc 2400

cctaggaaaa agggctgttg gaaatgtgga aaggaaggac accaaatgaa agattgtact 2460

gagagacagg ctaatttttt agggaagatc tggccttccc acaagggaag gccagggaat 2520

tttcttcaga gcagaccaga gccaacagcc ccaccagaag agagcttcag gtttggggaa 2580

gagacaacaa ctccctctca gaagcaggag ccgatagaca aggaactgta tcctttagct 2640

tccctcagat cactctttgg cagcgacccc tcgtcacaat aaagataggg gggcaattaa 2700

aggaagctct attagataca ggagcagatg atacagtatt agaagaaatg aatttgccag 2760

gaagatggaa accaaaaatg atagggggaa ttggaggttt tatcaaagta agacagtatg 2820

atcagatact catagaaatc tgcggacata aagctatagg tacagtatta gtaggaccta 2880

cacctgtcaa cataattgga agaaatctgt tgactcagat tggctgcact ttaaattttc 2940

ccattagtcc tattgagact gtaccagtaa aattaaagcc aggaatggat ggcccaaaag 3000

ttaaacaatg gccattgaca gaagaaaaaa taaaagcatt agtagaaatt tgtacagaaa 3060

tggaaaagga aggaaaaatt tcaaaaattg ggcctgaaaa tccatacaat actccagtat 3120

ttgccataaa gaaaaaagac agtactaaat ggagaaaatt agtagatttc agagaactta 3180

ataagagaac tcaagatttc tgggaagttc aattaggaat accacatcct gcagggttaa 3240

aacagaaaaa atcagtaaca gtactggatg tgggcgatgc atatttttca gttcccttag 3300

ataaagactt caggaagtat actgcattta ccatacctag tataaacaat gagacaccag 3360

ggattagata tcagtacaat gtgcttccac agggatggaa aggatcacca gcaatattcc 3420

agtgtagcat gacaaaaatc ttagagcctt ttagaaaaca aaatccagac atagtcatct 3480

atcaatacat ggatgatttg tatgtaggat ctgacttaga aatagggcag catagaacaa 3540

aaatagagga actgagacaa catctgttga ggtggggatt taccacacca gacaaaaaac 3600

atcagaaaga acctccattc ctttggatgg gttatgaact ccatcctgat aaatggacag 3660

tacagcctat agtgctgcca gaaaaggaca gctggactgt caatgacata cagaaattag 3720

tgggaaaatt gaattgggca agtcagattt atgcagggat taaagtaagg caattatgta 3780

aacttcttag gggaaccaaa gcactaacag aagtagtacc actaacagaa gaagcagagc 3840

tagaactggc agaaaacagg gagattctaa aagaaccggt acatggagtg tattatgacc 3900

catcaaaaga cttaatagca gaaatacaga agcaggggca aggccaatgg acatatcaaa 3960

tttatcaaga gccatttaaa aatctgaaaa caggaaagta tgcaagaatg aagggtgccc 4020

acactaatga tgtgaaacaa ttaacagagg cagtacaaaa aatagccaca gaaagcatag 4080

taatatgggg aaagactcct aaatttaaat tacccataca aaaggaaaca tgggaagcat 4140

ggtggacaga gtattggcaa gccacctgga ttcctgagtg ggagtttgtc aatacccctc 4200

ccttagtgaa gttatggtac cagttagaga aagaacccat aataggagca gaaactttct 4260

atgtagatgg ggcagccaat agggaaacta aattaggaaa agcaggatat gtaactgaca 4320

gaggaagaca aaaagttgtc cccctaacgg acacaacaaa tcagaagact gagttacaag 4380

caattcatct agctttgcag gattcgggat tagaagtaaa catagtgaca gactcacaat 4440

atgcattggg aatcattcaa gcacaaccag ataagagtga atcagagtta gtcagtcaaa 4500

taatagagca gttaataaaa aaggaaaaag tctacctggc atgggtacca gcacacaaag 4560

gaattggagg aaatgaacaa gtagataaat tggtcagtgc tggaatcagg aaagtactat 4620

ttttagatgg aatagataag gcccaagaag aacatgagaa atatcacagt aattggagag 4680

caatggctag tgattttaac ctaccacctg tagtagcaaa agaaatagta gccagctgtg 4740

ataaatgtca gctaaaaggg gaagccatgc atggacaagt agactgtagc ccaggaatat 4800

ggcagctaga ttgtacacat ttagaaggaa aagttatctt ggtagcagtt catgtagcca 4860

gtggatatat agaagcagaa gtaattccag cagagacagg gcaagaaaca gcatacttcc 4920

tcttaaaatt agcaggaaga tggccagtaa aaacagtaca tacagacaat ggcagcaatt 4980

tcaccagtac tacagttaag gccgcctgtt ggtgggcggg gatcaagcag gaatttggca 5040

ttccctacaa tccccaaagt caaggagtaa tagaatctat gaataaagaa ttaaagaaaa 5100

ttataggaca ggtaagagat caggctgaac atcttaagac agcagtacaa atggcagtat 5160

tcatccacaa ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag 5220

tagacataat agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc 5280

aaaattttcg ggtttattac agggacagca gagatccagt ttggaaagga ccagcaaagc 5340

tcctctggaa aggtgaaggg gcagtagtaa tacaagataa tagtgacata aaagtagtgc 5400

caagaagaaa agcaaagatc atcagggatt atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg 5460

tggcaagtag acaggatgag gattaacaca tggaaaagat tagtaaaaca ccatatgtat 5520

atttcaagga aagctaagga ctggttttat agacatcact atgaaagtac taatccaaaa 5580

ataagttcag aagtacacat cccactaggg gatgctaaat tagtaataac aacatattgg 5640

ggtctgcata caggagaaag agactggcat ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg 5700

aaaaagagat atagcacaca agtagaccct gacctagcag accaactaat tcatctgcac 5760

tattttgatt gtttttcaga atctgctata agaaatacca tattaggacg tatagttagt 5820

cctaggtgtg aatatcaagc aggacataac aaggtaggat ctctacagta cttggcacta 5880

gcagcattaa taaaaccaaa acagataaag ccacctttgc ctagtgttag gaaactgaca 5940

gaggacagat ggaacaagcc ccagaagacc aagggccaca gagggagcca tacaatgaat 6000

ggacactaga gcttttagag gaacttaaga gtgaagctgt tagacatttt cctaggatat 6060

ggctccataa cttaggacaa catatctatg aaacttacgg ggatacttgg gcaggagtgg 6120

aagccataat aagaattctg caacaactgc tgtttatcca tttcagaatt gggtgtcgac 6180

atagcagaat aggcgttact cgacagagga gagcaagaaa tggagccagt agatcctaga 6240

ctagagccct ggaagcatcc aggaagtcag cctaaaactg cttgtaccaa ttgctattgt 6300

aaaaagtgtt gctttcattg ccaagtttgt ttcatgacaa aagccttagg catctcctat 6360

ggcaggaaga agcggagaca gcgacgaaga gctcatcaga acagtcagac tcatcaagct 6420

tctctatcaa agcagtaagt agtacatgta atgcaaccta taatagtagc aatagtagca 6480

ttagtagtag caataataat agcaatagtt gtgtggtcca tagtaatcat agaatatagg 6540

aaaatattaa gacaaagaaa aatagacagg ttaattgata gactaataga aagagcagaa 6600

gacagtggca atgagagtga aggagaagta tcagcacttg tggagatggg ggtggaaatg 6660

gggcaccatg ctccttggga tattgatgat ctgtagtgct acagaaaaat tgtgggtcac 6720

agtctattat ggggtacctg tgtggaagga agcaaccacc actctatttt gtgcatcaga 6780

tgctaaagca tatgatacag aggtacataa tgtttgggcc acacatgcct gtgtacccac 6840

agaccccaac ccacaagaag tagtattggt aaatgtgaca gaaaatttta acatgtggaa 6900

aaatgacatg gtagaacaga tgcatgagga tataatcagt ttatgggatc aaagcctaaa 6960

gccatgtgta aaattaaccc cactctgtgt tagtttaaag tgcactgatt tgaagaatga 7020

tactaatacc aatagtagta gcgggagaat gataatggag aaaggagaga taaaaaactg 7080

ctctttcaat atcagcacaa gcataagaga taaggtgcag aaagaatatg cattctttta 7140

taaacttgat atagtaccaa tagataatac cagctatagg ttgataagtt gtaacacctc 7200

agtcattaca caggcctgtc caaaggtatc ctttgagcca attcccatac attattgtgc 7260

cccggctggt tttgcgattc taaaatgtaa taataagacg ttcaatggaa caggaccatg 7320

tacaaatgtc agcacagtac aatgtacaca tggaatcagg ccagtagtat caactcaact 7380

gctgttaaat ggcagtctag cagaagaaga tgtagtaatt agatctgcca atttcacaga 7440

caatgctaaa accataatag tacagctgaa cacatctgta gaaattaatt gtacaagacc 7500

caacaacaat acaagaaaaa gtatccgtat ccagagggga ccagggagag catttgttac 7560

aataggaaaa ataggaaata tgagacaagc acattgtaac attagtagag caaaatggaa 7620

tgccacttta aaacagatag ctagcaaatt aagagaacaa tttggaaata ataaaacaat 7680

aatctttaag caatcctcag gaggggaccc agaaattgta acgcacagtt ttaattgtgg 7740

aggggaattt ttctactgta attcaacaca actgtttaat agtacttggt ttaatagtac 7800

ttggagtact gaagggtcaa ataacactga aggaagtgac acaatcacac tcccatgcag 7860

aataaaacaa tttataaaca tgtggcagga agtaggaaaa gcaatgtatg cccctcccat 7920

cagtggacaa attagatgtt catcaaatat tactgggctg ctattaacaa gagatggtgg 7980

taataacaac aatgggtccg agatcttcag acctggagga ggcgatatga gggacaattg 8040

gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac 8100

caaggcaaag agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt 8160

ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca gcgtcaatga cgctgacggt 8220

acaggccaga caattattgt ctgatatagt gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat 8280

tgaggcgcaa cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc atcaaacagc tccaggcaag 8340

aatcctggct gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc 8400

tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct 8460

ggaacagatt tggaataaca tgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac 8520

aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga 8580

attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct 8640

gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt 8700

tgctgtactt tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac 8760

ccacctccca atcccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga 8820

gagagacaga gacagatcca ttcgattagt gaacggatcc ttagcactta tctgggacga 8880

tctgcggagc ctgtgcctct tcagctacca ccgcttgaga gacttactct tgattgtaac 8940

gaggattgtg gaacttctgg gacgcagggg gtgggaagcc ctcaaatatt ggtggaatct 9000

cctacagtat tggagtcagg aactaaagaa tagtgctgtt aacttgctca atgccacagc 9060

catagcagta gctgagggga cagatagggt tatagaagta ttacaagcag cttatagagc 9120

tattcgccac atacctagaa gaataagaca gggcttggaa aggattttgc tataagatgg 9180

tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg 9240

acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca 9300

agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg 9360

tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc 9420

acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca 9480

aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 9540

accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc 9600

tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca 9660

tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc 9720

actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc 9780

tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc 9840

tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaaagcg 9900

gccgcactag tgataattcc gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag 9960

ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc 10020

ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg 10080

tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc 10140

tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc 10200

cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa 10260

ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct 10320

ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg 10380

atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg 10440

tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg 10500

gtggcaagtg gtcaaaaagt agtgtgattg gatggcctgc tgtaagggaa agaatgagac 10560

gagctgagcc agcagcagat ggggtgggag cagtatctcg agacctagaa aaacatggag 10620

caatcacaag tagcaataca gcagctaaca atgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag 10680

aggaggaaga ggtgggtttt ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca 10740

aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc 10800

actcccaaag aagacaagat atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa ggctacttcc 10860

ctgattggca gaactacaca ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt 10920

gctacaagct agtaccagtt gagccagata aggtagaaga ggccaataaa ggagagaaca 10980

ccagcttgtt acaccctgtg agcctgcatg gaatggatga ccctgagaga gaagtgttag 11040

agtggaggtt tgacagccgc ctagcatttc atcacgtggc ccgagagctg catccggagt 11100

acttcaagaa ctgctgacat cgagcttgct acaagggact ttccgctggg gactttccag 11160

ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt ggcgagccct cagatgctgc atataagcag 11220

ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct 11280

ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 11340

gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 11400

gtgtggaaaa tctctagcac ccaggaggta gaggttgcag tgagccaaga tcgcgccact 11460

gcattccagc ctgggcaaga aaacaagact gtctaaaata ataataataa gttaagggta 11520

ttaaatatat ttatacatgg aggtcataaa aatatatata tttgggctgg gcgcagtggc 11580

tcacacctgc gcccggccct ttgggaggcc gaggcaggtg gatcacctga gtttgggagt 11640

tccagaccag cctgaccaac atggagaaac cccttctctg tgtattttta gtagatttta 11700

ttttatgtgt attttattca caggtatttc tggaaaactg aaactgtttt tcctctactc 11760

tgataccaca agaatcatca gcacagagga agacttctgt gatcaaatgt ggtgggagag 11820

gggaggtttt caccagcaca tgagcagtca gttctgccgc agactcggcg ggtgtccttc 11880

ggttcagttc caacaccgcc tgcctggaga gaggtcagac cacagggtga gggctcagtc 11940

cccaagacat aaacacccaa gacataaaca cccaacaggt ccaccccgcc tgctgcccag 12000

gcagagccga ttcaccaaga cgggaattag gatagagaaa gagtaagtca cacagagccg 12060

gctgtgcggg agaacggagt tctattatga ctcaaatcag tctccccaag cattcgggga 12120

tcagagtttt taaggataac ttagtgtgta gggggccagt gagttggaga tgaaagcgta 12180

gggagtcgaa ggtgtccttt tgcgccgagt cagttcctgg gtgggggcca caagatcgga 12240

tgagccagtt tatcaatccg ggggtgccag ctgatccatg gagtgcaggg tctgcaaaat 12300

atctcaagca ctgattgatc ttaggtttta caatagtgat gttaccccag gaacaatttg 12360

gggaaggtca gaatcttgta gcctgtagct gcatgactcc taaaccataa tttctttttt 12420

gttttttttt ttttattttt gagacagggt ctcactctgt cacctaggct ggagtgcagt 12480

ggtgcaatca cagctcactg cagcctcaac gtcgtaagct caagcgatcc tcccacctca 12540

gcctgcctgg tagctgagac tacaagcgac gccccagtta atttttgtat ttttggtaga 12600

ggcagcgttt tgccgtgtgg ccctggctgg tctcgaactc ctgggctcaa gtgatccagc 12660

ctcagcctcc caaagtgctg ggacaaccgg ggccagtcac tgcacctggc cctaaaccat 12720

aatttctaat cttttggcta atttgttagt cctacaaagg cagtctagtc cccaggcaaa 12780

aagggggttt gtttcgggaa agggctgtta ctgtctttgt ttcaaactat aaactaagtt 12840

cctcctaaac ttagttcggc ctacacccag gaatgaacaa ggagagcttg gaggttagaa 12900

gcacgatgga attggttagg tcagatctct ttcactgtct gagttataat tttgcaatgg 12960

tggttcaaag actgcccgct tctgacacca gtcgctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 13020

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 13080

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 13140

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 13200

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 13260

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 13320

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 13380

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 13440

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 13500

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 13560

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 13620

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 13680

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 13740

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 13800

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 13860

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 13920

gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 13980

gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 14040

ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 14100

atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 14160

agcaataaac cagccagccg gaaggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 14220

t 14221

<210> 2

<211> 14560

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 60

tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 120

cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 180

aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 240

tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 300

gcttttctgt atttttttag tctctactgt gcctaacttg taagttaaat ttgatcagag 360

gtgtgttccc agaggggaaa acagtatata cagggttcag tactatcgca tttcaggcct 420

ccacctgggt cttggaatgt gtcccccgag gggtgatgac tacctcagtt ggatctccac 480

aggtcacagt gacacaagat aaccaagaca cctcccaagg ctaccacaat gggccgccct 540

ccacgtgcac atggccggag gaactgccat gtcggaggtg caagcacacc tgcgcatcag 600

agtccttggt gtggagggag ggaccagcgc agcttccagc catccacctg atgaacagaa 660

cctagggaaa gccccagttc tacttacacc aggaaaggct ggaagggcta atttggtccc 720

aaaaaagaca agagatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac ttccctgatt 780

ggcagaacta cacaccaggg ccagggatca gatatccact gacctttgga tggtgcttca 840

agttagtacc agttgaacca gagcaagtag aagaggccaa tgaaggagag aacaacagct 900

tgttacaccc tatgagccag catgggatgg aggacccgga gggagaagta ttagtgtgga 960

agtttgacag cctcctagca tttcgtcaca tggcccgaga gctgcatccg gagtactaca 1020

aagactgctg acatcgagct ttctacaagg gactttccgc tggggacttt ccagggaggt 1080

gtggcctggg cgggactggg gagtggcgag ccctcagatg ctacatataa gcagctgctt 1140

tttgcctgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa 1200

ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgctcaa agtagtgtgt 1260

gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg 1320

aaaatctcta gcagtggcgc ccgaacaggg acttgaaagc gaaagtaaag ccagaggaga 1380

tctctcgacg caggactcgg cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac 1440

tggtgagtac gccaaaaatt ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga 1500

gcgtcggtat taagcggggg agaattagat aaatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg 1560

ggaaagaaac aatataaact aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc 1620

gcagttaatc ctggcctttt agagacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta 1680

caaccatccc ttcagacagg atcagaagaa cttagatcat tatataatac aatagcagtc 1740

ctctattgtg tgcatcaaag gatagatgta aaagacacca aggaagcctt agataagata 1800

gaggaagagc aaaacaaaag taagaaaaag gcacagcaag cagcagctga cacaggaaac 1860

aacagccagg tcagccaaaa ttaccctata gtgcagaacc tccaggggca aatggtacat 1920

caggccatat cacctagaac tttaaatgca tgggtaaaag tagtagaaga gaaggctttc 1980

agcccagaag taatacccat gttttcagca ttatcagaag gagccacccc acaagattta 2040

aataccatgc taaacacagt ggggggacat caagcagcca tgcaaatgtt aaaagagacc 2100

atcaatgagg aagctgcaga atgggataga ttgcatccag tgcatgcagg gcctattgca 2160

ccaggccaga tgagagaacc aaggggaagt gacatagcag gaactactag tacccttcag 2220

gaacaaatag gatggatgac acataatcca cctatcccag taggagaaat ctataaaaga 2280

tggataatcc tgggattaaa taaaatagta agaatgtata gccctaccag cattctggac 2340

ataagacaag gaccaaagga accctttaga gactatgtag accgattcta taaaactcta 2400

agagccgagc aagcttcaca agaggtaaaa aattggatga cagaaacctt gttggtccaa 2460

aatgcgaacc cagattgtaa gactatttta aaagcattgg gaccaggagc gacactagaa 2520

gaaatgatga cagcatgtca gggagtgggg ggacccggcc ataaagcaag agttttggct 2580

gaagcaatga gccaagtaac aaatccagct accataatga tacagaaagg caattttagg 2640

aaccaaagaa agactgttaa gtgtttcaat tgtggcaaag aagggcacat agccaaaaat 2700

tgcagggcct aacctaggaa aaagggctgt tggaaatgtg gaaaggaagg acaccaaatg 2760

aaagattgta ctgagagaca ggctaatttt ttagggaaga tctggccttc ccacaaggga 2820

aggccaggga attttcttca gagcagacca gagccaacag ccccaccaga agagagcttc 2880

aggtttgggg aagagacaac aactccctct cagaagcagg agccgataga caaggaactg 2940

tatcctttag cttccctcag atcactcttt ggcagcgacc cctcgtcaca ataaagatag 3000

gggggcaatt aaaggaagct ctattagata caggagcaga tgatacagta ttagaagaaa 3060

tgaatttgcc aggaagatgg aaaccaaaaa tgataggggg aattggaggt tttatcaaag 3120

taagacagta tgatcagata ctcatagaaa tctgcggaca taaagctata ggtacagtat 3180

tagtaggacc tacacctgtc aacataattg gaagaaatct gttgactcag attggctgca 3240

ctttaaattt tcccattagt cctattgaga ctgtaccagt aaaattaaag ccaggaatgg 3300

atggcccaaa agttaaacaa tggccattga cagaagaaaa aataaaagca ttagtagaaa 3360

tttgtacaga aatggaaaag gaaggaaaaa tttcaaaaat tgggcctgaa aatccataca 3420

atactccagt atttgccata aagaaaaaag acagtactaa atggagaaaa ttagtagatt 3480

tcagagaact taataagaga actcaagatt tctgggaagt tcaattagga ataccacatc 3540

ctgcagggtt aaaacagaaa aaatcagtaa cagtactgga tgtgggcgat gcatattttt 3600

cagttccctt agataaagac ttcaggaagt atactgcatt taccatacct agtataaaca 3660

atgagacacc agggattaga tatcagtaca atgtgcttcc acagggatgg aaaggatcac 3720

cagcaatatt ccagtgtagc atgacaaaaa tcttagagcc ttttagaaaa caaaatccag 3780

acatagtcat ctatcaatac atggatgatt tgtatgtagg atctgactta gaaatagggc 3840

agcatagaac aaaaatagag gaactgagac aacatctgtt gaggtgggga tttaccacac 3900

cagacaaaaa acatcagaaa gaacctccat tcctttggat gggttatgaa ctccatcctg 3960

ataaatggac agtacagcct atagtgctgc cagaaaagga cagctggact gtcaatgaca 4020

tacagaaatt agtgggaaaa ttgaattggg caagtcagat ttatgcaggg attaaagtaa 4080

ggcaattatg taaacttctt aggggaacca aagcactaac agaagtagta ccactaacag 4140

aagaagcaga gctagaactg gcagaaaaca gggagattct aaaagaaccg gtacatggag 4200

tgtattatga cccatcaaaa gacttaatag cagaaataca gaagcagggg caaggccaat 4260

ggacatatca aatttatcaa gagccattta aaaatctgaa aacaggaaag tatgcaagaa 4320

tgaagggtgc ccacactaat gatgtgaaac aattaacaga ggcagtacaa aaaatagcca 4380

cagaaagcat agtaatatgg ggaaagactc ctaaatttaa attacccata caaaaggaaa 4440

catgggaagc atggtggaca gagtattggc aagccacctg gattcctgag tgggagtttg 4500

tcaatacccc tcccttagtg aagttatggt accagttaga gaaagaaccc ataataggag 4560

cagaaacttt ctatgtagat ggggcagcca atagggaaac taaattagga aaagcaggat 4620

atgtaactga cagaggaaga caaaaagttg tccccctaac ggacacaaca aatcagaaga 4680

ctgagttaca agcaattcat ctagctttgc aggattcggg attagaagta aacatagtga 4740

cagactcaca atatgcattg ggaatcattc aagcacaacc agataagagt gaatcagagt 4800

tagtcagtca aataatagag cagttaataa aaaaggaaaa agtctacctg gcatgggtac 4860

cagcacacaa aggaattgga ggaaatgaac aagtagataa attggtcagt gctggaatca 4920

ggaaagtact atttttagat ggaatagata aggcccaaga agaacatgag aaatatcaca 4980

gtaattggag agcaatggct agtgatttta acctaccacc tgtagtagca aaagaaatag 5040

tagccagctg tgataaatgt cagctaaaag gggaagccat gcatggacaa gtagactgta 5100

gcccaggaat atggcagcta gattgtacac atttagaagg aaaagttatc ttggtagcag 5160

ttcatgtagc cagtggatat atagaagcag aagtaattcc agcagagaca gggcaagaaa 5220

cagcatactt cctcttaaaa ttagcaggaa gatggccagt aaaaacagta catacagaca 5280

atggcagcaa tttcaccagt actacagtta aggccgcctg ttggtgggcg gggatcaagc 5340

aggaatttta aggcattccc tacaatcccc aaagtcaagg agtaatagaa tctatgaata 5400

aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa gagatcaggc tgaacatctt aagacagcag 5460

tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg 5520

caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac 5580

aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttgga 5640

aaggaccagc aaagctcctc tggaaaggtg aaggggcagt agtaatacaa gataatagtg 5700

acataaaagt agtgccaaga agaaaagcaa agatcatcag ggattatgga aaacagatgg 5760

caggtgatga ttgtgtggca agtagacagg atgaggatta acacatagta atggaaaaga 5820

ttagtaaaac accatatgta tatttcaagg aaagctaagg actggtttta tagacatcac 5880

tatgaaagta ctaatccaaa aataagttca gaagtacaca tcccactagg ggatgctaaa 5940

ttagtaataa caacatattg gggtctgcat acaggagaaa gagactggca tttgggtcag 6000

ggagtctcca tagaatggag gaaaaagaga tatagcacac aagtagaccc tgacctagca 6060

gaccaactaa ttcatctgca ctattttgat tgtttttcag aatctgctat aagaaatacc 6120

atattaggac gtatagttag tcctaggtgt gaatatcaag caggacataa caaggtagga 6180

tctctacagt acttggcact agcagcatta ataaaaccaa aacagataaa gccacctttg 6240

cctagtgtta ggaaactgac agaggacaga tgtagtaaga acaagcccca gaagaccaag 6300

ggccacagag ggagccatac aatgaatgga cactagagct tttagaggaa cttaagagtg 6360

aagctgttag acattttcct aggatatggc tccataactt aggacaacat atctatgaaa 6420

cttacgggga tacttgggca ggagtggaag ccataataag aattctgcaa caactgctgt 6480

ttatccattt cagaattggg tgtcgacata gcagaatagg cgttactcga cagaggagag 6540

caagaaatgg agccagtaga tcctagacta gagccctgga agcatccagg aagtcagcct 6600

aaaactgctt gtaccaattg ctattgtaaa aagtgttgct ttcattgcca agtttgtttc 6660

atgacaaaag ccttaggcat ctcctatggc aggaagaagc ggagacagcg acgaagagct 6720

catcagaaca gtcagactca tcaagcttct ctatcaaagc agtaagtagt acatgtaatg 6780

tagtaacaac ctataatagt agcaatagta gcattagtag tagcaataat aatagcaata 6840

gttgtgtggt ccatagtaat catagaatat aggaaaatat taagacaaag aaaaatagac 6900

aggttaattg atagactaat agaaagagca gaagacagtg gcaatgagag tgaaggagaa 6960

gtatcagcac ttgtggagat gggggtggaa atggggcacc atgctccttg ggatattgat 7020

gatctgtagt gctacagaaa aattgtgggt cacagtctat tatggggtac ctgtgtggaa 7080

ggaagcaacc accactctat tttgtgcatc agatgctaaa gcatatgata cagaggtaca 7140

taatgtttgg gccacacatg cctgtgtacc cacagacccc aacccacaag aagtagtatt 7200

ggtaaatgtg acagaaaatt ttaacatgtg gaaaaatgac atggtagaac agatgcatga 7260

ggatataatc agtttatggg atcaaagcct aaagccatgt gtaaaattaa ccccactctg 7320

tgttagttta aagtgcactg atttgaagaa tgatactaat accaatagta gtagcgggag 7380

aatgataatg gagaaaggag agataaaaaa ctgctctttc aatatcagca caagcataag 7440

agataaggtg cagaaagaat atgcattctt ttataaactt gatatagtac caatagataa 7500

taccagctat aggttgataa gttgtaacac ctcagtcatt acacaggcct gtccaaaggt 7560

atcctttgag ccaattccca tacattattg tgccccggct ggttttgcga ttctaaaatg 7620

taataataag acgttcaatg gaacaggacc atgtacaaat gtcagcacag tacaatgtac 7680

acatggaatc aggccagtag tatcaactca actgctgtta aatggcagtc tagcagaaga 7740

agatgtagta attagatctg ccaatttcac agacaatgct aaaaccataa tagtacagct 7800

gaacacatct gtagaaatta attgtacaag acccaacaac aatacaagaa aaagtatccg 7860

tatccagagg ggaccaggga gagcatttgt tacaatagga aaaataggaa atatgagaca 7920

agcacattgt aacattagta gagcaaaatg gaatgccact ttaaaacaga tagctagcaa 7980

attaagagaa caatttggaa ataataaaac aataatcttt aagcaatcct caggagggga 8040

cccagaaatt gtaacgcaca gttttaattg tggaggggaa tttttctact gtaattcaac 8100

acaactgttt aatagtactt ggtttaatag tacttggagt actgaagggt caaataacac 8160

tgaaggaagt gacacaatca cactcccatg cagaataaaa caatttataa acatgtggca 8220

ggaagtagga aaagcaatgt atgcccctcc catcagtgga caaattagat gttcatcaaa 8280

tattactggg ctgctattaa caagagatgg tggtaataac aacaatgggt ccgagatctt 8340

cagacctgga ggaggcgata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata aatataaagt 8400

agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag tggtgcagag 8460

agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag cagcaggaag 8520

cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat tgtctgatat 8580

agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc tgttgcaact 8640

cacagtctgg ggcatcaaac agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa gatacctaaa 8700

ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca ccactgctgt 8760

gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaata acatgacctg 8820

gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct taattgaaga 8880

atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata aatgggcaag 8940

tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat tcataatgat 9000

agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag tgaatagagt 9060

taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaatcccga ggggacccga 9120

caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat ccattcgatt 9180

agtgaacgga tccttagcac ttatctggga cgatctgcgg agcctgtgcc tcttcagcta 9240

ccaccgcttg agagacttac tcttgattgt aacgaggatt gtggaacttc tgggacgcag 9300

ggggtgggaa gccctcaaat attggtggaa tctcctacag tattggagtc aggaactaaa 9360

gaatagtgct gttaacttgc tcaatgccac agccatagca gtagctgagg ggacagatag 9420

ggttatagaa gtattacaag cagcttatag agctattcgc cacataccta gaagaataag 9480

acagggcttg gaaaggattt tgctataaga tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 9540

gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 9600

ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 9660

ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt 9720

gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 9780

aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 9840

ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 9900

tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg 9960

tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca 10020

acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 10080

acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 10140

accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 10200

ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaaa gcggccgcac tagtgataat tccgcccctc 10260

tccctccccc ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt 10320

tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc 10380

tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca 10440

aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac 10500

gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg 10560

ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt 10620

gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca agcgtattca acaaggggct 10680

gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg 10740

ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt 10800

ggttttcctt tgaaaaacac gatgataata tgggtggcaa gtggtcaaaa agtagtgtga 10860

ttggatggcc tgctgtaagg gaaagaatga gacgagctga gccagcagca gatggggtgg 10920

gagcatagta agtatctcga gacctagaaa aacatggagc aatcacaagt agcaatacag 10980

cagctaacaa tgctgcttgt gcctggctag aagcacaaga ggaggaagag gtgggttttc 11040

cagtcacacc tcaggtacct ttaagaccaa tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc 11100

actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca ctcccaaaga agacaagata 11160

tccttgatct gtggatctac cacacacaag gctacttccc tgattggcag aactacacac 11220

cagggccagg ggtcagatat ccactgacct ttggatggtg ctacaagcta gtaccagttg 11280

agccagataa ggtagaagag gccaataaag gagagaacac cagcttgtta caccctgtga 11340

gcctgcatgg aatggatgac cctgagagag aagtgttaga gtggaggttt gacagccgcc 11400

tagcatttca tcacgtggcc cgagagctgc atccggagta cttcaagaac tgctgacatc 11460

gagcttgcta caagggactt tccgctgggg actttccagg gaggcgtggc ctgggcggga 11520

ctggggagtg gcgagccctc agatgctgca tataagcagc tgctttttgc ctgtactggg 11580

tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg 11640

cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt 11700

gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcacc 11760

caggaggtag aggttgcagt gagccaagat cgcgccactg cattccagcc tgggcaagaa 11820

aacaagactg tctaaaataa taataataag ttaagggtat taaatatatt tatacatgga 11880

ggtcataaaa atatatatat ttgggctggg cgcagtggct cacacctgcg cccggccctt 11940

tgggaggccg aggcaggtgg atcacctgag tttgggagtt ccagaccagc ctgaccaaca 12000

tggagaaacc ccttctctgt gtatttttag tagattttat tttatgtgta ttttattcac 12060

aggtatttct ggaaaactga aactgttttt cctctactct gataccacaa gaatcatcag 12120

cacagaggaa gacttctgtg atcaaatgtg gtgggagagg gaggttttca ccagcacatg 12180

agcagtcagt tctgccgcag actcggcggg tgtccttcgg ttcagttcca acaccgcctg 12240

cctggagaga ggtcagacca cagggtgagg gctcagtccc caagacataa acacccaaga 12300

cataaacacc caacaggtcc accccgcctg ctgcccaggc agagccgatt caccaagacg 12360

ggaattagga tagagaaaga gtaagtcaca cagagccggc tgtgcgggag aacggagttc 12420

tattatgact caaatcagtc tccccaagca ttcggggatc agagttttta aggataactt 12480

agtgtgtagg gggccagtga gttggagatg aaagcgtagg gagtcgaagg tgtccttttg 12540

cgccgagtca gttcctgggt gggggccaca agatcggatg agccagttta tcaatccggg 12600

ggtgccagct gatccatgga gtgcagggtc tgcaaaatat ctcaagcact gattgatctt 12660

aggttttaca atagtgatgt taccccagga acaatttggg gaaggtcaga atcttgtagc 12720

ctgtagctgc atgactccta aaccataatt tcttttttgt tttttttttt ttatttttga 12780

gacagggtct cactctgtca cctaggctgg agtgcagtgg tgcaatcaca gctcactgca 12840

gcctcaacgt cgtaagctca agcgatcctc ccacctcagc ctgcctggta gctgagacta 12900

caagcgacgc cccagttaat ttttgtattt ttggtagagg cagcgttttg ccgtgtggcc 12960

ctggctggtc tcgaactcct gggctcaagt gatccagcct cagcctccca aagtgctggg 13020

acaaccgggg ccagtcactg cacctggccc taaaccataa tttctaatct tttggctaat 13080

ttgttagtcc tacaaaggca gtctagtccc caggcaaaaa gggggtttgt ttcgggaaag 13140

ggctgttact gtctttgttt caaactataa actaagttcc tcctaaactt agttcggcct 13200

acacccagga atgaacaagg agagcttgga ggttagaagc acgatggaat tggttaggtc 13260

agatctcttt cactgtctga gttataattt tgcaatggtg gttcaaagac tgcccgcttc 13320

tgacaccagt cgctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 13380

gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 13440

gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 13500

ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 13560

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 13620

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 13680

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 13740

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 13800

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 13860

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 13920

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 13980

tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 14040

ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 14100

agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 14160

gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 14220

attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 14280

agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 14340

atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 14400

cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 14460

ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 14520

agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 14560

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcggaggct agaaggagag a 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagctccctg cttgcccata 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaattcggt taaggccagg 20

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatagattgc atccagtgca tgcagggcct attgcaccag gccag 45

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgttttact aatcttttcc attactatgt gttaatcctc atcct 45

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacaggatga ggattaacac atagtaatgg aaaagattag taaaa 45

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggtcttctg gggcttgttc ttactacatc tgtcctctgt cagt 44

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaactgaca gaggacagat gtagtaagaa caagccccag aaga 44

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attgctacta ttataggttg ttactacatt acatgtacta ctta 44

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcagtaagta gtacatgtaa tgtagtaaca acctataata gtagc 45

<210> 13

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tccatgtttt tctaggtctc gagatactta ctatgctccc accccatctg ctg 53

Claims (9)

1.一种用于检测可复制性慢病毒(RCL)的试剂盒，其特征在于，包含重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT或者重组菌NL4-3 HIV-EGFP-ATT；

所述重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT为在质粒pUC19-NL4-3HIV-EGFP-ATT中添加终止密码子基因序列的重组表达载体；所述重组菌NL4-3 HIV-EGFP-ATT中含有重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT。

2.根据权利要求1所述的检测可复制慢病毒的试剂盒，其特征在于，所述重组表达载体pUC19-NL4-3 HIV-EGFP-ATT为将质粒pUC19-NL4-EGFP的SphI和XhoI位点之间的序列替换为序列表中序列2中第2148位至10935位的序列。

3.根据权利要求1或2所述的检测可复制慢病毒的试剂盒，其特征在于，还包括成套试剂，所述成套试剂包括引物F、引物R和探针P；

所述引物F为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列3所示的单链核苷酸分子；

a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链核苷酸分子；

所述引物R为如下a3)或a4)：

a3)序列表中序列4所示的单链核苷酸分子；

a4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链核苷酸分子；

所述探针P为如下a5)或a6)：

a5)序列表中序列5所示的单链核苷酸分子；

a6)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链核苷酸分子。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在质粒pUC19-NL4-EGFP中添加终止密码子的基因序列的重组表达载体。

5.权利要求1所述的载体，其特征在于，所述重组表达载体为将质粒pUC19-NL4-EGFP的SphI和XhoI位点之间的序列替换为序列表中序列2中第2148位至10935位的序列。

6.一种重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.添加终止密码子的Vif、Vpr、Vpu和Nef基因序列的构建:通过序列比对设计的引物对gag-F/vif-R扩增带有终止密码子的Vif基因序列，经测序验证终止密码子添加在Vif基因后，作为同源重组基因片段2；经序列比对设计合成引物对vif-F/Vpr-R扩增基因片段3，通过扩增在VPR基因的起始密码子后添加两个终止密码子并经测序验证正确；经序列比对设计合成引物对Vpr-F/Vpu-R扩增片段4，通过扩增在Vpu基因的起始密码子后添加两个终止密码子并经测序验证正确；经序列比对设计合成引物对Vpu-F/Nef-R扩增片段5，通过扩增在nef基因后添加两个终止密码子并经测序验证正确；

b.将步骤1中的同源重组基因片段2、同源重组基因片段3、同源重组基因片段4和同源重组基因片段5替换质粒pUC19-NL4-EGFP的SphI和XhoI位点之间的序列，并保持其他序列不变，得到重组表达载体pUC19-NL4-3HIV-EGFP-ATT。

7.一种用于检测条件可复制性慢病毒的重组菌，其特征在于，所述重组菌中含有权利要求1或2所述的重组表达载体。

8.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为NL4-3HIV-EGFP-ATT，所述NL4-3HIV-EGFP-ATT为导入重组表达载体pUC19-NL4-3HIV-EGFP-ATT的大肠杆菌DH-5a。

9.权利要求4或5所述的载体、权利要求7或8所述重组菌、权利要求3中所述的成套引物在制备检测条件可复制性慢病毒的产品中的应用。

Images